一种杨梅苷及其药物组合物的制备方法 技术领域 本发明涉及一种药用活性成分的制备方法， 尤其涉及杨梅苷及其药物组合物的制 备方法， 属医药技术领域。
技术背景 杨梅苷， 如式 (I) 结构所示， 其化学名为 3’ ， 4’ ， 5’ ， 5， 7- 五羟基黄酮 -3-O-α-L- 鼠 李糖苷。杨梅苷为天然多羟基黄酮类化合物， 广泛存在于杨梅科植物杨梅 Myrica rubra Sieb.et Zucc. 的树皮及叶子， 豆科植物鬼箭锦鸡儿 Caraganajubata Poir. 的枝叶， 蓼科植 物扁蓄 Polygonum aviculare L 的地上部分中。
目前， 关于杨梅苷的提取分离方法主要有正相硅胶柱层析， 聚酰酰层析， LH-20 凝 胶层析等， 但由于杨梅苷分子中含多个羟基， 对温度、 光照及酸碱性不稳定， 采用常规的柱 层析， 不仅分离时间长， 而且很容易发生氧化变性及死吸附。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种杨梅苷的制备方法， 该方法具有不影响杨梅苷活性， 成本低、 易操作、 安全， 对操作者的身体健康和环境的保护 具有重要意义等特点。
本发明所述杨梅苷的制备方法， 包括如下步骤 ：
a. 提取粗提物 ： 使用有机溶剂从富含杨梅苷的植物中提取粗提物 ；
b. 分离、 纯化 ： 粗提物用色谱方法分离、 纯化， 得到杨梅苷单体。
上述杨梅苷的制备方法， 所述步骤 a 中提取方法为室温下浸渍、 超声波震荡、 或加 热回流提取。
上述杨梅苷的制备方法， 所述步骤 a 中有机溶剂选自水、 甲醇、 乙醇、 丙醇， 异丙 醇， 异丁醇， 仲丁醇， 叔丁醇， 乙酸乙酯， 乙酸甲酯， 甲酸乙酯， 丙酮中的任意一种或任意两种 以上溶剂以任意比例所组成的混合溶剂， 以上所有使用的溶剂皆为分析纯度。
上述杨梅苷的制备方法， 所述步骤 a 中富含杨梅苷的植物选自杨梅科植物杨梅 Myrica rubra Sieb.et Zucc. 的树皮、 叶子， 豆科植物鬼箭锦鸡儿 Caragana jubata Poir. 的枝叶或蓼科植物扁蓄 Polygonum aviculare L 的地上部分。
上述杨梅苷的制备方法， 所述步骤 b 中色谱方法为高速逆流色谱法。
上述杨梅苷的制备方法， 所述高速逆流色谱法其溶剂系统为石油醚 - 乙酸乙 酯 - 甲醇 - 水， 比例为 3 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 3。
上述杨梅苷的制备方法， 所述高速逆流色谱法为 ：
①将粗提物以甲醇溶解， 并定溶 0.1g/ml， 均一澄清状态， 将按比例配置的溶剂系 统石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水， 两相溶剂体系， 以上相作为固定相， 下相作流动相 ；
②将上相溶剂在最大流速下泵入并充满离心管柱体， 管路由机器自带， 本研究所 用仪器为上海同田生物技术公司生产 TBE-300A 型高速逆流色谱仪， 然后将下相溶剂以 5ml/min 的流速泵入离心管柱体， 同时开启检测器并按 850 转每分钟， 启动主机 ；
③待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入， 管柱出口处 的流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站和记录仪记录， 收集组分。
本发明所述杨梅苷的制备方法， 使用 HSCCC 无固相载体， 避免了常规柱层析的死 吸附 ； 分离的全过程是在密闭的聚四氟乙烯管中进行， 避免光照 ； 具有控温装置， 保证整个 分离过程在较低温度下进行。因此， HSCCC 对于温度、 光照、 酸碱等不稳定中药化学成分的 分离具有独特的优势。 HSCCC 分离使用的流动相多数为水相， 仅含少量的有机溶剂， 既降低了实验成本， 又降低了毒性溶剂的使用， 对操作者的身体健康和环境的保护都具有重要意义。
本发明还提供了杨梅苷用于治疗心血管疾病的药物组合物， 由杨梅苷与一种或多 种其他活性成分、 一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制成药物组合物。
本发明所述药物组合物最小单元所含活性成分优选杨梅苷的量为 1.25-10mg。更 优选为 ： 2.5-5mg ； 最优选为 2.5mg。
本发明所述药物组合物可为临床上任何可接受的剂型形式。 包括口服及肠胃外给 药形式的各种剂型。 用于口服时， 可以是片剂、 胶囊、 软胶囊、 口服液、 糖浆、 颗粒、 滴丸、 口崩 片、 缓释片、 缓释胶囊、 控释片、 控释胶囊 ； 用于肠胃外给药途径时， 可以是水针、 冻干粉针、 无菌粉针、 输液。本发明药物组合物优选片剂和水针剂型。
上述药物组合物， 所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制剂的药 用赋形剂， 包括填充剂、 粘合剂、 润滑剂、 崩解剂、 助溶剂、 表面活性剂、 吸附载体等。
上述药物组合物， 所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于注射剂的药用 赋形剂， 包括溶剂、 抗氧剂、 助溶剂、 吸附剂、 渗透压调节剂、 PH 调节剂。
药物组合物最小单元是指一片， 一颗胶囊， 一袋颗粒或一支注射剂等。
本发明剂型可使用药物制剂工艺学本领域熟练技术人员所公知的惯常使用的任 何方法产生并且对此没有特别限制。
例如， 本发明片剂可通过使用本领域公知的合适的方法粒化、 干燥和筛分主要药 剂和赋形剂、 粘合剂等等， 向所得混合物中加入润滑剂等等然后混合并形成片剂。 造粒可通 过本领域公知的任何合适的方法进行， 例如湿法造粒、 干法造粒或加热造粒。 合适的非限制 性实例包括使用高速搅拌造粒机、 流动造粒干燥机、 挤压造粒机或滚筒压紧器进行这些造
粒方法。此外， 例如干燥和筛分的方法可以根据进行造粒的需要进行。主要药剂、 赋形剂、 粘合剂、 润滑剂等等的混合物还可直接形成片剂。
如果需要薄膜包衣， 可以使用本领域已知的任何薄膜包衣装置， 并且作为薄膜包 衣基质， 合适的实例包括糖衣基、 亲水膜包衣基、 肠溶薄膜包衣基和缓释薄膜包衣基。 附图说明
图 1 杨梅苷高速逆流色谱 (HSCCC) 分离图谱 图 2 杨梅苷 HPLC 纯度检查色谱图具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例 1 ： 以杨梅树皮为原料， 采用高速逆流色谱法谱法分离杨梅苷
a. 提取粗提物 ： 以杨梅树皮 500g 为原料， 95％乙醇作为溶剂， 室温下浸渍对原料 进行提取， 合并滤液， 减压浓缩并干燥去溶剂得粗提取物干粉 48g ；
b. 分离、 纯化 ：
①将粗提物 500mg 以甲醇溶解， 并定溶 0.1g/ml， 均一澄清状态， 将按比例配置的 溶剂系统石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水， 两相溶剂体系， 以上相作为固定相， 下相作流动相 ；
②将上相溶剂在最大流速下泵入并充满离心管柱体， 管路由机器自带， 本研究所 用仪器为上海同田生物技术公司生产 TBE-300A 型高速逆流色谱仪， 然后将下相溶剂以 5ml/min 的流速泵入离心管柱体， 同时开启检测器并按选定的转速 850 转每分钟， 启动主 机；
③待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入， 管柱出口处 的流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站和记录仪记录， 收集组分。
结果 ：
在 1.5 小时便可分离制得纯品， 经 HPLC( 面积归一化法 ) 测定， 纯度达 95％， (以 原料和单体比例换算 ) 得率 3％。相对于传统工艺反复使用硅胶柱层析以及 2-3 天的色谱 周期， 节省了大量的时间也提高了产率。
熔点 mp 182.0 ～ 184.0℃， 旋光 ： -168℃ ( 甲醇 )， TLC 紫外灯下 (1％ AlCl3 乙醇 溶液 ) 显深黄色荧光， HCl-Mg 粉反应呈红色， Molish 反应呈阳性， 薄层酸水解检测有鼠李 糖。
紫外光谱 ： UV(MeOH)λmaxnm ： 257， 354。 -1
红 外 光 谱： IRvmax(KBr)cm ： 3400， 2930， 1656， 1606， 1454， 1346， 1291， 1200， 1165， 1074， 1058， 1040， 1021， 969， 917， 858， 716， 641。
质谱 ： ESIMS m/z ： 463.1[M-H] (negative)， 分子式 C21H20O12。 1
氢 谱： HNMR(Methanol， 600Hz)， δ： 6.95(2H， s， H-2’ ， 6 ′ )， 6.36(1H， d， J＝ 2.0Hz， H-6)， 6.20(1H， d， J ＝ 2.0Hz， H-8). 13
碳 谱 ： CNMR(Methanol ， 125Hz) δ ： 158.7(C-2) ， 136.5(C-3) ， 179.9(C-4) ， 163.4(C-5) ， 99.9(C-6) ， 166.0(C-7) ， 94.8(C-8) ， 159.6(C-9) ， 106.1(C-10) ， 122.1(C-1 ′ )， 109.8(C-2 ′ )， 147.0(C-3 ′ )， 138.1(C-4 ′ )， 147.0(C-5 ′ )，109.8(C-6 ′ )， 103.8(C-1 ″ )， 72.2(C-2 ″ )， 72.3(C-3 ″ )， 73.5(C-4 ″ )， 72.1(C-5 ″ )， 17.9(C-6″ )。
以上波谱数据与文献报道杨梅苷 (Myricitrin) 光谱数据一致。
实施例 2 ： 以杨梅树新鲜叶子 (8 月采摘 ) 为原料， 采用高速逆流色谱法分离杨梅 苷。
a. 提取粗提物 ： 以杨梅树新鲜叶子 (8 月采摘 )500g 为原料， 分析纯甲醇作为溶 剂， 回流提取， 合并滤液， 减压浓缩并干燥去溶剂得粗提取物干粉 40g ；
b. 分离、 纯化 ：
①将粗提物 500mg 以甲醇溶解， 并定溶 0.1g/ml， 均一澄清状态， 将按比例配置的 溶剂系统石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水， 两相溶剂体系， 以上相作为固定相， 下相作流动相 ；
②将上相在最大流速下泵入并充满离心管柱体， 管路由机器自带， 本研究所用仪 器为上海同田生物技术公司生产 TBE-300A 型高速逆流色谱仪， 然后将下相溶剂以 5ml/min 流速泵入离心管柱体， 同时开启检测器并按选定的转速 850 转每分钟， 启动主机 ；
③待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入， 管柱出口处 的流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站和记录仪记录， 收集组分。 结果 ：
在 1.5 小时便可分离制得纯品， 经 HPLC 测定纯度达 95％ ( 面积归一化法 )， 得率 1％ ( 以原料和单体比例换算 )。 相对于传统工艺反复使用硅胶柱层析以及 2-3 天的色谱周 期， 节省了大量的时间也提高了产率。
紫外光谱、 红外光谱、 碳谱、 氢谱及质谱数据同实施方案 1。
实施例 3 ： 以鬼箭锦鸡儿叶 ( 干燥叶 ) 为原料， 采用高速逆流色谱法分离杨梅苷。
a. 提取粗提物 ： 以鬼箭锦鸡儿叶 ( 干燥叶 )500g 为原料， 分析纯甲醇作为溶剂， 加 热回流对原料进行提取， 合并滤液， 减压浓缩并干燥去溶剂得粗提取物干粉 45g ；
b. 分离、 纯化 ：
①将粗提物 500mg 以甲醇溶解， 并定溶 0.1g/ml， 均一澄清状态， 将按比例配置的 溶剂系统石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水， 两相溶剂体系， 以上相作为固定相， 下相作流动相 ；
②将上相在最大流速下泵入并充满离心管柱体， 管路由机器自带， 本研究所用仪 器为上海同田生物技术公司生产 TBE-300A 型高速逆流色谱仪， 然后将下相溶剂以 5ml/min 流速泵入离心管柱体， 同时开启检测器并按选定的转速 850 转每分钟， 启动主机 ；
③待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入， 管柱出口处 的流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站和记录仪记录， 收集组分。
结果 ：
在 1.5 小时便可分离制得纯品， 经 HPLC 测定纯度达 90％ ( 面积归一化法 )， 得率 0.1％ ( 以原料和单体比例换算 )。 相对于传统工艺反复使用硅胶柱层析以及 2-3 天的色谱 周期， 节省了大量的时间也提高了产率。
紫外光谱、 红外光谱、 碳谱、 氢谱及质谱数据同实施方案 1。
实施例 4 ： 以蓄叶 ( 干燥叶 ) 为原料， 采用高速逆流色谱法分离杨梅苷。 蓄叶 ( 干燥叶 )500g 为原料， 分析纯丙酮作为溶剂， 电热套加a. 提取粗提物 ： 以热回流对原料进行提取， 合并滤液， 减压浓缩并干燥去溶剂得粗提取物干粉 48g ；b. 分离、 纯化 ：
①将粗提物 500mg 以甲醇溶解， 并定溶 0.1g/ml， 均一澄清状态， 将按比例配置的 溶剂系统石油醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水， 两相溶剂体系， 以上相作为固定相， 下相作流动相 ；
②将上相在最大流速下泵入并充满离心管柱体， 管路由机器自带， 本研究所用仪 器为上海同田生物技术公司生产 TBE-300A 型高速逆流色谱仪， 然后将下相溶剂以 5ml/min 流速泵入离心管柱体， 同时开启检测器并按选定的转速 850 转每分钟， 启动主机 ；
③待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入， 管柱出口处 的流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站和记录仪记录， 收集组分。
结果 ：
在 1.5 小时便可分离制得纯品， 经 HPLC 测定纯度达 93.5％ ( 面积归一化法 )， 得 率 0.1％ ( 以原料和单体比例换算 )。相对于传统工艺反复使用硅胶柱层析以及 2-3 天的 色谱周期， 节省了大量的时间也提高了产率。
紫外光谱、 红外光谱、 碳谱、 氢谱及质谱数据同实施方案 1。
实施例 5 ： 杨梅苷规格为 10mg/ 片的制备
处方 ：工艺 ：
1、 原、 辅料分别粉碎过 80 目筛备用 ；
2、 取 2％ HPMC 加浓度为 30 ～ 95％药用乙醇制成 5 ～ 10％的溶液， 即得 ；
3、 取杨梅苷、 微晶纤维素、 可压性淀粉、 羧甲基淀粉钠混合均匀， 加入 2％ HPMC 乙 醇溶液制软材， 16 目筛制粒， 60℃干燥 ；
4、 16 目筛整粒， 加入硬脂酸镁、 滑石粉混合 10 分钟， 使均匀， 压片即得。
实施例 6 ： 杨梅苷规格为 5mg/ 片的制备
处方 ：
工艺 ：1、 原、 辅料分别粉碎过 80 目筛备用 ；
2、 取 2％ HPMC 加浓度为 30 ～ 95％药用乙醇制成 5 ～ 10％的溶液， 即得 ；
3、 取杨梅苷、 微晶纤维素、 可压性淀粉、 羧甲基淀粉钠混合均匀， 加入 2％ HPMC 乙 醇溶液制软材， 16 目筛制粒， 60℃干燥 ；
4、 16 目筛整粒， 加入硬脂酸镁、 滑石粉混合 10 分钟， 使均匀， 压片即得。
实施例 7 ： 杨梅苷规格为 1.25mg/ 片的制备
处方 ：工艺 ：
1、 原、 辅料分别粉碎过 80 目筛备用 ；
2、 取 2％ HPMC 加浓度为 30 ～ 95％药用乙醇制成 5 ～ 10％的溶液， 即得 ；
3、 取杨梅苷、 微晶纤维素、 可压性淀粉、 羧甲基淀粉钠混合均匀， 加入 2％ HPMC 乙 醇溶液制软材， 16 目筛制粒， 60℃干燥 ；
4、 16 目筛整粒， 加入硬脂酸镁、 滑石粉混合 10 分钟， 使均匀， 压片即得。 实施例 8 ： 杨梅苷规格为 2.5mg/ 片的制备
处方 ：工艺 ：
1、 原、 辅料分别粉碎过 80 目筛备用 ；
2、 取 2％ HPMC 加浓度为 30 ～ 95％药用乙醇制成 5 ～ 10％的溶液， 即得 ；
3、 取杨梅苷、 微晶纤维素、 可压性淀粉、 羧甲基淀粉钠混合均匀， 加入 2％ HPMC 乙 醇溶液制软材， 16 目筛制粒， 60℃干燥 ；
4、 16 目筛整粒， 加入硬脂酸镁、 滑石粉混合 10 分钟， 使均匀， 压片即得。
实施例 9 ： 杨梅苷片剂在高温条件下的稳定性对比试验
取实施例五、 六、 七、 八四种规格的片剂各 10 片， 分别置密封洁净容器中， 在 60℃ 条件下放置 10 天 ； 分别于第 0 天、 第 5 天和第 10 天取样， 检测， 结果如下 ：
在 60℃高温条件放置变化情况
时间 杨梅苷 10mg/ 片 杨梅苷 5mg/ 片 杨梅苷 2.5mg/ 片 杨梅苷 1.25mg/ 片
0天： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化 5天： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化 10 天 ： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化由上表可见， 在高温 60℃条件下放置 10 天后， 杨梅苷片剂外观变化不大， 对高温 的稳定性很好。
实施例 10 ： 杨梅苷片剂高湿条件下的稳定性对比试验。
取实施例五、 六、 七、 八四种规格的片剂各 10 片， 置恒湿密闭容器中， 于 92.5％相对湿度条件下放置 10 天 ； 分别于第 0 天、 第 5 天和第 10 天取样， 检测， 结果如下 ：
在 92.5％相对湿度高湿条件下放置变化情况
时间 杨梅苷 10mg/ 片 杨梅苷 5mg/ 片 杨梅苷 2.5mg/ 片 杨梅苷 1.25mg/ 片
0天： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化 5天： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化 10 天 ： 外观 无变化 无变化 无变化 其中两片表面出现 2 到 5 个小坑由上表可见， 在高湿 92.5％相对湿度条件下放置 10 天后， 10mg/ 片与 8mg/ 片的片 剂外观无变化， 1.25mg/ 片的片剂其中两片表面出现 2 到 5 个小坑， 外观稍有变化， 表明杨梅 苷片剂对高湿稳定。
实施例 11 ： 杨梅苷片剂在强光照射条件下的稳定性对比试验。
取实施例五、 六、 七、 八四种规格的片剂各 10 片， 置光照箱， 于照度 5000Lx 条件下 放置 10 天， 分别于第 0 天第、 5 天和第 10 天取样， 检测， 结果如下 ：
在光照 5000Lx 条件下放置变化情况
时间 杨梅苷 10mg/ 片 杨梅苷 5mg/ 片 杨梅苷 2.5mg/ 片 杨梅苷 1.25mg/ 片
0天： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化 5天： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化 10 天 ： 外观 无变化 无变化 无变化 无变化由上表可见， 在光照 5000Lx 条件下放置 10 天后， 杨梅苷片剂对光照的稳定性很好。 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些 属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。