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1、(10)申请公布号 CN 103087194 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103087194 A *CN103087194A* (21)申请号 201210591562.9 (22)申请日 2012.12.30 C07K 16/40(2006.01) C07K 16/02(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 39/02(2006.01) (71)申请人 浙江中医药大学 地址 310053 浙江省杭州市滨江区滨文路 548 号 (72)发明人 范永升 蒋福升 丁志山 刘翔宇 吕迪 潘平 毛建洋 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限。
2、公 司 33201 代理人 黄美娟 王兵 (54) 发明名称 一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗 体， 所述抗体按如下方法制备 ： 基于血循型蛇毒 锌离子金属蛋白酶活性结构域序列， 合成蛇毒锌 离子金属蛋白酶活性结构域多肽 ； 将多肽与载体 偶联、 缀合或融合， 制备抗原肽复合物 ； 将抗原肽 复合物注入母鸡体内进行免疫， 连续收集鸡蛋 ； 从收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体， 即获得 所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体 ； 本发明所述抗血 循型蛇毒鸡卵黄抗体产率高、 成本低 ； 所得到的 抗体安全性高、 稳定性好、 过敏性不良反应小 ； 可 以做。
3、成口服制剂或注射剂 ； 可用于具有血循毒性 蛇毒咬伤治疗， 尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬 伤治疗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103087194 A CN 103087194 A *CN103087194A* 1/1 页 2 1. 一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体， 其特征在于所述抗体按如下方法制备 ： （1） 基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列， 合成蛇毒锌离子金属蛋白酶 活性结构域多肽 ； 所述多肽的氨基酸序列为 C。
4、XnHEXXHXXGXXHXn或 XnHEXXHXXGXXHXnC， 其中 X 为除半胱氨酸以外的任何氨基酸， n 是包括零的任何正整数 ； （2） 将步骤 （1） 中的多肽与载体偶联、 缀合或融合， 制备抗原肽复合物 ； （3） 母鸡免疫 ： 将步骤 （2） 中的抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫， 连续收集鸡蛋 ； （4） 从步骤 （3） 收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体， 即获得所述抗血循型蛇毒鸡卵黄 抗体。 2.如权利要求1所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体， 其特征在于所述n是020之间的任何 正整数。 3. 如权利要求 1 所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体， 其特征在于所述载体包括蛋白或脂 类。 。
5、4. 如权利要求 1 所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体， 其特征在于步骤 （3） 按如下方法进行 ： 将步骤 （2） 中制备的抗原肽复合物与等体积福氏完全佐剂在室温下混合乳化， 然后于母鸡 皮下多点注射进行首次免疫， 首次免疫抗原肽复合物的用量为 0.13 mg/ 只， 首次免疫 12 周后进行第一次加强免疫， 抗原肽复合物的用量为0.13 mg/只， 首次免疫24周后进行第 二次加强免疫， 抗原肽复合物的用量为 0.13 mg/ 只， 后续每间隔 34 周免疫一次， 抗原肽 复合物的用量为 0.13 mg/ 只， 并于初次免疫 3 周后开始连续收集鸡蛋。 5. 一种权利要求 1 所述抗血循型蛇毒鸡。
6、卵黄抗体在制备抗血循型蛇毒药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103087194 A 2 1/6 页 3 一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体及其应用 （一） 技术领域 0001 本发明涉及一种血循型蛇毒鸡卵黄抗体 （Immunoglobulin-yolk， IgY） 及制备方法 与应用。 具体而言， 是基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性基序多肽免疫， 制备抗血循型 蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法。 （二） 背景技术 0002 长久以来， 毒蛇咬伤给人们的生产生活带来了严重危害， 据世界卫生组织网站公 布的数字显示 ： 全世界每年被蛇咬伤的人数有 250 多万人， 导致死亡人数高达 12.5 万人。 我。
7、国每年毒蛇咬伤患者达10多万人次， 其中约73为中青年， 死亡率为510， 蛇伤致 残丧失劳动能力者占 25 30。可见毒蛇是危害人类健康的一个重要生物安全隐患， 必 须采取相关措施， 降低或消除相关风险。 0003 注射抗蛇毒血清是目前世界公认的最有效的治疗方法， 但蛇毒本身成分复杂， 含 有数百种功能各异的蛋白质， 用全毒免疫产生的抗蛇毒血清不仅含有能中和毒素成分的 抗体， 也含有大量针对蛇毒中其他非毒素成分的抗体。这不仅使得抗血清的临床使用剂 量大大增加， 增加了过敏反应概率， 也浪费了宝贵的血清资源 （Wagstaff S C, Laing G D, Theakston R D, et。
8、 al. Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom. PLoS Med, 2006, 3:184.） 。 如果能够将蛇毒中的主 要毒性致死成分分离、 纯化， 制备单克隆抗体， 则其中和相应蛇毒蛋白能力将极大提高， 抗 体用量减少， 不良反应也可相应减少， 而且其抗体生产成本也将极大降低， 质量也可得到稳 定控制。 检索相关文献， 已有不少有关蛇毒蛋白单克隆抗体的成功制备 （尹惠琼. 利用噬菌 体展示文库技术制备抗蛇毒 ScFv 抗体 . 云南大学 ,2004 硕士论文 。
9、.; 李丽红等 . 眼镜王 蛇毒单克隆抗体的制备 . 细胞与分子免疫学杂志 ,2009,25(3):236-238. 等） 但绝大部分 仅局限于毒蛇分类鉴定和基础理论研究上 ； 这极可能是由于蛇毒毒性成分的多样性 （贾艳 等 . 蛇毒的毒性成分及其应用研究 . 蛇志 ,2004,16(2):23-32.） ， 因此至今几乎没有一种 单克隆抗体能够完全中和某种蛇毒毒性。 0004 尖吻蝮蛇 ( Deinagkistrodon acutus) 是我国常见的毒蛇， 属于蝰科蝮亚 科， 又名五步蛇 （浙江） ， 棋盘蛇 （福建） ， 百步蛇 （台湾） ， 主要栖息于越南北部， 老挝和中 国南部地区， 。
10、其毒液主要为血循毒 （Li QB, Yu QS, Huang GW, et al. Hemostatic disturbances observed in patients with snakebite in south China. Toxicon. 2000, 38(10):1355-1366. Chen CC, Yang CM, Hu FR, et al. Penetrating ocular injury caused by venomous snakebite. Am. J. Ophthalmol. 2005, 140(3): 44- 546.） 。患 者被咬伤后， 伤口局部红肿、 。
11、疼痛剧烈， 流血不止， 肿胀迅速， 毒素向肢体上端蔓延， 常有水 泡、 淤斑出现。中毒严重者还会出现血压下降、 心律失常、 少尿、 无尿， 最后因循环衰竭而 导致死亡。研究表明， 蛇毒金属蛋白酶 （Wagstaff S C, Laing G D, Theakston R D, et al. Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom. PLoS Med, 2006, 3:184） 是引起出血、 致死等症状的主要物质， 它们有的干扰 说 明 书 CN 103087194 A。
12、 3 2/6 页 4 伤口血液的凝结和血栓的形成， 有的则降解胞外基质或基底膜， 可占总蛇毒蛋白的 60% 以 上， 是蛇毒蛋白中的主要成分 ； 能够有效中和这些金属蛋白酶， 则基本可以有效缓解五步蛇 毒对机体的损伤。 0005 研究表明， 蛇毒金属蛋酶和哺乳动物基质金属蛋白酶一样， 它们都是金属锌蛋 白， 有一个锌结合域 HEXXHXXGXXH。自 1950 年以来， 已有 150 多种蛋白酶 （其中有 100 多 种毒金属蛋白酶） 从蛇毒中纯化出来， 其中有超过 40 种 （20 多种是金属蛋白酶） 的氨基酸 全序列被测定。根据已报道的蛇毒金属蛋白酶的 cDNA 序列和蛋白质的结构， 将蛇。
13、毒金属 蛋白酶分成 4 类 ： 其中 PI 类仅含金属蛋白酶域 （metalloproteinase domain） ， 分子量 20 30kDa ； PII 类含金属蛋白酶域和去整合素域 （disintegrin domain） ， 分子量 30 50kDa ； PIII 类含金属蛋白酶域、 去整合素域和富半胱氨酸域 （cysteine-rich domain） ， 分子量 50 80kDa ； PIV 类在 PIII 类基础上多了二硫键连接的类 C 型凝集素域 （C-type lectin domain） （Cynthia Tallant, Aniebrys Marrero, F.Xavi。
14、er Gomis-Rth. Matrix metalloproteinases: Fold and function of their catalytic domains. Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1803:20-28） 。 0006 金属蛋白酶域是四类蛇毒金属酶类的共有部分。 对比分析各蛇毒金属蛋白酶域结 果表明， HEXXHXXGXXH 序列是酶活性中心的高度保守序列。为此， 理论上而言， 将该保守序 列作为抗原肽免疫动物可以得到针对该类抗原位点的特异性抗血清， 而该抗血清极可能均 能够与上述各类蛇毒金属蛋白发生交叉反应， 起到中和蛇毒毒性。
15、作用。而由于免疫动物所 用抗原肽的单一性， 其制备所得抗血清抗体成分相对单一， 可减少抗血清用量， 减少不良反 应 ； 同时， 基于这一抗原肽， 可以进一步筛选建立有效的单克隆抗体制剂。 （三） 发明内容 0007 本发明目的是提供一种基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列作为 抗原肽， 免疫母鸡制备抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法 ； 该方法抗体产率高、 成本低 ； 所得到的抗体安全性高、 稳定性好、 过敏性不良反应小 ； 可以做成口服制剂和注射剂 ； 可用 于具有血循毒性蛇毒咬伤治疗， 尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤治疗。 0008 本发明采用的技术方案是 ： 0009 本发明提供一。
16、种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体， 所述抗体按如下方法制备 ： 0010 （1） 基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列， 合成蛇毒锌离子金属蛋 白酶活性结构域多肽 ； 所述多肽的氨基酸序列为CXnHEXXHXXGXXHXn或XnHEXXHXXGXXHXnC， 其 中 X 为除半胱氨酸以外的任何氨基酸， n 是包括零的任何正整数 ； 0011 （2） 将步骤 （1） 中的多肽与载体偶联、 缀合或融合， 制备抗原肽复合物 ； 0012 （3） 母鸡免疫 ： 将步骤 （2） 中的抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫， 连续收集鸡 蛋 ； 0013 （4） 从步骤 （3） 收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体。
17、， 即获得所述抗血循型蛇毒鸡 卵黄抗体。 0014 进一步， 优选所述 n 是 020 之间的任何正整数。 0015 进一步， 所述载体包括蛋白或脂类。更优选所述载体为 ： 钥孔血蓝蛋白 （keyhole Limpet Hemocyanin） 、 人血清白蛋白 （Human Serum Albumin） 、 牛血清白蛋白 （Bovine 说 明 书 CN 103087194 A 4 3/6 页 5 Serum Albumin） 、 牛甲状腺球蛋白 （Bovine Thyroglobulin） 、 鸡卵白蛋白 （Ovalbumin） 及其 他 球蛋白等蛋白载体 ； 另有重组载体可以为多聚赖氨酸 。
18、（Poly-L-Lysine） 、 二软脂酰赖 氨酸 （Dipalmitoyl-Lysine） 、 多聚谷氨酸 （Poly-Glutamic acid） 及其他多聚混合氨基 酸等。 0016 进一步， 步骤 （3） 按如下方法进行 ： 将步骤 （2） 中制备的抗原肽复合物与等体积福 氏完全佐剂 （Freunds complete adjuvant） 在室温下混合乳化， 然后于母鸡皮下多点注射 进行首次免疫， 首次免疫抗原肽复合物的用量为0.13 mg/只 （优选1mg/只） ， 首次免疫12 周后进行第一次加强免疫， 抗原肽复合物的用量为 0.13 mg/ 只 （优选 0.5mg/ 只） ， 。
19、首次免 疫24周后进行第二次加强免疫， 抗原肽复合物的用量为0.13 mg/只 （优选0.5mg/只） ， 后 续每间隔34周免疫一次， 抗原肽复合物的用量为0.13 mg/只 （优选0.5mg/只） ， 并于初次 免疫 3 周后开始连续收集鸡蛋。首次免疫之后的每次加强免疫或免疫均用步骤 （2） 中制备 的抗原肽复合物与等体积福氏不完全佐剂在室温下混合乳化后于母鸡皮下进行多点注射。 0017 本发明步骤 （4） 所述从收集的鸡蛋中提取鸡卵黄抗体的方法及分离纯化方法为本 领域公知技术， 可以采用硫酸铵沉淀法、 聚乙二醇沉淀法、 柱层析法及相关商品化试剂盒等 纯化方法。 0018 本发明还涉及一种。
20、所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体在制备抗血循型蛇毒药物中的 应用。 0019 所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体可对血循型毒蛇咬伤进行治疗， 可以通过口服或注 射给药， 优选为注射给药。抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体用量优选 410 mg/kg 体重。 0020 与现有技术相比， 本发明有益效果主要体现在 ： 本发明所述抗血循型蛇毒鸡卵黄 抗体产率高、 成本低 ； 所得到的抗体安全性高、 稳定性好、 过敏性不良反应小 ； 可以做成口 服制剂或注射剂 ； 可用于具有血循毒性蛇毒咬伤治疗， 尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤 治疗。 （四） 附图说明 0021 图 1 ： M15 多肽 HPLC 图 ； 0022 图 2 。
21、： M15 多肽质谱图 ； 0023 图 3 ： IgY 样品 SDS-PAGE 电泳图 ； 0024 图 4 ： 小鼠皮下出血毒性实验结果 ： A 为五步蛇蛇毒皮下出血毒性实验结果 ； B 为 蝮蛇蛇毒皮下出血实验结果 ； 图中 0 是指蛇毒加免疫前的 IgY 50g 注射点， D1 是指蛇毒加 免疫后的 IgY50g 注射点， D2 是指蛇毒加免疫后的 IgY 25g 注射点， D3 是指蛇毒加免疫 后的 IgY 10g 注射点， D4 是指蛇毒加免疫后的 IgY 5g 注射点， D5 是指蛇毒加免疫后的 IgY 2.5g 注射点。 （五） 具体实施方式 0025 下面结合具体实施例对本发。
22、明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0026 如未特别指明之处， 可根据本领域技术人员所熟悉的 Making and Using Antibodies: A Practical Handbook （CRC Press， Florida， 2006） 、抗体制备与使用实验 说 明 书 CN 103087194 A 5 4/6 页 6 指南 （科学出版社， 北京， 2010 年） 等手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实 施。另外， 实施例中所使用的材料除有特别说明外， 均可通过商业途径从市场上购买。 0027 实施例 1 ： 基于蛇毒锌离子金属蛋白酶活性基序的新型抗血。
23、循型蛇毒鸡卵黄抗体 制备 0028 1、 多肽的合成及偶联 0029 通过对多种蛇毒金属蛋白酶 （如， Acutolysin A、 Acutolysin F、 Acutolysin E、 Aculysin 2、 Metalloprotease H1、 Metalloprotease H2、 Metalloprotease H3、 Metalloprotease H4 和 Metalloprotease H5） 催化结构域氨基酸序列进行对比分析， 确定 合成以下多肽序列 （M15） ： CAHEMAHNLGVRHDE， 并提交杭州聚成生物技术有限公司合成多肽， HPLC 和 MS 鉴定结果如图 。
24、1、 2 所示。然后通过碳二亚胺法将该多肽偶联至钥孔血蓝蛋白 （keyhole limpet hemocyanin， KLH， 购自 sigma 公司） ， 形成抗原肽复合物 KLH-M15。 0030 2、 母鸡免疫 0031 将上述抗原肽复合物 KLH-M15 与等体积福氏完全佐剂 （购自 MP Biomedicals） 在 室温下混合乳化， 取 22 周龄的莱杭母鸡， 于母鸡皮下多点注射上述福氏完全佐剂乳化的抗 原肽复合物 KLH-M15 进行初次免疫， 初次免疫 KLH-M15 量为 1.0mg/ 只 ； 2 周后用福氏不 完全佐剂 （购自 MP Biomedicals） 乳化的抗原肽。
25、复合物 KLH-M15 加强免疫一次， KLH-M15 用量为 0.5mg/ 只 ； 4 周后进行第二次加强免疫 （福氏不完全佐剂乳化的抗原肽复合物 KLH-M15） ， KLH-M15 用量为 0.5mg/ 只 ； 之后每隔 4 周免疫一次 （福氏不完全佐剂乳化的抗原 肽复合物 KLH-M15） ， 每次 KLH-M15 量为 0.5mg/ 只 ； 并于第一次免疫 3 周后连续收集鸡蛋， 置于 4保存备用 ； 同时留取免疫前鸡蛋作为阴性对照。 0032 3、 抗体提取 0033 采用聚乙二醇沉淀法从步骤 2 收集的鸡蛋中提取、 纯化抗蛇毒鸡卵黄抗体 （IgY） （Pauly D, Chaca。
26、na PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.IgY technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. J Vis Exp. 2011(51). doi:pii:3084.10.3791/3084.） ： 取卵黄， 加入 2 倍卵黄体积 pH7.4 的 PBS 缓冲液， 混匀后加入终浓度为 3.5% 的 PEG6000（质量浓度） ， 冰浴振荡溶解 10min， 12 000g， 4离心 20min， 取上清 。
27、； 按照上清液体积， 加入 8.5%（质量浓度） 的 PEG6000， 冰浴振 荡溶解 15min， 12 000g， 4离心 20min， 去上清 ； 沉淀用 10ml pH7.4 的 PBS 溶解， 加入 12% （质量浓度） 的 PEG6000， 冰浴振荡溶解 15min， 12 000g， 4离心 20min， 去上清 ； 沉淀用 1ml pH7.4 的 PBS 溶解后用 14 000Da 截留量的透析袋于冰浴的 pH7.4 的 PBS 中透析过夜， 换 液 3 次。透析后的样品于 280nm 处测定吸光度值， 计算抗体 IgY 含量达 56.7mg/ml（计算 方法参照 ： Paul。
28、y D, Chacana PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.IgY technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.J Vis Exp. 2011(51). doi:pii:3084.10.3791/3084.） ； 样品于 -20保 存备用。 0034 4、 SDS-PAGE 检测 0035 采用 SDS-PAGE 法 （参见申请号 ： 200610035761.6） 对步骤 3 提取、 纯化的 IgY。
29、 样品 进行检测 ； 样品于 65kDa （重链） 和 25kDa （轻链） 处可见明显两个条带 （图 3 所示） ， 与相关文 献报道一致 （Pauly D, Chacana PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.IgY technology: 说 明 书 CN 103087194 A 6 5/6 页 7 extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.J Vis Exp. 2011(51). doi:pii:3084.10.37。
30、91/3084.） （见图 3） 。 0036 5、 ELISA 效价检测 0037 参照申请号 ： 200610035761.6 方法， 对步骤 3 制备的抗体样品与抗原肽复合物 KLH-M15 的效价及样品与五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的交叉免疫性进行了测定。结果表明， 样品 与 KLH-M15 的效价可达 32 万倍稀释度， 但其与五步蛇和蝮蛇蛇毒的交叉反应性均较差， 稀 释度分别只有 5 千倍和 2 千倍左右。 0038 6、 小鼠皮下出血试验 0039 选用ICR系健康雄性小白鼠， 随机分组， 每组10只。 实验组一 ： 将1.0mg/ml的五步 蛇毒液 10L 与 PBS（pH7.4） 溶解。
31、的不同稀释度的 IgY 样品 10L 在无菌 EP 管内混合 （见 表 1） ， 置 25恒温水浴箱中孵育 60min， 然后在脱毛小白鼠的背部进行皮下注射。实验组 二 ： 将 0.5mg/ml 的蝮蛇蛇毒液 10L 与 PBS（pH7.4） 溶解的不同稀释度的 IgY 样品 10L 在无菌EP管内混合 （见表1） ， 置25恒温水浴箱中孵育60min， 然后在脱毛小白鼠的背部进 行皮下注射。 18h后颈椎脱臼处死， 解剖， 拍照记录出血斑块长短径， 并采用IPP软件计算出 血面积及各抗血清对出血抑制率， 结果见表 1 和图 4 所示。 0040 0041 结果表明， 样品 IgY 体内对五步。
32、蛇毒和蝮蛇蛇毒出血毒性均具有较好的中和作 用， 其中对五步蛇毒中和活性较好， 50g IgY 样品可完全中和 10g 五步蛇蛇毒， 而同样剂 量只能中和 70% 左右蝮蛇蛇毒 （见表 1 和图 4） 。样品体外 ELISA 和体内出血毒性之间的显 著差异可能与蛇毒金属蛋白酶构象有关 （Tallant C, Marrero A, Gomis-Rth FX.Matrix metalloproteinases: fold and function of their catalytic domains.Biochim Biophys Acta. 2010,1803(1):20-28.） 。 0042 。
33、表 1 各样品对蛇毒引起的小鼠皮下出血抑制率 （%） 说 明 书 CN 103087194 A 7 6/6 页 8 0043 0044 7、 蛇毒中和试验 0045 选用 ICR 系健康雄性小白鼠， 随机分组， 每组 10 只。实验组一 ： 将 KLH-M15 免疫后 样品 IgY(10mg/kg 小鼠体重 ) 分别与 2 倍半数致死量 LD50剂量的五步蛇毒在无菌 EP 管内 混合， 置 25恒温水浴箱中孵育 60min， 然后小鼠腹腔注射 0.2ml， 记录给药后 24h 内小鼠 存活率。实验组二 ： 将 KLH-M15 免疫后样品 IgY(20mg/kg 小鼠体重 ) 分别与 2 倍半数。
34、致死 量 LD50剂量的蝮蛇蛇毒在无菌 EP 管内混合， 置 25恒温水浴箱中孵育 60min， 然后小鼠腹 腔注射 0.2ml， 记录给药后 24h 内小鼠存活率。分别以免疫前 IgY 样品作为对照。 0046 结果表明， 无论是五步蛇毒还是蝮蛇蛇毒， 给予KLH-M15免疫后的IgY样品的小鼠 全部存活， 而给予免疫前 IgY 样品的小鼠全部死亡。 说 明 书 CN 103087194 A 8 1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103087194 A 9 2/3 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 103087194 A 10 3/3 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103087194 A 11 。