PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒的制备方法 【技术领域】
本发明涉及新城疫 DNA 疫苗的制备方法。背景技术 新城疫 (Newcastle disease， ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus， NDV) 引起的鸡和火鸡的一种急性、 高度接触性、 致死性传染病， 常呈败血症， 是危害养禽业 的最重要传染病之一， 被国际兽医局定为 I 类传染病。控制 ND 最根本的措施是进行有效的 疫苗接种， 目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和灭活疫苗， 但二者在实际应用中均存在一定的 局限性。ND 油乳剂灭活疫苗通过注射免疫鸡体后可产生较高水平的血液循环抗体， 但在抵 抗呼吸道和消化道病原感染的黏膜系统中却有局限性， 很难阻止病原通过黏膜组织侵入动 物体内， 且对已经进入细胞的病毒很难发挥作用 ； ND 弱毒活疫苗虽然可以产生一定的黏膜 免疫和体液免疫， 但受免疫方法和途径影响， 产生的循环抗体较低， 维持期短。饮水免疫很 容易造成疫苗被消化道降解， 导致疫苗吸收效率低 ； 滴鼻点眼也只能使疫苗在鼻腔内存在 15min， 致使疫苗不能有效进入机体激发有效的黏膜免疫 ； 气雾免疫产生的黏膜免疫效果较 好， 但容易诱导慢性呼吸道疫病， 且弱毒苗均不能产生较高的血清抗体等。
DNA 疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内， 在体内表达相应 抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答， 产生保护性免疫。目前， DNA 疫苗大动物实验、 人体临床实验结果表明 ： DNA 疫苗存在着给药剂量较大， 生物利用度低， 免疫效果个体差异 大， 不够理想的缺点， 极大地阻碍了 DNA 疫苗的研究进展。因此， 如何提高新城疫疫苗的免 疫效果， 研制出既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部黏膜免疫的新型疫苗已 成为 ND 疫苗研究的焦点。
近年来随着新型材料学和制剂新技术的发展， 迫切需要一种新的和改进的疫苗递 送方法以降低传染病的死亡率。目前， 制备载疫苗抗原纳米粒所采用的载体材料主要有天 然高分子聚合物壳聚糖、 明胶， 合成聚合物 PLA、 PLGA 等。目前， 国外 DNA 疫苗微球 / 纳米粒 黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速， 取得了不少阶段性成果， 有的已进入临床实验。 国 内 DNA 疫苗微球 / 纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少， 尤其是新城疫 DNA 疫苗 黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。
发明内容
本发明提供了 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒的制备方法。
本发明 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒按以下步骤制备 ：
一、 称取 40mg 的聚乳酸 / 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 溶于 1mL 的二氯甲烷中， 待完全 溶解后加入 200μg 新城疫病毒 F48E9 株的 F 基因 DNA 质粒， 冰浴条件下超声乳化 30s， 得初 乳液， 然后加入 2mL 质量浓度为 2％的聚乙烯醇， 在冰浴条件下超声乳化 60s， 得复乳液 ；
二、 将复乳液逐滴加入到 10mL 质量浓度为 0.5％的聚乙烯醇中进行纳米粒固化并 挥发多余的二氯甲烷， 以 500r/min 匀速搅拌 5h， 得固化液 ；三、 取 3000g 固化液 4℃离心 15min， 收集纳米粒， 然后用 ddH2O 洗涤 3 次， 经真空 冷冻干燥后即得 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒 ； 其中步骤一中新城疫病毒 F48E9 株的 F 基因 DNA 质粒的浓度为 0.5％ ； 步骤一中超声乳化的功率均为 50w。
本发明 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒具有巨大的应用潜力， 本发明 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒递送系统对新城疫 DNA 疫苗具有保护作用， 提高细胞转运效率， 提高免疫效 果， 可肌注、 点眼， 也可口服， 诱导黏膜免疫等特点。 同时， 在保证药物作用的前提下， 减少了 给药剂量、 减轻或避免了毒副反应、 可延长免疫保护期， 避免了多次反复给药， 且载体材料 PLGA 本身无毒， 生物相容性好， 可生物降解， 因而是一种具有广阔应用前景的新型载体疫 苗。本发明为新城疫 DNA 疫苗在临床上广泛应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递 药系统， 将促进新城疫 DNA 疫苗在家禽养殖的实际应用 ； 在此基础上可将该研究成果应用 到更多的动物疫苗和药物体系中， 届时用于预防、 治疗、 诊断动物和人的疾患， 将拯救诸多 病畜或病者的生命或延长其寿命， 其经济效益和社会效益无疑是巨大的。
经透射电子显微镜观察本发明制备的 pDNA-PLGA-NPs 形态完整呈圆球形， 表 面光滑， 分散性较好， 无明显的粘连、 塌陷等现象， 粒径为 (433.5±7.5)nm， 粒径分散度 为 0.41。Zeta 电位分析本发明制备的 pDNA-PLGA-NPs 的 Zeta 电位为 +2.7mV， 包封率为 (91.8±0.3)％。本发明制备的 pDNA-PLGA-NPs 黏膜免疫比肌肉注射更能活跃地激活黏膜 免疫应答部位， 产生高水平的特异性 IgG 和 IgA， 说明纳米粒黏膜免疫递送系统不仅在黏膜 局部产生免疫应答， 还可引起全身性的体液免疫应答和细胞免疫应答 ； 同时克服了常规疫 苗在储存和运输过程中易失活等缺点， 且用本发明方法所制备处的 NDV-CS-NPs 易于保存， 稳定性高、 包封率高、 毒性小、 药物生物利用度高、 成本低、 易于工业化生产。
使用本发明方法制备的 DNA 疫苗纳米粒在保证 DNA 疫苗稳定性的条件下具有较 高的包封率 ( 包封率为 91.8±0.3 ％ )， 可以保持体内最佳的药物浓度， 体外释放试验结 果： 在前两天质粒释放速度很快， 质粒释放量占总包裹量的 31.25％ ； 在第 2d 到第 10d 间， pDNA-PLGA-NPs 中的质粒 DNA 每天的释放量达到包裹总量的 4.53％； 在第 10d 以后， 是质粒 DNA 释放的后期， 到第 16d 质粒 DNA 的释放达到 93.14％。因此， 本发明方法制备的 DNA 疫 苗纳米粒可实现药物的缓释。
本发明方法具有工艺简便、 制备成本低、 工艺重现性好、 样品需要量少， 较好保持 了 DNA 疫苗的活性等优点， 试验筛选的 pDNA-PLGA-NPs 的制备方法也可放大到生产应用， 因 而对产业化的应用具有指导意义。
本发明 pDNA-PLGA-NPs 可用于鸡新城疫免疫， 经口服给药， 给药量为 200μg 质粒 DNA。 附图说明 图 1 是具体实施方式一中 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒的透射电子显微镜观察图 ；
图 2 是具体实施方式一中 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒的粒径分布图 ；
图 3 是具体实施方式一中 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒的 Zeta 电位图 ；
图 4 是具体实施方式一中 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒的体外释放曲线图 ；
图 5 是具体实施方式一中 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒抗 DNase I 降解的电泳图， 1 泳道为 Markers， 2 泳道为未被包裹的裸 DNA， 3-6 泳道为 pDNA-PLGA-NPs 所包裹的 DNA ；
图 6 是具体实施方式一中 Western-blotting 检测目的蛋白的表达的电泳图， 1泳 道为 Markers， 2 泳道为转染后处理的 pDNA-PLGA-NPs， 3 泳道为质粒 pVAX1-F(o)， 4 泳道为 空白纳米粒， 5 泳道为未转染的 BHK 细胞。 具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。
具体实施方式一 ： 本实施方式 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒按以下步骤制备 ：
一、 称取 40mg 的聚乳酸 / 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 溶于 1mL 的二氯甲烷中， 待完全 溶解后加入 200μg 新城疫病毒 F48E9 株的 F 基因 DNA 质粒， 冰浴条件下超声乳化 30s， 得初 乳液， 然后加入 2mL 质量浓度为 2％的聚乙烯醇， 在冰浴条件下超声乳化 60s， 得复乳液 ；
二、 将复乳液逐滴加入到 10mL 质量浓度为 0.5％的聚乙烯醇中进行纳米粒固化并 挥发多余的二氯甲烷， 以 500r/min 匀速搅拌 5h， 得固化液 ；
三、 取 3000g 固化液 4℃离心 15min， 收集纳米粒， 然后用 ddH2O 洗涤 3 次， 经真空 冷冻干燥后即得 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒 ； 其中步骤一中新城疫病毒 F48E9 株的 F 基因 DNA 质粒的浓度为 0.5％ ； 步骤一中超声乳化的功率均为 50w。
本实施方式步骤一中新城疫病毒 F48E9 株的 F 基因 DNA 质粒的制备与纯化是按如 下步骤进行 ： 用限制性内切酶 EcoR V 和 Xba I 将新城疫病毒 F48E9 株的 F 基因真核表达质 粒 pVAX1-F(o) 进行双酶切， 将阳性质粒转化到 E.coli. 感受态细胞 DH5α 中， 过夜培养 12h 后， 随机挑取单菌落， 接种于 LB 液体培养基 ( 含 Kana 抗性 ) 中， 37℃空气浴摇床培养 16h， 以备大提质粒用。 采用碱裂解法大量提取质粒 DNA， 质粒的大量提取和纯化参见 《Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(3rd ed)》 质粒 DNA 大量制备的 SDS 碱裂解法和聚乙二醇 (PEG8000) 纯化方法， 并进行适当改进。真核表达质粒 pVAX1-F(o) 由中国农业科学院哈尔滨 兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室构建和保存。碱裂解法大量提取质粒 DNA 具体步 骤如下 ：
1) 挑取生长于 LB 平板上的单个菌落接种于 5mL 液体 LB 培养基 ( 含 Kana， 100μg/ mL) 中， 37℃振荡培养过夜到对数晚期 OD600 值为 0.6 ；
2) 按 1/1000 的比例将细菌培养物转接到 1000mL LB 液体培养基中， 37℃、 300r/ min 震荡培养 16h， 留 1mL 菌液用于小提质粒鉴定 ；
3) 将菌液 4℃、 6000r/min 离心 8min， 细菌沉淀用 300mL 预冷的 STE 振荡重悬， 4℃、 6000r/min 再次离心 8min ；
4) 将洗过的细菌沉淀物重悬于 100mL 溶液 I 中， 剧烈振荡， 加入 0.05g 溶菌酶粉 末， 轻轻混匀， 放入 37℃水浴锅中温浴 ；
5) 加入 100mL 新鲜配制的溶液 II( 现用现配 )， 反复轻轻颠倒混匀， 室温作用 8min。此时拿出的溶液澄清 ；
6) 加入 100mL 冰预冷的溶液 III， 温和振荡数次， 使溶液 III 分散均匀， 此时可看 到有白色沉淀析出， 冰上静置 30min， 4℃、 9000r/min 离心 30min ；
7) 用 4-6 层纱布将离心后的上清过滤至另一个离心瓶中， 加入 0.6 倍体积的异丙 醇， 混匀充分， 室温放置 10min， 22℃、 9000r/min 离心 30min ；8) 弃上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀和管壁， 干燥后用 10mL TE(pH8.0) 溶解 ； ( 可 4℃过夜 ) 9) 将溶有粗 DNA 的 TE 溶液转入另一离心管中， 加入 10mL( 与 TE 等体积 ) 冰预冷 的 5mol/L 的 LiCl， 充分混匀， 4℃、 10000r/min 离心 15min ； ( 去除高分子 RNA 和杂蛋白 )
10) 将上清转移至另一管中， 再加入等体积的异丙醇， 充分混匀， 室温静置 15min， 22℃、 10000r/min 离心 15min ；
11) 弃上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀和管壁， 待沉淀干燥后用 10mL TER(RNase 浓度 为 25mg/mL) 溶解 ； ( 消化污染的小 RNA， 可 4℃过夜 )
12) 加入等体积 PEG-NaCl， 混匀， 4℃、 10000r/min 离心 15min ； ( 沉淀出大分子质 粒 DNA， 使小分子量 DNA 和 RNA 留在上清中 )
13) 弃上清， 用 10mLTE 溶解质粒 DNA ；
14) 加等量的酚、 酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25/24/1)、 氯仿各抽提一次， 22 ℃、 10000r/ min 离心 15min ； ( 除去蛋白 )
15) 轻轻吸取上层水相溶液至另一离心管中， 加入 1/10 体积的 3mol/L pH5.2 NaAC， 再加 2.5 倍体积的冰预冷的无水乙醇沉淀 DNA 2h 以上或过夜 ；
16)4℃、 10000r/min 离心 30min， 弃上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀一次， 离心弃上清 ；
17) 在超净台中通风干燥后， 用 1mL TE(pH8.0) 溶解 DNA 沉淀 ；
18) 用 TE 稀释到适当浓度后测 OD260 并计算质粒 DNA 浓度 ； 在 EP 管上标记好浓度 和日期后放 -20℃保存原液。
本实施方式方法制备的 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒 ( 简称 ： pDNA-PLGA-NPs) 在 -20℃条件下保存 3 个月， 然后透射电镜观察 ( 如图 1 所示 )， 形态完整呈圆球形， 表面光 滑， 分散性较好， 无明显的粘连、 塌陷等现象， 粒径为 (433.5±7.5)nm( 如图 2 所示 )， 粒径分 散度为 0.41。Zeta 电位分析本发明制备的 pDNA-PLGA-NPs 的 Zeta 电位为 +2.7mV( 如图 3 所示 )。
本实施方式制备的 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒， 包封率测定， 在制备纳米粒前， 将 质粒 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳， 经与 DNA 标准分子 Marker 比较准确测定新城疫 DNA 疫苗质 粒含量， 此为投入的总药量。吸取 50μL 纳米粒固化后的离心上清液， 经琼脂糖凝胶电泳测 定上清中的 DNA 含量， 确定未包裹进纳米粒的质粒 DNA 含量。PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒 的包封率的计算公式如下 ：
总 DNA 含量 (μg) ＝ DNA 浓度 × 体积
未包裹的 DNA 含量 (μg) ＝上清中 DNA 浓度 × 体积
包封率 (％ ) ＝ ( 总 DNA 含量 - 未包裹的 DNA 含量 )/ 总 DNA 含量 ×100％
本实施方式制备的 pDNA-PLGA-NPs 的包封率平均为 91.8±0.3％。
本实施方式制备的 DNA 疫苗纳米粒在保证 DNA 疫苗稳定性的条件下具有较高的包 封率， 可以保持体内最佳的药物浓度， 体外释放试验结果 ( 如图 4 所示 ) 表明， 在前两天质 粒释放速度很快， 质粒释放量占总包裹量的 31.25％ ； 在第 2d 到第 10d 间， pDNA-PLGA-NPs 中的质粒 DNA 每天的释放量达到包裹总量的 4.53％ ； 在第 10d 以后， 是质粒 DNA 释放的后 期， 到第 16d 质粒 DNA 的释放达到 93.14％。因此， 本实施方式制备的 DNA 疫苗纳米粒可实 现药物的缓释。
本实施方式通过 1％琼脂糖凝胶电泳检测 PLGA 新城疫 DNA 疫苗纳米粒抗 DNase I 降解， 结果是未被包裹的裸 DNA 经 DNase I 作用 30min 后即被完全降解， 而 pDNA-PLGA-NPs 所包裹的 DNA 即使作用时间长至 3h 也能保持其完整性， 说明纳米粒的包裹能抵抗 DNase I 的降解， 起到了保护作用 ( 如图 5 所示 )。
通过间接免疫荧光试验和 Western-blotting 检测 pDNA-PLGA-NPs 体外表达 ：
(1)pDNA-PLGA-NPs 的脂质体转染
将单层 BHK 细胞用胰酶消化下来后， 以适当密度接种于六孔细胞培养板内， 37℃、 5％ CO2 培养至 70％ -80％状态。 此时吸去培养液， 用不含抗生素和血清的新鲜 DMEM 培养基 洗涤细胞， 洗 2 遍， 待用。将纳米粒中的质粒 DNA 提取出来， 以质粒 DNA pVAX1-F(o) 作为阳 TM 性质粒分别在脂质体 Lipofectamine 2000 介导下转染 BHK 细胞。具体操作步骤按照说明 书进行。取 4.0μg 质粒加入 300μL 不含血清和抗生素优化的 DMEM， 此为 A 液 ； 将 10μL 脂 质体加入到另一装有 300μL 优化 DMEM 的 EP 管中， 此为 B 液 ； A、 B 液分别静置 2-3min 后， 将 A、 B 液轻轻混合， 室温静置 30min( 不可超过 45min， 否则脂质体会对质粒有毒害作用 )。 将混合液加入到之前准备好的细胞培养孔中， 前后左右轻轻晃动混匀， 于 37℃、 5％ CO2 培养 5h 后， 弃去培养物， 换成含 1％ GIBCO 血清和适量抗生素的 DMEM 维持培养基， 继续培养。同 时， 以空白纳米粒和空白细胞作为阴性对照。 再采用间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。具体操作步骤如下 ： 1) 将转染后 培养 72h 的细胞培养液弃掉， 用 PBS 缓冲液 (pH 7.4) 洗涤 2 次， 每次轻轻晃动 5min ； 2) 用 中性甲醛固定 10min 后再用 PBS 洗 3 次 ； 3) 加入 1mL 1/100 稀释的 NDV 阳性血清， 37℃作 用 1h， PBS 洗涤 3 次， 每次 5min ； 4) 加入 FITC 标记的二抗 (1/5000 稀释 )37℃继续作用 1h， 再用 PBS 洗涤三次每次 5min ； 5) 加入适量甘油 - 水 (1/9)， 荧光显微镜下观察目的蛋白表 达情况。试验结果是从 pDNA-PLGA-NPs 中提取出的质粒 DNA 和阳性质粒 pVAX1-optiF 均能 观察到特异性荧光， 转染的空白纳米粒和未转染的细胞均没有检测到荧光。
(2)Western-blotting 检测目的蛋白的表达
BHK 细 胞 转 染 后 72h， 收 集 细 胞， 用 PBS 洗 涤 1 次， 在细胞沉淀中加入适量 2×SDS-PAGE 上样缓冲液， 沸水浴煮沸 8min， 进行 SDS-PAGE 分离蛋白。试验结果是转染后 处理的 pDNA-PLGA-NPs 和质粒 pVAX1-F(o) 都能检测到相同大小的蛋白， 与预期结果一致， 蛋白分子大小约为 58kDa ； 而空白纳米粒和未转染的 BHK 细胞均没有检测到目的蛋白的表 达 ( 如图 6 所示 )。
用 CCK-8 试剂盒 ( 购自 Dojindo 公司 ) 测定本实施方式制备的 pDNA-PLGA-NPs 递 送系统的安全性评价 ： 将 BHK 细胞用含血清的 DMEM 培养基稀释成 2×106 个 /mL 细胞悬液， 以每孔 100μL 的量加入到 96 孔培养板中， 37℃培养 5h ； 之后， 向每孔加入被 DMEM 培养基 稀释过的 pDNA-PLGA-NPs， 37℃、 5％ CO2 继续培养过夜， 第 2d 向每孔加 10μL CCK-8 试剂培 养 5h ； 最后于 450nm 波长条件下测定各孔的吸光值， 计算细胞存活率 (％ )。
细胞存活率 (％ ) ＝ [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
As ： 试验孔 ( 含有细胞的培养基、 CCK-8、 纳米粒混悬液 )
Ab ： 对照孔 ( 含有细胞的培养基、 CCK-8)
Ac ： 空白孔 ( 不含细胞和纳米粒混悬液的培养基、 CCK-8)
实验结果测得细胞的存活率为 (80.14±8.27)％， 表明制备的 pDNA-PLGA-NPs 的
细胞毒性较小， 构建的新城疫 DNA 疫苗 PLGA 纳米粒黏膜免疫递送系统具有较高的安全性。
通过 SPF 鸡免疫接种试验， 检测本实施方式制备的 pDNA-PLGA-NPs 的免疫效果。 检 测步骤如下 ：
将 2 周 龄 SPF 鸡 随 机 分 为 7 组， 每 组 25 只。 分 组 情 况 见 表 1。 其 中， 裸 DNA pVAX1-F(o) 质粒含量为 200μg， 根据包封率的换算使载 DNA 纳米粒组免疫的质粒 DNA 含 量也为 200μg。肌肉注射组采用股四头肌多点注射 ； 一免后两周以后以相同的剂量加强免 疫， 第 7 组首免采用滴鼻免疫法， 加强免疫时用相同的剂量进行肌肉注射。分别于一免后第 13d 和第 27d， 每组各取 3 只鸡剖杀， 取脾做淋巴细胞增殖试验。整个免疫效果的考察持续 监测到一免后第 49d。
表 1 免疫分组
组号 1 2 3 4 5 6 7
组别 PBS 空白纳米粒 空白纳米粒 pVAX1-F(o) pDNA-PLGA-NPs pDNA-PLGA-NPs pDNA-PLGA-NPs 免疫方式 肌肉注射 (i.m.) 肌肉注射 (i.m.) 滴鼻免疫 (i.n.) 肌肉注射 (i.m.) 肌肉注射 (i.m.) 滴鼻免疫 (i.n.) 滴鼻免疫 / 肌肉注射 (i.n./i.m.)免 疫 鸡 脾 淋 巴 细 胞 增 殖 反 应 试 验 结 果 ( 见 表 2) 表 明， 和 对 照 组 PBS、 肌注 pDNA-PLGA-NPs 以及滴鼻免疫 pDNA-PLGA-NPs 相比， 其余各免疫组均对 Con A 表现出较 明显的刺激反应。特别是在一免后第 28d， 即二免后两周， pDNA-PLGA-NPs 联合免疫组、 pDNA-PLGA-NPs 滴鼻组以及 pDNA-PLGA-NPs 肌注组免疫鸡脾细胞的增殖反应极显著于裸 DNApVAX1-F(o) 肌注组 (p ＜ 0.01)。一免后第 28d， pDNA-PLGA-NPs 滴鼻组免疫鸡脾细胞增 殖反应要显著增强于肌注组 (p ＜ 0.05)。
表 2 鸡免疫后脾淋巴细胞增殖反应
注： 同一列数据中右上角无相同小写字母者表明组间差异显著 (p ＜ 0.05) ； 无相 同大写字母者表示组间差异极显著 (p ＜ 0.01)
免疫后血清特异性 IgG 抗体变化 ： 免疫后两周抗体效价仍处于一个较低的水平 ； 加强免疫后一周， 抗体效价上升幅度较快， pVAX1-F(o) 肌肉注射组， 即阳性对照组在一免 后第 28d 达到最高水平， 与其他免疫组和阴性对照组相比有极显著差异 (p ＜ 0.01) ； 而 pDNA-PLGA-NPs 滴鼻组抗体水平在一免后第 28d 开始上升， 并在第 35d 达到最高峰， 与阳性 对照 pVAX1-F(o) 相比差异显著 (p ＜ 0.05) ； pDNA-PLGA-NPs 首免滴鼻， 加强免疫为肌肉注 射组在第 35d 达到最高峰， 并能持续较高抗体 IgG 水平至一免后第 49d， 极显著高于阳性对 照组 (p ＜ 0.01)。
免疫后血清中 IgA 含量变化 ： 每周所采的血清中各免疫组 IgA 抗体含量差距不 大， 但都极显著高于阴性对照组 (p ＜ 0.01)。pVAX1-F(o) 肌肉注射组和联合免疫组动态 变化规律差不多， 均在一免后第 28d 达到最高峰， 并能保持较高水平至一免后第 49d。而 pDNA-PLGA-NPs 滴鼻组血清中 IgA 抗体含量增长速度较慢， 到一免后第 28d 才明显的增长， 在第 35d 达到 IgA 抗体含量的最高峰。
SPF 鸡体内免疫试验结果表明， 新城疫 DNA 疫苗 PLGA 纳米粒黏膜免疫比肌肉注射 更能活跃地激活黏膜免疫应答部位， 产生高水平的特异性 IgG 和 IgA， 说明纳米粒黏膜免 疫递送系统不仅在黏膜局部产生免疫应答， 还可引起全身性的体液免疫应答和细胞免疫应 答。
间接 ELISA 法测定本实施方式制备的 pDNA-PLGA-NPs 免疫血清中特异性 IgG 抗体 水平 ：
步骤 ： 首先， 将待测血清 1/100 倍稀释， 加入到已经包被好的 96 孔板中， 同时设 立阳性和阴性对照孔， 37℃温育 30min， 用 PBS(pH 7.4) 洗涤 4 次 ； 每孔加入试剂盒提供的
羊抗鸡酶标二抗 100μL， 37℃继续温育 30min， 再用 PBS 洗涤 4 次 ； 然后， 向每孔加 100μL TMB 底物显色剂， 室温避光孵育 15min ； 最后， 用 100μL 终止液 (2mol/L H2SO4) 终止反应， 在 650nm 波长下测量并记录 OD650nm 值。实验结果表明， 经 PLGA 纳米粒包裹后的 DNA 疫苗， 产生 的结合抗体水平有了显著的提高， pDNA-PLGA-NPs 组体液免疫明显高于裸新城疫 DNA 疫苗 组且抗体水平持续时间长起到了缓释的作用。
间接 ELISA 法检测本实施方式制备的 pDNA-PLGA-NPs 免疫血清中 IgA 抗体 ： 方法 如下 ： 将上清以 1/100 倍浓度稀释加入到包被好的 96 孔板中， 37℃孵育 1h， 用 PBST 洗 5 遍， 每次 5min ； 每孔加 100μL 稀释好的 HRP 标记羊抗鸡 IgA， 37℃孵育 1h， 用 PBST 洗 5 遍， 每 次 5min ； 每孔加 100μL TMB 显色液， 室温避光孵育 15min 后， 每孔加 100μL 终止液 (2mol/ L H2SO4) 终止显色反应， 450nm 波长下测定 OD450 值。同时， 加入 IgA 标准梯度稀释液绘制标 准曲线。实验结果表明， pDNA-PLGA-NPs 能刺激特异性 B 细胞， 并且增强体液免疫应答， 从 而提高抗体滴度。
具体实施方式二 ： 本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中聚乳酸 / 羟基 乙酸共聚物的分子量为 40000 ～ 75000， LA/GA ＝ 50/50， 特异性粘度为 0.37dL/g。其它步 骤及参数与具体实施方式一相同。