一类苊并杂环类化合物及其应用 技术领域 本发明涉及一系列新的苊并杂环类 Bcl-2 家族蛋白抑制剂及其在体内、 体外的模 拟 BH3-only 蛋白， 竞争性结合和拮抗 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白， 从而诱导细胞凋亡作用和作为 抗癌化合物的应用。
背景技术 分子靶向抗肿瘤药物正在成为继细胞毒剂类抗肿瘤药物之后， 新药研发的热点和 市场化的新生代产品。Bcl-2 家族蛋白， 是拮抗和逆转恶性肿瘤永生性的最重要的分子靶 点。所以， 特异性拮抗 Bcl-2 家族蛋白的药物， 将通过专一诱导肿瘤细胞凋亡， 最终实现高 选择性、 安全、 高效、 无毒副作用抗癌的目标。在 Bcl-2 类抑制剂中， 以高特异的 BH3 类似物 (BH3mimetics) 的抗肿瘤效果最为显著， 药效学活性最好， 毒副作用最低。 此外， 还必须具备 广谱拮抗 Bcl-2 家族蛋白的抗凋亡成员 ( 至少包括 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白 ) 的能力， 才能实 现单剂有效和低耐药。
但到目前为止， 以 Bcl-2 为靶点的抗肿瘤药物尚无上市产品， 仅有的 19 个临床前 Bcl-2 抑制剂中， 有三个效果最优的分别处于临床 I， II， III 期。分别是 ： 由美国伊利诺州 阿伯特实验室研发的 ABT-737， Gemin X 公司研发的 Obatoclax(GX15-070)， 和美国 Ascenta 公司的 AT-101。它们都是 BH3 类似物， 与 Bcl-2 蛋白的竞争结合常数达到 nM 级， 远远高于 其它 15 个同类分子。但是它们都存在不足 ： Gossypol， Obatoclax 的 BH3 类似程度不足， 不 是绝对的 BH3 类似物， 也就是具有不依赖 BAX/BAK 的细胞毒性， 说明存在其他的作用靶点， 因此具有毒副作用。ABT-737 虽然是特异性最高的 BH3 类似物， 但是不能拮抗和结合 Mcl-1 蛋白， 不是广谱的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂， 因而严重限制了其适用的病种。
本发明人既往研究的成果中公开了一系列 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 的苊并杂环类化合物， 并且这类化合物具有通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长的活性 (CN1304370C)。 然而， 作为潜在的以凋亡为基础的抗肿瘤药物， 其开发同样面对此类药物开 发的难点 ： 凋亡信号通路复杂及潜在的强烈的细胞毒性及其所必然导致的用药的盲目性， 而这是导致该类药物的开发失败的重要原因。因此， 研究中需要突出强调药物作用的靶向 性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一类苊并杂环类化合物， 具有下述通式 I 的结构 ：通式 I 中 ：
R1、 R2 和 R3 各自独立地选自 XR5 和 H ；
R4 选自 CN、 COOH、 COOR6 和 CONHR6 ；
当所述的 X 是 O、 羰基、 酯基、 酰胺基或磺酰胺基时 ； 5
所述的 R 选自 (CH2)nY 和 (CH2)nPh-(o， m， p)Y， 所述的 Y 选自直链或支链的 C2-C8 烷基、 取代的直链或支链的 C1-C8 烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基和羧基 ； 6
所述的 R 选自取代或未取代的直链或支链的 C1-C6 烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基、 羧基或 (CH2)nPh-(o， m， p)Z， 其中 Z 选自 -CH3、 -C2H5、 -NO2、 -Ph、 -F、 -Cl、 -Br 、 -CF3、 -OCH3、 -SCH3、 -NH2 和 -N(CH3)2 ；
当所述的 X 是 S 时 ；
所述的 R5 选自 (CH2)nPh-(o， m， p)Y， 所述的 Y 选自直链或支链的 C2-C8 烷基、 取代 的直链或支链的 C1-C8 烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基和羧基 ； 6
所述的 R 选自取代或未取代的直链或支链的 C1-C6 烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基、 羧基或 (CH2)n Ph-(o， m， p)Z， 其中 Z 选自 -CH3、 -C2H5、 -NO2、 -Ph、 -F、 -Cl、 -B r、 -CF3、 -OCH3、 -SCH3、 -NH2 和 -N(CH3)2 ；
上述的 n 为 0 ～ 4 的整数。
优选的技术方案中， 所述的 R1 和 R2 分别是 XR5 和 H。
再一优选技术方案中， 所述的 R4 是 CN。
又一优选的技术方案中， 所述的 R5 是 (CH2)nPh-(o， m， p)Y。进一步优选 X 是 O 或 S， Y 是直链或支链的 C3-C5 烷基。最优选 Y 是异丙基、 异丁基或仲丁基。
更为优选地， 上述本发明的化合物选自 ： 3-(4- 仲丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 4-(4- 仲丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 3-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 4-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 3-(4- 异丁基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 4-(4- 异丁基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 3-(4- 异丙基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 3-(4- 仲丁基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈。本发明的目的之二在于提供一种上述化合物的制备方法， 经下述 a 或 b 途径 ：
a. 以 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈为原料， 与亲核试剂醇， 酚， 酯， 酰胺发生 反应， 温度为 20 ～ 100℃， 反应时间 0.5 ～ 24 小时， 反应完成后蒸出溶剂， 柱层析得到 3- 取 代、 6- 取代或者 3， 6- 位双取代的 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 腈基再经过水解， 酯 化或酰胺化得本发明的苊并杂环类化合物 ； 反应式如下 ：
b. 以苊醌为原料， 加入液溴回流 2 小时， 得到溴代苊醌 ； 再与醇， 酚， 酯， 酰胺反应 得到相应的取代苊醌 iii( 如下反应式 ) ；
取代苊醌 ( 式 iii) 与乙腈在硅胶弱酸性催化的条件下反应得到通式为 i 或 ii 的 化合物， 化合物 i 或 ii 在 K2CO3 催化， 乙腈回流 0.5 ～ 6h 冷却后减压蒸除部分溶剂后， 过滤 或柱层析制得 3 位或 4 位取代的 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ； 再经过水解， 酯化或 酰胺化得本发明的苊并杂环类化合物， 如下反应式 ：
上述本发明所提供的制备方法中， 各个取代基的定义与前述对化合物中取代基的 定义一致， 所述及的取代基 R 在反应中进入不同的取代位置后区别为 R1 或 R2。
在既往一些列本发明的苊并杂环类化合物的基础上， 本申请的发明人经过分析及 试验， 筛选出上述一系列的新的化合物。这些化合物具有与既往公开的化合物相比相当或 更优异的 BH3 相似性， 在制备 BH3 类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中具有相当的应用前景。
基于此， 本发明的再一目的在于提供本发明的苊并杂环类化合物在制备 BH3 类似 物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。包括将本发明的化合物以有效剂量与通常可选的药用 辅料配合制剂的步骤， 按照本发明实施例的检测结果， 本发明所述及的化合物在此应用中 所需的有效剂量可能远低于现有技术中公开的化合物。更进一步， 本发明的目的还在于提 供本发明的苊并杂环类化合物在制备高靶向性抗肿瘤药物中的应用。
附图说明
本发明附图 9 幅， 其中 ：
附图 1 是荧光偏振方法检测化合物 1 与 FAM-Bid 肽段竞争结合 Bcl-2 蛋白的动力 学曲线 ；
附图 2 是荧光偏振方法检测化合物 1 与 FAM-Bid 肽段竞争结合 Mcl-1 蛋白的动力 学曲线 ；
附图 3 是不同浓度的化合物 1 在细胞水平上干扰 Bcl-2/Bax 之间相互作用结果示图； 附图 4 是化合物 1 在细胞水平上以不同的作用时间干扰 Bcl-2/Bax 之间相互作用 结果示图 ；
附图 5 是化合物 1 依赖 BAX/BAK 的细胞毒性实验结果， 其中 Gossypol 为非特异性 对照 ；
附图 6 是化合物 1 对 Mcl-1 抑制作用 Western 印记检测电泳图 ；
附图 7 是化合物 1 对 Bcl-2 抑制作用 Western 印记检测电泳图 ；
附图 8 是化合物 1 抑制 Mcl-1 蛋白作用半定量曲线 ；
附图 9 是化合物 1 抑制 Bcl-2 蛋白作用半定量曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。
第一部分 ： 苊并杂环类化合物制备及其表征实施例 ；实施例 1 ： 3-(4- 仲丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 1) 和 4-(4- 仲丁基苯氧基 ) 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 2) 的合成 及表征
称取 0.99g 5-(4- 仲丁基苯氧基 ) 苊醌， 0.33g 丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入 硅胶柱中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得红色固体。称重 1.07g， 产率 94％。取 0.77g 所 得红色固体， 加入 0.05g K2CO3， 20ml 乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反应液。层析 柱分离 (CH2Cl2 ∶石油醚＝ 1 ∶ 1) 得到两种同分异构体。
化 合 物 1： M.p.219-220 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.92(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.65(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.46(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.87(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.33(d， J＝ 8.4Hz， 2H)， 7.14(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.04(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 2.70(m， 1H)， 1.65(m， 2H)， + 1.30(d， J ＝ 8.0Hz， 3H)， 0.88(t， J ＝ 8.0Hz， 3H).TOF MS(EI ) ： C25H18N2O2， (m/z) ： calcd for 378.1368， found 378.1376.
化 合 物 2： M.p.278-279 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.76(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 8.60(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.42(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.88(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.40(d， J＝ 8.0Hz， 2H)， 7.09(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 6.95(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 2.70(m， 1H)， 1.65(m， 2H)， + 1.30(d， J ＝ 8.0Hz， 3H)， 0.88(t， J ＝ 8.0Hz， 3H).TOF MS EI ： C25H18N2O2， (m/z) ： calcd for 378.1368， found 378.1362.
实施例 2 ： 3-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 3) 和 4-(4- 异丁基苯氧基 ) 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 4) 的合成 及表征
称取 0.99g 5-(4- 异丁基苯氧基 ) 苊醌， 0.33g 丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入 硅胶柱中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得红色固体。称重 1.07g， 产率 94％。取 0.77g 所 得红色固体， 加入 0.05g K2CO3， 20ml 乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反应液。层析 柱分离 (CH2Cl2 ∶石油醚＝ 1 ∶ 1) 得到两种同分异构体。
化 合 物 3： M.p.214-215 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.78(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 8.60(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.43(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.67(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.29(d， J＝ 8.0Hz， 2H)， 7.12(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 6.95(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 2.42(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， + 1.75(m， 1H)， 0.75(d， J ＝ 8.0Hz， 6H).TOF MS(EI ) ： C25H18N2O2， (m/z) ： calcd for 378.1368， found 378.1365.
化 合 物 4： M.p.273-274 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.72(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 8.53(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.38(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.98(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.31(d， J＝ 8.0Hz， 2H)， 7.02(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 6.80(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 2.43(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 1.75(m， 1H)， 0.75(d， J ＝ 8.0Hz， 6H).TOF MS EI+ ： C25H18N2O2， (m/z) ： calcd for 378.1368， found 378.1363.
实施例 3 ： 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 5) 的合成及表征
50 毫升乙腈中加入 1g8- 氧 -8H 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 0.54g 对异丙基苯酚， 回流 3 小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 5， 收率 30％。 1
化 合 物 5： M.p.272-274 ℃ ； H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.92(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.25(d， J ＝ 8.8Hz， 2H)， 8.44(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.86(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.38(d， J＝ 8.4Hz， 2H)， 7.14(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.04(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 3.01(m， 1H)， 1.32(d， J ＝ + 8.0Hz， 6H) ； TOF MS EI (m/z) ： C24H16N2O2， 计算值 ： 364.1212， 实测值 ： 364.1215。
实施例 4 ： 3-(4- 异丁基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 6) 和 4-(4- 异丁基苯硫基 ) 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 7) 的合成
及表征
称取 1.04g 对特戊基苯氧基苊醌， 0.33g 丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入硅胶柱 中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得红色固体。称重 0.99g， 产率 84％。取 0.79g 所得红色 固体， 加入 0.05g K2CO3， 20ml 乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反应液。层析柱分离 (CH2Cl2 ∶石油醚＝ 1 ∶ 1) 得到两种同分异构体。
化 合 物 6： M.p.234-235 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.58(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)，
8.41(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.30(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.53(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.31(d， J＝ 8.0Hz， 2H)， 7.02(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 6.95(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 2.75(m， 1H)， 1.69(m， 2H)， + 1.29(d， J ＝ 8.0Hz， 3H)， 0.92(t， J ＝ 8.0Hz， 3H).TOF MS(EI ) ： C25H18N2OS， (m/z) ： calcd for 394.1140， found 394.1142.
化 合 物 7： M.p.282-283 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.55(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 8.39(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.15(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.92(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.45(d， J＝ 8.0Hz， 2H)， 7.13(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 7.02(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 2.75(m， 1H)， 1.69(m， 2H)， + 1.29(d， J ＝ 8.0Hz， 3H)， 0.92(t， J ＝ 8.0Hz， 3H).TOF MS EI ： C25H18N2OS， (m/z) ： calcd for 394.1140， found 394.1137.
实施例 5 ： 3-(4- 异丙基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 8) 的合成及表征
50mL 乙腈中加入 0.69g 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 1.82g 对丙基苯硫 酚， 常温反应 3 小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 8， 收率 50％。 1
结构表征 ： mp ： 214-215 ℃ . H NMR(400MHz， CDCl3) ： δ8.57(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 8.47(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.92(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.87(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.61(t， J＝ 8.0Hz， 1H)， 7.31(t， J ＝ 9.2Hz， 2H)， 7.22(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 2.87(m， 1H)， 1.2(d， J ＝ + 8.0Hz， 6H).TOF MS(EI ) ： C24H16N2OS， (m/z) ： calcd for 380.0983， found 380.0985.
实施例 6 ： 3-(4- 仲丁基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 9) 的合成及表征
50mL 乙腈中加入 0.69g 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 1.99g 对仲丁基苯 硫酚， 常温反应 3 小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 9， 收率 42％。结构表征： M.p.245-246 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.85(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.22(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.07(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 7.68(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.53(d， J＝ 8.0Hz， 2H)， 7.41(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.12(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 2.55(m， 1H)， 1.55(m， 2H)， + 1.31(d， J ＝ 8.0Hz， 3H)， 0.89(t， J ＝ 8.0Hz， 3H)， TOF MS(EI ) ： C25H18N2OS， (m/z) ： calcd for 394.1140， found 394.1137.
实施例 7 ： 6-(4- 丙基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 10) 的合成及表征
50mL 乙腈中加入 0.69g 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 1.82g 对丙基苯硫 酚， 常温反应 3 小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 10， 收率 32％。结构表征： M.p.257-259 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.32(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.11(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.95(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.85(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.57(d， J＝ 8.4Hz， 2H)， 7.50(t， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 7.06(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 2.87(m， 1H)， 1.2(d， J ＝ + 8.0Hz， 6H).TOF MS EI ： C24H16N2OS， (m/z)calcd for 380.0983， found 380.0987.
实施例 8 ： 3， 6- 二 (4- 仲丁基苯硫基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化 合物 11) 的合成及表征
50mL 乙腈中加入 1.0g 8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 2.9g 对仲丁基苯硫 酚， 常温反应 30 小时， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得化合物 11， 收率 20％。 1
结构表征： M.p.268-269 ℃ . H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.12(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.60(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.51(d， J ＝ 8.0Hz， 4H)， 7.48(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.23(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.08(d， J ＝ 8.0Hz， 4H)， 2.55(m， 2H)， 1.52(m， 4H)， 1.25(d， J ＝ 8.0Hz， + 6H)， 0.78(t， J ＝ 8.0Hz， 6H).TOF MSEI ： C35H30N2OS2， (m/z) ： calcd for 558.1800， found 558.1803.
实施例 9 ： 3-[(4- 胺甲基 ) 苯甲酰基 ]-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化
合物 12) 和 4-[(4- 胺甲基 ) 苯甲酰基 ]-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈 ( 化合物 13) 的合成及表征
称取 0.95g 5-[(4- 胺甲基 ) 苯甲酰基 ] 苊醌， 0.33g 丙二腈用二氯甲烷溶解之 后， 加入硅胶柱中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重 0.93g， 产率 85％。取 0.73g 所得红色固体， 加入 0.08g K2CO3， 20mL 乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反 应液。层析柱分离 (CH2Cl2 ∶石油醚＝ 2 ∶ 1) 得到深红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 ∶ 0.2。利用制备液相分离得到两种同分异构体。
化 合 物 12 ： M.p.289-290 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.96(dd， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.73(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.15(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 8.08(t， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.93(d， J＝ 8.4Hz， 1H)， 7.69(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.35(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 6.32(br， 2H)， 4.36(s， 2H).TOF + MS EI ： C23H13N3O2， (m/z) ： calcd for 363.1008， found 363.1009. 1
化 合 物 13 ： M.p. ＞ 300 ℃ ； H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.85(dd， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.70(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.10(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 7.98(t， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 7.86(d， J＝ 8.4Hz， 1H)， 7.59(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.50(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 6.08(br， 2H)， 4.36(s， 2H).TOF + MS EI ： C23H13N3O2， (m/z) ： calcd for 363.1008， found 363.1005.
实施例 10 ： 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 甲酸 ( 化合物 14) 的合 成及表征
在 50mL 单口烧瓶中， 加入 60mL 浓硫酸， 在 0 ～ 5℃下， 分批加入 1.15g 的 3- 己氧 基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 腈， 1 小时内加完， 加完后在室温继续反应 18 小时， 反应混合物为粘稠的深棕红色。 然后小心缓慢的将其滴入碎冰中， 同时剧烈搅拌， 滴完后静 置， 滤饼用大量水洗涤， 直至滤饼呈中性， 滤饼干燥后得到化合物 14， 产率 90％。 1
结构表征： M.p.235-237 ℃ . H NMR(400M， CDCl3) ： δ11.0(s， 1H)， 8.55(d， J＝ 8.0Hz， 1H)， 8.45(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.01(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.71(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 6.561(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 4.10(t， J ＝ 7.6Hz， 2H)， 1.75(m， J ＝ 7.6Hz， 2H)， 1.43(m， 2H)， + 1.31(m， 2H)， 1.29(m， 2H)， 0.89(t， J ＝ 7.6Hz， 3H) ； TOF MS EI ： C21H19NO4， (m/z) ： calcd for 349.1314， found 349.1316.
实施例 11 ： 3-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 甲酸乙酯 ( 化 合物 15) 的合成及表征
在 100mL 单口烧瓶中， 依次加入 3.78g 3-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 甲酸， 50mL 乙腈做溶剂， 2.76g 的碳酸钾做缚酸计， 过量 10 倍的碘甲烷， 氮气 保护下， 加热至 42℃反应 18 小时。 减压蒸去乙腈， 加入二氯甲烷使反应物充分溶解， 过滤之 后旋干滤液， 得黄棕色粗产品。硅胶柱层析分离， 得到化合物 15， 产率 85％。
结构表征： M.p.215-216 ℃ .1H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.45(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.35(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.85(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.68(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 7.36(d， J＝ 8.8Hz， 2H)， 7.23(d， J ＝ 8.8Hz， 2H)， 6.50(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 2.45(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， + 1.52(m， 2H)， 1.25(d， J ＝ 8.4Hz， 3H)， 0.93(t， J ＝ 8.4Hz， 3H).TOF MS EI ： C26H21NO3S， (m/ z) ： calcd for 427.1242， found 427.1245.
实施例 12 ： 3-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9-N- 叔丁基酰 胺 ( 化合物 16) 的合成及表征
在 100mL 单口烧瓶中， 依次加入 3.97g 3-(4- 异丁基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1， 2-b] 吡咯 -9- 酸， 50mL DMF 做溶剂， 0.15mL 的三乙胺， 1.63g 的 (EtO)2P( ＝ O)CN， 过量 10 倍的正丁胺， 常温反应 1 小时。反应完毕得到黄色固体， 产率 35％。 1
结构表征 ： M.p.247℃ . H NMR(400M， CDCl3) ： δ8.49(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.40(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.83(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.66(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.46(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.31(d， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 6.63(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 5.53(br， 1H)， 3.21(t， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 2.53(m， 1H)， 1.52-1.50(m， 7H)， 1.25-1.32(m， 5H)， 0.91(t， J ＝ 8.0Hz， 3H).TOF MS EI+ ：
C25H19N2O3， (m/z) ： calcd for395.1396， found 395.1394.
第二部分 ： Bcl-2 家族蛋白抑制剂化合物的理化活性检测
实施例 13 ： 通过荧光偏振分析法检测化合物的 BH3 类似程度
合 成 一 个 21 个 氨 基 酸 的 Bid BH3 肽 段 ( 氨 基 酸 ： 79-99 ： QEDIIRNIARHLAQ VGDSMDR)， 并在 N 端标记上 6- 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (FAM) 作为荧光标签 (FAM-Bid)。 竞争结合实验中所用的反应体系为 GST-Bcl-2 蛋白 (40nM) 或 Mcl-1 蛋白， 和 FAM-Bid 多肽 (5nM) 溶于反应缓冲液中 (100mM K3PO4， pH 7.5， 100μg/ml 牛 γ 白蛋白 ； 0.02％叠氮化 钠 )。在 96 孔板中， 每孔加入 100μL 反应体系， 然后加入 1μL 不同浓度的溶于 DMSO 的待 检测化合物 1 的母液至实验设计所需终浓度。同时设立对照组， 反应体系中只含有 Bcl-2 或 Mcl-1 和 FAM-Bid( 相当于 0％抑制率 )。96 孔板经过 4 个小时的避光孵育后， 进行酶标 仪上检测。荧光极化值 (mP) 在由 530nm 波长激发产生的 485nm 发射波长下测量。竞争结 合常数 (Ki) 值根计算公式推导得出。 该化合物与 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的竞争结合常数 (Ki) 值分别为 158nM 和 24nM( 附图 1 和附图 2)。
按照上述相同的试验方法检测其他 12 个化合物的 BH3 类似程度， 它们与 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的结合常数 ( 表 1 中简称结合常数 ) 也在 nM 级， 具体结果如表 1 所示。
表1
化合物 1 Bcl-2 蛋白结合常数 (nM) 158 Mcl-1 蛋白结合常数 (nM) 2415102321012 A CN 102321017 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15
140 210 20 120 23 23 12 9 540 115 105 86说明书12 56 85 8 85 57 65 85 25 135 85 7513/17 页实施例 14 ： 活细胞内荧光偏振能量转移 (FRET) 检测化合物的 BH3 类似性
利用磷酸钙共沉淀的方法将 2μg Bcl-2-CFP 和 Bax-YFP 质粒分别或同时转染至 Hela 细胞中， 转染 24 小时后， 将细胞接种于 6 孔培养板 (2×105 个 / 孔 )， 加入溶于 DMSO 的 待检测化合物 1 至终浓度 (2， 5， 10 和 15μM)， 药物作用 24 小时后 ( 如附图 3)， PBS 清洗细胞 3 次， 用 GENIOS 荧光酶标仪 (TECAN， Swiss) 检测荧光值。 在时间依赖的实验中， 转染后的细 胞接种于 6 孔板后， 加入 40μM 化合物， 药物作用 3、 6 和 24 小时 ( 附图 4)， 读板检测荧光。 在只转染 Bcl-2-CFP 质粒的细胞组中记录 475nm 发射波长值， 激发波长为 433nm。 在只转染 Bax-YFP 质粒的细胞组中记录 527nm 发射波长值， 激发波长为 505nm。对共转染 Bcl-2-CFP 和 Bax-YFP 质粒的细胞实验组记录 527nm 和 475nm 发射波长值， 激发波长为 433nm。527nm 发射荧光与 475nm 发射荧光相比值即为 FRET， 将单独转染对照组的 FRET 值设为 1.0。在共 转染的细胞中， 由于 Bcl-2 蛋白和 Bax 蛋白的相互作用使得 FRET 值增加至 2.0， 而随着加药 浓度和时间的增加， 对两蛋白相互作用的干扰增强， FRET 随之减弱。细胞活力由 MTT 法进 行测定。试验结果如附图 3 和附图 4 所示， 该化合物在 2μM， 作用 3 小时即可干扰 Bcl-2/ Bax 之间的相互作用， 呈浓度时间依赖趋势。
按照上述相同的试验方法检测其他 12 个化合物， 试验证明这些化合物在不同作 用浓度和作用时间的条件下， 均具有细胞内模拟 BH3-only 蛋白的作用， 能明显干扰 Bcl-2/ Bax 之间的相互作用。具体结果如表 2 所示。其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下 干扰 Bcl-2/Bax 之间的相互作用发生的时间。
表216102321012 A CN 102321017
化合物说明书时间 ( 小时 )14/17 页浓度 (μM)1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15
0.5 0.5 0.5 0.1 0.5 0.3 0.2 0.2 0.5 1.0 0.6 0.5 0.34 4 3 2 4 3 2 2 2 2 4 5 3实施例 15 ： 通过 Bax 蛋白与线粒体共定位检测化合物的 BH3 类似度
利用磷酸钙共沉淀方法将 5μg Bax-YFP 质粒转染至 MCF-7 细胞中， 转染 24 小 6 时后， 将细胞接种于 6 孔培养板 (0.2×10 个 / 孔 )， 加入 10μM 待检测化合物 1， 作用 6 小时后， PBS 清洗并同 50nM Mito Tracker Red CMXRos( 线粒体特异探针 ； 红色 ) 避光孵 育 10min， PBS 清洗三次后， Radiance2000 激光共聚焦显微镜 (Bio-Rad， USA) 扫描荧光图 像。同时进行双通道扫描， 一个通道扫描 Bax-YFP 的绿色荧光， 另一通道扫描指示线粒体的 CMXRos 探针红色荧光， 两通道图像相互叠加显示共定位情况。 该化合物作用下， 叠加图片呈 现橘色荧光， 表示 Bax 向线粒体位移。
按照上述相同的试验方法检测其他 12 个化合物， 结果显示他们在不同作用浓 度和作用时间的条件下， 均具有驱动 BAX 向线粒体移位的作用， 说明具有细胞内模拟 BH3-only 蛋白的作用。具体结果如表 3 所示， 其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下 模拟 BH3-only 蛋白驱动 BAX 向线粒体移位的作用发生的时间。
表3
17102321012 A CN 102321017 化合物 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15
说明书时间 ( 小时 ) 4 3 3 1 4 3 3 2 3 3 4 5 315/17 页浓度 (μM) 5.0 5.0 4.0 1.0 5.0 3.0 5.0 2.0 5.0 1.0 6.0 5.0 2.0实施例 16 ： 化合物依赖 BAX/BAK 的细胞毒性实验验证其 BH3 类似物的特性
磷酸钙共沉淀转染 3μg BAX/BAK 干扰质粒至 MCF-7 细胞中， 转染 24 小时后， 收集 细胞， Western 检测 RNA 干扰后 BAX 和 BAK 蛋白表达情况， 相同处理无质粒转染的细胞组设 5 为对照组。转染后的细胞接种于 96 孔板中 (1×10 个 / 孔 )， 平行进行未转染质粒细胞组 的对照实验， 按实验设计浓度梯度加入待检测化合物 1， 作用 48 小时后， MTT 检测细胞活力， 结果如附图 5 所示， Gossypol 作为非特异性 BH3 类似物与本发明的化合物对比平行处理， 可见化合物 1 具有绝对依赖 BAX/BAK 的细胞毒性。
按上述相同试验方法检测其他 12 个化合物， 通过对比检测化合物作用于转染细 胞和未转染细胞的 IC50 值变化， 说明所检测化合物也均具有绝对依赖 BAX/BAK 的作用特点 ( 见表 4)。
表4
化合物 1 未转染细胞 IC50 值 (μM) 7.5 转染细胞 IC50 值 (μM) ＞ 5018102321012 A CN 102321017 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15
7.1 8.5 2 6.8 2.2 2.1 1.5 1.2 15 6.5 6.2 5.6说明书＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 50 ＞ 5016/17 页实施例 17 ： Western 印记检测化合物对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用
收集细胞样品后， 以 1×106/50μl 细胞裂解液 (62.5mM Tris-HCL pH 6.8 ； 2％ SDS ； 10％甘氨酸 ； 50mM DTT ； 0.01％溴酚蓝 ) 低温裂解， 离心， 取蛋白上清， 100℃煮沸样品 5 分钟， 12％ SDS-PAGE 电泳并转膜， 相应抗体检测目的蛋白， 辣根过氧化酶标记二抗并结合 ECL 显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。附图 6 和附图 7 分别显示待检测化合物 1 对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用。从图中可以看出， 随着待测化合物作用于肿瘤细胞时间的延 长， Bcl-2 和 Mcl-1 的蛋白条带逐渐变浅， 说明化合物具有抑制这两个蛋白的作用。利用 KODAK Gel Logic1500 成像系统软件对 Western 图片中蛋白条带浓度进行半定量分析， 归一 化处理后， 蛋白条带的浓度如附图 8 和 9 所示。
经同样方法对检测下述 9 个化合物， 它们均具有抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的作用， 这些化合物包括 ： 化合物 1、 化合物 3、 化合物 5、 化合物 6、 化合物 8、 化合物 9、 化合物 10、 化 合物 11 和化合物 15。
这些化合物下调 Mcl-1 蛋白和 Bcl-2 蛋白的半定量分析结果分别如表 5 和表 6 所 示：
表5
化合物 对照 1 1 3 1 5 1 6 1 8 1 9 1 10 1 11 1 15 119102321012 A CN 102321017 6 小时 12 小时 18 小时 24 小时
化合物 对照 2 小时 6 小时 1 1 0.79 0.29 3 1 0.69 0.42 5 1 0.65 0.37 0.99 0.99 0.42 0.14 0.99 0.99 0.39 0.12 0.99 0.99 0.58 0.11说明0.99 0.99 0.36 0.10书0.99 0.99 0.50 0.23 0.99 0.99 0.49 0.18 0.99 0.99 0.60 0.37 0.99 0.99 0.70 0.4117/17 页 0.99 0.99 0.57 0.29表66 1 0.66 0.39 8 1 0.60 0.29 9 1 0.59 0.28 10 1 0.68 0.49 11 1 0.60 0.59 15 1 0.57 0.29