诊断癌症的试剂及试剂盒.pdf

本发明涉及诊断癌症的试剂及试剂盒。本发明首次揭示5-羟甲基胞嘧啶(hmc)在组织中的存在情况与癌症的发生和发展密切相关，组织中hmc水平明显下降提示癌症的发生或发展；并且hmc水平的高低还能指示癌症的严重程度。因此，检测hmc的试剂可良好地应用于癌症的诊断、预后或分型，具有很高的临床应用价值。

权利要求书一种5‑羟甲基胞嘧啶用作检测癌症的标志物的用途。
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症包括：脑癌、鳞状上皮癌、乳腺癌、胃癌、肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、胸腺癌、精原细胞癌、肌肉瘤。
一种5‑羟甲基胞嘧啶的用途，用于制备检测癌症的试剂。
如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的检测癌症包括：确定癌症的严重程度或进行癌症的分型。
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的5‑羟甲基胞嘧啶与载体蛋白连接，用于制备检测癌症的试剂。
如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白。
一种抗原，其特征在于，所述抗原包含载体蛋白，以及连接于载体蛋白上的一个或多个5‑羟甲基胞嘧啶。
如权利要求7所述地抗原，其特征在于，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白。
权利要求7或8所述的抗原的用途，用于制备检测癌症的试剂。
一种特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶的试剂的用途，用于制备检测癌症的试剂盒。
如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的试剂是特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶的抗体。
一种多克隆抗体，其特异性地识别5‑羟甲基胞嘧啶。
如权利要求12所述的多克隆抗体，其特征在于，其制备方法为：用权利要求5所述的抗原免疫兔子，获取免疫血清，纯化后获得所述的多克隆抗体。
一种单克隆抗体，其特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶，其由保藏号为CCTCC No：C201191的杂交瘤细胞株产生。
一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNo：C201191。
一种用于检测癌症的试剂盒，其中包括特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶的试剂。

说明书诊断癌症的试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于医学领域；更具体地，本发明涉及诊断癌症的试剂及试剂盒。
背景技术
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，在哺乳动物中DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C)5位上的碳被甲基化修饰成5‑甲基胞嘧啶(5mC)。CpG二核苷酸是发生DNA甲基化主要的位点，它在基因组中呈不均匀分布。在一些区域，主要是基因的启动子和第一外显子区域，CpG高于正常概率，这些区段因此而被称为CpG岛。整个基因组范围内，约有60％以上基因的启动子区含有CpG岛。总体来说，在哺乳动物中5mC约占C总量的2‑7％，因此而有了“第五种碱基”之称。
DNA甲基化在正常和异常的生理活动中起着重要的作用。它可以抑制基因的表达，参与对染色体的结构维持，调节X染色体失活、基因印记、和转座子沉默等重要细胞功能。
TET1，全名Ten‑Eleven Translocation 1。Tet1是一个2‑OG，Fe++依赖性的5mC加氧酶，可以将5mC转变为5‑羟甲基胞嘧啶(5‑HydroxymethylCytosine)(hmc)。同时，在大脑细胞中也发现了hmc的存在。
TET1的生物学功能仍不知道，由于Tet1是从急性骨髓状白血病患者的十号衍生染色体中克隆出来的，而且易位至十一号染色体上，估计它与癌症发生发展有关，但Tet1在癌症中的作用仍不知道。
hmc是1952年在噬菌体中发现的。1972年发现hmc也存在于哺乳动物中，它存在于小鼠和青蛙的脑DNA中，也存在于大鼠的脑和肝脏中，在脑中hmc大约占总胞嘧啶的20％，在肝脏组织里占总胞嘧啶的6％(40)。目前现有技术中，还没有发现hmc与癌症的相关性。
发明内容
本发明的目的在于提供诊断癌症的试剂及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种5‑羟甲基胞嘧啶用作检测癌症的标志物的用途。
在一个优选例中，所述的癌症包括(但不限于)：脑癌(如胶质瘤)、鳞状上皮癌(如食管癌、皮肤癌、头颈癌等)、乳腺癌、胃癌、肠癌(如结肠癌、直肠癌)、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、胸腺癌、精原细胞癌、肌肉瘤。
在本发明的另一方面，提供一种5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)的用途，用于制备检测癌症的试剂。
在另一优选例中，所述的检测癌症包括：确定癌症的严重程度或进行癌症的分型。
在另一优选例中，所述的5‑羟甲基胞嘧啶与载体蛋白连接，用于制备检测癌症的试剂。
在另一优选例中，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
在本发明的另一方面，提供一种抗原，所述抗原包含载体蛋白(优选没有免疫原性的)，以及连接于载体蛋白上的一个或多个(如1‑100个；更特别地如5、10、12、13、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90个)5‑羟甲基胞嘧啶。
在另一优选例中，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
在本发明的另一方面，提供所述的抗原的用途，用于制备检测癌症的试剂。
在本发明的另一方面，提供一种特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)的试剂的用途，用于制备检测癌症的试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂是特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶的抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)。
在本发明的另一方面，提供一种多克隆抗体，其特异性地识别5‑羟甲基胞嘧啶。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体的制备方法为：用所述的抗原免疫兔子，获取免疫血清，纯化后获得所述的多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体的制备方法为：将所述的抗原与弗氏佐剂混合(较佳地1∶1混合)后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔1.5‑3周(较佳地2周)免疫1次，免疫2‑4次(较佳地3次)，从兔血清中分离多克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，其特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶，其由保藏号为CCTCC No：C201191的杂交瘤细胞株产生。
在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No：C201191。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测癌症的试剂盒，其中包括特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：显色剂等免疫组化试剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、MALDI‑TOF 4800质谱检测未偶联对照组BSA(下图)和偶联后产物hmc‑BSA(上图)的分子量。
图2、SDS‑PAGE分离偶联后产物(conju)、未偶联对照组BSA(Control，Ctrl)和未经过反应的BSA对照。
图3、MALDI‑TOF 4800质谱检测未偶联对照组OVA(control)和偶联后各种产物的分子量。U‑OVA、5mU‑OVA、A‑OVA、G‑OVA、hmc‑OVA分别是尿嘧啶、5‑甲基尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、和5‑羟甲基胞嘧啶偶联到OVA上。
图4、紫外分光光度分析游离的KLH、hmc、KLH和hmc偶联反应后产物的吸收峰，以判断偶联反应是否成功。
图5、免疫印迹检测hmc兔多克隆抗体HMC‑PA01的特异性。5mC或hmc(初始量分别为125纳克)以2倍递减量固定到膜上，与hmc兔多克隆抗体HMC‑PA01(上图)或5mC抗体(33 D3，Calbiochem，San Diego，CA)(中图)反应后，经过二抗和显色后显示：hmc的兔多克隆抗体HMC‑PA01只识别hmc，基本不识别5‑甲基胞嘧啶(5mC)(上图)。而5mC抗体只认识5mC，不识别hmc(中图)。Ponceau‑S显示各点含有稀释物质(下图)。
图6、免疫荧光染色检测hmc兔多克隆抗体HMC‑PA01的特异性。编码Tet1和GFP的质粒(mTET1‑ires‑GFP)被转入细胞中，用DAPI染每个细胞的细胞核(左上图)、hmc兔多克隆抗体HMC‑PA01染hmc(右上图)、5mC抗体染5mC(左下图)、绿色显示mTET1‑ires‑GFP转入的细胞(中下图)，Merge是四个图像重叠。
图7、hmc兔多克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES细胞(左图)、293T(control)(中图)、或转入Tet1的293T细胞(Tet1)分别用5mC抗体(5mC)或hmc抗体(hmc)进行免疫共沉淀，沉淀的DNA经Agarose胶分离后，用溴化乙锭染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗体对照。
图8、免疫印迹检测hmc鼠单克隆抗体MA7的特异性。5mC或hmc(初始浓度分别为5纳克)以10倍递减量固定到膜上，与hmc鼠单克隆抗体MA7(上图)、同时含有5mC抗体(33 D3，Calbiochem，San Diego，CA)和hmc鼠单克隆抗体MA7(中图)反应后，经过二抗和显色后显示：hmc的鼠单克隆抗体只识别hmc，不识别5mC(上图)。而5mC抗体认识5mC(中图)。Ponceau‑S显示各点含有稀释物质(下图)。
图9、免疫荧光染色检测hmc鼠单克隆抗体MA7的特异性。编码Tet1和GFP的质粒(Tet1‑Ires‑GFP)被转入细胞中，用DAPI染每个细胞的细胞核(左上图)、hmc鼠单克隆抗体MA7免疫染色(右上图)、hmc兔多克隆抗体免疫染色(左下图)、绿色显示mTET1‑ires‑GFP转入的细胞(中下图)，Merge是四个图像重叠。
图10、hmc鼠单克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。293T(control)(左图)和转入Tet1的293T细胞(Tet1)分别用5mC抗体(5mC)或hmc抗体(hmc)进行免疫共沉淀，沉淀的DNA经Agarose胶分离后，用溴化乙锭染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗体对照。
图11、hmc鼠单克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES细胞(左图)、和脑组织(右图)分别用5mC抗体(5mC)或hmc抗体(hmc)进行免疫共沉淀，沉淀的DNA经Agarose胶分离后，用溴化乙锭染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗体对照。
图12、病理号200401486肾癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌组织和癌旁组织的肾癌组织切片用hmc抗体(左图)或5mC抗体(右图)进行免疫组化染色，癌旁组织有高水平的hmc(左图右上角)，但癌组织基本检测不到5‑hmc(左图右下角)。相反地，癌组织(右图右上角)和其癌旁组织(右图右下角)有相似的5mC水平。
图13、病理号200309294肾癌病人的组织经免疫组化染色发现：癌旁组织(a)有高强度的hmc染色，但癌组织基本检测不到hmc(b)。相反地，癌组织(c)和其癌旁组织(d)有相似强度的hmc染色。
图14、肾癌组织中hmc水平明显下降。根据表一的定量积分方法，将着色强度和广度乘积作为组织的hmc染色程度。每个圆圈代表一个癌组织，每个三角代表一个癌旁组织，两条横线分别是癌组织和癌旁组织hmc染色程度的平均值，癌旁组织有高水平的hmc，而癌组织中hmc水平明显下降。
图15、hmc免疫组化染色病理号201003780和201004888的正常尿路上皮，hmc染色阳性。
图16、举例说明膀胱癌病人组织hmc染色程度。hmc免疫组化染色病理号200216104(上图)、200300702(中图)、和200309678(下图)膀胱癌病人的组织，它们的hmc染色程度分别为1分(阴性)、6分(弱阳性)、和9分(阳性)。
图17、膀胱癌组织中hmc水平与膀胱癌的严重程度相关联。参照前述，将着色强度和广度乘积作为染色程度，以显示不同恶化程度膀胱癌的积分。横线分别是不同恶化程度膀胱癌癌组织hmc染色程度的平均值，随着恶化程度的加深，hmc水平不断减少。LNI：低级别非浸润性尿路上皮癌，Low：低级别尿路上皮癌，High：高级别尿路上皮癌，HI：高级别浸润性尿路上皮癌。
图18、hmc免疫组化染色正常脑组织，DAPI染细胞核、NeuN染神经细胞，神经细胞hmc染色阳性。
图19、hmc免疫组化染色正常脑组织，DAPI染细胞核、GFAP染胶质细胞，胶质细胞hmc染色阳性。
图20、举例说明胶质瘤组织hmc染色程度。hmc免疫组化染色胶质瘤病人的组织，它们的hmc染色程度分别为0分(A，0x0)、1分(B，1x1)、4分(C，2x2)和9分(D，3x3)。
图21、胶质瘤组织hmc免疫组化染色程度与胶质瘤的癌症严重程度相关联。根据病理诊断级别把胶质瘤分成4级：I、II、III和IV级。参照所述积分方法，对胶质瘤组织hmc染色结果进行定量积分分析，以着色强度和广度乘积作为染色程度，以显示不同恶化程度膀胱癌的积分。横线分别是不同恶化程度胶质瘤癌组织hmc染色程度的平均值，随着恶化程度的加深，hmc水平不断减少。A，第一组55例病人样品，B，第二组103例病人样品。
图22、胶质瘤癌组织中hmc水平可以判断胶质瘤癌症病人的存活时间。根据胶质瘤癌组织hmc染色结果把病人分成分成阴性(2分及以下)、弱阳性(3‑4分)、阳性(6分及以上)，然后绘制每一类病人的Kaplan‑Meier生存时间曲线。A，第一组55例病人样品，B，第二组103例病人样品。
图23、病理诊断严重程度相同的癌症病人可以通过hmc水平进一步分型。第一组55例病人和第二组103例病人样品合在一起，Kaplan‑Meier生存时间曲线分别分析病理诊断为II级癌症样品(A)或III级癌症样品(B)。
图24、乳腺癌组织hmc免疫组化染色。两例包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的乳腺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织中正常乳腺导管细胞hmc染色呈阳性，但其相邻的癌组织hmc染色呈阴性。
图25、乳腺癌组织hmc免疫组化染色。4例乳腺癌组织免疫组化染色发现乳腺癌组织中hmc水平有不同程度的下降。
图26、前列腺癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的前列腺癌组织切片用hmc抗体(上图)或5mC抗体(下图)进行免疫组化染色，癌旁组织有高水平的hmc(左上图)，但癌组织基本检测不到hmc(右上图)。相反地，癌组织(右下图)和其癌旁组织(左下图)有相似的5mC水平。
图27、前列腺癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左图)和癌组织(右图)的前列腺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织有高水平的hmc(左图)，尽管癌组织基本检测不到hmc，但仍有一些细胞含有低水平的hmc(右图)。
图28、结肠癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(右边图)和癌组织(左边图)的结肠癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，部分正常结肠腺体细胞hmc染色呈阳性，但癌组织基本检测不到hmc。
图29、两例结肠癌组织的hmc免疫组化染色，癌组织丧失了hmc。
图30、胃癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的胃癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，正常胃腺体细胞hmc染色呈阳性，但癌组织基本检测不到hmc。
图31、直肠癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的直肠癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，正常腺体细胞有一定的hmc染色，但癌组织基本检测不到hmc。
图32、子宫癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的子宫癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织中正常平滑肌细胞hmc染色呈阳性，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(上图)。在另一例中，癌旁组织中正常子宫鳞状上皮和间质细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的子宫鳞癌组织hmc染色呈阴性。
图33、平滑肌肉瘤组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的平滑肌肉瘤组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织中正常平滑肌细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(上图)。
图34、肺癌组织的hmc免疫组化染色。肺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，大部分癌组织hmc染色呈阴性。
图35、肝癌组织的hmc免疫组化染色。肝癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现，癌组织hmc染色呈阴性。
图36、白血病组织的hmc免疫组化染色。白血病细胞用hmc抗体进行免疫组化染色，M2型非淋巴性白血病hmc染色呈阳性或弱阳性，但M4型非淋巴性白血病hmc染色呈阴性。
图37、淋巴瘤组织的hmc免疫组化染色。淋巴瘤组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌组织hmc染色呈阴性。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，首次揭示5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)在组织中的存在情况与癌症的发生和发展密切相关，组织中hmc水平明显下降提示癌症的发生或发展；并且hmc水平的高低还能指示癌症的严重程度。因此，检测hmc的试剂可良好地应用于癌症的诊断、预后或分型，具有很高的临床应用价值。
如本文所用，所述的“癌症”是指多种癌症，只要其癌组织中hmc的水平明显下降(如明显低于癌旁组织)。较佳地，所述的癌症包括(但不限于)：脑癌(如胶质瘤)、鳞状上皮癌(如食管癌、皮肤癌、头颈癌等)、乳腺癌、胃癌、肠癌(如结肠癌、直肠癌)、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、胸腺癌、精原细胞癌、肌肉瘤。
如本文所用，所述的“诊断癌症”包括：确定癌症的发生、确定癌症的发展、确定癌症的严重程度、对癌症进行预后、进行癌症的易感性分析，进行癌症的分型等。
Hmc及其用途
5‑羟甲基胞嘧啶(5‑Hydroxymethyl Cytosine，hmc)为一种小分子化合物。它以共价形式连接于DNA链的胞嘧啶上，前人研究发现其存在于哺乳动物的脑和肝脏中，并存在于胚胎干细胞中。
本发明人第一次揭示hmc在组织中的存在情况与癌症的发生和发展密切相关，组织中hmc水平明显下降提示癌症的发生或发展；并且hmc水平的高低还能指示癌症的严重程度，hmc水平越低预示着癌症越严重。
基于本发明人的新发现，可以利用hmc：(i)进行癌症的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的癌症治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群癌症患病风险，早期监测早期预防等。
在得知了hmc与癌症的相关性后，可方便地基于此来诊断癌症。任何可鉴定出组织中hmc表达情况的方法都包含在本发明中。这些鉴定方法是本领域技术人员所熟知的，较为经典的例如是免疫组化方法或免疫共沉淀方法。
免疫组化(Immunohistochemistry)是本领域技术人员所熟知的技术，即应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量。免疫组化方法一般是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测。
免疫共沉淀(Co‑Immunoprecipitation)也是本领域技术人员所熟知的技术，其是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用或蛋白质与DNA相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质或蛋白质与DNA在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
识别Hmc的试剂及其用途
所述的hmc可用于制备诊断癌症的试剂。由于hmc为小分子化合物，具有较弱的免疫原性，因此，优选地将hmc作为半抗原连接(偶联或附着)到载体蛋白上，制备具有免疫原性的抗原。所述的载体蛋白是本身没有或具有较低的免疫原性的一类生物大分子，例如所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。所述的抗原免疫动物可获得特异性识别hmc的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。作为本发明的优选方式，所述的单克隆抗体由保藏号为CCTCC No：C201191的杂交瘤细胞株产生，经测其识别抗原的特异性良好。
所述的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本中的hmc水平，从而用于诊断癌症。
作为本发明的优选方式，提供了一种多克隆抗体，该抗体的制备方法如下：将hmc偶联牛血清白蛋白(BSA)，获得免疫抗原，将所述免疫抗原与弗氏佐剂混合后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔2周免疫1次，免疫3次，从兔血清中分离多克隆抗体。该抗体特异性好，检测灵敏度高，准确性高，可良好地应用于免疫组织化学检测。
试剂盒
本发明还提供了用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒包括：特异性识别5‑羟甲基胞嘧啶的试剂。所述的试剂例如是：单克隆抗体或多克隆抗体。
此外，所述的试剂盒中还可含有：用于免疫组织化学分析的试剂，所述的试剂例如：染色剂、显色剂等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示hmc可以作为诊断癌症的标志物，其可广谱地用于多种癌症的诊断，且可指示癌症的严重程度；对于一些癌症还能作为分型的依据。
(2)首次制备出了特异性识别hmc的试剂，所述试剂特异性好，检测灵敏度高，准确性高，具有良好的临床应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)抗原的制备
5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)是小分子化合物，直接注射入兔子、大鼠、小鼠或其它免疫动物的体内不足以引起抗原抗体免疫反应。因此，本发明人把hmc作为半抗原偶联到BSA(牛血清白蛋白)、OVA(卵清白蛋白)、KLH(血蓝蛋白)等载体蛋白上，然后再将其注射入兔子、小鼠等免疫动物体内制备识别hmc的多抗，并通过与克隆细胞的融合和筛选，制备识别hmc的单抗。
1.牛血清白蛋白BSA与5‑羟甲基胞嘧啶hmc偶联的方法和产物检测
(1)称取10mg hmc(PY7596，Berry & Associates，Inc.USA)，放入1.5ml的Ep管中；
(2)加入500μl 0.1M的NaIO4，与hmc室温下暗处反应20min；
(3)加入30μl 1M的乙二醇，室温下反应5min，以反应掉多余的NaIO4；
(4)将上述反应混合液加入到1ml 28mg/ml的BSA溶液中(称取28mg BSA粉末(北京鼎盛，lot：15310450)，用1ml双蒸水(Milli‑Q级别的水也可)溶解，再用5％(w/v)的K2CO3调节PH至9.1‑9.5，现用现配)，边搅动边调节PH，确保PH保持在9.1‑9.5，室温下反应45min；
(5)加入1ml 15mg/ml的NaBH4，室温下反应18h；
(6)加入500μl 1M的甲醇，室温下反应1h，以反应掉多余的NaBH4；
(7)加入350‑450μl 1M的氨水，调节PH至8.5；
(8)反应液在流动的水中透析10h；
(9)质谱或者SDS‑PAGE检测确定hmc成功地被偶联到BSA上。
MALDI‑TOF 4800质谱检测发现未偶联的对照组BSA分子量是66809，但偶联后产物的分子量变成了69022(图1)。由于偶联后一个hmc分子量是(274‑18)，因此，平均一个BSA分子上偶联的hmc数目为：(69022‑66809)/(274‑18)＝8.3个。
通过SDS‑PAGE把未偶联对照组BSA和偶联后产物分离开来，用Coomassic染色发现：反应后BSA比未偶联对照组BSA移动慢，说明反应后hmc已经被成功地偶联到BSA上(图2)。
2.卵清白蛋白OVA与5‑羟甲基胞嘧啶hmc偶联的方法
(1)称取5mg hmc，放入1.5ml的Ep管中；
(2)加入500μl 0.1M的NaIO4，与hmc室温下暗处反应20min；
(3)加入30μl 1M的乙二醇，室温下反应5min，以反应掉多余的NaIO4；
(4)将上述反应混合液加入到1ml 28mg/ml的OVA溶液中(称取28mg OVA粉末(Sigma，A5503‑1G)，用1ml双蒸水(Milli‑Q级别的水也可)溶解，再用5％的K2CO3调节PH至9.1‑9.5，现用现配)，边搅动边调节PH，确保PH保持在9.1‑9.5，室温下反应45min；
(5)加入1ml 15mg/ml的NaBH4，室温下反应18h；
(6)加入500μl 1M的甲醇，室温下反应1h，以反应掉多余的NaBH4；
(7)加入350‑450μl 1M的氨水，调节PH至8.5；
(8)反应液在流动的水中透析10h；
(9)质谱检测确定hmC成功地被偶联到OVA上(图3)。
同样方法，通过调整摩尔比例，可以把不同的碱基偶联到OVA上(表1)。
表1、不同碱基偶联到OVA上所使用的摩尔比例

平均一个OVA分子上偶联的各种核苷的数目如表2
表2


3.血蓝蛋白KLH与5‑羟甲基胞嘧啶hmc偶联的方法
(1)称取10mg hmc，放入1.5ml的Ep管中；
(2)加入500μl 0.1M的NaIO4，与hmc室温下暗处反应20min；
(3)加入30μl 1M的乙二醇，室温下反应5min，以反应掉多余的NaIO4；
(4)将上述反应混合液加入到1ml 6mg/ml的KLH溶液中(称取6mg KLH粉末(Sigma，H8283‑100MG)，用1ml双蒸水(Milli‑Q级别的水也可)溶解，再用5％的K2CO3调节PH至9.1‑9.5)，边搅动边调节PH，确保PH保持在9.1‑9.5，室温下反应45min；
(5)加入1ml 15mg/ml的NaBH4，室温下反应18h；
(6)加入500μl 1M的甲醇，室温下反应1h，以反应掉多余的NaBH4；
(7)加入350‑450μl 1M的氨水，调节PH至8.5；
(8)反应液在流动的水中透析10h；
(9)通过紫外分光光度计检测确定hmC成功地被偶联到KLH上。
紫外分光光度分析发现(图4)：游离的KLH和hmc分别具有不同的吸光度，当KLH和hmc发生偶联反应后会生成具有其他吸光度值的偶联产物，而且由于发生了偶联反应，游离的KLH和hmc的量降低，因此游离的KLH和hmc的吸光度值发生改变，说明hmc成功地被偶联到KLH上。
实施例2、5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)抗体的制备方法
兔多克隆抗体的制备
本发明人把偶联到BSA载体蛋白上的hmc注射入兔子体内，获取免疫血清。制备方法如下：hmc偶联牛血清白蛋白(BSA)与弗氏佐剂混合后，注射到家兔，免疫量0.5mg，每隔2周免疫1次，免疫3次。经常规的亲和纯化后得到针对hmc的兔多克隆抗体。
免疫印迹实验显示：兔多克隆抗体HMC‑PA01只识别hmc，基本不识别5‑甲基胞嘧啶(5mC)(图5)和其它碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶等。
鼠单克隆抗体的制备
本发明人把偶联到BSA载体蛋白上的hmc注射入小鼠体内，获取免疫血清，通过ELISA和免疫印迹实验挑选产生高效价、特异性强的hmc抗体的小鼠，把这些小鼠脾脏细胞和克隆株融合后，筛选产生高效价、特异性强hmc抗体的杂交瘤细胞株(保藏号：CCTCC No：C201191)，其分泌鼠单克隆抗体MA7。
把杂交瘤细胞株注入小鼠体内，使其产生腹水，这些腹水含有高浓度的hmc单克隆抗体。
免疫印迹实验显示：鼠单克隆抗体MA7只认识hmc，基本不识别5‑甲基胞嘧啶(5mC)(图8)和其它碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶等。
实施例3、hmc抗体的实验应用
1.兔多克隆抗体能特异性地检测5‑羟甲基胞嘧啶hmc
为了检测HMC‑PA01多克隆抗体能否被用于免疫染色，本发明人用RT‑PCR的方法从小鼠胚胎干细胞中获得催化产生hmc的酶Tet1的cDNA，该cDNA含有C端第1367到2007的氨基酸(基于GenBank登录号：NM030625的蛋白序列)的编码序列，两端设置Nhe I和Bam HI酶切位点。经Nhe I和BamHI酶切后插入含有绿色荧光蛋白(GFP)编码序列的pIRES2‑EGFP，构建成一个质粒pmTET1‑ires‑GFP，并把它转入293T细胞(CRL‑11268，美国ATCC)内，用GFP区分转入和未转入的细胞，转入的细胞GFP呈阳性，相反，未转入的细胞GFP呈阴性。用hmc兔多克隆抗体HMC‑PA01或5mC抗体(clone 162 33D3，Calbiochem，CA，美国)对这些细胞进行免疫荧光染色(图6)，结果显示：没有转入Tet1的细胞hmc染色阴性，而转入的细胞hmc染色阳性。相反地，没有转入Tet1的细胞5mC阳性，转入的细胞5mC阴性。
说明hmc兔多克隆抗体可被用于免疫染色，能特异性地检测细胞内的hmc。
2.hmc兔多克隆抗体可以被用于免疫共沉淀(hmcDIP)
为了检测HMC‑PA01兔多克隆抗体能否被用于免疫共沉淀，本发明人把pmTET1‑ires‑GFP转入293T细胞内，用GFP把转入和未转入的细胞分离开来，用hmc兔多克隆抗体或5mC抗体对这些细胞进行免疫共沉淀实验(图7)。用未转入293T细胞进行免疫共沉淀时，5mC抗体可以把DNA沉淀下来，而hmc抗体HMC‑PA01却只能沉淀很少的DNA；相反，用转入Tet1细胞进行免疫共沉淀时，5mC抗体沉淀的DNA比未转入Tet1的细胞明显减少，验证了Tet1把很多5mC变成了hmc；用这些细胞做实验，hmc的抗体HMC‑PA01就可以沉淀很多的DNA，说明hmc兔多克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。本发明人把用hmc抗体进行的免疫共沉淀叫做hmc免疫共沉淀(hmc DNA immunoprecipitation，hmcDIP)。
同样地，免疫共沉淀实验发现，hmc抗体和5mC抗体都可以把小鼠ES细胞46C(获自Austin Smith，Wellcome Trust Centre for Stem Cell Research，University of Cambridge，Tennis Court Road，Cambridge CB2 1QR，英国)中的DNA沉淀下来。
3.鼠单克隆抗体能特异性地检测5‑羟甲基胞嘧啶hmc
为了检测MA7鼠单克隆抗体能否被用于免疫染色，本发明人把pmTET1‑ires‑GFP质粒转入293T细胞内，用GFP区分转入和未转入的细胞，转入的细胞GFP呈阳性，相反，未转入的细胞GFP成阴性。用hmc鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体HMC‑PA01对这些细胞进行免疫荧光染色(图9)，结果显示：没有转入Tet1的细胞hmc鼠单克隆抗体染色阴性，而转入的细胞hmc鼠单克隆抗体染色阳性。这与兔多克隆抗体HMC‑PA01的染色一样。
说明hmc鼠单克隆抗体MA7可被用于免疫染色，能特异性地检测细胞内的hmc。
4.hmc鼠单克隆抗体可以被用于免疫共沉淀(hmcDIP)
为了检测鼠单克隆抗体能否被用于免疫共沉淀，本发明人把pmTET1‑ires‑GFP转入293T细胞内，用GFP把转入和未转入的细胞分离开来，用hmc鼠单克隆抗体或5mC抗体对这些细胞进行免疫共沉淀实验(图10)。用未转入293T细胞进行免疫共沉淀时，5mC抗体可以把DNA沉淀下来，而hmc抗体却几乎不能沉淀任何DNA；相反，用转入Tet1细胞进行免疫共沉淀时，5mC抗体沉淀的DNA比未转入Tet1的细胞明显减少，验证了Tet1把很多5mC变成了hmc；用这些细胞做实验，hmc的抗体就可以沉淀很多DNA，说明hmc鼠单克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。
同样地，免疫共沉淀实验发现，hmc抗体可以把小鼠ES细胞46C中或小鼠脑中的DNA沉淀下来(图11)。
实施例4、5‑羟甲基胞嘧啶(hmc)抗体的医学应用
1.hmc染色可以用于诊断肾癌
本发明人用病理号200401486检验hmC多克隆抗体HMC‑PA01能否用于免疫组化染色检测肾癌组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的肾癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，组织切片经脱蜡，过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性，2N盐酸处理暴露抗原，HMC‑PA01孵育，辣根酶标记二抗孵育，DAB显色发现，癌旁组织中正常肾小管中大部分细胞hmc染色呈阳性，但同一切片上的癌组织hmc染色呈阴性(图12左)。为了说明这种差别不是染色技术造成的，本发明人用5mC染色相邻的肾癌组织切片作为染色对照，结果显示：癌细胞和其癌旁组织正常肾小管细胞有相似的5mC染色强度(图12右)。该免疫组化染色结果提示：肾癌组织中丧失了hmc。
本发明人用hmc和5mC免疫组化染色包含有癌组织和癌旁组织的肾癌病理号200309294的组织，得到同样的结果(图13)。癌旁组织中正常肾小管中大部分细胞hmc染色呈阳性，但癌组织hmc染色呈阴性；癌细胞和其癌旁组织正常肾小管细胞有相似的5mC染色强度。该免疫组化染色结果进一步提示：肾癌组织中丧失了hmc。
为了检查肾癌组织中hmc丧失的普遍性，本发明人采用HMC‑PA01多克隆抗体对49例肾癌组织样品进行hmc免疫组化染色，其中40例样品含有癌组织和癌旁组织(表3)。为了对hmc染色结果进行分析，本发明人采用了一个定量积分方法。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％，将着色强度和广度乘积作为染色结果，2分及以下为阴性，3‑4分为弱阳性，6和9分为阳性。癌旁组织染色显示：大部分癌旁组织hmc呈阳性(6‑9分)(34/40)。而在这些病人的肾癌组织里，除了4例hmc染色强度与癌旁组织相同外(编号24、32、41、7)，其它36例的hmc染色强度都有明显的减少，其中，16例hmc阴性(0‑2分)。这些数据说明，大部分(90％)肾癌组织中hmc明显减少(图14)，40％肾癌组织中丧失了hmc。因此，hmc染色可以用于诊断肾癌。
表3

表3，肾癌组织hmc免疫组化染色。对肾癌hmc染色结果进行定量积分分析。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％，将着色强度和广度乘积作为染色结果，2分及以下为阴性，3‑4分为弱阳性，6‑9分为阳性。
hmc染色可以用于诊断膀胱癌
本发明人用多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测了正常尿路上皮细胞的hmc水平，结果显示：正常尿路上皮细胞有强的hmc染色，说明正常尿路上皮细胞含有高水平的hmc(图15)。
为了检查膀胱癌组织中hmc是否丧失及其丧失的普遍性，本发明人对54例膀胱癌组织样品进行hmc免疫组化染色(表4)(图16)，参照表3积分方法，对hmc染色结果进行定量积分分析。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％，以着色强度和广度乘积作为组织染色程度，把病人组织中hmc水平分成阴性(2分及以下)、弱阳性(3‑4分)、阳性(6‑9分)。其中，14例hmc阳性(6‑9分)，16例hmc呈弱阳性(3‑4分)，24例为hmc阴性(0‑2分)，说明44％膀胱癌组织都丧失了hmc。
为了检查膀胱癌组织中hmc水平是否与膀胱癌的严重程度相关联，本发明人根据病理诊断把膀胱癌分成4类：低级别非浸润性尿路上皮癌、低级别尿路上皮癌、高级别尿路上皮癌、和高级别浸润性尿路上皮癌(表5)，并把癌症严重程度和hmc水平进行关联分析(图17)。结果显示：低级别非浸润性尿路上皮癌的平均hmc染色分数是6分、低级别尿路上皮癌的平均hmc染色分数是3.6分、高级别尿路上皮癌的平均hmc染色分数是2.8分、高级别浸润性尿路上皮癌的平均hmc染色分数是2.7分。这些数据显示：膀胱癌组织hmc水平与癌症的严重性负相关。因此，hmc染色可以用于判断膀胱癌的严重程度。
表4
  编号  性别  年龄  病理号  患者目前情况  病理诊断                强度  广度  结果  30  男  70  200404524  09年复发，现存活  低级别尿路上皮癌          0  0  0  20  男  70  200311800  2004年去世  高级别尿路上皮癌          0  0  0  61  男  72  200517740  复发2次，现很好  高级别尿路上皮癌          0  0  0  65  女  55  200519995  2次复发。现很好  高级别尿路上皮癌          0  0  0  3  男  58  200215946  2007年复发，现存活  低级别尿路上皮癌          1  1  1  4  男  76  200216104  很好  低级别尿路上皮癌          1  1  1  15  男  64  200306201  很好  低级别尿路上皮癌          1  1  1  18  女  54  200311399  很好  低级别尿路上皮癌          1  1  1  21  男  82  200312533  存活  低级别尿路上皮癌          1  1  1  29  男  73  200403832  很好  低级别尿路上皮癌          1  1  1  31  男  69  200404531  很好  低级别尿路上皮癌          1  1  1  40  男  62  200413881  很好  低级别尿路上皮癌          1  1  1  23  男  65  200315649  2009年去世  高级别尿路上皮癌          1  1  1  24  女  78  200315824  很好  高级别尿路上皮癌          1  1  1  59  男  77  200515958  很好  浸润性尿路上皮癌          1  1  1  56  男  78  200512267  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  1  2  2  2  男  22  200214735  2007年去世  低级别尿路上皮癌          2  1  2  47  男  70  200503353  很好  高级别浸润性尿路上皮癌    2  1  2  9  男  24  200304456  术后半年复发去世  高级别尿路上皮癌          1  2  2  11  男  57  200305963  很好  高级别尿路上皮癌          1  2  2  42  女  70  200414872  2004年去世  高级别尿路上皮癌          1  2  2  48  女  43  200503756  09年复发，现存活  高级别尿路上皮癌          1  2  2  49  男  86  200505447  05年去世  浸润性尿路上皮癌          1  2  2  53  男  74  200508845  很好  浸润性尿路上皮癌          1  2  2  7  男  74  200302398  04年复发，现存活  低级别尿路上皮癌          1  3  3  62  男  68  200518515  06年复发，现很好  高级别浸润性尿路上皮癌    1  3  3  64  男  74  200520330  2008年去世  高级别浸润性尿路上皮癌    1  3  3  26  男  51  200400744  2006年因转移去世  高级别尿路上皮癌          1  3  3  45  女  68  200415880  复发两次，现存活  高级别尿路上皮癌          1  3  3  50  男  59  200506200  很好  浸润性尿路上皮癌          1  3  3  57  男  76  200512982  很好  尿路上皮癌                1  3  3  63  男  79  200519964  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  2  2  4  13  女  55  200305858  很好  低级别尿路上皮癌          2  2  4  39  女  71  200411739  很好  低级别尿路上皮癌          2  2  4  8  男  33  200304135  存活  高级别尿路上皮癌          2  2  4  12  女  64  200305648  多次复发，现存活  高级别尿路上皮癌          2  2  4  32  男  59  200405527  去世  高级别尿路上皮癌          2  2  4  44  女  50  200415906  很好  高级别尿路上皮癌          2  2  4  51  男  56  200506818  很好  浸润性尿路上皮癌          2  2  4  54  男  68  200508645  2008年去世  浸润性尿路上皮癌          2  2  4  5  男  55  200300702  很好  低级别尿路上皮癌          3  2  6  17  男  39  200309583  很好  低级别尿路上皮癌          2  3  6  34  女  46  200407490  05年复发，现存活  低级别尿路上皮癌          2  3  6  38  男  63  200409744  很好  低级别尿路上皮癌          2  3  6  41  男  37  200413595  2010年转移，现存活  低级别尿路上皮癌          2  3  6  46  男  45  200416212  很好  低级别尿路上皮癌          2  3  6  25  男  75  200400547  多次复发，现存活  高级别尿路上皮癌          2  3  6  35  男  44  200407782  很好  高级别尿路上皮癌          2  3  6  43  女  79  200415729  去世  高级别尿路上皮癌          2  3  6  58  男  56  200514823  很好  浸润性尿路上皮癌          2  3  6  52  男  67  200508336  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  3  3  9  55  男  78  200510504  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  3  3  9  16  女  49  200309463  09年复发，现存活  低级别尿路上皮癌          3  3  9  28  男  66  200402444  08年复发，现存活  低级别尿路上皮癌          3  3  9
表4，膀胱癌组织hmc免疫组化染色。参照前述积分方法，对膀胱癌hmc染色结果进行定量积分分析。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％，将着色强度和广度乘积作为染色程度，3分以下为阴性，4‑6分为弱阳性，6分以上为阳性。
表5
  编号  性别  年龄  病理号  患者目前情况  病理诊断  强度  广度  结果  56  男  78  200512267  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  1  2  2  63  男  79  200519964  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  2  2  4  52  男  67  200508336  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  3  3  9  55  男  78  200510504  很好  低级别非浸润性尿路上皮癌  3  3  9  30  男  70  200404524  09年复发，现存活  低级别尿路上皮癌  0  0  0  3  男  58  200215946  2007年复发，现存活  低级别尿路上皮癌  1  1  1  4  男  76  200216104  很好  低级别尿路上皮癌  1  1  1  15  男  64  200306201  很好  低级别尿路上皮癌  1  1  1  18  女  54  200311399  很好  低级别尿路上皮癌  1  1  1  21  男  82  200312533  存活  低级别尿路上皮癌  1  1  1  29  男  73  200403832  很好  低级别尿路上皮癌  1  1  1  31  男  69  200404531  很好  低级别尿路上皮癌  1  1  1  40  男  62  200413881  很好  低级别尿路上皮癌  1  1  1  2  男  22  200214735  2007年去世  低级别尿路上皮癌  2  1  2  7  男  74  200302398  04年复发，现存活  低级别尿路上皮癌  1  3  3  13  女  55  200305858  很好  低级别尿路上皮癌  2  2  4  39  女  71  200411739  很好  低级别尿路上皮癌  2  2  4  5  男  55  200300702  很好  低级别尿路上皮癌  3  2  6  17  男  39  200309583  很好  低级别尿路上皮癌  2  3  6  34  女  46  200407490  05年复发，现存活  低级别尿路上皮癌  2  3  6  38  男  63  200409744  很好  低级别尿路上皮癌  2  3  6  41  男  37  200413595  2010年转移，现存活  低级别尿路上皮癌  2  3  6  46  男  45  200416212  很好  低级别尿路上皮癌  2  3  6  16  女  49  200309463  09年复发，现存活  低级别尿路上皮癌  3  3  9  28  男  66  200402444  08年复发，现存活  低级别尿路上皮癌  3  3  9  47  男  70  200503353  很好  高级别浸润性尿路上皮癌  2  1  2  62  男  68  200518515  06年复发，现很好  高级别浸润性尿路上皮癌  1  3  3  64  男  74  200520330  2008年去世  高级别浸润性尿路上皮癌  1  3  3  20  男  70  200311800  2004年去世  高级别尿路上皮癌  0  0  0  61  男  72  200517740  复发2次，现很好  高级别尿路上皮癌  0  0  0  65  女  55  200519995  2次复发。现很好  高级别尿路上皮癌  0  0  0  23  男  65  200315649  2009年去世  高级别尿路上皮癌  1  1  1  24  女  78  200315824  很好  高级别尿路上皮癌  1  1  1  9  男  24  200304456  术后半年复发去世  高级别尿路上皮癌  1  2  2  11  男  57  200305963  很好  高级别尿路上皮癌  1  2  2  42  女  70  200414872  2004年去世  高级别尿路上皮癌  1  2  2  48  女  43  200503756  09年复发，现存活  高级别尿路上皮癌  1  2  2  26  男  51  200400744  2006年因转移去世  高级别尿路上皮癌  1  3  3  45  女  68  200415880  复发两次，现存活  高级别尿路上皮癌  1  3  3  8  男  33  200304135  存活  高级别尿路上皮癌  2  2  4  12  女  64  200305648  多次复发，现存活  高级别尿路上皮癌  2  2  4  32  男  59  200405527  去世  高级别尿路上皮癌  2  2  4  44  女  50  200415906  很好  高级别尿路上皮癌  2  2  4  25  男  75  200400547  多次复发，现存活  高级别尿路上皮癌  2  3  6  35  男  44  200407782  很好  高级别尿路上皮癌  2  3  6  43  女  79  200415729  去世  高级别尿路上皮癌  2  3  6  59  男  77  200515958  很好  浸润性尿路上皮癌  1  1  1  49  男  86  200505447  05年去世  浸润性尿路上皮癌  1  2  2  53  男  74  200508845  很好  浸润性尿路上皮癌  1  2  2  50  男  59  200506200  很好  浸润性尿路上皮癌  1  3  3  51  男  56  200506818  很好  浸润性尿路上皮癌  2  2  4  54  男  68  200508645  2008年去世  浸润性尿路上皮癌  2  2  4  58  男  56  200514823  很好  浸润性尿路上皮癌  2  3  6  57  男  76  200512982  很好  尿路上皮癌  1  3  3
表5，膀胱癌组织hmc免疫组化染色结果按病理诊断重排。参照前述积分方法，对膀胱癌hmc染色结果进行定量积分分析，以着色强度和广度乘积作为染色程度。并根据病理诊断把膀胱癌分成4类：低级别非浸润性尿路上皮癌、低级别尿路上皮癌、高级别尿路上皮癌、和高级别浸润性尿路上皮癌。
hmc染色可以用于诊断胶质瘤
本发明人用多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测了正常脑组织细胞的hmc水平，与报道的结果一致，神经细胞含有高水平的hmc(图18)。正常脑组织中胶质细胞也有强的染色(图19)，这是以前没有发现的，说明正常脑组织中除了神经细胞外，胶质细胞也含有高水平的hmc。
为了检查胶质瘤组织中hmc是否丧失及其丧失的普遍性，本发明人对55例胶质瘤组织样品进行hmc免疫组化染色(表6)，其中，24例hmc阳性(6‑9分)，18例hmc呈弱阳性(3‑4分)，13例为染色阴性(0‑2分)，说明不同胶质瘤组织含有不同水平的hmc(图20)。
为了检查胶质瘤组织中hmc水平是否与癌症严重程度相关联，本发明人把病人组织按照病理诊断级别把胶质瘤分成4级：I级、II级、III级和IV级，把癌症严重程度和hmc水平进行关联分析。病理诊断为I级的癌症样品的平均hmc染色分数是3分、病理诊断为II级的癌症样品的平均hmc染色分数是6.1分、病理诊断为III级的癌症样品的平均hmc染色分数是4.5分、病理诊断为IV级的癌症样品的平均hmc染色分数是3.9分(图21A)。由于病理诊断为I级的癌症样品只有4例，不具备代表性。其它3级的样品染色数据显示：胶质瘤组织hmc水平与癌症的严重性成负相关。因此，hmc染色可以用于判断胶质瘤的严重程度。
为了检查胶质瘤组织中hmc水平是否可以判断胶质瘤癌症病人的存活时间，本发明人参照前述积分方法，对胶质瘤hmc染色结果进行定量积分分析。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％，以着色强度和广度乘积作为组织染色程度，把胶质瘤病人组织中hmc水平分成阴性(2分及以下)、弱阳性(3‑4分)、阳性(6‑9分)，然后绘制每一类病人的Kaplan‑Meier生存时间曲线(图22A、B)。结果显示：组织中hmc阴性病人的存活时间明显短于组织中hmc弱阳性的病人，而组织中hmc阳性的病人存活时间最长。
这些数据表明：胶质瘤癌组织中hmc水平可以判断胶质瘤癌症病人的存活时间，水平越低，存活时间越短。
表6

表6，胶质瘤组织hmc免疫组化染色。参照前述积分方法，对胶质瘤hmc染色结果进行定量积分分析。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％。将着色强度和广度乘积作为组织着色的结果。
为了证实上述结果，本发明人对另一组103例胶质瘤组织样品进行hmc免疫组化染色(表7)。结果发现：病理诊断为I级的癌症样品的平均hmc染色分数是5分、病理诊断为II级的癌症样品的平均hmc染色分数是5.3分、病理诊断为III级的癌症样品的平均hmc染色分数是3.1分、病理诊断为IV级的癌症样品的平均hmc染色分数是1.8分(图21B)。该结果证实胶质瘤组织hmc水平与癌症的严重性成负相关。Kaplan‑Meier生存时间曲线结果证实组织中hmc阴性病人的存活时间明显短于组织中hmc弱阳性的病人，而组织中hmc阳性的病人存活时间最长(图22B)。
为了检测组织中hmc水平与病人生存时间相关性是否与目前病理诊断的癌症严重程度无关，本发明人把两组病人合在一起，用目前病理诊断为同一级别严重程度的癌症病人进行Kaplan‑Meier生存时间曲线结果分析。由于I级癌症病人样品只有10例，不足于进行Kaplan‑Meier生存时间曲线分析。诊断为II级的癌症样品总共有71例，Kaplan‑Meier生存时间曲线分析发现：组织中hmc阴性病人的存活时间短于组织中hmc弱阳性的病人，而组织中hmc阳性的病人存活时间最长(图23A)。对诊断为III级的癌症样品进行Kaplan‑Meier生存时间曲线分析，同样发现，组织中hmc阴性和弱阳性病人的存活时间明显短于组织中hmc阳性的病人(图23B)。这些结果说明目前病理诊断为同一级别严重程度的癌症病人，还可以通过hmc水平进一步分型。
表7


表7，另一组胶质瘤组织hmc免疫组化染色。参照前述积分方法，对胶质瘤hmc染色结果进行定量积分分析。将染色强度分为4级，0分＝没有着色，1＝弱阳性，2＝中度着色，3＝强度着色；同时按照着色细胞所占组织细胞总量(广度)百分比分为四级，0＝小于5％，1＝5‑30％，2＝30‑60％，3＝大于60％。将着色强度和广度乘积作为组织着色的结果。
hmc染色可以用于诊断乳腺癌
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测乳腺癌组织中hmc的水平。两例包含有癌组织和癌旁组织的乳腺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现：癌旁组织中正常乳腺导管细胞hmc染色呈阳性，但其相邻的癌组织hmc染色呈阴性(图24)。另外4例乳腺癌组织免疫组化染色发现乳腺癌组织中hmc染色有不同程度的下降(图25)。该免疫组化染色结果提示：乳腺癌组织中不同程度地丧失了hmc。
因此，hmc染色可以用于诊断乳腺癌，并判断癌症的严重性。
hmc染色可以用于诊断前列腺癌
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测前列腺癌组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的前列腺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现，癌旁组织中正常前列腺细胞hmc染色呈阳性，但同一个病人来源的癌组织hmc染色呈阴性(图26)。为了说明这种差别不是染色技术造成的，本发明人用5mC染色相邻的前列腺癌组织切片作为染色对照，结果显示：癌细胞和其癌旁组织正常前列腺细胞有相似的5mC染色强度。该免疫组化染色结果提示：前列腺癌组织中丧失了hmc。另外一例前列腺癌组织染色发现：癌组织没有完全丧失hmc，仍有一些细胞含有低水平的hmc(图27)。
因此，hmc染色可以用于诊断前列腺癌，判断其癌症的严重性。
hmc染色可以用于诊断结肠癌
本发明人用hmC多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测结肠癌组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的结肠癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现，癌旁组织中部分正常结肠腺体细胞hmc染色呈阳性，但同一切片的癌组织hmc染色呈阴性(图28)。另外两例结肠癌组织染色发现：癌组织丧失了hmc(图29)。
因此，hmc染色可以用于诊断结肠癌。
hmc染色可以用于诊断胃癌
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测胃癌组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的胃癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现，癌旁组织中正常胃腺体细胞hmc染色呈阳性，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(图30)。
因此，hmc染色可以用于诊断胃癌。
hmc染色可以用于诊断直肠癌
本发明人用hmC多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测直肠癌组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的直肠癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现，癌旁组织中正常腺体细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(图31)。
因此，hmc染色可以用于诊断直肠癌。
hmc染色可以用于诊断子宫癌
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测子宫癌组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的子宫癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现：癌旁组织中正常平滑肌细胞hmc染色呈阳性，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(图32)。另一例子宫癌组织染色显示：癌旁组织中正常子宫鳞状上皮和间质细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的子宫鳞癌组织hmc染色呈阴性(图32)。
因此，hmc染色可以用于诊断子宫癌。
hmc染色可以用于诊断平滑肌肉瘤
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测平滑肌肉瘤组织中hmc的水平。包含有癌组织和癌旁组织的平滑肌肉瘤组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现：癌旁组织中正常平滑肌细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(图33)。
因此，hmc染色可以用于诊断肌肉瘤。
hmc染色可以用于诊断肺癌
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测肺癌组织中hmc的水平。肺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现：大部分肺癌如鳞状细胞癌、小细胞癌等组织hmc染色呈阴性，但腺癌细胞却呈阳性(图34)。
这些数据表明，hmc染色可以区分不同肺癌，可以用于肺癌的分型。
hmc染色可以用于诊断肝癌
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测肝癌组织中hmc的水平。肝癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现：肝癌组织hmc染色呈阴性(图35)。
这些数据表明，hmc染色可以用于肝癌的诊断。
hmc染色可以用于诊断白血病
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测白血病组织中hmc的水平。不同级别的白血病细胞用hmc抗体进行免疫组化染色发现：M2型非淋巴性白血病hmc染色呈阳性或弱阳性，但M4型非淋巴性白血病hmc染色呈阴性(图36)。
因此，hmc染色程度可以判断白血病的严重程度。
hmc染色可以用于诊断淋巴瘤
本发明人用hmc多克隆抗体HMC‑PA01免疫组化染色检测淋巴瘤组织中hmc的水平。淋巴瘤组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现：淋巴瘤癌组织hmc染色呈阴性(图37)。
因此，hmc染色可以用于诊断淋巴瘤。
保藏
分泌鼠单克隆抗体MA7的杂交瘤细胞株(5hmC小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株)，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏登记号为CCTCC No：C201191，保藏日期2011年10月26日。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。