一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用.pdf

《一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用.pdf（19页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103087956 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103087956 A *CN103087956A* (21)申请号 201310023046.0 (22)申请日 2013.01.22 CGMCC No.6459 2012.08.17 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01G 13/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 海南业勤香蕉产业技术开发有限公 司 地址 570216 海南省海口市南海大道 1 号 申请人 中国热带农。

2、业科学院海口实验站 (72)发明人 付业勤 王必尊 龙自梅 金志强 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株防治香蕉枯萎病的细菌 及其应用。本发明所提供的细菌具体为芽孢杆 菌 （Bacillus sp.） Bsp.6， 它在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC No.6459。实验证明， 本发明所提供的芽孢 杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 能够 同时抑制古巴尖镰孢菌 （Fusantan o。

3、xysporumf spcubense） 1 号和 4 号小种。以所述芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 为活性成 分的菌剂能够防控粉蕉枯萎病， 其大田防控效果 达95%左右 ； 本发明所提供的芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459及其菌剂对于粉蕉枯萎 病具有显著的防控效果， 这将很大程度上促进香 蕉种植业的快速发展。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 11 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书1。

4、1页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103087956 A CN 103087956 A *CN103087956A* 1/2 页 2 1. 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6， 它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心的保藏编号为 CGMCC No.6459。 2. 菌 剂，它 的 活 性 成 分 为 权 利 要 求 1 所 述 的 芽 孢 杆 菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCCNo.6459。 3. 根 据 权 利 要 求 2 所 述 的 菌 剂， 其 特 征 在 于 ： 所 述 菌 剂 为 将 所 述 芽 孢 杆 菌 （Bac。

5、illussp.） Bsp.6CGMCC No.6459 接 种 到 培 养 基 中 培 养，得 到 菌 体 浓 度 为 3104-4.5105cfu/mL 的菌液 ； 所述培养基由如下原料制成 ： 黄豆粉、 距离地面 0.5-1.5 米的香蕉假茎、 蔗糖和水的配 比为 5g ： 10g ： 20g ： 1L。 4. 根据权利要求 3 所述的菌剂， 其特征在于 ： 所述培养基由黄豆粉滤液、 香蕉组织液、 所述蔗糖和所述水按照 100mL ： 100mL ： 20g ： 800mL 的配比混合， pH 为 7.07.2。 5. 根据权利要求 4 所述的菌剂， 其特征在于 ： 所述黄豆粉滤液的制备。

6、方法包括如下步 骤 ： 将所述黄豆粉与所述水按照 1g ： 30mL 至 1g ： 400mL 的比例混合而成， 煮沸后过滤， 获得 所述黄豆粉滤液 ； 所述香蕉组织液的制备方法包括如下步骤 ： 将所述香蕉假茎与所述水按照 1g ： 100mL 至 1g ： 25mL 的比例混合， 煮沸后过滤， 获得所述香蕉组织液。 6. 权利要求 1 所述的芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459， 或权利要求 2-5 中任一所述的菌剂在下述 a） 或 b） 中应用 ： a） 抑制枯萎病菌 ； b） 防治植物枯萎病。 7. 根据权利要求 6 所述应用， 其特征在于 ： 所。

7、述枯萎病菌为古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） ； 所述枯萎病为由古巴尖镰孢菌 （Fusantanoxysporum fsp cubense） 所引起的枯萎病 ； 所述植物为香蕉。 8. 利用权利要求 2-5 中任一所述的菌剂防治香蕉枯萎病的方法， 包括如下步骤 ： （1） 在香蕉组培苗定植后抽出第 1 片新叶、 第 2-3 片新叶、 第 4-5 片新叶和第 6-7 片新 叶这四个时期各施用 1 次所述菌剂 ； 所述施用的浓度如下 ： 四次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的 1/5-1/10 ； 所述施用的剂量如下 ： 前三次所述施用的剂量为 60-80。

8、g/ 株， 第四次所述施用的剂量 为 100g200g/ 株 ； 所述施用的方式如下 ： 四次所述施用的方式均为根部灌施 ； （2） 在香蕉苗定植大田后， 待 80%-90% 所述香蕉苗抽出新叶后 1 周内， 开始施用所述菌 剂， 直至 80%-90% 所述香蕉苗抽蕾后 1 周为止 ； 所述施用的频率为如下 （a） 和 （b） ： （a） 自 80%-90% 所述香蕉苗抽出新叶时起， 至所述香蕉苗定植大田 3 个月时止， 平均每 月施用 1 次所述菌剂 ； （b） 自所述香蕉苗定植大田 4 个月时起， 至 80%-90% 所述香蕉苗抽蕾后 1 周时止， 平均 每两个月施用 1 次所述菌剂 ； 。

9、所述施用的浓度如下 ： 所述 （a） 和 （b） 中的每次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的 1/5-1/10 ； 权 利 要 求 书 CN 103087956 A 2 2/2 页 3 所述施用的剂量如下 ： 所述 （a） 中的每次所述施用的剂量均为 400g600g/ 株 ； 所述 （b） 中的每次所述施用的剂量均为 1000g/ 株 ； 所述施用的方式如下 ： 所述 （a） 中的第一次所述施用的方式为根部灌施 ； 所述 （a） 中的 第二次及以后所述施用， 和所述 （b） 中的每次所述施用的方式均为环状布施 ； 所述环状布 施为在所述香蕉中部叶片外缘垂直对应的土壤部分施用所述菌剂。 9.根据。

10、权利要求8所述的方法， 其特征在于 ： 所述枯萎病为由古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 所引起的枯萎病 ； 所述植物为香蕉。 10. 根据权利要求 7 所述的应用， 或权利要求 9 所述的方法， 其特征在于 ： 所述古巴尖 镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 为古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporumf spcubense） 1 号小种和 / 或古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 4 号 小种。 权 利 要 求 书 CN 103087956 A 3 1/11 页。

11、 4 一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用。 背景技术 0002 粉蕉是香蕉的杂交栽培种， 因其果型小、 外型美、 果皮金黄、 皮薄肉白、 口感嫩滑甜 蜜、 清香、 营养丰富等特点， 深受广大消费者喜爱。 近十年来， 粉蕉种植得到快速发展。 目前， 广西、 广东和海南的粉蕉种植面积分别在5000、 500和200公顷左右。 由于枯萎病危害， 粉蕉 的规模化种植不仅受到严重制约， 而且需要轮作。 由古巴尖镰孢菌Fusarium oxysporumf. sp.cubense(E.F.Simth)Snyder et 。

12、Hansen 引起的香蕉枯萎病 （也称巴拿马病） 是一种毁 灭性的土传真菌病害， 自 1910 年巴拿马香蕉枯萎病大爆发至今， 已给南美、 非洲和亚洲的 各主要香蕉种植国造成惨重损失。古巴尖镰孢菌有 4 个生理小种， 其中， 对香蕉危害性最大 的是 1 号和 4 号小种， 均危害粉蕉。 0003 国内外对香蕉枯萎病的防治技术作了大量研究， 涉及化学防治、 间作 / 轮 作、 抗病品种培育和生物防治等多个方面。由于香蕉枯萎病是土传维管束病害， 病原 菌从根、 茎基部侵入后在维管束中侵染蔓延， 所以化学防治技术几乎是无效的 （Nel B,ViljoenA,Steinberg C,et al.Eva。

13、luation of chem ical substances for the mamagement and control ofFusarium wilt of bananaA.In Claudine Picq,Anne Vezina Eds20d Intem ationalsymposium on Fusarium wilt on banana BrazilC. Salvador de Bahia,2003.） 。韭菜与巴西香蕉轮作可显著降低枯萎病发生率 （黄永 红， 李春雨， 左存武， 等 . 韭菜对巴西香蕉枯萎病发生的抑制作用 . 中国生物防治学 报 ,2011,27(3):344-3。

14、48） 。室内试验表明， 韭菜叶片提取液对巴西香蕉和广粉 1 号粉蕉的 枯萎病防控效果在75%左右 （黄永红， 李春雨， 魏岳荣， 等.韭菜对香蕉枯萎病菌的拮抗及其 对盆栽香蕉枯萎病发生的抑制作用.浙江农业学报， 2011， 23(6) ： 1162-1166） 。 香蕉抗枯萎 病品种培育主要采用组培苗变异选择和毒素筛选两种方式。但是， 选育出的抗性品种往往 在产量和品质等方面都不理想 （黄秉智， 唐小浪， 许林兵， 等.香蕉抗枯萎病品种抗枯5号引 种试验 . 中国果树， 2009， 6 ： 17-19） 。至今， 香蕉抗枯萎病转基因育种尚未开始。因此， 用 绿色环保的生物防治方法来控制香蕉枯。

15、萎病越来越受到人们的重视 （钟群有， 郑卓辉， 彭增 明， 等 . 香蕉枯萎病生物防治研究概述 . 广东农业科学， 2007， 7 ： 64-65） 。 0004 目前， 国内外对香蕉枯萎病生物防治的研究刚刚起步， 主要集中在对香蕉枯萎病 4 号小种拮抗菌的筛选、 室内防治或短期田间试验方面。 这些拮抗菌涉及木霉菌 （Thandavelu R,Palaniswami A,Doraiswamy S,et al.The effect of Pseudomonasfluorescens and Fusarium oxysporumf. sp.cubense oninduction of defenc。

16、eenzymesandphenolics in banana.Biol Plantarum,2003,46(1):107-110） 、 青霉菌 （王宇光， 卢娟， 孙建波， 等.一株拮 抗香蕉枯萎病的青霉菌的分离及鉴定 . 中国农学通报， 2011， 27（04） ： 178-182） 、 放线菌 （茹 祥， 曾涛， 莫坤联， 等 . 海南吊罗山原始林区抗香蕉枯萎病土壤放线菌的分离及田间防治效 果试验 . 中国农学通报， 2012， 28(13) ： 97-102） 、 芽孢杆菌 （付业勤， 张科立， 潘羡心， 等 . 内 说 明 书 CN 103087956 A 4 2/11 页 5 生拮抗。

17、细菌 BEB2 的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用 . 热带作物学报， 2009， 30 （1） ： 80-85） 、 链霉菌 （林梅， 张绍升 . 链霉菌 F-1013 虾壳粉发酵液对 3 种植物病原真菌的 抑制作用 . 福建农林大学学报 ( 自然科学版 )， 2010， 39（6） ： 584-589） 和假单孢杆菌 （钟 小燕， 梁妙芬， 甄锡壮， 等 . 假单胞菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用 . 植物保护， 2009， 35（1） 86-89） 。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一株防治香蕉枯萎病的细菌及其应用。 0006 本发明所提供的细菌具体为芽孢杆菌 （Bacillus 。

18、sp.） Bsp.6。 该菌株已于2012年 8 月 17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC， 地址为 ： 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号） ， 保藏编号为 CGMCC No.6459。 0007 本发明的另一个目的是提供一种菌剂。 0008 本发明所提供的菌剂的活性成分为所述芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459。 0009 具体的， 所述菌剂为将所述芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459接种到 培养基中培养， 得到菌体浓度为 3104-4.5105cfu/mL 的菌液。

19、 ； 所述菌液的使用过程中， 可根据实际需要进行稀释， 调整使用浓度。 在本发明的一个实施例中， 所述菌剂具体为含有 3.8105cfu/mL 所述芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 的菌液。 0010 所述培养基可由如下配比的原料制成 ： 黄豆粉 （黄豆籽粒粉末） 、 距离地面0.5-1.5 米 （如 1.0 米） 的香蕉假茎、 蔗糖和水的配比为 5g ： 10g ： 20g ： 1L。 0011 进一步， 所述培养基可由黄豆粉滤液、 香蕉组织液、 所述蔗糖和所述水按照 100mL ： 100mL ： 20g ： 800mL 的配比混合而成， pH 。

20、为 7.0-7.2（如 pH7.0） 。 0012 所述黄豆粉滤液的制备方法具体可包括如下步骤 ： 将所述黄豆粉与所述水按照 1g ： 30mL 至 1g ： 400mL 的比例混合， 煮沸后过滤， 获得所述黄豆粉滤液 ； 所述煮沸的持续时 间为 20-60min。 0013 在本发明的一个实施例中， 所述黄豆粉与所述水的比例具体为 1g ： 100mL ； 所述煮 沸的持续时间具体为 20min。 0014 所述香蕉组织液的制备方法具体可包括如下步骤 ： 将所述香蕉假茎与所述水按照 1g ： 100mL 至 1g ： 25mL 的比例混合， 煮沸后过滤， 获得所述香蕉组织液 ； 所述煮沸的持。

21、续时 间为 20-40min。 0015 在本发明的一个实施例中， 所述香蕉假茎与所述水的比例具体为 1g ： 50mL ； 所述 煮沸的持续时间具体为 20min。 0016 在本发明的一个实施例中， 所述培养基的制备方法具体包括如下步骤 ： 0017 A） 所述黄豆粉滤液的制备 ： 称所述黄豆粉 5g， 加入到 500mL 所述水 （蒸馏水） 中， 煮沸 20 分钟后过滤， 获得所述黄豆粉滤液 （约 100mL） ； 0018 B） 所述香蕉组织液的制备 ： 取距离地面 1 米左右的所述香蕉假茎 20g， 加所述水 1000mL， 煮沸 20 分钟后过滤， 获得滤液即为所述香蕉组织液 （约。

22、 200mL） 。 0019 C） 将 100mL 步骤 A） 获得的所述黄豆粉滤液、 100mL 步骤 B） 获得的所述香蕉组织 液和 20g 蔗糖混合后， 调整 pH 至 7， 加蒸馏水 800mL， 即获得所述培养基。 说 明 书 CN 103087956 A 5 3/11 页 6 0020 所述芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459， 或所述的菌剂在下述 a） 或 b） 中应用也属于本发明的保护范围 ： 0021 a） 抑制枯萎病菌 ； 0022 b） 防治植物枯萎病。 0023 在上述应用中， 所述枯萎病菌具体可为古巴尖镰孢菌 （Fusantan。

23、 oxysporumf. sp.cubense） ； 所述枯萎病具体可为由古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporumf.sp.cubense） 所引起的枯萎病 ； 所述古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f.sp.cubense） 具体可为古巴 尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f.sp.cubense） 1 号小种和 / 或古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f.sp.cubense） 4号小种 ； 所述植物可为香蕉， 具体如粉蕉， 更加具体如粉蕉品种 广粉 1 号。 0024 本发明的又一个目的是提供一种利用所述菌剂防治香蕉枯萎。

24、病的方法。 0025 本发明所提供的利用所述菌剂防治香蕉枯萎病的方法具体可包括如下 （1） 和 （2） 的步骤 ： 0026 （1） 在香蕉组培苗定植后抽出第 1 片新叶、 第 2-3 片新叶、 第 4-5 片新叶和第 6-7 片新叶这四个时期各施用 1 次所述菌剂 ； 0027 所述施用的浓度如下 ： 四次所述施用的浓度均为所述菌剂浓度的 1/5-1/10， 如 1/10（即将所述菌剂进行 10 倍稀释） ； 0028 所述施用的剂量如下 ： 前三次所述施用的剂量为 60-80g/ 株， 如 60g， 第四次所述 施用的剂量为 100g-200g/ 株 （如 150g/ 株） ； 0029 。

25、所述施用的方式如下 ： 四次所述施用的方式均为根部灌施 ； 0030 （2） 在香蕉苗定植大田后， 待 80%-90% 所述香蕉苗抽出新叶后 1 周内， 开始施用所 述菌剂， 直至 80%-90% 所述香蕉苗抽蕾后 1 周为止 ； 0031 所述施用的频率为如下 （a） 和 （b） ： 0032 （a） 自 80%-90% 所述香蕉苗抽出新叶时起， 至所述香蕉苗定植大田满 3 个月时止， 平均每月施用 1 次所述菌剂 ； 0033 （b） 自所述香蕉苗定植大田第 4 个月时起， 至 80%-90% 所述香蕉苗抽蕾后 1 周时 止， 平均每两个月施用 1 次所述菌剂 ； 0034 所述施用的浓度。

26、如下 ： 所述 （a） 和 （b） 中的每次所述施用的浓度均为所述菌剂浓 度的 1/5-1/10， 如 1/10（即将所述菌剂进行 10 倍稀释） ； 0035 所述施用的剂量如下 ： 所述 （a） 中的每次所述施用的剂量均为 400g-600g/ 株 （如 500g/ 株） ； 所述 （b） 中的每次所述施用的剂量均为 800g-1200g/ 株 （如 1000g/ 株） 。 0036 所述施用的方式如下 ： 所述 （a） 中的第一次所述施用的方式为根部灌施 ； 所述 （a） 中的第二次及以后所述施用， 和所述 （b） 中的每次施用的方式均为环状布施 ； 所述环状布 施为在所述香蕉中部叶片外。

27、缘垂直对应的土壤部分施用所述菌剂。 0037 在上述方法中， 步骤 （1） 中在香蕉组培苗定植后抽出第 4-5 片新叶时施用所述菌 剂 （即第三次施用） 前在距离胶杯外缘 1cm 处伤根 1 圈。 0038 在上述方法中， 所述枯萎病可为由古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporumf. sp.cubense） 所引起的枯萎病 ； 所述古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f.sp.cubense） 具 体可为古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f.sp.cubense） 1 号小种和 / 或古巴尖镰孢菌 说 明 书 CN 103087956 A 6 。

28、4/11 页 7 （Fusantan oxysporum f.sp.cubense） 4 号小种 ； 所述香蕉具体可为粉蕉， 更加具体的可为 粉蕉品种广粉 1 号。 0039 在上述方法中， 所述菌剂浓度的 1/5-1/10 为将所述菌剂原液进行 5-10 倍稀释。 0040 本发明所提供的芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 能够同时抑制古 巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号和 4 号小种。以所述芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 为活性成分的菌剂能够防控粉蕉枯萎。

29、病， 其大田防控 效果达 95% 左右。本发明所提供的芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 及其菌 剂对于粉蕉枯萎病具有显著的防控效果， 这将很大程度上促进香蕉种植业的快速发展。 0041 保藏说明 0042 菌种名称 ： 芽孢杆菌 0043 拉丁名 ：（Bacillus sp.） 0044 菌株编号 ： Bsp.6 0045 保藏机构 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0046 保藏机构简称 ： CGMCC 0047 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 0048 保藏日期 ： 2012 年 8 月 17 日 0049 保藏中。

30、心登记入册编号 ： CGMCC No.6459 附图说明 0050 图 1 为 菌 株 Bsp.6 的 对 峙 试 验 结 果。 其 中， A 为 古 巴 尖 镰 孢 菌 （Fusantan oxysporumf sp cubense） 1号小种 ； B为菌株Bsp.6与古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporumf sp cubense） 1号小种的对峙 ； C为古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f sp cubense） 4 号小种 ； D 为菌株 Bsp.6 与古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号小 种的对峙。 。

31、0051 图 2 为芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 抑菌活性的检测结果。其 中， 1-6 分别表示组 1- 组 6。 0052 图 3 为芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 对香蕉枯萎病防治效果盆 栽试验结果 （植株存活率统计） 。其中， 1-6 分别表示组 1- 组 6。 具体实施方式 0053 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0054 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0055 菌株 ： 0056 芽孢杆菌 （Bacillus sp.）。

32、 BEB2， 即内生细菌 BEB2 或内生拮抗细菌 BEB2 ： 记载于 “付业勤.香蕉内生细菌BEB2菌株对香蕉枯萎病的防治作用研究.海南大学硕士学位论文， 2008” 一文， 以及 “付业勤， 张科立， 潘羡心等 . 内生拮抗细菌 BEB2 的分子鉴定及其对香蕉 枯萎病的抑制作用 . 热带作物学报， 2009 年 01 期” 一文中， 公众可从中国热带农业科学院 海口实验站获得。 0057 古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号小种和古巴尖镰孢菌 说 明 书 CN 103087956 A 7 5/11 页 8 （Fusantan oxyspor。

33、um fspcubense） 4 号小种， 即香蕉枯萎病菌 1 号和 4 号生理小种 ： 记载在 “曹永军， 程萍， 喻国辉等 . 香蕉枯萎病菌 1 号和 4 号生理小种在几种培养基上的生 长特性 . 热带作物学报， 2010 年第 08 期” 一文中， 公众可从中国热带农业科学院海口实验 站获得。 0058 培养基 ： 0059 NA 培养基 ： 牛肉浸膏 3g， 酵母浸膏 1g， 蛋白胨 5g， 葡萄糖 10g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1000mL， pH7.0。 0060 PDA 培养基 ： 马铃薯 200g， 蔗糖 20g， 琼脂 20g， 水 1000mL， pH 自然 （约 6.。

34、0） 。 0061 NB 液体培养基 ： 牛肉膏 5g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 蒸馏水 1000mL， pH7.2。 0062 菌株母液培养基 ： 牛肉浸膏 3g， 香蕉组织液 100-200mL， 蛋白胨 5g， 蒸馏水定容至 1000mL， pH7.0。 0063 扩大培养菌液培养基 ： 黄豆粉 2-10g， 加 200-400mL 水， 煮沸 20-60 分钟后过滤， 取 其滤液 100mL， 香蕉组织液 100-200mL， 蔗糖 20g-40， pH 值 7， 加蒸馏水至 1000mL。 0064 其中， 所述香蕉组织液的制备方法如下 ： 取距离地面 0.5-1.5 米左。

35、右的香蕉假茎 10-40g， 加水 1000mL， 煮沸 20-40 分钟， 过滤， 保存滤液， 即为香蕉组织液。 0065 实施例 1、 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6 的分离与鉴定 0066 一、 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6 的分离 0067 1、 采用组织分离法， 获取植物组织中的菌株 0068 从中国海南健康的大田粉蕉植株体上采集距地表 10-15cm 的根 （直径 0.2-0.5cm） 1-2g， 用自来水冲洗10-30min， 再依次用体积百分比为70%的乙醇和质量百分比为3.25%的 次氯酸钠消毒1min和3min， 然后用无菌水漂洗3。

36、次。 将根置于研钵中， 加无菌水充分研磨。 静置 15min 后， 吸上清液， 进行 10-1、 10-2、 10-3梯度稀释。各取 100L 稀释液， 涂布于 NA 培 养基平板， 对照涂布 100L 的第 3 次无菌水漂洗液。28培养 3-5 天后， 挑取形态完整、 差 异明显的单菌落， 在 NA 培养基平板上划线培养， 获得不同类型菌株。 0069 2、 抗性菌株分离 0070 （1） 香蕉枯萎病病原菌划线培养 0071 取 2 个 PDA 培养基平板， 分别划线接种古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporumfsp cubense） 1 号小种和古巴尖镰孢菌 （Fusantan。

37、 oxysporum fspcubense） 4 号小种， 28， 培养 3-5 天。 0072 （2） 不同类型菌株划线培养 0073 将步骤 1 得到的不同类型菌株分别划线接种于 PDA 培养基平板， 28， 培养 1-2 天。 0074 （3） 对峙实验检测抑菌效果 0075 从步骤 （2） 中培养分离得到的每个菌株的平板中挑取单菌落， 分别划线接种在两 个新的 PDA 培养基平板的一侧边缘， 在相对应的另一侧放置边长 3mm 含有病原菌菌丝的胶 块 （即两平板之一放置来自于步骤 （1） 中接种了古巴尖镰孢菌 （Fusantanoxysporum fsp cubense） 1 号小种培养。

38、后的 PDA 培养基胶块， 两平板中的另一放置来自于步骤 （1） 中接种了 古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f sp cubense） 4号小种培养后的PDA培养基胶块） ， 盖上盖子， 用保鲜膜封口， 放入 28条件下培养 5 至 7 天， 得到对枯萎病菌 - 古巴尖镰孢菌 说 明 书 CN 103087956 A 8 6/11 页 9 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号小种和古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f spcubense） 4 号小种均有较强抑制作用的菌株， 将其中一个菌株记作 Bsp6。菌株 Bsp6。

39、 的对峙试验结果如图 1 所示。 0076 二、 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6 的鉴定 0077 从以下几个方面鉴定步骤一分离得到的菌株 Bsp.6 ： 0078 1、 形态学鉴定 0079 对于处于对数生长期的菌株 Bsp.6， 经涂片染色后采用光学显微镜观察， 其主要形 态特征为 ： 大小为 （0.5 1.0m） （1.52.3m） ， 浅黄白色， 不透明， 湿润、 菌体表面有 褶皱， 边缘不规则。 0080 2、 生理生化特征分析 0081 采用常规生理生化鉴定方法对菌株 Bsp.6 进行鉴定， 结果如表 1。 0082 表 1 菌株 Bsp.6 的生理生化特征 0。

40、083 0084 注 ：“+” 表示能利用该物质，“-” 表示不能利用该物质。 0085 3、 16s rDNA 序列同源性分析 0086 常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株 Bsp.6， 提取菌株的总 DNA 作为基因 说 明 书 CN 103087956 A 9 7/11 页 10 扩增模板， 以细菌 16s rDNA 通用引物， 27f ： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 1492r ： 5 -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3进行 PCR 反应。应程序为 ： 95变性 30s、 55退火 1min、 72延伸 2min， 共 30 个循环。反应结束。

41、后进行 DNA 测序， 序列拼接及相似性分析， 序 列比对通过美国国家生物技术信息中心 NCBI 数据库 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov） 在 线完成。 0087 菌株 Bsp.6 的 16s rDNA 的序列详见序列表中序列 1。 0088 4、 菌株 Bsp.6 生长最适温度的确定 0089 将 12 份 100L OD600值为 0.5 的菌株 Bsp.6 的菌液分别接种于 12 个装有 200mL NB 液体培养基的 500mL 三角瓶中， 在不同温度 （10 45， 具体取值如表 2 所示） 条件下， 160rpm 恒温培养 24 小时后测量其 OD600值。。

42、 0090 结果如表 2 所示， 结果表明在 26 33培养时， 菌株 Bsp.6 的菌液 OD600值为 2.385 2.701， 表明该菌株培养温度 26 33为宜， 最适温度为 30， OD600值为 2.701。 0091 表 2 菌株 BSP.6 菌株在不同温度条件培养时生长状况 0092 温度10152024 OD600值01.9080.0302.0130.1542.2750.014 温度26283033 OD600值2.4230.0372.5610.0082.7010.0222.3850.017 温度36394245 OD600值2.2120.0561.8390.0360.679。

43、0.0120 0093 5、 菌株 Bsp.6 生长最适 pH 值的确定 0094 将 13 份 100L OD600值为 0.5 的菌株 Bsp.6 的菌液分别接种于 13 个装有 200mL NB 液体培养基的 500mL 三角瓶中， 分别将培养液调节至起始 pH 值 （4 12， 如表 3 所示） 条 件下， 160rpm28培养 24 小时后测量其 OD600值。 0095 结果如表 3 所示， 结果表明在培养基 pH 值 6.5 8.5 培养时， 菌液 OD600值为 2.516 2.701， 表明该菌株培养 pH 值以 6.5 8.5 为宜， 最适 pH 值为 7， OD600值达。

44、 2.701。 0096 表 3 菌株 BSP.6 菌株在不同 pH 值时生长状况 0097 说 明 书 CN 103087956 A 10 8/11 页 11 0098 鉴于上述形态、 生理生化特征分析和 16s rDNA 序列同源性分析等结果， 将步骤一 分离得到的菌株 Bsp.6 鉴定为芽孢杆菌 （Bacillus sp.） 。该菌株已于 2012 年 8 月 17 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区 北辰西路 1 号院 3 号） ， 保藏编号为 CGMCC No.6459。 0099 实施例 2、 芽孢杆菌 （Bacil。

45、lus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 抑菌活性的检测 0100 本实施例对实施例 1 获得的芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 对古 巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号小种和 4 号小种的抑制效果进行 了检测。同时以芽孢杆菌 （Bacillus sp.） BEB2 为对照。分组如表 4 所示。 0101 表 4 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 抑菌活性实验分组 0102 组别拮抗菌病原菌 1芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6C。

46、GMCC No.6459古巴尖镰孢菌 1 号小种 2芽孢杆菌 （Bacillus sp.） BEB2古巴尖镰孢菌 1 号小种 3-古巴尖镰孢菌 1 号小种 4芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459古巴尖镰孢菌 4 号小种 5芽孢杆菌 （Bacillus sp.） BEB2古巴尖镰孢菌 4 号小种 6-古巴尖镰孢菌 4 号小种 0103 注 ：“-” 表示不加入相应菌株。 0104 在 PDA 培养基平板上一侧沿一直线划线接种拮抗菌， 而在另一侧分别接入直径约 5mm 的病原菌菌块， 两者相距 3cm 左右， 保证组与组之间实验菌和病原菌接种量相等。接 种后。

47、， 置于 28下培养 67d， 抑菌带出现， 观察各组中病原菌菌落生长情况， 测量抑菌距离 （拮抗菌与病原菌之间的距离） 。实验中， 每组设 3 次重复， 试验重复 2 次， 结果取平均值。 0105 抑 菌 距 离 测 量 结 果 如 图 2 所 示， 结 果 表 明， 芽 孢 杆 菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCCNo.6459对古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum f sp cubense） 1号小种和4号 小种均有良好的抑制效果， 特别是对古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号小种的抑制效果显著高于 （p。

48、0.05） 对照菌株芽孢杆菌 （Bacillus sp.） BEB2。 0106 实施例 3、 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 对香蕉枯萎病防治效果 的检测 0107 本实施例对实施例 1 获得的芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 对由 古巴尖镰孢菌 （Fusantan oxysporum fspcubense） 1 号小种和 / 或 4 号小种引起的香 蕉枯萎病的防治效果进行了盆栽试验检测。同时以芽孢杆菌 （Bacillus sp.） BEB2 作为对 照菌株。实验分组及菌株接种方式如表 5 所示。 0108 表 5 芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459 对香蕉枯萎病防治效果盆栽 试验实验分组及接种方式 0109 说 明 书 CN 103087956 A 11 9/11 页 12 组别首次接种 （0d）第二次接种 （30d） 1-古巴尖镰孢菌 1 号小种 2-古巴尖镰孢菌 4 号小种 3芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.6459古巴尖镰孢菌 1 号小种 4芽孢杆菌 （Bacillus sp.） Bsp.6CGMCC No.64。