《在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法.pdf（16页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103088000 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103088000 A *CN103088000A* (21)申请号 201310009844.8 (22)申请日 2013.01.10 201210080666.3 2012.03.23 CN C12N 9/20(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/877(2010.01) A01K 67/027(2006.01) (71)申请人 北京济福霖生物技术有限公司 地址 100193 北。
2、京市海淀区马连洼北路 158 号众鼎大厦 306 室 (72)发明人 王媛媛 赵要风 李宁 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方 法 (57) 摘要 本发明提供了一种在哺乳动物乳腺中过表达 胆盐激活脂酶的方法， 其是将编码人源胆盐激活 脂酶的基因转入哺乳动物中， 从而实现在哺乳动 物乳腺中过表达人源胆盐激活脂酶。本发明利用 构建 BSSL 乳腺特异表达载体， 制备转基因小鼠， 在小鼠乳腺中过表达人的胆盐激活脂酶， 其在转 基因小鼠奶中的表达量可达 0.38mg/ml， 活性为 914。
3、73.94mU/ml。 利用高表达胆盐激活脂酶的转基 因奶饲喂早产幼鼠， 结果表明早产小鼠的存活率 较饲喂野生鼠奶提高了约 10%。为今后利用大型 家畜乳腺生物反应器生产人源胆盐激活脂酶打下 基础。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103088000 A CN 103088000 A *CN103088000A* 1/1 页 2 1. 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法， 。
4、其特征在于， 其是将编码人源胆盐 激活脂酶的基因转入哺乳动物中， 从而实现在哺乳动物乳腺中过表达人源胆盐激活脂酶。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 其是将编码人源胆盐激活脂酶的基因通 过显微注射法、 体细胞克隆法或精子载体法转入哺乳动物中。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 人源胆盐激活脂酶的氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 编码人源胆盐激活脂酶的基因序列如SEQ ID No.2 所示。 5.根据权利要求1或2所。
5、述的方法， 其特征在于， 所述哺乳动物为大猩猩、 猫、 狗、 雪貂、 小鼠。 6. 含有编码人源胆盐激活脂酶的基因的乳腺特异表达载体。 7. 根据权利要求 6 所述的表达载体， 其特征在于， 其出发载体为 pBC1。 8. 含有权利要求 6 或 7 所述表达载体的转基因哺乳动物细胞。 9. 一种制备克隆胚胎的方法， 其以权利要求 8 所述的转基因细胞为核移植供体细胞， 离体的卵母细胞为核移植受体细胞， 通过核移植技术获得克隆胚胎。 10. 一种制备转基因家畜的方法， 其是将权利要求 9 所述方法制备的克隆胚胎通过非 手术法移入家畜子宫内进行妊娠， 获得转基因家畜。 权 利 要 求 书 CN 1。
6、03088000 A 2 1/6 页 3 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 特别是涉及一种在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂 酶的方法。 背景技术 0002 胆盐激活脂酶 (Bile salt-stimulated lipase,BSSL) 被发现存在于人、 大猩猩、 猫、 狗、 雪貂、 小鼠的奶中， 而牛奶中却不存在， 其活性可在婴儿胃部酸性条件及胃蛋白酶水 解条件下保持稳定， 对于新生儿肠道吸收奶中甘油三酯起着非常重要的作用。BSSL 活性 在婴儿胃液的 pH 环境下稳定， 胆盐保护其免受胰蛋白失活， 直到与十二脂肠中的胆盐混合 BSSL。
7、 才能水解奶中甘油三脂。BSSL 在胃部酸性条件及胃蛋白酶水解条件下保持活性的原 因主要是 BSSL 有氧联的糖基化重复部位。因为粘蛋白起到保护作用， 其中可以确定的是保 护小肠和胃黏膜上皮抵抗酸性条件和不被蛋白酶水解。相对于胰脂酶， BSSL 水解乳化胶溶 和水溶的底物， 并且没有位置特异性。 0003 BSSL 是一种分泌型酶， 主要在泌乳期乳腺和外分泌的胰腺中表达， 在小肠中被胆 盐激活。BSSL 占胰液中酶含量的 5%。敲除 BSSL 的小鼠表明缺少 BSSL 不影响小肠对非酯 化脂肪的吸收。但在消化道中 BSSL 对胆甾醇酯的水解活性是独一无二的， 而对于甘油三酯 和磷脂的有效水解来。
8、说是辅助的。BSSL 负责调节小肠对胆甾醇酯的吸收， 但对于游离的胆 固醇的吸收不起主要作用。 0004 人、 大鼠、 小鼠的 BSSL 基因保守地拥有 11 个外显子和 10 个内含子。每一个外显 子都有一个关键结构和 / 或功能区域。例如， 1 号外显子编码信号肽， 3 号外显子包含第一 个分子内的半胱氨酸交联， 而第二个分子内的半胱氨酸交联是由 7 号外显子编码的。活性 位点丝氨酸 -194、 组氨酸 -435、 天冬氨酸 -320 分别被 5、 8、 10 号外显子编码。表面的环由 4 号外显子编码部分覆盖在活性位点的凹槽。在不同物种中保守性最低的外显子是 11 号， 其编码氧联糖基化。
9、区域和羧基末端富含脯氨酸的重复单元。11 号外显子核苷酸序列最重 要的不同是富含脯氨酸的重复单元数目的不同。根据以前的报道， 大鼠和小鼠的 BSSL 基因 分别有 4 和 3 个重复单元。相比较而言， 人的 BSSL 基因具有高度的多态性， 大多数共有的 等位基因编码 16 个重复单元的蛋白。高频率的多态性是由于基因 3 末端高变区的存在。 5 末端序列具有经典的 TATA 和 CCAAT 元件， 与组织特异表达相关。BSSL 基因的上游序列 也含有 AP1、 AP2 和 SP1 绑定位点的共有序列。然而， 还不能确定这些顺式元件对调控 BSSL 基因表达功能方面的作用。 发明内容 0005 。
10、本发明的目的是通过基因工程技术， 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶。 0006 为了实现本发明目的， 本发明的一种在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方 法， 其是将编码人源胆盐激活脂酶的基因转入哺乳动物中， 从而实现在哺乳动物乳腺中过 表达人源胆盐激活脂酶。 说 明 书 CN 103088000 A 3 2/6 页 4 0007 优选地， 前述方法是将编码人源胆盐激活脂酶的基因通过显微注射法、 体细胞克 隆法或精子载体法等方法转入哺乳动物中， 以实现在哺乳动物乳腺中过表达人源胆盐激活 脂酶。 0008 其中， 人源胆盐激活脂酶的氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 或该序列经替换、。
11、 缺 失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 0009 优选地， 编码上述人源胆盐激活脂酶的基因序列如 SEQ ID No.2 所示。 0010 前述的方法， 所述哺乳动物为大猩猩、 猫、 狗、 雪貂、 小鼠等。 0011 本发明还提供含有编码人源胆盐激活脂酶的基因的乳腺特异表达载体。 优选的出 发载体为 pBC1。 0012 本发明还提供含有上述表达载体的转基因哺乳动物细胞。 0013 本发明还提供一种制备克隆胚胎的方法， 其以上述转基因细胞为核移植供体细 胞， 离体的卵母细胞为核移植受体细胞， 通过核移植技术获得克隆胚胎。 0014 本发明进一步提供一种制备转基因家畜的方。
12、法， 其是将上述方法制备的克隆胚胎 通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠， 获得转基因家畜。 0015 本发明利用构建 BSSL 乳腺特异表达载体， 制备转基因小鼠， 在小鼠乳腺中过表达 人的胆盐激活脂酶， 其在转基因小鼠奶中的表达量可达 0.38mg/ml， 活性为 91473.94mU/ ml。利用高表达胆盐激活脂酶的转基因奶饲喂早产幼鼠， 结果表明早产小鼠的存活率较饲 喂野生鼠奶提高了约 10%。为今后利用大型家畜乳腺生物反应器生产人源胆盐激活脂酶打 下基础。 附图说明 0016 图 1 为 pBC-hBSSL 载体线性化酶切回收结构图。 0017 图 2 为双酶切 pBC-hBSSL 载。
13、体后， 回收用于显微注射的目的片段的电泳结果 ； 其 中， M 为 /Hind 分子量标准 ； pBC-hBSSL 为 18kb 线性化的载体片段。 0018 图 3 为转基因小鼠制备流程。 0019 图 4 为 PCR 检测 F0 代阳性转基因小鼠结果 ； 其中， M 为 1kb 梯度 DNA 分子量标准 ; 转基因小鼠基因组分别为 4、 6、 9、 13、 14、 24、 25 和 29， WT 为阴性对照， P 为阳性质粒的 PCR 结果。 0020 图 5 为 Southern 杂交检测转基因小鼠基因组中外源基因的整合 ； 其中， M 为 1kb 梯度 DNA 分子量标准 ； WT 为。
14、野生型小鼠对照 ； P1、 P5、 P10 分别为相当于 1、 5、 10 拷贝数的阳 性质粒对照杂交结果 ； 4、 6、 9、 13、 14、 24、 25 和 29 分别为 F0 代阳性小鼠对应基因组的杂交 结果。 0021 图 6 为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的存活率状况 ； 其 中， H为人奶样品杂交结果 ； WT为野生型小鼠乳样杂交对照 ； 9、 13、 14、 24、 25和29分别为F0 代阳性小鼠乳样杂交结果。 0022 图 7 为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的存活率状况 ； 其 中， WN， 野生型母鼠代哺正常生产的幼仔 ； BN, 转基。
15、因母鼠代哺正常生产的幼仔 ； BP， 转基因 母鼠代哺早产幼仔 ； WP， 野生型母鼠代哺早产幼仔 ； 每组分别为 3 只母鼠共代喂 30 只幼仔。 0023 图 8 为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的体重增长状况 ； 其 说 明 书 CN 103088000 A 4 3/6 页 5 中， WN， 野生型母鼠代哺正常生产的幼仔 ； BN, 转基因母鼠代哺正常生产的幼仔 ； BP， 转基因 母鼠代哺早产幼仔 ； WP， 野生型母鼠代哺早产幼仔。每组控制在 8-10 幼仔。对幼仔的体重 测定从第一天一直到断奶的第 21 天， 每天上午 9:00-12:00 进行测定。 0024 图。
16、 9 为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的粪便主要成分的 状况 ； 其中， WN， 野生型母鼠代哺正常生产的幼仔 ； BN, 转基因母鼠代哺正常生产的幼仔 ； BP， 转基因母鼠代哺早产幼仔 ； WP， 野生型母鼠代哺早产幼仔。 具体实施方式 0025 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0026 以下实施例所使用的载体、 试剂及其来源 ： 0027 pBC1 载体 (Invitrogen)， 含有人脂蛋白脂酶 cDNA 序列的 IRATp970H1068D 载体购 自 Imagene。
17、s 公司。引物合成及序列测定由上海生工完成。实验动物用昆明小白鼠， 购自北 京实验动物中心。Taq 酶、 T4DNA 连接酶、 内切酶均为 Biolabs 公司产品 ； 质粒纯化及回收试 剂盒为 Omega 公司产品 ； 同位素标记试剂盒购自 Promega 公司 ； 放射性同位素 -32P-dCTP 以及 Southern 杂交膜购自美国 Amershambiosciences 公司。抗人胆盐激活脂酶的一抗购 自 Santa Cruz 公司。BSSL 含量检测 ELISA 试剂盒购自 GBD 公司。甘油三酯、 胆固醇、 葡萄 糖检测试剂盒购自中生北控公司， BCA 蛋白检测试剂盒购自碧云天公。
18、司。酶切、 连接、 回收、 转化、 PCR 扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见 分子克隆 ( 第三版 ) 。 0028 实施例 1 人源 BSSL 乳腺表达载体构建 0029 以 IRATp970H1068D 质粒为模板 PCR 扩增得到人源 BSSL 基因 cDNA 序列。用于扩 增 cDNA 序列的一对引物为 hBSSL-F(5 -CCGCTCGAGACCATGCTCACCATGGGGCGC-3 ) 和 hBS SL-R(5-CCGCTCGAGTTCAGGGGTATGAGGCTTTAT-3)， 分别在引物中引入XhoI酶切位点。 将 扩增序列回收， 克隆到经过XhoI酶切的pBC1载体中。
19、(图1)， 通过PCR鉴定插入片段序列及 方向， 并进行测序， 最终将插入正确的表达载体命名为 pBC-hBSSL。 0030 实施例 2 转基因小鼠模型的建立及检测 0031 1.1 显微注射生产转基因小鼠 0032 研究表明， 用显微注射法生产转基因小鼠， 线性 DNA 比环状 DNA 整合效率高， 因此 要将构建好的表达载体 pBC-hLPL 酶切去除无用的原核部分同时线性化后进行显微注射。 0033 用 NotI/SalI 酶切构建好的表达载体 pBC-hBSSL， 去掉原核载体骨架结构部分， 然 后将酶切 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳， 切下待回收的含目的片段的 18kb 所在位置处的。
20、凝胶， 利用可回收 10kb 以上 DNA 片段的凝胶回收试剂盒 (Omega) 进行回收， 结果如图 2 所示。 0034 将回收片段溶于TE溶液(10mmol/L Tris.cl(pH7.4)， 0.1mmol/LEDTA， 用Milli-Q 水配制 ) 后， 紫外分光光度计中测定 260nm 和 280nm 下 OD 比值并计算浓度， 上述两种纯化 方法的 OD260/OD280 比值都在 1.8 以上， 可用于注射小鼠受精卵。将含有外源基因片段的 TE 溶液稀释至终浓度 2.5ug/ml， 注射到小鼠受精卵的雄原核， 然后移植到同期发情的假孕 母鼠输卵管中。转基因小鼠制备流程如图 3 。
21、所示。 0035 1.2 转基因小鼠的 PCR 检测 0036 取 3 周龄转基因小鼠的尾巴组织样， 提取 DNA。以提取好的基因组为模板， 利用人 说 明 书 CN 103088000 A 5 4/6 页 6 源 BSSL cDNA 序列设计的引物 (L-F:5 -GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3 ， L-R:5 -ACAGG TAGTTGTTGAGGAAGTT-3 )在转基因阳性小鼠中可以扩增出499bp大小的片段， 以野生型小鼠 基因组为阴性对照， 以载体 pBC-hBSSL 为阳性对照。扩增条件为 94， 30sec ； 58， 30sec ； 72， 90s。
22、ec ； 30 个循环。1.0% 琼脂糖电泳观察结果。PCR 在 F0 代 42 只小鼠中检测出 8 只 阳性小鼠， 结果如图 4 所示， 第 4、 6、 9、 13、 14、 24、 25 和 29 号均为转基因阳性小鼠。 0037 1.3 转基因小鼠的 Southern blotting 检测 0038 将 PCR 检测为阳性的 F0 代 8 只转基因小鼠， 剪尾部组织提取基因组， 取 10g 用 PstI 内切酶消化， 以 PstI 酶切的野生型小鼠基因组为阴性对照， PstI 酶切的 pBC-hBSSL 注 射载体片段为阳性对照， 杂交探针是以人 BSSLcDNA 为模板利用 PCR 。
23、扩增后回收 1.1kb 的基 因片段 ( 引物为 S-F:5 -AGACCCTCTCCCCCTACAACAA-3 ， S-R:5 -GGCATATGAGCTTCCTTGGAGT- 3 )。 将样品低压慢速电泳， 采用碱转移方法将DNA从琼脂糖转移至尼龙膜， 将尼龙膜有DNA 的一面朝内 , 卷成筒状放入杂交管中， 加入预杂交液， 于 65 C 预杂交不短于 1hr， 加入经 过加热变性的 -P32dCTP 同位素标记的探针 ,65 C 杂交 1216hr， 洗膜后用保鲜膜包好 , 放进暗盒中 , 暗室中压上 X 光片 , 于 -70 C 放射自显影， 12 小时冲洗 X 光片观察结果。 Sou。
24、thern blotting 结果如图 5 所示， 结果表明阳性小鼠 Southern blotting 检测结果与 PCR 检测结果一致。 0039 实施例 3 重组人 BSSL 在转基因小鼠乳样中的表达分析 0040 1.1 转基因小鼠乳样的 Western blotting 检测 0041 采集 F0 代 9、 13、 14、 24、 25 和 29 号小鼠泌乳中期的奶样， 野生型小鼠乳汁作为阴 性对照， 人奶为阳性对照。乳汁在小鼠出生后第 8-12 天采集， 采集前将母鼠与仔鼠分离 3 小时以上， 并向腹腔注射一定剂量的催产素。将离心后去除乳脂和酪蛋白的乳清在 10% 的 SDS-PA。
25、GE上电泳后转到尼龙膜上。 用抗人的BSSL一抗进行WesternBlot分析， 即可检测重 组人 BSSL 在转基因小鼠乳汁中的表达。重组人 BSSL 与人奶中 BSSL 分子量大小相一致， 约 为 100kDa， 结果如图 6 所示。 0042 1.2 转基因小鼠乳样中 BSSL 表达量分析 0043 采用 ELISA 法对转基因小鼠乳汁中的 BSSL 表达量进行分析， 选取了 6 只转基因 小鼠泌乳中期的奶样进行检测。由于采用商业化的 ELISA 试剂盒， 并不能有效地区分人源 与鼠源的 BSSL， 因而本发明检测了 6 只野生型小鼠泌乳中期的奶样作为对照 （具体操作按 说明书） 。转基。
26、因鼠表达的 BSSL 含量显著高于野生型鼠奶中的 BSSL 含量， 最高表达量达到 0.38mg/ml（表 1） 。 0044 1.3 转基因小鼠奶样中 BSSL 的活性检测 0045 采用与进行 BSSL 表达量分析所使用的同样一批转基因和野生型的鼠奶进行酶活 性的检测。使用含 3H 标记三油酸甘油酯的甘油乳剂为底物， 标本与底物 37孵育反应后通 过抽提将甘油酯与游离脂肪酸分开， 脂解产生的游离脂肪酸的放射活性与标本中脂肪酶的 活性成正比的放射性同位素标记法测定体外 BSSL 活性。具体操作可参考张爱宏， 刘国庆， 放射性同位素标记法检测脂蛋白脂肪酶活性及其应用） 。检测结果如表 1 所示。
27、。 0046 表 1 转基因鼠奶及野生型鼠奶在泌乳中期 BSSL 表达量和活性统计表 0047 说 明 书 CN 103088000 A 6 5/6 页 7 0048 0049 *P0.05;*P0.001。以上数据代表平均值 0050 实施例 4 转基因鼠奶对早产幼鼠生长影响的检测 0051 1.1 对早产幼仔存活率的检测 0052 转基因与野生型母鼠分别代喂早产与正常生产的幼仔， 所有的幼仔均不是生母喂 养， 每只母鼠代喂得幼仔控制在 8-10 只， 幼仔间不进行性别区分。正常生产的小鼠来源于 自然分娩， 早产小鼠通过对怀孕 19 天的孕鼠剖腹产获得。 0053 正常生产的幼仔无论是转基因。
28、还是野生型母鼠代喂， 其存活率为 100%。而早产小 鼠的存活率由转基因母鼠代喂的为 93.3% 高于由野生型母鼠代喂的 83.3%( 图 7)。 0054 1.2 对早产幼仔胃中 BSSL 活性的检测 0055 对母乳中BSSL在胃中的活性检测是确保BSSL没有被胃中消化酶所降解及确保其 在幼鼠消化道中活性的。在出生后第 10 天， 正常生产的小鼠饲喂转基因奶的胃中 BSSL 显 著高于早产小鼠饲喂转基因奶的。 早产小鼠由转基因母鼠代喂的较由野生型母鼠代喂的来 说， 胃容物中 BSSL 活性在第 10 天增加了 108%， 在第 20 天增加了 73%（表 2） 。 0056 表 2 出生后。
29、第 10 天和第 20 天， 正常生产和早产幼仔胃中母乳的 BSSL 活性 0057 0058 说 明 书 CN 103088000 A 7 6/6 页 8 0059 *P0.05;*P0.01。n 为实验动物数目。 0060 1.3 早产幼仔断奶前体重增长的测定 0061 早产和正常生产的幼仔出生时的体重均值分别在 1.50g 和 2.06g。由图 8 可以看 出， 转基因奶饲喂的早产儿较野生型饲喂的体重增长显著， 在断奶的第 21 天， BP 组和 WP 组 幼仔的体重均值分别为 12.38 和 8.61g， BP 组较 WP 增长了 43.79%。 0062 1.4 早产幼仔断奶前粪便中。
30、主要成分的测定 0063 对粪便中主要成分的测定是为了分析小鼠营养成分的流失状况。 对幼仔哺乳期的 粪便中的主要成分 （脂肪、 蛋白质、 干物质） 进行测定， 各成分以在粪便中所占百分比如图 9 所示(*P0.01,*P0.05)， 粪便中脂肪的含量， BN组为WN组中的71.16%(P0.01) ； BP组为 WP 组的 67.66%(P0.05)。粪便中蛋白和干物质的含量各组间没有显著性差异。 0064 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基。
31、础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103088000 A 8 1/5 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103088000 A 9 2/5 页 10 0003 序 列 表 CN 103088000 A 10 3/5 页 11 0004 序 列 表 CN 103088000 A 11 4/5 页 12 0005 序 列 表 CN 103088000 A 12 5/5 页 13 序 列 表 CN 103088000 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103088000 A 14 2/3 页 15 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103088000 A 15 3/3 页 16 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103088000 A 16 。