用于生物合成芳族化合物、2,4戊二烯酸和1,3丁二烯的微生物和方法.pdf

本发明提供了非天然存在的微生物体，其具有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸盐、(2-羟基-4-氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4-戊二烯酸、3-丁烯-1-醇或1,3-丁二烯途径。本发明另外提供了使用这样的生物体来生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸盐、(2-羟基-4-氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4-戊二烯酸、3-丁烯-1-醇或1,3-丁二烯的方法。

权利要求书一种非天然存在的微生物体，包括具有甲苯途径的微生物体，所述甲苯途径包含至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达，所述甲苯途径选自：(A)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或两种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，和3)苯乙醛脱羰酶；(B)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱氢酶和苯乙醛氧化酶中的一种或多种，和4)苯乙酸脱羧酶；(C)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸氧化酶，和3)苯乙酸脱羧酶；和(D)1)苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，2)苯丙酮酸氧化酶和3)苯乙酸脱羧酶。
根据权利要求1所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求1所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含3种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求3所述的非天然存在的微生物体，其中所述3种外源核酸编码：1)苯丙氨酸氨基转移酶或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱羰酶。
根据权利要求1所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含4种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求5所述的非天然存在的微生物体，其中所述4种外源核酸编码：1)苯丙氨酸氨基转移酶或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱氢酶或氧化酶，和4)苯乙酸脱羧酶。
根据权利要求1所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求1所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产甲苯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有甲苯途径的非天然存在的微生物体足以生产甲苯的时间段，所述甲苯途径包含至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达，所述甲苯途径选自：(A)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或两种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，和3)苯乙醛脱羰酶；(B)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱氢酶和苯乙醛氧化酶中的一种或多种，和4)苯乙酸脱羧酶；(C)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸氧化酶，和3)苯乙酸脱羧酶；和(D)1)苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，2)苯丙酮酸氧化酶和3)苯乙酸脱羧酶。
根据权利要求9所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物体包含2种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物体包含3种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求12所述的方法，其中所述3种外源核酸编码：1)苯丙氨酸氨基转移酶或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，和3)苯乙醛脱羰酶。
根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物体包含4种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求14所述的方法，其中所述4种外源核酸编码：1)苯丙氨酸氨基转移酶或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱氢酶或氧化酶，和4)苯乙酸脱羧酶。
根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
一种非天然存在的微生物体，包括具有苯途径的微生物体，所述苯途径包含至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达，所述苯途径包含苯丙氨酸苯‑裂合酶。
根据权利要求17所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是所述苯丙氨酸苯‑裂合酶。
根据权利要求17所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求17所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产苯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有苯途径的非天然存在的微生物体足以生产苯的时间段，所述途径包含至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达，所述苯途径包含苯丙氨酸苯‑裂合酶。
根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是所述苯丙氨酸苯‑裂合酶。
根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求21所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种非天然存在的微生物体，包括具有苯乙烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码苯乙烯途径酶的外源核酸，所述苯乙烯途径酶以足以生产苯乙烯的量表达，所述苯乙烯途径选自：(A)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种或多种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶；或(B)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含3种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含4种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含5种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求29所述的非天然存在的微生物体，其中所述5种外源核酸编码：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含6种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求31所述的非天然存在的微生物体，其中所述6种外源核酸编码：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求25所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有苯乙烯途径的非天然存在的微生物体足以生产苯乙烯的时间段，所述途径包含至少一种编码苯乙烯途径酶的外源核酸，所述苯乙烯途径酶以足以生产苯乙烯的量表达，所述苯乙烯途径选自：(A)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种或多种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶；或(B)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶。
根据权利要求35所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物体包含2种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物体包含3种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物体包含4种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物体包含5种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求40所述的方法，其中所述5种外源核酸编码：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶。
根据权利要求35所述的方法，其中所述微生物体包含6种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求42所述的方法，其中所述6种外源核酸编码：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶。
根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
一种非天然存在的微生物体，包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径选自：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(E)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(F)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
根据权利要求45所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求46所述的非天然存在的微生物体，其中所述2种外源核酸编码选自下述的集合：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
根据权利要求45所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求45所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径选自：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(E)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(F)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
根据权利要求50所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求50所述的方法，其中所述微生物体包含2种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求52所述的方法，其中所述2种外源核酸编码选自下述的集合：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
一种非天然存在的微生物体，包括具有(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸，所述(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶以足以生产(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的量表达，所述(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径包含赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
根据权利要求55所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸。
根据权利要求56所述的非天然存在的微生物体，其中所述2种外源核酸编码：赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
根据权利要求55所述的非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求55所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体进行厌氧培养。
一种非天然存在的微生物体，包括具有苯甲酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码苯甲酸途径酶的外源核酸，所述苯甲酸途径酶以足以生产苯甲酸的量表达，所述苯甲酸途径包含2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含3种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含4种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含5种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含6种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含7种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含8种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求67所述的非天然存在的微生物体，其中所述8种外源核酸编码：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，所述微生物体另外包含(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产苯甲酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求60所述的非天然存在的微生物体足以生产苯甲酸的时间段。
根据权利要求72所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求72所述的方法，其中所述微生物体包含8种各自编码苯甲酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求74所述的方法，其中所述8种外源核酸编码：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
根据权利要求72所述的方法，其中所述微生物体另外包含(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
根据权利要求72所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
一种非天然存在的微生物体，包括具有苯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达，所述苯途径选自途径酶集合，所述途径酶集合选自：a)苯甲酸脱羧酶；b)苯甲酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；c)苯甲酸激酶，(苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和苯甲醛脱羰酶；d)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，磷酸苯甲酰基转移酶，(苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和苯甲醛脱羰酶；和e)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶，f)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，苯甲酸脱羧酶，g)苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶，h)磷酸苯甲酰基转移酶，(苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和苯甲醛脱羰酶，i)磷酸苯甲酰基转移酶，苯甲酸激酶，苯甲酸脱羧酶，j)磷酸苯甲酰基转移酶，苯甲酸激酶，苯甲酸还原酶，苯甲醛脱羰酶；k)磷酸苯甲酰基转移酶，(苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和苯甲醛脱羰酶；和l)苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述苯途径包含：苯甲酸脱羧酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述苯途径包含：苯甲酸还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述苯途径包含：苯甲酸激酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述苯途径包含：(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，磷酸苯甲酰基转移酶，(苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述苯途径包含：(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含3种各自编码苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含4种各自编码苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其另外包含苯甲酸途径，所述途径包含至少一种编码苯甲酸途径酶的外源核酸，所述苯甲酸途径酶以足以生产苯甲酸的量表达，所述苯甲酸途径包含2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其另外包含(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产苯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求78所述的非天然存在的微生物体足以生产苯的时间段。
根据权利要求91所述的方法，其中所述苯途径包含：苯甲酸脱羧酶。
根据权利要求91所述的方法，其中所述苯途径包含：苯甲酸还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求91所述的方法，其中所述苯途径包含：苯甲酸激酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求91所述的方法，其中所述苯途径包含：(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，磷酸苯甲酰基转移酶，(苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求91所述的方法，其中所述苯途径包含：(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求91所述的方法，其中所述微生物体包含2种各自编码苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求91所述的方法，其中所述微生物体包含3种各自编码苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求91所述的方法，其中所述微生物体包含4种各自编码苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求91所述的方法，其另外包含苯甲酸途径，所述途径包含至少一种编码苯甲酸途径酶的外源核酸，所述苯甲酸途径酶以足以生产苯甲酸的量表达，所述苯甲酸途径包含2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶、和分支酸裂合酶。
根据权利要求91所述的方法，其另外包含(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
根据权利要求91所述的方法，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求91所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体在基本上厌氧的培养基中进行培养。
一种非天然存在的微生物体，包括具有甲苯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达，所述甲苯途径选自途径酶集合，所述途径酶集合选自：a)对甲苯甲酸脱羧酶；b)对甲苯甲酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；c)对甲苯甲酸激酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶；d)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶；和e)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶，f)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，对甲苯甲酸脱羧酶，g)对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶，h)磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶，i)磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，对甲苯甲酸激酶，对甲苯甲酸脱羧酶，j)磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，对甲苯甲酸激酶，对甲苯甲酸还原酶，对甲基苯甲醛脱羰酶；k)磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶(去磷酸化)，和对甲基苯甲醛脱羰酶；和l)对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述甲苯途径包含：对甲苯甲酸脱羧酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述甲苯途径包含：对甲苯甲酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述甲苯途径包含：c)对甲苯甲酸激酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述甲苯途径包含：(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述甲苯途径包含：(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含3种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含4种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其另外包含对甲苯甲酸途径，所述途径包含至少一种编码对甲苯甲酸途径酶的外源核酸，所述对甲苯甲酸途径酶以足以生产对甲苯甲酸的量表达，所述对甲苯甲酸途径包含2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其另外包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含DXP合酶、DXP还原异构酶和2ME4P脱水酶。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产甲苯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求104所述的非天然存在的微生物体足以生产甲苯的时间段。
根据权利要求117所述的方法，其中所述甲苯途径包含：对甲苯甲酸脱羧酶。
根据权利要求117所述的方法，其中所述甲苯途径包含：对甲苯甲酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求117所述的方法，其中所述甲苯途径包含：c)对甲苯甲酸激酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求117所述的方法，其中所述甲苯途径包含：(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶，和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求117所述的方法，其中所述甲苯途径包含：(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)，对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。
根据权利要求117所述的方法，其中所述微生物体包含2种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求117所述的方法，其中所述微生物体包含3种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求117所述的方法，其中所述微生物体包含4种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。
根据权利要求117所述的方法，其另外包含对甲苯甲酸途径，所述途径包含至少一种编码对甲苯甲酸途径酶的外源核酸，所述对甲苯甲酸途径酶以足以生产对甲苯甲酸的量表达，所述对甲苯甲酸途径包含2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
根据权利要求117所述的方法，其另外包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含DXP合酶、DXP还原异构酶和2ME4P脱水酶。
根据权利要求117所述的方法，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求117所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体在基本上厌氧的培养基中进行培养。
一种非天然存在的微生物体，包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：A)i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶；B)i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；C)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；D)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶；和E)i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含3种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求132所述的非天然存在的微生物体，其中所述3种外源核酸编码：i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含4种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求134所述的非天然存在的微生物体，其中所述4种外源核酸编码：i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含5种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求136所述的非天然存在的微生物体，其中所述5种外源核酸编码：i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求136所述的非天然存在的微生物体，其中所述5种外源核酸编码：i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求136所述的非天然存在的微生物体，其中所述5种外源核酸编码：i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其另外包含2,4‑戊二烯酸脱羧酶，所述2,4‑戊二烯酸脱羧酶以足以通过2,4‑戊二烯酸至1,3‑丁二烯的转化而生产1,3‑丁二烯的量表达。
根据权利要求130所述的非天然存在的微生物体，其另外包含AKP硫解酶、鸟氨酸4,5‑氨基变位酶、2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶和2,4‑二氨基戊酸4‑脱氢酶中的至少一种。
一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径选自：A)i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶;B)i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶;C)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶;D)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶；和E)i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求144所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求144所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求144所述的方法，其中所述微生物体包含2种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求144所述的方法，其中所述微生物体包含3种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求148所述的方法，其中所述3种外源核酸编码：i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求144所述的方法，其中所述微生物体包含4种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求150所述的方法，其中所述4种外源核酸编码：i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求144所述的方法，其中所述微生物体包含5种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求152所述的方法，其中所述5种外源核酸编码：i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求152所述的方法，其中所述5种外源核酸编码：i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求152所述的方法，其中所述5种外源核酸编码：i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
根据权利要求144所述的方法，其另外包含以足够量表达的2,4‑戊二烯酸脱羧酶，以将2,4‑戊二烯酸转化成1,3‑丁二烯。
根据权利要求144所述的方法，其另外包含AKP硫解酶、鸟氨酸4,5‑氨基变位酶、2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶和2,4‑二氨基戊酸4‑脱氢酶中的至少一种。
一种非天然存在的微生物体，包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：
1)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
2)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
3)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
4)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
5)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
6)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
7)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
8)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
9)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
10)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
11)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
12)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
13)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，R.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
14)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和
15)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
16)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，R.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
17)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
18)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
19)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
20)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
21)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
22)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
23)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和
24)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求158所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6、7或8种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求158所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求158所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求158所述的非天然存在的微生物体，其另外包含2,4‑戊二烯脱羧酶，以将2,4‑戊二烯酸转化成1,3‑丁二烯。
一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求158所述的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段。
根据权利要求163所述的方法，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6、7或8种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求163所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求163所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求162所述的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
根据权利要求167所述的方法，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6、7或8种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求167所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求167所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种非天然存在的微生物体，包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径具有选自下述的酶集合：
1)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
2)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
3)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
4)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
5)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
6)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶。
根据权利要求171所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4或5种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求171所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求171所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求171所述的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
根据权利要求175所述的方法，其中所述微生物体包含2、3、4或5种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求175所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求175所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种非天然存在的微生物体，包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸，所述3‑丁烯‑1‑醇途径酶以足以生产3‑丁烯‑1‑醇的量表达，所述3‑丁烯‑1‑醇途径具有选自下述的酶集合：
1)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
2)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
3)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
4)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
5)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
6)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
7)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
8)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
9)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
10)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
11)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
12)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
13)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
14)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
15)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
16)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
17)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
18)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
19)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
20)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶。
根据权利要求179所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6或7种各自编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸。
根据权利要求179所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求179所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求179所述的非天然存在的微生物体，其另外包含3‑丁烯‑1‑醇脱水酶，以将3‑丁烯‑1‑醇转化成1,3‑丁二烯。
一种用于生产3‑丁烯‑1‑醇的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求179所述的非天然存在的微生物体足以生产3‑丁烯‑1‑醇的时间段。
根据权利要求184所述的方法，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6或7种各自编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸。
根据权利要求184所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求184所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
根据权利要求184所述的方法，其另外包括：将3‑丁烯‑1‑醇化学脱水，以得到1,3‑丁二烯。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求183所述的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
根据权利要求189所述的方法，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6、7或8种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求189所述的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求189所述的方法，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种非天然存在的微生物体，包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径选自：
(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；
(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；
(E)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
(F)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；
(G)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；和
(H)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
根据权利要求193所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6或7种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求194所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含外源核酸，所述外源核酸编码选自下述的每种酶：
(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；
(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；
(E)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
(F)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；
(G)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；和
(H)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
根据权利要求193所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：
(i)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；
(ii)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或
(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。
根据权利要求196所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(i)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。
根据权利要求196所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(ii)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
根据权利要求196所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含：(i)包含4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；
其中所述微生物体包含(ii)包含5种外源核酸，所述外源核酸编码：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或
其中所述微生物体包含(iii)包含2种外源核酸，所述外源核酸编码：CO脱氢酶和H2氢化酶。
根据权利要求193所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求193所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求193‑201中任一项所述的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
一种非天然存在的微生物体，包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径选自：
(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和
(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶。
根据权利要求203所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5或6种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求204所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含外源核酸，所述外源核酸编码选自下述的每种酶：
(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和
(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶。
根据权利要求203所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：
(i)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；
(ii)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或
(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。
根据权利要求206所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(i)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。
根据权利要求206所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(ii)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
根据权利要求206所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含：(i)包含4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；
其中所述微生物体包含：(ii)包含5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或
其中所述微生物体包含：(iii)包含2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
根据权利要求203所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求203所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求203‑211中任一项所述的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段。
一种非天然存在的微生物体，包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径选自：
(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(K)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(L)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(M)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(N)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；和
(O)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶。
根据权利要求213所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6或7种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。
根据权利要求214所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含外源核酸，所述外源核酸编码选自下述的每种酶：
(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(K)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(L)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；
(M)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；
(N)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；和
(O)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶。
根据权利要求213所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：
(i)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；
(ii)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或
(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。
根据权利要求216所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(i)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。
根据权利要求216所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(ii)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
根据权利要求216所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含：(i)包含4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；
其中所述微生物体包含：(ii)包含5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或
其中所述微生物体包含：(iii)包含2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
根据权利要求213所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求213所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求213‑221中任一项所述的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
一种非天然存在的微生物体，包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径选自：
(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和
(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求223所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5或6种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。
根据权利要求224所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含外源核酸，所述外源核酸编码选自下述的每种酶：
(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；
(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和
(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
根据权利要求223所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：
(i)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；
(ii)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或
(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。
根据权利要求226所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(i)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。
根据权利要求226所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(ii)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
根据权利要求226所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含：(i)包含4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；
其中所述微生物体包含：(ii)包含5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或
其中所述微生物体包含：(iii)包含2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
根据权利要求223所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求223所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求223‑231中任一项所述的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段。
一种非天然存在的微生物体，包括具有3‑丁烯‑1‑醇途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸，所述3‑丁烯‑1‑醇途径酶以足以生产3‑丁烯‑1‑醇的量表达，所述3‑丁烯‑1‑醇途径选自：
(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和
(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶。
根据权利要求233所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4或5种各自编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸。
根据权利要求234所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含外源核酸，所述外源核酸编码选自下述的每种酶：
(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和
(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶。
根据权利要求233所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：
(i)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；
(ii)还原TCA途径，所述还原TCA途径包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或
(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。
根据权利要求236所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(i)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。
根据权利要求236所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含(ii)另外包含编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
根据权利要求236所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含：(i)包含4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；
其中所述微生物体包含：(ii)包含5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或
其中所述微生物体包含：(iii)包含2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
根据权利要求233所述的非天然存在的微生物体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
根据权利要求233所述的非天然存在的微生物体，其中所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
一种用于生产3‑丁烯‑1‑醇的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求233‑241中任一项所述的非天然存在的微生物体足以生产3‑丁烯‑1‑醇的时间段。
一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据权利要求233‑241中任一项所述的非天然存在的微生物体足以生产3‑丁烯‑1‑醇的时间段，和将所述3‑丁烯‑1‑醇化学地转化成1,3‑丁二烯。

说明书用于生物合成芳族化合物、2,4‑戊二烯酸和1,3‑丁二烯的微生物和方法
背景技术
本发明一般地涉及生物合成方法，更具体地，涉及具有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成能力的生物体。
甲苯是一种已经替代苯（由于苯的更大致癌力）的常见溶剂，且是一种工业原料，并用于生产TNT、聚氨酯泡沫、苯甲醛和苯甲酸。甲苯是汽油生产的一种副产物，并以低浓度存在于原油中。
苯经常被用作制备其它化学试剂的中间体。它的最广泛地生产的衍生物包括：苯乙烯（用于制备聚合物和塑料）、苯酚（经由异丙基苯用于制备树脂和粘着剂）和环己烷（用于生产尼龙）。苯也被用于制备某些类型的橡胶、润滑剂、染料、去污剂、药物、爆炸物、凝固汽油和杀虫剂。在石油工业中的苯生产，通过多种能量集中型的方法来进行，包括：催化重整、甲苯加氢脱烷基化、甲苯歧化和蒸汽裂化。
苯乙烯是聚苯乙烯和众多共聚物的前体。基于苯乙烯的产品包括：丙烯腈1,3‑丁二烯苯乙烯(ABS)、苯乙烯‑1,3‑丁二烯(SBR)橡胶、苯乙烯‑1,3‑丁二烯胶乳、SIS(苯乙烯‑异戊二烯‑苯乙烯)、S‑EB‑S(苯乙烯‑乙烯/丁烯‑苯乙烯)、苯乙烯‑二乙烯基苯(S‑DVB)和不饱和的聚酯。这些材料被用于橡胶、塑料、绝缘材料、纤维玻璃、管材、汽车和船部件、食物容器和地毯衬垫中。
苯乙烯最常见地通过乙基苯的催化脱氢来生产。将乙基苯与是它的体积的10‑15倍的气相在高温蒸汽中混合，并在固体催化剂床上面经过。大部分乙基苯脱氢催化剂是基于氧化铁(III)，由几个百分比的氧化钾或碳酸钾促进。蒸汽在该反应中起几种作用。它是给吸热反应供给能量的热源，它会除去焦炭，所述焦炭倾向于通过水气变换反应而形成在氧化铁催化剂上。钾助催化剂会增强该除焦反应。所述蒸汽也会稀释反应物和产物，从而使化学平衡位置向产物移动。一个典型的苯乙烯工厂由串联的2或3个反应器组成，所述反应器在真空下运行，以增强转化率和选择性。典型的单程转化率是约65%（对于2个反应器而言）和70‑75%（对于3个反应器而言）。
每年生产超过250亿磅1,3‑丁二烯(或仅丁二烯或BD)，并用于生产聚合物（诸如合成橡胶和ABS树脂）和化学试剂诸如六亚甲基二胺和1,4‑丁二醇。1,3‑丁二烯通常作为蒸汽裂化过程的副产物而生产，所述蒸汽裂化过程用于将石油原料（诸如石脑油、液化石油气、乙烷或天然气）转化成乙烯和其它烯烃。从替代性的和/或可再生的原料生产1,3‑丁二烯的能力，代表对更可持续的化学生产工艺的寻找的重大进步。
可再生地生产1,3‑丁二烯的一种可行方法包括：发酵糖或其它原料，以生产二元醇，诸如1,4‑丁二醇或1,3‑丁二醇，将其分离、纯化，然后在包括基于金属的催化的第二步中脱水成1,3‑丁二烯。从可再生的原料直接发酵生产1,3‑丁二烯，会避免对脱水步骤的需求，并从发酵罐中连续地排出1,3‑丁二烯气体(沸点‑4.4℃)，容易地浓缩和收集。开发发酵生产方法，会消除对基于化石的1,3‑丁二烯的需求，并允许与石化衍生的1,3‑丁二烯相比大幅减少成本、能量和有害的废物和排放。
2,4‑戊二烯酸本身是一种有用的被取代的丁二烯衍生物，和通向其它被取代的1,3‑丁二烯衍生物（包括、例如，通过Curtius重排可得到的1‑氨甲酰基‑1,3‑丁二烯）的有价值的中间体，得到的N‑保护的‑1,3‑丁二烯衍生物可以用于狄尔斯‑阿德耳反应中，用于制备被取代的苯胺。2,4‑戊二烯酸可以用于制备多种聚合物和共聚物。
对苯二甲酸(也称作对酞酸和PTA)是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的直接前体，所述PET被用于制备服装、树脂、塑料瓶，和甚至用作家禽饲料添加剂。几乎所有的PTA都从对二甲苯生产，通过在称作中世纪工艺（Mid Century Process）的方法中在空气中氧化得到。该氧化在高温在含有催化剂的醋酸溶剂中进行，所述催化剂由钴和/或锰盐组成。对二甲苯源自石化来源，并通过石脑油的高严格催化重整而形成。二甲苯也在石脑油蒸汽裂解器中从热解汽油流得到，并通过甲苯不相称得到。
迄今为止尚未开发出用于制备可再生的PTA的节省成本的方法。PTA、甲苯和其它芳族前体会被某些细菌天然地降解。但是，这些降解途径通常包括在降解方向不可逆地运行的单加氧酶。因此，迄今为止，PTA的生物合成途径受到已知酶的性质的严重限制。
PTA的一种有期望的前体是对甲苯甲酸，也称作对甲基苯甲酸。对甲苯甲酸是某些用于将对二甲苯氧化成PTA的工业过程的中间体。它也是聚合物稳定剂、杀虫剂、光敏化合物、动物饲料补充物和其它有机化学试剂的中间体。对甲苯甲酸仅微溶于水溶液中，在生理温度是固体，具有275℃的熔点。迄今为止，尚未描述从糖原料合成该化合物的微生物催化剂。
因而，需要有效地生产商业数量的化合物（诸如苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、1,3‑丁二烯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、苯和甲苯）的替代方法。本发明满足了该需要，并且还提供了有关的优点。
发明内容
本发明提供了非天然存在的微生物体，其具有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径。本发明另外提供了使用这样的生物体来生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的方法。
本发明也提供了非天然存在的微生物体，其具有(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H3M4OP)途径、对甲苯甲酸途径、对苯二甲酸途径、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H4OP)途径和/或苯甲酸途径。本发明另外提供了使用这样的生物体来生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐或苯甲酸的方法。
附图说明
图1显示了苯丙氨酸经由苯乙酸向甲苯的转化。酶是：A.苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，B.苯丙酮酸脱羧酶，C.苯乙醛脱氢酶和/或氧化酶，D.苯乙酸脱羧酶，E.苯乙醛脱羰酶，和F.苯丙酮酸氧化酶。
图2显示了苯丙氨酸苯‑裂合酶将苯丙氨酸转化成苯。
图3显示了从苯甲酰辅酶A至苯乙烯的途径。酶是：A.苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.苯甲酰乙酸脱羧酶，D.乙酰苯还原酶和E.1‑苯基乙醇脱水酶，F.磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，G.苯甲酰乙酸激酶。
图4显示了粘康酸立体异构体向1,3‑丁二烯的转化。酶是：A.反式,反式‑粘康酸脱羧酶，B.顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶，C.顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶，D.顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶，E.反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶，F.顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
图5显示了从甘油醛‑3‑磷酸和丙酮酸至(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H3M4OP)的示例性途径的示意描述。G3P是甘油醛‑3‑磷酸，DXP是1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸，且2ME4P是C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸。酶是：(A)DXP合酶；(B)DXP还原异构酶；和(C)2ME4P脱水酶。
图6显示了通向对甲苯甲酸的一个示例性的替代莽草酸途径的示意描述。酶是：(A)2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；(B)3‑脱氢奎尼酸合酶；(C)3‑脱氢奎尼酸脱水酶；(D)莽草酸脱氢酶；(E)莽草酸激酶；(F)3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；(G)分支酸合酶；和(H)分支酸裂合酶。化合物是：(1)(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐；(2)2,4‑二羟基‑5‑甲基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸；(3)1,3‑二羟基‑4‑甲基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸；(4)5‑羟基‑4‑甲基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸；(5)3,5‑二羟基‑4‑甲基环己‑1‑烯‑1‑甲酸；(6)5‑羟基‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸；(7)5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸；(8)3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸；和(9)对甲苯甲酸。
图7显示了用于将对甲苯甲酸转化成对苯二甲酸(PTA)的示例性途径。反应A、B和C分别由对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶还原酶、4‑羧基苯甲醇脱氢酶和4‑羧基苄基醛脱氢酶催化。显示的化合物是：(1)对甲苯甲酸；(2)4‑羧基苯甲醇；(3)4‑羧基苯甲醛和(4)对苯二甲酸。
图8显示了从赤藓糖‑4‑磷酸至(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的示例性途径。酶是：A.赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶，B.(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。化合物是：(1)赤藓糖‑4‑磷酸，(2)(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸盐和(3)(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐。
图9显示了从(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐至苯甲酸的替代莽草酸途径。酶是：A.2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶，B.3‑脱氢奎尼酸合酶，C.3‑脱氢奎尼酸脱水酶，D.莽草酸脱氢酶，E.莽草酸激酶，F.3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶，G.分支酸合酶，H.分支酸裂合酶。化合物是：1.(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐，2.2,4‑二羟基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸，3.1,3‑二羟基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸，4.5‑羟基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5.3,5‑二羟基环己‑1‑烯‑1‑甲酸，6.5‑羟基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，7.5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，8.3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸，9.苯甲酸。
图10显示了从苯甲酸和苯甲酰辅酶A至苯的途径。酶是：A.苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，B.苯甲酸还原酶，C.苯甲醛脱羰酶，D.苯甲酰辅酶A还原酶，E.苯甲酸脱羧酶，F.磷酸苯甲酰基转移酶，G.(苯甲酰氧基)膦酸还原酶(去磷酸化)，H.苯甲酸激酶。
图11显示了从对甲苯甲酸(也称作对甲基苯甲酸)和对甲基苯甲酰辅酶A至甲苯的途径。酶是：A.对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，B.对甲苯甲酸还原酶，C.对甲基苯甲醛脱羰酶，D.对甲基苯甲酰辅酶A还原酶，E.对甲苯甲酸脱羧酶，F.磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶，G.(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶(去磷酸化)，H.对甲苯甲酸激酶。
图12显示了从丙酮酸至2,4‑戊二烯酸的途径。酶是：A.4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，B.4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，C.2‑氧代戊烯酸还原酶，D.2‑羟基戊烯酸脱水酶，E.4‑羟基‑2‑氧代戊酸还原酶，F.2,4‑二羟基戊酸2‑脱水酶，G.4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶和H.2,4‑二羟基戊酸4‑脱水酶。
图13显示了从丙氨酸和鸟氨酸至2,4‑戊二烯酸的途径。酶是：A.AKP硫解酶，B.AKP脱氨酶，C.乙酰基丙烯酸还原酶，D.4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，E.AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，F.2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，G.2,4‑二羟基戊酸2‑脱水酶，H.2,4‑二氧代戊酸2‑还原酶，I.2‑羟基‑4‑氧代戊酸还原酶，J.AKP还原酶，K.2,4‑二氧代戊酸4‑还原酶，L.2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，M.鸟氨酸4,5‑氨基变位酶，N.2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶和/或4‑脱氢酶。AKP是2‑氨基‑4‑氧代戊酸。
图14显示了从鸟氨酸至2,4‑戊二烯酸的其它途径。酶是：A.鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，B.3,5‑二氨基戊酸脱氨酶，C.5‑氨基戊‑2‑烯酸脱氨酶，D.3,5‑二氨基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，E.3‑氨基‑5‑氧代戊酸脱氨酶，F.5‑氧代戊‑2‑烯酸还原酶，G.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，H.5‑氨基戊‑2‑烯酸氨基转移酶和/或脱氢酶，I.3‑氨基‑5‑氧代戊酸还原酶，J.3‑氨基‑5‑羟基戊酸脱氨酶。
图15显示了从3‑羟基丙酰辅酶A和/或丙烯酰辅酶A至2,4‑戊二烯酸的途径。酶是：A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，R.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶。3‑HP‑CoA是3‑羟基丙酰辅酶A。
图16显示了3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶从3‑羟基戊‑4‑烯酸(3HP4)形成丁二烯。
图17显示了3,5‑二羟基戊酸脱羧酶和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶从3,5‑二羟基戊酸形成丁二烯。还可以通过化学催化，将3‑丁烯‑1‑醇脱水为丁二烯。
图18显示了通过2,4‑戊二烯酸水合酶从2,4‑戊二烯酸形成3‑羟基戊‑4‑烯酸(3HP4)中间体。
图19显示了从3‑HP‑CoA和/或丙烯酰辅酶A至丁二烯、3‑羟基戊‑4‑烯酸(3HP4)，2,4‑戊二烯酸和3‑丁烯‑1‑醇的途径。酶是：A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Q.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，R.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶，W.3‑丁烯‑1‑醇脱水酶(或化学转化)，X.2,4‑戊二烯脱羧酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶。3‑HP‑CoA是3‑羟基丙酰辅酶A。
图20显示了从琥珀酰辅酶A至3‑羟基戊‑4‑烯酸(3HP4)、2,4‑戊二烯酸和丁二烯的途径。酶是：A.琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶，B.3‑氧代己二酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，C.3‑氧代己二酸脱氢酶，D.2‑富马酰乙酸脱羧酶，E.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，F.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶，G.3‑氧代己二酰辅酶A还原酶，H.3‑羟基己二酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，I.3‑羟基己二酸脱氢酶，J.3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶，K.3‑氧代己二酸还原酶，L.2‑富马酰乙酸还原酶，M.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶，N.2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
图21显示了从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A至3‑丁烯‑1‑醇、丁二烯和2、4‑戊二烯酸的途径。用于将鉴别的底物转化成产物的酶包括：A.丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶，B.3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)，C.3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)，D.3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶，E.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，F.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，G.3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)，H.3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)，I.3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)，J.5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶，K.3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)，L.3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)，M.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶，N.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶，O.3‑丁烯‑1‑醇脱水酶(或化学转化)，P.2,4‑戊二烯脱羧酶。
图22显示了用于将CO2固定化在作为底物的碳水化合物上的反向TCA循环。由所示的酶进行酶促转化。
图23显示了与一氧化碳脱氢酶和氢化酶偶联的反向TCA循环的途径，所述一氧化碳脱氢酶和氢化酶用于将合成气转化成乙酰辅酶A。
图24显示了10微克ACS90(泳道1)、ACS91(泳道2)、Mta98/99(泳道3和4)细胞提取物以及尺寸标准品(泳道5)和热醋穆尔氏菌（M.thermoacetica）CODH(Moth_1202/1203)或Mtr(Moth_1197)蛋白对照(50、150、250、350、450、500、750、900和1000ng)的蛋白质印迹。
图25显示了CO氧化测定结果。培养细胞(热醋穆尔氏菌或大肠杆菌，其具有CODH/ACS操纵子;ACS90或ACS91或空载体:pZA33S)，并制备提取物。在制备提取物当天的不同时间，在55℃进行测定。在578nm历经120秒时程进行甲基紫精还原。
具体实施方式
本发明部分地涉及具有甲苯、苯、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸和1,3‑丁二烯的生物合成生产能力的细胞和生物体的设计和生产。图1和2中通向甲苯和苯的途径从天然存在的氨基酸苯丙氨酸开始，且因而，大多数生物体能够充当宿主，用于构建生产甲苯和苯所用的非天然存在的生物体。用于增加苯丙氨酸生产的策略是本领域已知的(Yakandawala等人,App.Microbiol.Biotech.78:283‑291(2008);Lee等人,美国专利5,008,190)。
通向苯乙烯的途径依赖于用于生产苯甲酰辅酶A的生物体，如图3所示。苯甲酰辅酶A是众多生物合成和降解途径的关键代谢中间体。苯甲酰辅酶A是芳族天然产物（诸如抗生素、芳香剂和防御信号）的关键前体。苯甲酰辅酶A生物合成的生物途径是本领域已知的(Boatright等人,Plant Physiol135:1993‑2011(2004);Xiang等人,JBacteriol.185:399‑404(2003);Moore等人,J Nat.Prod65:1956‑1962(2002))。苯甲酰辅酶A也是厌氧的和好氧的芳族化合物降解途径的共同中间体(Gescher等人,J Bacteriol.184:6301‑6315(2002);Philipp等人,FEMS Microbiol Lett.212:139‑143(2002);Koch等人,Eur.J Biochem.205:195‑202(1992))。
本发明还部分地涉及非天然存在的微生物，所述微生物表达编码催化1,3‑丁二烯生产的酶（如图4所示）的基因。在有些实施方案中，用于生产粘康酸的途径源自中枢代谢前体。粘康酸是微生物中的多种芳族化合物的共同降解产物。已经开发了几种用于制备顺式,顺式‑粘康酸的生物催化策略。在Frost实验室中已经开发了通过莽草酸途径酶从葡萄糖生产粘康酸的工程改造的大肠杆菌菌株(美国专利5,487,987(1996);Niu等人,Biotechnol Prog.,18:201‑211(2002))。在补料分批发酵罐条件下培养48小时以后，这些菌株能够生产36.8g/L的顺式,顺式‑粘康酸(从葡萄糖开始的最大理论收率的22%)。还已经从芳族原料诸如甲苯、苯甲酸和儿茶酚生物催化地生产粘康酸。从苯甲酸生产粘康酸的菌株达到的13.5g/L的滴度和5.5g/L/小时的生产力(Choi等人,J.Ferment.Bioeng.84:70‑76(1997))。还已经从苯乙烯单体生产植物的流出物制备粘康酸(Wu等人,Enzyme and Microbiology Technology35:598‑604(2004))。
本发明还部分地涉及非天然存在的微生物，所述微生物表达编码催化2,4‑戊二烯酸生产的酶（如图12‑15所示）的基因。通过包括必要的2,4‑戊二烯酸脱羧酶，这些途径中的任一个可以向进一步的1,3‑丁二烯途径供料。图12显示了丙酮酸通过3个途径向2,4‑戊二烯酸的总转化。图13显示了鸟氨酸或丙氨酸通过共同中间体2‑氨基‑4‑酮戊酸(AKP)向2,4‑戊二烯酸的总转化。图13显示了从AKP至2,4‑戊二烯酸的6条途径，其中的3条截断图12所示的中间体。图14显示了从鸟氨酸至2,4‑戊二烯酸的另外4条途径。图15显示了从3‑羟基丙酰辅酶A(3‑HP‑CoA)和丙烯酰辅酶A至2,4‑戊二烯酸的众多途径。
本发明还部分地涉及非天然存在的微生物体，其表达编码催化1,3‑丁二烯生产的酶（如图16‑17和19‑21所示）的基因。图16显示了3‑羟基戊‑4‑烯酸(3HP4)脱羧脱水为1,3‑丁二烯，其中3HP4可通过图15和19所示的途径得到。3HP4（其本身是重要的）在图18中显示为经由中间体2,4‑戊二烯酸通过水合，以及通过图15、19和20的途径。同样地，图17显示了中间体3,5‑二羟基戊酸的串联脱羧脱水和消除(进一步脱水)，所述中间体本身可通过图15、19和21所示的途径得到。
图19显示了从3‑HP‑CoA和丙烯酰辅酶A至1,3‑丁二烯和1,3‑丁二烯中间体的途径。图20显示了从琥珀酰辅酶A至1,3‑丁二烯和1,3‑丁二烯中间体的途径。必要的琥珀酰辅酶A是中枢代谢中间体，通过本文进一步描述的还原TCA循环，可以增强其收率。最后，图21显示了从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A的缩合至1,3‑丁二烯和1,3‑丁二烯中间体的途径，所述乙酰辅酶A也受益于通过本文描述的还原TCA途径而增加的产量。
本发明也涉及具有对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、甲苯、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸或苯的生物合成生产能力的细胞和生物体的设计和生产。本文描述的结果指示，可以设计和重组地工程改造代谢途径，以实现对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、甲苯、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸或苯在大肠杆菌和其它细胞或生物体中的生物合成。通过构建具有设计的代谢基因型的菌株，可以证实对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、甲苯、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸或苯的生物合成生产。这些代谢工程改造的细胞或生物体也可以发生适应进化，以进一步增加对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、甲苯、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸或苯生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。
在大肠杆菌中的莽草酸生物合成途径会将赤藓糖‑4‑磷酸转化成分支酸，后者是导致许多必需代谢物（包括4‑羟基苯甲酸）的生物合成的一种重要中间体。4‑羟基苯甲酸在结构上类似于对甲苯甲酸，后者是对苯二甲酸和苯的一种工业前体。如本文所公开的，莽草酸途径酶用于接收替代底物(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H3M4OP)，并将它转化成对甲苯甲酸或甲苯，或者接收替代底物(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H4OP)，并将它转化成苯甲酸或苯。另外，使用来自类异戊二烯生物合成的非甲羟戊酸途径的酶，使用一条途径来合成2H3M4OP或2H4OP前体。
本文公开了用于工程改造微生物的策略，所述微生物从碳水化合物原料生产可再生的对甲苯甲酸、对苯二甲酸(PTA)、甲苯、苯甲酸或苯。在甲苯系列中，在在3个酶促步骤中，将甘油醛‑3‑磷酸(G3P)和丙酮酸转化成2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H3M4OP)(参见实施例III和图5)。随后，通过莽草酸途径中的酶，将2H3M4OP中间体转化成对甲苯甲酸(参见实施例IV和图6)。微生物可以将对甲苯甲酸进一步转化成PTA(参见实施例V和图7)。在苯系列中，通过赤藓糖‑4‑磷酸的脱水和还原，制备2H4OP(参见实施例VI和图8)。随后，通过莽草酸途径中的酶，将2H4OP中间体转化成苯甲酸(参见实施例VI和图9)。苯甲酸和对甲苯甲酸分别被转化成苯和甲苯(参见实施例VII,和图10和11)。
根据下述的净反应，G3P向对甲苯甲酸的转化需要1摩尔ATP、2摩尔还原当量(NAD(P)H)和2摩尔磷酸烯醇丙酮酸分子。
G3P+2PEP+ATP+2NAD(P)H+2H+→对甲苯甲酸+4Pi+ADP+2NAD(P)++CO2+H2O
需要额外的ATP来从葡萄糖合成G3P。从葡萄糖至能量所需的碳，最大理论对甲苯甲酸收率是0.67mol/mol(0.51g/g)。假设合成每摩尔对甲苯甲酸分子消耗2摩尔ATP，从葡萄糖开始预测的对甲苯甲酸收率是0.62mol/mol(0.46g/g)对甲苯甲酸。
如果对甲苯甲酸被实施例III所述的酶进一步转化成PTA，从葡萄糖开始预测的PTA收率是0.64mol/mol(0.58g/g)。在该情况下，根据下述净反应，对甲苯甲酸向PTA的氧化会产生额外的净还原当量：
对甲苯甲酸+O2+NAD+→PTA+NADH+2H+
在下述的部分中，描述了用于催化上述途径的每个步骤的酶候选物。成功地工程改造用于生产甲苯、苯、苯乙烯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸或1,3‑丁二烯的途径，需要：鉴别出具有足够的活性和特异性的适当酶集合，将它们的对应基因克隆进生产宿主中，优化这些基因在生产宿主中的表达，优化发酵条件，和测定发酵以后的产物形成。
本文使用的术语“非天然存在的”，当用于指本发明的微生物体或微生物时，意图表示，该微生物体具有至少一个在所述物种的天然存在的菌株（包括所述物种的野生型菌株）中通常未发现的遗传改变。遗传改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸加成、核酸缺失和/或微生物体的遗传物质的其它功能破坏。这些修饰包括，例如，所述物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和其功能片段。另外的修饰包括，例如，非编码调控区，其中修饰会改变基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括：在甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、甲苯、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯或1,3‑丁二烯生物合成途径中的酶或蛋白。
代谢修饰是指从其天然存在的状态被改变的生物化学反应。因此，非天然存在的微生物可以具有对编码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。本文公开了示例性的代谢修饰。
本文使用的术语“分离的”，当用于指微生物体时，意图表示，基本上不含至少一种当所述微生物体在自然界中发现时的组分的生物体。该术语包括从在其自然环境中被发现时的一些或全部组分中移出的微生物体。该术语还包括从微生物体在其非天然存在环境中被发现时的一些或全部组分中移出的微生物体。因此，分离的微生物体部分或完全与其在自然界中发现时或其在非天然存在的环境中生长、保藏、生存时的其它物质分离。分离的微生物体的具体实例包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
本文使用的术语“微生物的(microbial)”、“微生物体(microbial organism)”或“微生物(microorganism)”意图表示，是作为微观细胞存在的任意生物，其包括在古细菌、细菌或真核生物的范围内。因此，该术语意欲包括原核或真核细胞或具有微观大小的生物以及包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物诸如酵母和真菌。该术语还包括任意物种的细胞培养物，所述物种可培养用于生产生物化学物质。
本文使用的术语“CoA”或“辅酶A”意图表示，有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)，其存在是许多酶(脱辅酶)的活性所必需的，以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或其它酰基转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其它乙酰化中起作用。
本文使用的术语“(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐”（在本文中缩写为2H3M4OP）具有图5所示的化学式。这样的化合物也可以描述为丁醛‑4‑磷酸‑3‑羟基‑2‑甲酯。
本文使用的术语“(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐”（在本文中缩写为2H4OP）具有图8(化合物3)所示的化学式。这样的化合物也可以描述为3‑羟基丁醛‑4‑磷酸盐。
本文使用的术语“对甲苯甲酸盐”具有分子式C8H7O2‑(参见图6,化合物9)(IUPAC名称为4‑甲基苯甲酸)是对甲苯甲酸的离子化形式，且应当理解，对甲苯甲酸盐和对甲苯甲酸可以在各处可互换地用于表示处于它的任一种中性或离子化形式（包括它们的任意盐形式）的化合物。本领域的技术人员应当理解，具体的形式将取决于pH。
本文使用的术语“苯甲酸盐”具有分子式C7H6O2(参见图9,化合物9)是苯甲酸的离子化形式，且应当理解，苯甲酸盐和苯甲酸可以在各处可互换地用于表示处于它的任一种中性或离子化形式（包括它们的任意盐形式）的化合物。本领域的技术人员应当理解，具体的形式将取决于pH。
本文使用的术语“对苯二甲酸盐”具有分子式C8H4O4‑2(参见图7,化合物4)(IUPAC名称对苯二甲酸)是对苯二甲酸（也称作对酞酸或PTA）的离子化形式，且应当理解，对苯二甲酸盐和对苯二甲酸可以在各处可互换地用于表示处于它的任一种中性或离子化形式（包括它们的任意盐形式）的化合物。本领域的技术人员应当理解，具体的形式将取决于pH。
本文使用的术语“基本上厌氧的”，当用于指培养物或生长条件时，意图表示，氧的量小于在液体培养基中的溶解氧饱和度的约10％。该术语还拟包括液体或固体培养基的密封室被保持在小于约1％氧的气氛下。
本文所使用的“外源的”意图表示，相关分子或相关活性被引入宿主微生物体中。所述分子可以如下引入：例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，诸如通过整合进宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质诸如质粒。因此，当用于指编码核酸的表达时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物体中。当用于指生物合成活性时，该术语指被引入至宿主相关生物体中的活性。来源可以是例如同源的或异源的编码核酸，其在引入至宿主微生物体中以后会表达相关的活性。因此，术语“内源的”指在宿主中存在的相关分子或活性。类似地，当用于指编码核酸的表达时，该术语指在微生物体中含有的编码核酸的表达。术语“异源的”指源自相关物种之外的来源的分子或活性，而“同源的”指源自宿主微生物体的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可以利用异源的或同源的编码核酸中的任一种或两者。
应当理解，当微生物体中包括超过一种外源核酸时，超过一种外源核酸表示如上讨论的相关编码核酸或生物合成活性。进一步理解，如本文所公开的，这样的超过一种外源核酸可以在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或以它们的组合引入宿主微生物体中，且仍然视作超过一种外源核酸。例如，如本文公开的，可以工程改造微生物体，以表达编码所需途径酶或蛋白的2种或更多种外源核酸。在将编码所需活性的2种外源核酸引入宿主微生物体中的情况下，应当理解，所述2种外源核酸可以作为单个核酸（例如，在单个质粒上、在分开的质粒上）引入，可以在单个位点或多个位点处整合进宿主染色体中，且仍然视作2种外源核酸。类似地，应当理解，超过2种外源核酸可以以任意所需的组合（例如，在单个质粒上、在分开的质粒上）引入宿主生物中，可以在单个位点或多个位点处整合进宿主染色体中，且仍然视作2种或更多种外源核酸，例如3种外源核酸。因而，所述的外源核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目或生物合成活性的数目，而不是指引入宿主生物中的单独核酸的数目。
本发明的非天然存在的微生物体可包含稳定的遗传改变，其指可被培养五代以上而不失去所述改变的微生物。一般而言，稳定的遗传改变包括持续10代以上的修饰，特别稳定的修饰将持续约25代以上，以及更特别稳定的遗传修饰将是50代以上，包括无限地。
本领域的技术人员应当理解，参考合适的宿主生物（诸如大肠杆菌）和它们的相应代谢反应或所需代谢途径的所需遗传物质（诸如基因）的合适源生物体，描述包括本文示例的代谢修饰在内的遗传改变。然而，鉴于许多生物的完整基因组测序以及基因组学领域的高技能水平，本领域的技术人员可容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有的其它生物。例如，通过掺入来自除所述物种之外的物种的相同或相似的编码核酸，可将本文示例的大肠杆菌代谢改变容易地应用于其它物种。这些遗传改变一般而言包括例如物种同源物的遗传改变，以及具体而言，直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。
直系同源物是通过垂直传递(vertical descent)相关并且在不同生物中负责基本上相同或同一功能的一个基因或多个基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶对于环氧化物的水解生物学功能而言可被认为是直系同源物。例如，当基因共享数量足以表明它们是同源的序列相似性时，所述基因通过垂直传递相关，或基因通过从共同的祖先进化而相关。如果基因共享三维结构，但不一定共享足以表明它们从共同的祖先进化而来的量‑‑其程度为一级序列相似性不可鉴定‑‑的序列相似性，则所述基因也可以被认为直系同源物。为直向同源的基因可以编码具有约25％序列相似性至100％氨基酸序列同源性的蛋白质。编码共享小于25％的氨基酸相似性的蛋白质的基因，如果它们的三维结构也显示相似性，也可以被认为通过垂直传递产生。酶的丝氨酸蛋白酶家族成员（包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶）被认为从共同的祖先通过垂直传递产生。
直系同源物包括基因或它们编码的基因产物，其通过例如进化在结构或总体活性方面已经偏离。例如，在一种物种编码显示两种功能的基因产物并且这些功能在第二种物种中已经被分成不同的基因的情况下，三个基因和它们的相应的产物被认为是直系同源物。对于生物化学产物的生产，本领域的技术人员应当理解，携带要引入或破坏的代谢活性的直向同源基因要进行选择用以构建非天然存在的微生物。显示可分离活性的直系同源物的实例是其中不同的活性已经在两种或更多种物种之间或在单一物种内被分成不同的基因产物的情况。具体实例是将弹性蛋白酶蛋白酶解和纤维蛋白溶酶原蛋白酶解‑‑两种类型的丝氨酸蛋白酶活性‑‑作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分成不同的分子。第二个实例是支原体5’‑3’外切核酸酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶中任一种或两者的直系同源物，反之亦然。
相比而言，旁系同源物是通过例如进化趋异所伴随的复制相关的同源物，并且其具有类似或共同的但不是同样的功能。旁系同源物可以起源或源自例如相同的物种或不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源物，这是因为它们代表从共同的祖先共同进化而来的两种不同的酶，所述酶催化不同的反应并且在相同的物种中具有不同的功能。旁系同源物是来自相同物种的、彼此具有明显的序列相似性的蛋白质，这表明它们是同源的或通过从共同的祖先共同进化而相关。旁系同源蛋白质家族群包括Hip A同源物、荧光素酶基因、肽酶以及其它。
非直系同源基因置换是来自一种物种的非直系同源基因，其可以取代不同物种中的相关基因功能。取代包括，例如，与不同物种的相关功能相比，能够在起源的物种中完成基本上相同或类似的功能。尽管一般而言，非直系同源基因置换可以鉴定为结构上与编码相关功能的已知基因有关，但是结构上较不相关但功能上类似的基因和它们相应的基因产物，仍将落入本文所使用的术语的含义中。功能相似性要求，例如，与编码要求取代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性部位或结合区域中至少有一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源基因或不相关的基因。
因此，在鉴定和构建具有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成能力的本发明的非天然存在的微生物体中，本领域技术人员应当理解，通过将本文提供的教导和指导应用到具体的物种，代谢修饰的鉴定可以包括直系同源物的鉴定以及引入或失活。就旁系同源物和/或非直系同源基因置换存在于编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的相关微生物中而言，本领域的技术人员还可以利用这些进化相关的基因。
直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将揭示在所比较的序列之间的序列同源性和相似性。基于这些相似性，本领域技术人员可以确定相似性是否足够高，以表明蛋白质通过从共同的祖先进化而相关。本领域的技术人员熟知的算法，诸如Align、BLAST、Clustal W以及其它算法，比较和测定未处理的序列相似性或同源性，并且还测定序列中空位(gap)的存在和显著性，所述空位可以被标记重量或分数。这些算法在本领域也是已知的并且可类似地应用于确定核苷酸序列相似性或同源性。确定相关性的足够相似性的参数基于熟知的方法计算，所述方法用于计算统计学的相似性或在随机多肽中发现相似匹配的机会和所确定的匹配的显著性。如果期望，两个或更多个序列的计算机比较也可以由本领域技术人员进行视觉优化。相关的基因产物或蛋白质可以期望具有高度相似性，例如，25％至100％序列同源性。如果细察足够大小的数据库(约5％)，不相关的蛋自质可以具有一定同源性，所述同源性与期望偶然出现的基本相同。在5％和24％之间的序列可以或不可以代表足够的同源性，以推断所比较的序列是相关的。根据数据集的大小，可以实施确定这些匹配的显著性的另外的统计学分析，以确定这些序列的相关性。
使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数例如可以是如下所示。简而言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP2.0.8版(1999年1月5日)和如下参数完成：Matrix：0BLOSUM62；gap open：11；gap extension：1；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：3；filter：on。核酸序列比对可以使用BLASTN2.0.6版(1998年9月16日)和如下参数完成：Match：1；mismatch：‑2；gap open：5；gap extension：2；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：11；filter：off。本领域的技术人员了解对上述参数可以进行何种修改以增加或减少例如比较的严格性和测定两个或更多个序列的相关性。
在某些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有甲苯途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达。所述甲苯途径选自：(A)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或两种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，和3)苯乙醛脱羰酶；(B)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱氢酶和苯乙醛氧化酶中的一种或多种，和4)苯乙酸脱羧酶；和(C)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸氧化酶，和3)苯乙酸脱羧酶，如在图1中的替代途径中所示。
所述具有甲苯途径的非天然存在的微生物体可以包括：2种各自编码甲苯途径酶的外源核酸，3种各自编码甲苯途径酶的外源核酸，4种各自编码甲苯途径酶的外源核酸，或5种各自编码甲苯途径酶的外源核酸。具有3种外源核酸的示例性的非天然存在的微生物体可以包括具有编码下述酶的基因的生物体：1)苯丙氨酸氨基转移酶和/或氧化还原酶(脱氨)，3)苯丙酮酸氧化酶，和5)苯乙酸脱羧酶。具有4种外源核酸的示例性的非天然存在的生物体可以包括具有编码下述酶的外源基因的生物体：1)苯丙氨酸氨基转移酶，2)苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，3)苯丙酮酸脱羧酶，和4)苯乙醛脱羰酶。具有5种外源核酸的示例性的非天然存在的微生物体可以包括具有编码下述酶的基因的生物体：1)苯丙氨酸氨基转移酶，2)苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，3)苯丙酮酸脱羧酶，4)苯乙醛脱氢酶和/或氧化酶，和5)苯乙酸脱羧酶。因而，在具体实施方案中，非天然存在的微生物体可以具有完整的甲苯途径，每个基因编码完整的甲苯途径中的每种酶。在有些实施方案中，所述具有甲苯途径的非天然存在的微生物体可以包括：至少一种是异源核酸的外源核酸。最后，所述具有甲苯途径的非天然存在的微生物体可以是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有苯途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达。所述苯途径可以包括：图2所示的苯丙氨酸苯‑裂合酶。所述至少一种外源核酸可以是苯丙氨酸苯‑裂合酶本身或影响它的前体苯丙氨酸的生产的核酸。在有些实施方案中，所述具有苯途径的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。在有些实施方案中，所述具有苯途径的非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有苯乙烯途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码苯乙烯途径酶的外源核酸，所述苯乙烯途径酶以足以生产苯乙烯的量表达。所述苯乙烯途径可以选自：(A)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种或多种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶；和(B)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶，如在图3中的替代途径所示。
在有些实施方案中，所述具有苯乙烯途径的非天然存在的微生物体可以包括：2种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸，3种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸，4种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸，5种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸，6种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸，诸如此类。具有5种外源核酸的示例性的非天然存在的生物体可以包括具有编码下述酶的外源基因的生物体：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)乙酰苯还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶。具有6种外源核酸的示例性的非天然存在的生物体可以包括具有编码下述酶的外源基因的生物体：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶。在有些实施方案中，所述具有苯乙烯途径的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。在有些实施方案中，所述具有苯乙烯途径的非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达。所述1,3‑丁二烯途径可以选自：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶，如在图4中的替代途径中所示。
在有些实施方案中，所述具有1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体可以包括2种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。因而，所述2种外源核酸可以编码选自下述的集合：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶，它们与图4所示的完整途径相对应。在有些实施方案中，所述具有1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。在有些实施方案中，所述具有1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的能够将AKP转化成2,4‑戊二烯酸的酶集合：(A)1)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，2)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，3)2‑氧代戊烯酸还原酶，和4)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如图12的步骤A‑D所示，(B)1)AKP脱氨酶，2)乙酰基丙烯酸还原酶，和3)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如图13的步骤B‑D所示，(C)1)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，2)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，3)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，4)乙酰基丙烯酸还原酶，和5)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如图13的步骤E、H、F、C和D所示，(D)1)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，2)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，3)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，4)2‑氧代戊烯酸还原酶，和5)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如图13的步骤E和K以及图12的步骤B‑D所示，和(E)1)AKP还原酶，2)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，3)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，4)2‑氧代戊烯酸还原酶，和5)2‑羟基戊烯酸脱水酶，也显示在图13的步骤J和L以及图12的步骤B‑D中。在有些实施方案中，图13的包括中间体4‑羟基‑2‑氧代戊酸的途径（显示在图12中）还可以指向图12所示的2,4‑二羟基戊酸途径，以提供2,4‑戊二烯酸。例如，从4‑羟基‑2‑氧代戊酸至2,4‑戊二烯酸的途径可以包括：在图12的步骤E、H和D或步骤E、F和G中的酶。
在有些实施方案中，本发明也提供了一种具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：(A)1)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，2)4‑羟基‑2‑氧代戊酸还原酶，3)2,4‑二羟基戊酸2‑脱水酶，和4)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图12的步骤A、E、F和G中所示，和(B)1)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，2)4‑羟基‑2‑氧代戊酸还原酶，3)2,4‑二羟基戊酸4‑脱水酶，和4)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如在图12的步骤A、E、H和D中所示。
在有些实施方案中，本发明也提供了一种具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：(A)1)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，2)2,4‑二氧代戊酸2‑还原酶，3)2‑羟基‑4‑氧代戊酸还原酶，4)2,4‑二羟基戊酸2‑脱水酶，和5)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图13的步骤E、H、I、G和D中所示，和(B)1)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，2)2,4‑二氧代戊酸2‑还原酶，3)2‑羟基‑4‑氧代戊酸还原酶，以及4)2,4‑二羟基戊酸‑2‑脱水酶和5)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶或4)2,4‑二羟基戊酸‑4‑脱水酶和5)2‑羟基戊烯酸脱水酶，分别如在图13的步骤E、H和I以及图12的步骤F和G或H和D中所示。也就是说，可以以任意次序进行2,4‑二羟基戊酸的双重脱水。
在有些实施方案中，本发明也提供了一种具有AKP途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码AKP途径酶的外源核酸，所述AKP途径酶以足以生产AKP的量表达。所述AKP途径包括：鸟氨酸4,5‑氨基变位酶和2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶和/或4‑脱氢酶，如在图13的步骤M和N中所示。在有些实施方案中，所述具有AKP途径的微生物体包括2种外源酶，所述外源酶编码鸟氨酸4,5‑氨基变位酶和2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶或2,4‑二氨基戊酸4‑脱氢酶。在有些实施方案中，该AKP途径可以加入任一个前述的2,4‑戊二烯酸途径中，且如在图13中所示。可替换地，通过加入AKP硫解酶，可以从丙氨酸得到AKP，如在图13的步骤A中所示，并供料给本文所述的和在图13以及图12中所示的各个2,4‑戊二烯酸途径。
在有些实施方案中，本发明也提供了一种具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：(A)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸脱氨酶，和3)5‑氨基戊‑2‑烯酸脱氨酶，如在图14的步骤A‑C中所示，(B)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸脱氨酶，3)5‑氨基戊‑2‑烯酸氨基转移酶和/或脱氢酶，4)5‑氧代戊‑2‑烯酸还原酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图14的步骤A、B、H、F和G中所示，(C)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，3)3‑氨基‑5‑氧代戊酸脱氨酶，4)5‑氧代戊‑2‑烯酸还原酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图14的步骤A、D、E、F和G中所示，和(D)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，3)3‑氨基‑5‑氧代戊酸还原酶，和4)3‑氨基‑5‑羟基戊酸脱氨酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图14的步骤A、D、I、J和G中所示。
在有些实施方案中，本发明也提供了一种具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：从3‑HP‑CoA或丙烯酰辅酶A开始，在图15中显示的众多途径中的任一个。
从3‑HP‑CoA开始的示例性途径包括下述酶集合：(A)1)3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，3)3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，4)5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，和5)戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，如在图15的步骤A‑E中所示，和(B)1)3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，3)3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，4)3,5‑二羟基戊酸脱水酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图15的步骤A、F、I、J和Q中所示。本领域技术人员会认识到，从3‑HP‑CoA开始限定途径(A)和(B)的酶集合可以通过可逆酶3,5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶（如在图15的步骤G中所示）和5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶（如在图15的步骤H中所示）而混合。因而，3‑HP‑CoA至2,4‑戊二烯酸途径可以包括：在步骤A、B、G、J和Q、或步骤A、B、C、H和Q、或步骤A、B、G、J、H、D和E、或步骤A、F、I、G、C、D和E、或步骤A、F、I、G、C、H和Q、或步骤A、F、I、J、H、D和E中的酶，各自显示在图15中。
从丙烯酰辅酶A开始的示例性途径包括下述酶集合：(C)1)丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，3)3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，4)3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶，如在图15的步骤M、O、P和S中所示，和(D)，1)丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，3)3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，和4)戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，如在步骤M、N、R和E中所示。本领域技术人员会认识到，从3‑HP‑CoA开始限定途径(A)和(B)和从丙烯酰辅酶A开始限定(C)和(D)的酶集合可以通过可逆酶3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶（如在图15的步骤K中所示）和3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶（如在图15的步骤L中所示）而混合。因而，步骤K可以加入任一个列举的从丙烯酰辅酶A至2,4‑戊二烯酸的途径中，从而提供2,4‑戊二烯酸途径，诸如步骤K、M、N、R、和E，或步骤K、M、O、P、和S。步骤K还可以用作步骤A的穿梭替代步骤，以从3‑HP‑CoA经由步骤K、M和L提供3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A。因而，利用步骤A的酶的任意前述途径可以替代性地利用步骤K、M和L的酶。通过经由图15的步骤K和A或M和L的酶的途径，可以从丙烯酰辅酶A得到相同的3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A中间体。因而，丙烯酰辅酶A可以用于接入可从3‑HP‑CoA介入的所有列举的途径。因而，例如，丙烯酰辅酶A至2,4‑戊二烯酸途径可以包括：来自步骤K、A、B、C、D和E、或步骤K、A、F、I、J和Q、或步骤K、A、B、G、J和Q、或步骤K、A、B、G、J、H、D和E、或步骤K、A、B、C、H和Q、或步骤K、A、F、I、G、C、D和E、或步骤K、A、F、I、G、C、H、Q、或步骤K、A、F、I、J、H、D和E、或步骤M、L、B、C、D和E、或步骤M、L、F、I、J和Q、或步骤M、L、B、G、J和Q、或步骤M、L、B、G、J、H、D和E、或步骤M、L、B、C、H和Q、或步骤M、L、F、I、G、C、D和E、或步骤M、L、F、I、G、C、H、Q、或步骤M、L、F、I、J、H、D和E的酶，都如在图15中所示。类似地，使用步骤L的酶，3‑HP‑CoA可以经由中间体3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A供料进列举的丙烯酰辅酶A途径。因而，3‑HP‑CoA至2,4‑戊二烯酸途径可以包括：来自步骤A、L、N、R、和E或步骤A、L、O、P、和S的酶，每个途径显示在图15中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：
1)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
2)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
3)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
4)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
5)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
6)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
7)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
8)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
9)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
10)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
11)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
12)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，D.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
13)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，R.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
14)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和
15)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；
16)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，R.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，E.戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶；
17)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和
18)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，S.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶。
在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体包括2、3、4、5、6、7或8种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体另外包括2,4‑戊二烯脱羧酶，以将2,4‑戊二烯酸转化成1,3‑丁二烯。
在有些实施方案中，非天然存在的微生物体包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达。所述1,3‑丁二烯途径具有选自下述的酶集合：
1)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
2)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
3)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
4)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
5)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，N.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，T.3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
6)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，O.3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，P.3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，Y.3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；
在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体包括2、3、4或5种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体包括至少一种是异源核酸的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸，所述3‑丁烯‑1‑醇途径酶以足以生产3‑丁烯‑1‑醇的量表达。所述3‑丁烯‑1‑醇途径具有选自下述的酶集合：
1)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
2)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
3)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
4)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
5)A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
6)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
7)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
8)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
9)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
10)M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
11)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
12)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
13)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
14)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
15)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，A.3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
16)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
17)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，F.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，I.3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
18)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，U.3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；
19)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，G.3,5‑二羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，J.3,5‑二羟基戊酸脱水酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
20)K.3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶，M.丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，L.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶，B.3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，C.3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，H.5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，V.5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；
在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体包括2、3、4、5、6或7种各自编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体另外包括3‑丁烯‑1‑醇脱水酶，以将3‑丁烯‑1‑醇转化成1,3‑丁二烯。
在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以包括2种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以包括3种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。例如，本发明的非天然存在的微生物体可以包括3种外源核酸，所述外源核酸编码：i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，从而提供丙氨酸或鸟氨酸经由AKP可到达2,4‑戊二烯酸的途径。本领域技术人员会认识到，这仅仅是示例性的，并且3种外源核酸可以是在图12‑15的任一个列举途径中的任意生产2,4‑戊二烯酸的非天然存在的生物体的基础。
在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以包括：任意4种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。例如，非天然存在的微生物体可以包括4种外源核酸，所述外源核酸编码：i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶，从而限定从丙酮酸至2,4‑戊二烯酸的完整途径，如在图12中所示。本领域技术人员会认识到，这仅仅是示例性的，并且4种外源核酸可以是在图12‑15的任一个列举途径中的任意生产2,4‑戊二烯酸的非天然存在的生物体的基础。
在其它实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以包括5种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。具有5种外源核酸的本发明的示例性的非天然存在的微生物体可以包括这样的外源核酸，所述外源核酸编码：(A)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图13的步骤E、H、F、C和D中所示，或(B)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如在图13的步骤E和K以及图12步骤B、C和D中所示，或i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如在图13的步骤J和L、以及图12的步骤B、C和D中所示。本领域技术人员会认识到，这仅仅是示例性的，并且5种外源核酸可以是在图12‑15的任一个列举途径中的任意生产2,4‑戊二烯酸的非天然存在的生物体的基础。因而，在有些实施方案中，可以提供2,4‑戊二烯酸途径中的2、3、4、5、6种、最多所有酶来插入外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。此外，在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以提供在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以另外包括2,4‑戊二烯酸脱羧酶，所述2,4‑戊二烯酸脱羧酶以足以生产1,3‑丁二烯（通过将2,4‑戊二烯酸转化成1,3‑丁二烯）的量表达。因而，图12的任意2,4‑戊二烯酸途径可以形成进一步生产1,3‑丁二烯的基础，如图4中顺式或反式2,4‑戊二烯酸向1,3‑丁二烯的转化所示。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其具有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径，其中所述非天然存在的微生物体包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码将底物转化成产物的酶或蛋白。例如，在甲苯途径(图1)中，这样的底物至产物选自：苯丙氨酸至苯丙酮酸、苯丙酮酸至苯乙醛、苯丙酮酸至苯乙酸、苯乙醛至苯乙酸、苯乙醛至甲苯和苯乙酸至甲苯。在苯乙烯途径(图3)中，这样的底物至产物选自：苯甲酰辅酶A至3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A、3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A至[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐、[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐至苯甲酰乙酸、3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A至苯甲酰乙酸、苯甲酰乙酸至乙酰苯、乙酰苯至1‑苯基乙醇和1‑苯基乙醇至苯乙烯。在1,3‑丁二烯途径(图4)中，这样的底物至产物选自：反式,反式‑粘康酸至反式‑2,4‑戊二烯酸、顺式,反式‑粘康酸至反式‑2,4‑戊二烯酸、顺式,反式‑粘康酸至顺式‑2,4‑戊二烯酸、顺式,顺式‑粘康酸至顺式‑2,4‑戊二烯酸、反式‑2,4‑戊二烯酸至1,3‑丁二烯和顺式‑2,4‑戊二烯酸至1,3‑丁二烯。本领域的技术人员应当理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员基于本文的教导，可以容易地确定适用于生产所需产物的任意本文公开的底物‑产物对和可用于将底物转化成产物的适当活性。
在2,4‑戊二烯酸途径中，这样的底物至产物选自：丙酮酸至4‑羟基‑2‑氧代戊酸、4‑羟基‑2‑氧代戊酸至2‑氧代戊烯酸、2‑氧代戊烯酸至2‑羟基戊烯酸、2‑羟基戊烯酸至2,4‑戊二烯酸、AKP至乙酰基丙烯酸、乙酰基丙烯酸至4‑羟基戊‑2‑烯酸、4‑羟基戊‑2‑烯酸至2,4‑戊二烯酸、AKP至2,4‑二氧代戊酸、2,4‑二氧代戊酸至4‑羟基‑2‑氧代戊酸、AKP至2‑氨基‑4‑羟基戊酸、2‑氨基‑4‑羟基戊酸至4‑羟基‑2‑氧代戊酸、鸟氨酸至2,4‑二氨基戊酸、2,4‑二氨基戊酸至AKP、丙氨酸至AKP，诸如此类。
本发明也提供了一种非天然存在的微生物体，包括具有(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸，所述(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶以足以生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的量表达，所述(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径包括2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶(参见实施例III和图5、步骤C)。包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的非天然存在的微生物体可以另外包含1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶或1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶(参见实施例III和图5、步骤A和B)。因而，(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径可以包括：2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶、1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶和1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶。
本发明也提供了一种非天然存在的微生物体，包括具有对甲苯甲酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码对甲苯甲酸途径酶的外源核酸，所述对甲苯甲酸途径酶以足以生产对甲苯甲酸的量表达，所述对甲苯甲酸途径包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶;3‑脱氢奎尼酸合酶;3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶;3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；或分支酸裂合酶(参见实施例IV和图6、步骤A‑H)。具有对甲苯甲酸途径的非天然存在的微生物体可以另外包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径(图5)。(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径可以包括，例如，2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶、1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶或1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶(图5)。
本发明另外提供了一种非天然存在的微生物体，包括具有对苯二甲酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码对苯二甲酸途径酶的外源核酸，所述对苯二甲酸途径酶以足以生产对苯二甲酸的量表达，所述对苯二甲酸途径包括：对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶还原酶；4‑羧基苯甲醇脱氢酶；或4‑羧基苄基醛脱氢酶(参见实施例V和图7)。这样的含有对苯二甲酸途径的生物体可以另外包含对甲苯甲酸途径，其中所述对甲苯甲酸途径包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；3‑脱氢奎尼酸合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶；3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；或分支酸裂合酶(参见实施例IV和V和图6和7)。这样的具有对苯二甲酸途径和对甲苯甲酸途径的非天然存在的微生物体可以另外包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径(参见实施例III和图5)。(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径可以包括，例如，2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶、1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶或1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶(参见实施例III和图5)。
在有些实施方案中，本发明提供了一种具有甲苯途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达。所述甲苯途径选自下述的途径酶集合：a)对甲苯甲酸脱羧酶；b)对甲苯甲酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；c)对甲苯甲酸激酶、(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；d)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶、(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；和e)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。
在有些实施方案中，本发明提供了一种具有(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸，所述(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶以足以生产(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的量表达。所述(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径包括赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
在有些实施方案中，本发明提供了一种具有苯甲酸途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码苯甲酸途径酶的外源核酸，所述苯甲酸途径酶以足以生产苯甲酸的量表达。所述苯甲酸途径包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；3‑脱氢奎尼酸合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶；3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；和分支酸裂合酶。
在有些实施方案中，本发明提供了一种具有苯途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达。所述苯途径选自下述的途径酶集合：a)苯甲酸脱羧酶；b)苯甲酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；c)苯甲酸激酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；d)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、磷酸苯甲酰基转移酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；和e)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其具有(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、甲苯、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸或苯途径，其中所述非天然存在的微生物体包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码将底物转化成产物的酶或蛋白。例如，在(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径中，所述底物和产物可以选自：甘油醛‑3‑磷酸和丙酮酸至1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸；1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸至C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸；和C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸至(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(参见实施例III和图5)。在另一个实施方案中，对甲苯甲酸途径可以包括选自下述的底物和产物：(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐至2,4‑二羟基‑5‑甲基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸；2,4‑二羟基‑5‑甲基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸至1,3‑二羟基‑4‑甲基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸；1,3‑二羟基‑4‑甲基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸至5‑羟基‑4‑甲基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸；5‑羟基‑4‑甲基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸至3,5‑二羟基‑4‑甲基环己‑1‑烯‑1‑甲酸；3,5‑二羟基‑4‑甲基环己‑1‑烯‑1‑甲酸至5‑羟基‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸；5‑羟基‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸至5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸；5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸至3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸；和3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸至对甲苯甲酸(参见实施例IV和图6)。在另一个实施方案中，对苯二甲酸途径可以包括选自下述的底物和产物：对甲苯甲酸至4‑羧基苯甲醇；4‑羧基苯甲醇至4‑羧基苯甲醛；和4‑羧基苯甲醛至对苯二甲酸(参见实施例V和图7)。在另一个实施方案中，甲苯途径可以包括选自下述的底物和产物：对甲苯甲酸至甲苯；对甲苯甲酸至对甲基苯甲酰辅酶A；对甲基苯甲酰辅酶A至对甲基苯甲酰氧基磷酸盐或对甲基苯甲醛；对甲基苯甲酰氧基膦酸盐至对甲基苯甲醛；和对甲基苯甲醛至甲苯(参见实施例VII和图11)。在另一个实施方案中，2H4OP途径可以包括选自下述的底物和产物：赤藓糖‑4‑磷酸至(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸盐；和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸盐至2H4OP(参见实施例VI和图8)。在另一个实施方案中，苯甲酸途径可以包括选自下述的底物和产物：(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐至2,4‑二羟基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸；2,4‑二羟基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸至1,3‑二羟基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸；1,3‑二羟基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸至5‑羟基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸；5‑羟基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸至3,5‑二羟基环己‑1‑烯‑1‑甲酸，3,5‑二羟基环己‑1‑烯‑1‑甲酸至5‑羟基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸；5‑羟基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸至5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸；5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸至3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸；和3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸至苯甲酸(参见实施例VI和图9)。在另一个实施方案中，苯途径可以包括选自下述的底物和产物：苯甲酸至苯；苯甲酸至苯甲酰辅酶A、(苯甲酰氧基)膦酸盐或苯甲醛；苯甲酰辅酶A至(苯甲酰氧基)膦酸盐或苯甲醛；(苯甲酰氧基)膦酸盐至苯甲醛；和苯甲醛至苯。本领域的技术人员应当理解，这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员基于本文的教导，可以容易地确定适用于生产所需产物的任意本文公开的底物‑产物对和可用于将底物转化成产物的适当活性。
如本文所公开的，(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径如图5所示(参见实施例III)。因此，除了含有生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的微生物体以外，本发明另外提供了一种非天然存在的微生物体，其包含至少一种编码(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸，其中所述微生物体生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径中间体，例如，1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸或C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸。类似地，本发明也提供了一种非天然存在的微生物体，其含有生产对甲苯甲酸的对甲苯甲酸途径，其中所述非天然存在的微生物体包含至少一种编码对甲苯甲酸途径酶的外源核酸，其中所述微生物体生产对甲苯甲酸途径中间体，例如，2,4‑二羟基‑5‑甲基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸，1,3‑二羟基‑4‑甲基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸，5‑羟基‑4‑甲基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸，3,5‑二羟基‑4‑甲基环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5‑羟基‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，或3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸。此外，本发明另外提供了一种含有对苯二甲酸途径酶的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体生产对苯二甲酸途径中间体，例如，4‑羧基苯甲醇或4‑羧基苯甲醛。
类似地，本发明也提供了一种非天然存在的微生物体，其含有生产甲苯的甲苯途径，其中所述非天然存在的微生物体包含至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，其中所述微生物体生产甲苯途径中间体，例如，对甲基苯甲酰辅酶A、(对甲基苯甲酰氧基)膦酸盐或对甲基苯甲醛。
类似地，本发明也提供了一种非天然存在的微生物体，其含有生产苯的苯途径，其中所述非天然存在的微生物体包含至少一种编码苯途径酶的外源核酸，其中所述微生物体生产苯途径中间体，例如，苯甲酰辅酶A、(苯甲酰氧基)膦酸盐和苯甲醛(图10)。
类似地，本发明也提供了一种非天然存在的微生物体，其含有生产苯甲酸的苯甲酸途径，其中所述非天然存在的微生物体包含至少一种编码苯甲酸途径酶的外源核酸，其中所述微生物体生产苯甲酸途径中间体，例如，(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐，2,4‑二羟基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸，1,3‑二羟基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸，5‑羟基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸，3,5‑二羟基环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5‑羟基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，和3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸(图9)。
因而，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包含至少一种编码酶或蛋白的外源核酸，其中所述酶或蛋白转化下述途径的底物和产物：甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径，诸如在图1‑11中所示的那些。
当在本文中一般地描述为含有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的微生物体时，应当理解，本发明另外提供了一种非天然存在的微生物体，其包含至少一种编码甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。例如，如本文所公开的，甲苯、苯、苯乙烯和1,3‑丁二烯途径显示在图1‑23中。因此，除了含有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径（所述途径生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯）的微生物体以外，本发明另外提供了一种非天然存在的微生物体，其包含至少一种编码甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，其中所述微生物体生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体，例如，苯丙酮酸、苯乙醛、苯乙酸、3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A、[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐，苯甲酰乙酸、乙酰苯、1‑苯基乙醇、DXP、2ME4P、苯甲酰辅酶A、(苯甲酰氧基)膦酸盐，苯甲醛、反式‑2、4‑戊二烯酸、和顺式‑2、4‑戊二烯酸以及图6和9所示的任意莽草酸途径中间体。
应当理解，在实施例中描述的和在附图中图解的、在本文中公开的任意途径（包括图1‑11的途径），可以用于制备非天然存在的微生物体，其生产所需的任意途径中间体或产物。如本文所公开的，这样的生产中间体的微生物体可以与另一种表达下游途径酶的微生物体联合使用，以生产所需产物。但是，应当理解，生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体的非天然存在的微生物体可以用于生产中间体作为所需产物。
本文一般地参考代谢反应、反应物或其产物或具体地参考一个或更多个核酸或基因对本发明进行描述，所述核酸或基因编码与所述代谢反应、反应物或产物相关或进行催化的酶，或与所述代谢反应、反应物或产物相关的蛋白。除非本文另外明确说明，本领域的技术人员应当理解，对反应的提及也构成对反应物和反应产物的提及。类似地，除非本文另外明确说明，对反应物或产物的提及也提及反应，并且对这些代谢组分中的任一种的提及也提及这样的一个基因或多个基因：所述基因编码催化所提及的反应、反应物或产物的酶，或参与所提及的反应、反应物或产物的蛋白。同样地，鉴于熟知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的提及也构成对对应的编码酶和其催化的反应或与所述反应有关的蛋白以及所述反应的反应物和产物的提及。
本发明的非天然存在的微生物体可以通过引入可表达的核酸产生，所述核酸编码一种或多种参与一个或更多个甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的酶或蛋白。根据选择用于生物合成的宿主微生物体，可以表达用于一些或所有特定的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的核酸。例如，如果选择的宿主缺乏所需生物合成途径中的一种或多种酶或蛋白，那么将所述缺乏的酶或蛋白的可表达核酸引入宿主中，用于随后的外源性表达。可替换地，如果选择的宿主表现出一些途径基因的内源表达，但是缺乏其它的途径基因，那么需要所述缺乏的酶或蛋白的编码核酸，以实现甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成。因此，可以如下生产本发明的非天然存在的微生物体：通过引入外源酶或蛋白质活性以获得所需的生物合成途径，或者通过将一种或多种外源酶或蛋白质活性与一种或多种内源酶或蛋白质一起引入以获得所需的生物合成途径，生产所需的产物诸如甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。
宿主微生物体可以选自，且所述非天然存在的微生物体可以产自：例如，细菌、酵母、真菌或可用于发酵过程的多种其它微生物中的任一种。示例性的细菌包括选自以下的物种：大肠杆菌、产酸克雷伯菌、产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡萄糖菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭杆菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。示例性的酵母或真菌包括选自以下的物种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、巴氏毕赤酵母、无根根霉、米根霉等等。大肠杆菌是特别有用的宿主生物，因为它是适用于基因工程的确定地表征的微生物体。其它特别有用的宿主生物包括酵母诸如酿酒酵母。应当理解，任意合适的微生物宿主生物可以用于引入代谢修饰和/或遗传修饰以生产所需产物。
根据已选择的宿主微生物体的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的组分，本发明的非天然存在的微生物体包括至少一种外源地表达的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的编码核酸和针对一个或更多个甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的最多所有的编码核酸。例如，通过相应编码核酸的外源表达，可以在缺乏途径酶或蛋白质的宿主中建立甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成。在缺乏甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的所有酶或蛋白质的宿主中，可包括所述途径中所有酶或蛋白质的外源表达，虽然可以理解，即使所述宿主包含至少一种途径酶或蛋白质，也可以表达该途径的所有酶或蛋白质。例如，可以包括在甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生产途径中的所有酶或蛋白质的外源表达，诸如苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶和/或氧化酶、苯丙酮酸氧化酶、苯乙酸脱羧酶、苯乙醛脱羰酶、苯丙氨酸苯‑裂合酶、苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶、3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶、苯甲酰乙酸脱羧酶、乙酰苯还原酶、1‑苯基乙醇脱水酶、磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶、苯甲酰乙酸激酶、反式,反式‑粘康酸脱羧酶、顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶、顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶、顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶、反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶、和顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
例如，可以包括在对甲苯甲酸途径中的所有酶，诸如2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；3‑脱氢奎尼酸合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶；3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；和分支酸裂合酶。另外，可以包括在对苯二甲酸途径中的所有酶，诸如对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶还原酶；4‑羧基苯甲醇脱氢酶；和4‑羧基苄基醛脱氢酶。此外，可以包括在(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径中的所有酶，诸如2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶、1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶和1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶。同样地，可以包括在甲苯途径中的所有酶，诸如对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶、对甲苯甲酸还原酶、对甲基苯甲醛脱羰酶、对甲基苯甲酰辅酶A还原酶、对甲苯甲酸脱羧酶、磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶、(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶(去磷酸化)和对甲苯甲酸激酶。
同样地，可以包括在(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径中的所有酶，诸如赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
同样地，可以包括在苯甲酸途径中的所有酶，诸如2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶、3‑脱氢奎尼酸合酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
同样地，可以包括在苯途径中的所有酶，诸如苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶、苯甲酸还原酶、苯甲醛脱羰酶、苯甲酰辅酶A还原酶、苯甲酸脱羧酶、磷酸苯甲酰基转移酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶(去磷酸化)和苯甲酸激酶。
在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员将理解，以可表达形式引入的编码核酸的数量至少与已选择的宿主微生物体的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径缺乏相对应。因此，本发明的非天然存在的微生物体可以具有1、2、3、4、5、6、7、8种核酸，也就是说，最多至编码构成本文公开的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的酶或蛋白质的所有核酸。在有些实施方案中，非天然存在的微生物体还可以包括其它遗传修饰，所述遗传修饰会促进或优化甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成，或对宿主微生物体赋予其它有用的功能。一种这样的其它功能可以包括，例如，增加一种或多种甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径前体的合成，所述前体诸如苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯乙醛、苯乙酸、苯甲酰辅酶A、3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A、[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐、苯甲酰基乙酸、乙酰苯、1‑苯基乙醇、反式,反式‑粘康酸、顺式,反式‑粘康酸、顺式,顺式‑粘康酸、反式‑2,4‑戊二烯酸、顺式‑2,4‑戊二烯酸、4‑羟基‑2‑氧代戊酸、2‑氧代戊烯酸、2‑羟基戊烯酸、2,4‑二羟基戊酸、4‑羟基戊‑2‑烯酸、2,4‑二氨基戊酸、AKP、乙酰基丙烯酸、2,4‑二氧代戊酸、2‑羟基‑4‑氧代‑戊酸、2‑氨基‑4‑羟基戊酸、3,5‑二氨基戊酸、5‑氨基戊‑2‑烯酸、3‑氨基‑5‑氧代戊酸、5‑氧代戊‑2‑烯酸、5‑羟基戊‑2‑烯酸、3‑氨基‑5‑羟基戊酸、3‑HP‑CoA、丙烯酰辅酶A、3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A、3‑氧代‑5‑羟基戊酸、3,5‑二羟基戊酸、3,5‑二羟基戊酰辅酶A、5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A、2,4‑戊二烯酰辅酶A、3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A、3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A、3‑氧代戊‑4‑烯酸和3‑羟基戊‑4‑烯酸甘油醛‑3‑磷酸、丙酮酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐或对甲苯甲酸。此外，如本文所公开的，可以在单个生物体中包括多个途径，诸如生产对甲苯甲酸(图6)、对苯二甲酸(图7)甲苯(图11)和(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(图5)、（根据需要）或2H4OP(图8)、苯甲酸(图9)和苯(图10)的途径。
通常，选择宿主微生物体，使得其生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的前体，无论是作为天然地产生的分子，还是作为工程改造的产物，其会提供所需前体的从头生产或增加由宿主微生物体天然地产生的前体的产量。例如，在宿主生物（例如大肠杆菌）中天然地产生顺式,顺式‑粘康酸。作为另一个实例，在宿主生物（例如大肠杆菌）中天然地产生甘油醛‑3‑磷酸和磷酸烯醇丙酮酸。如本文公开的，可以工程改造宿主生物以提高前体产量。另外，已经工程改造以生产所需前体的微生物体可用作宿主生物，并且进一步工程改造以表达甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的酶或蛋白质。
在某些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体从这样的宿主产生：所述宿主包含合成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的酶能力。在该具体的实施方案中，可以有用的是，增加甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径产物的合成或积累，以便例如向着甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产方向推动甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径反应。增加的合成或积累可以如下实现：例如，过量表达编码一种或多种上述的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶或蛋白的核酸。甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的一种酶或多种酶和/或一种酶或多种蛋白质的过量表达可以如下实现：例如，外源表达一个或更多个内源基因，或外源表达一个或更多个异源基因。因此，通过过量表达1、2、3、4、5、6、7、8种核酸，也就是说，最多至编码甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径酶或蛋白质的所有核酸，可以容易地将天然存在的生物体制成本发明的非天然存在的微生物体，例如，其生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。另外，非天然存在的生物体可以通过内源基因的诱变产生，所述诱变会导致甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径中的酶的活性增加。
在特别有用的实施方案中，采用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表达和/或调控元件的能力和实现由使用者控制的期望的表达水平的应用。然而，在其它实施方案中，也可以利用内源表达，诸如当连接到诱导型启动子或其它调控元件时，通过除去负调控效应物或诱导基因的启动子。因此，通过提供适当的诱导剂可以增量调节具有天然存在的诱导型启动子的内源基因，或可以工程构造内源基因的调控区以掺入诱导型调控元件，从而允许在期望的时间调控内源基因的增加的表达。类似地，可以包括诱导型启动子作为引入非天然存在的微生物体中的外源基因的调控元件。
应当理解，在本发明的方法中，可以将任意一种或多种外源核酸引入微生物体中，以产生本发明的非天然存在的微生物体。可以引入核酸，以便对微生物体赋予例如甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径。可替换地，可以引入编码核酸，以产生具有生物合成能力的中间微生物体，从而催化一些所需的反应，以赋予甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成能力。例如，具有甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的非天然存在的微生物体可以包含至少两种外源核酸，所述外源核酸编码期望的酶或蛋白，诸如甲苯途径中的下述组合：苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)和苯丙酮酸脱羧酶，苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)和苯乙醛脱氢酶和/或氧化酶，苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)和苯丙酮酸氧化酶，苯丙酮酸氧化酶和苯乙酸脱羧酶，苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)和苯乙酸脱羧酶，苯丙氨酸氨基转移酶和/或苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)和苯乙醛脱羰酶，苯丙酮酸脱羧酶和苯乙醛脱氢酶，苯丙酮酸脱羧酶和苯乙酸脱羧酶，苯丙酮酸脱羧酶和苯乙醛脱羰酶，和苯乙醛脱氢酶和/或氧化酶和苯乙酸脱羧酶。类似地，在苯乙烯途径中，至少2种外源核酸的组合可以包括：苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶和3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶，苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶和苯甲酰乙酸脱羧酶，苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶和乙酰苯还原酶，苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶和1‑苯基乙醇脱水酶，苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶和磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶和苯甲酰乙酸激酶，3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶和苯甲酰乙酸脱羧酶，3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶和苯乙酮还原酶，3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶和1‑苯基乙醇脱水酶，诸如此类。
类似地，在(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径中，表达的酶组合可以是下述组合：2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶和1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶，或2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶和1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶。在对甲苯甲酸途径中，表达的酶组合可以是下述组合：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶和3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸激酶和3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；莽草酸激酶和莽草酸脱氢酶，等等。类似地，在对苯二甲酸途径中，表达的酶组合可以是：对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶还原酶和4‑羧基苯甲醇脱氢酶；或4‑羧基苯甲醇脱氢酶和4‑羧基苄基醛脱氢酶，等等。因而，应当理解，在本发明的非天然存在的微生物体中可以包括生物合成途径的2种或更多种酶或蛋白质的任意组合。
类似地，应当理解，根据需要，在本发明的非天然存在的微生物体中可以包括生物合成途径的3种或更多种酶或蛋白质的任意组合，诸如此类，只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合会导致对应的所需产物的生产。根据需要，这样的3种酶的组合可以包括，例如，3‑脱氢奎尼酸合酶、莽草酸脱氢酶和莽草酸激酶；莽草酸激酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶，诸如此类，只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合会导致对应的所需产物的生产。
类似地，根据需要，在本发明的非天然存在的微生物体中可以包括如本文公开的生物合成途径的4、5、6或更多种酶或蛋白质的任意组合，只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合会导致对应的所需产物的生产。
除了本文所述的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成以外，本发明的非天然存在的微生物体和方法也可以用于彼此的各种组合中，和与本领域熟知的其它微生物体和方法的各种组合中，以实现通过其它途径的产物生物合成。例如，除了使用甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产菌株以外，生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的一种替代方案是，通过添加另一种微生物体，所述微生物体能够将甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体转化成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。一种这样的方法包括，例如，发酵生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体的微生物体。然后可以使用甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体作为第二种微生物体的底物，所述第二种微生物体将甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体转化成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。所述甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体可以直接加入第二种生物体的其它培养物中，或可以从甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体生产菌株的原始培养物中除去这些微生物体（例如，通过细胞分离），然后将第二种生物体加入发酵液中，以没有中间纯化步骤地生产终产物。
在其它实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体和方法可以以许多种亚途径(subpathway)组合，以实现例如甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成。在这些实施方案中，本发明的期望产物的生物合成途径可以分离到不同的微生物体中，并且不同的微生物体可以共同培养以产生终产物。在这种生物合成方案中，一种微生物体的产物是第二种微生物体的底物，直至合成终产物。例如，甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成可以如下实现：构建微生物体，该微生物体包含将一种途径中间体转化成另一种途径中间体或产物的生物合成途径。可替换地，也可以在同一容器中使用两种生物通过共同培养或共同发酵由微生物体生物合成地生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯，其中第一种微生物体生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯中间体，第二种微生物体将所述中间体转化成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。
在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员应当理解，对于本发明的非天然存在的微生物体和方法以及其它微生物体、其它具有亚途径的非天然存在的微生物体的共同培养物、及本领域中熟知的其它化学和/或生物化学方法的组合，存在许多种组合和变换，以生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。
甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶或蛋白的编码核酸的来源可以包括，例如，其中编码的基因产物能够催化相关反应的任意物种。这样的物种包括：包括原核和真核生物，包括但不限于，细菌（包括古细菌和真细菌属），和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和包括人在内的哺乳动物。这些来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌、结核分枝杆菌、根瘤土壤杆菌、枯草芽孢杆菌、集胞藻属各种、拟南芥、运动发酵单胞菌、产酸克雷伯菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、丘状菌落乳杆菌、肺炎克雷伯菌、巴斯德梭菌、弗氏柠檬酸杆菌、酪酸梭菌、Roseburiainulinivorans、硫矿硫化叶菌、粗糙链孢霉、费氏中华根瘤菌、幽门螺杆菌、强烈火球菌、流感嗜血杆菌、菊欧文氏菌、金黄色葡萄球菌、杜氏盐藻、肺炎链球菌、酿酒酵母、构巢曲霉、卡氏肺孢菌、天蓝色链霉菌，来自伯霍尔德杆菌属、产碱菌属、假单胞菌属、假平胞菌属和丛毛平胞菌属的各种，例如，睾丸酮丛毛平胞菌以及本文公开的或可作为对应基因的源生物体的其它示例性种。但是，由于目前可获得550个物种以上的全基因组序列(这些中一半以上可在诸如NCBI等公共数据库上获得)，包括395种微生物基因组以及多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，对于在相关或远缘物种中的一个或更多个基因（包括例如已知基因的同系物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换，以及生物间遗传改变的互换）而言，对编码必要的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成活性的基因的鉴定，在本领域中是常规的和熟知的。因此，本文参考具体生物（诸如大肠杆菌）描述的能够生物合成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的代谢改变可以容易地应用于其它微生物，包括原核和真核生物等。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将知道，在一种生物中示例的代谢改变可以同样应用于其它生物。
在某些情况下，诸如当可选的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径存在于不相关的物种中时，可以将甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成赋予给宿主物种，例如，通过外源表达来自不相关物种的一个或更多个旁系同源物，所述旁系同源物催化类似的但不相同的代谢反应，以替换相关的反应。因为不同的生物之间存在某些代谢网络差异，所以本领域技术人员应当理解，在不同的生物之间实际的基因应用可以不同。然而，在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员也应当理解，本发明的教导和方法可以应用于使用与本文示例的那些的同源的代谢改变的所有微生物体，以在目标物种中构建微生物体，所述微生物体将合成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。
用于构建和检测非天然存在的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产宿主的表达水平的方法，可以通过例如本领域中熟知的重组和检测方法完成。可以发现这些方法描述在，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory，New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
利用本领域熟知的技术，可以将参与生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的途径的外源核酸序列稳定地或瞬时地导入宿主细胞中，所述技术包括、但不限于，接合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。对于在大肠杆菌或其它原核细胞中的外源表达而言，一些基因中的核酸序列或真核核酸的cDNA可编码靶向信号诸如N‑末端线粒体或其它靶向信号，如果需要，所述靶向信号可以在转化进原核宿主细胞之前除去。例如，线粒体前导序列的除去会导致在大肠杆菌中增加的表达(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329‑4338(2005))。对于酵母或其它真核细胞中的外源表达而言，基因可在不添加前导序列的情况下在胞质溶胶中表达，或通过添加合适的靶向序列（诸如适合宿主细胞的线粒体靶向信号或分泌信号）而靶向线粒体或其它细胞器，或靶向分泌。因此，应当理解，用于除去或包含靶向序列的对核酸序列的适当修饰，可以掺入外源核酸序列中，以赋予合乎需要的特性。此外，可用本领域熟知的技术对基因进行密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
可以构建一个或更多个表达载体，以包括本文所示例的一种或多种甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径编码核酸，所述编码核酸与在宿主生物中起作用的表达控制序列可操作地相连。适用于本发明的宿主微生物体的表达载体包括，例如，质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括可操作地稳定整合进宿主染色体中的载体和选择序列或标记。另外，所述表达载体可包含一个或更多个选择标记基因和合适的表达控制序列。也可以包括选择标记基因，其例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型缺乏或供给培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共同表达两种或更多种外源编码核酸时，可以将所述核酸插入例如单一表达载体中或分离的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。使用本领域中熟知的方法，可以证实参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化。这样的方法包括例如，核酸分析诸如RNA印迹或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，或用于基因产物表达的免疫印迹，或用于检测导入的核酸序列或其相应基因产物的表达的其它合适的分析方法。本领域的技术人员应当理解，外源核酸以足以生产期望的产物的量表达，且进一步理解，利用本领域熟知的和本文公开的方法，可以优化表达水平以获得足够的表达。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产甲苯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有甲苯途径的非天然存在的微生物体足以生产甲苯的时间段，所述甲苯途径包括至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达。所述甲苯途径可以选自：(A)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或两种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，和3)苯乙醛脱羰酶；(B)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸脱羧酶，3)苯乙醛脱氢酶和苯乙醛氧化酶中的一种或多种，和4)苯乙酸脱羧酶；和(C)1)苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙氨酸氧化还原酶中的一种或多种(脱氨)，2)苯丙酮酸氧化酶，和3)苯乙酸脱羧酶，如在图1所示的替代途径中所指示的。在有些实施方案中，所述方法包括：在基本上厌氧的培养基中培养所述非天然存在的微生物体。
在有些实施方案中，本发明的用于生产甲苯的方法包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体包括2种各自编码甲苯途径酶的外源核酸、3种各自编码甲苯途径酶的外源核酸、4种各自编码甲苯途径酶的外源核酸、5种各自编码甲苯途径酶的外源核酸，诸如此类。具有4种外源核酸的示例性生物体可以编码：1)苯丙氨酸氨基转移酶，2)苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，3)苯丙酮酸脱羧酶，和4)苯乙醛脱羰酶。具有5种外源核酸的示例性生物体可以编码：1)苯丙氨酸氨基转移酶，2)苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)，3)苯丙酮酸脱羧酶，4)苯乙醛脱氢酶和/或氧化酶，和5)苯乙酸脱羧酶。在有些实施方案中，本发明的用于生产甲苯的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产苯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有苯途径的非天然存在的微生物体足以生产苯的时间段，所述苯途径可以包括至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达。所述苯途径可以包括苯丙氨酸苯‑裂合酶，如在图2中所示。在有些实施方案中，所述至少一种外源核酸是苯丙氨酸苯‑裂合酶本身，而在替代实施方案中，所述至少一种外源核酸可以影响前体代谢物苯丙氨酸的生产。在有些实施方案中，所述苯途径的至少一种外源核酸是异源核酸。在有些实施方案中，本发明的用于生产苯的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有苯乙烯途径的非天然存在的微生物体足以生产苯乙烯的时间段，所述苯乙烯途径可以包括至少一种编码苯乙烯途径酶的外源核酸，所述苯乙烯途径酶以足以生产苯乙烯的量表达。所述苯乙烯途径可以选自：(A)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种或多种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶；和(B)1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶，如在图3中的替代途径中所示。在有些实施方案中，本发明的用于生产苯乙烯的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明的用于生产苯乙烯的方法包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体包括2种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸、3种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸、4种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸、5种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸、6种各自编码苯乙烯途径酶的外源核酸，诸如此类。具有5种外源核酸的示例性生物体可以编码：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A合成酶、转移酶和水解酶中的一种，3)苯甲酰乙酸脱羧酶，4)苯乙酮还原酶，和5)1‑苯基乙醇脱水酶。具有6种外源核酸的示例性生物体可以编码：1)苯甲酰辅酶A乙酰基转移酶，2)磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶，3)苯甲酰乙酸激酶，4)苯甲酰乙酸脱羧酶，5)苯乙酮还原酶，和6)1‑苯基乙醇脱水酶。在有些实施方案中，本发明的用于生产苯乙烯的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段，所述1,3‑丁二烯途径包括至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达。所述1,3‑丁二烯途径可以选自：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶，如在图4中的替代途径所示。在有些实施方案中，所述生产1,3‑丁二烯的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体具有2种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。具有2种外源核酸的示例性生物体可以包括编码选自下述的酶集合的基因：(A)1)反式,反式‑粘康酸脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(B)1)顺式,反式‑粘康酸顺式‑脱羧酶和2)反式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)1)顺式,反式‑粘康酸反式‑脱羧酶2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶；和(D)1)顺式,顺式‑粘康酸脱羧酶和2)顺式‑2,4‑戊二烯酸脱羧酶。在有些实施方案中，本发明的方法可以包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。
本发明另外提供了一种用于生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的方法，所述方法包括：在一定条件下培养含有(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的非天然存在的微生物体足以生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的时间段。这样的微生物体可以具有(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径，所述途径包含至少一种编码(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸，所述(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶以足以生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的量表达，所述(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径包括2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶(参见实施例III和图5、步骤C)。(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径可以任选地另外包括1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶和/或1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶(参见实施例III和图5、步骤A和B)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产对甲苯甲酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养包含对甲苯甲酸途径的非天然存在的微生物体足以生产对甲苯甲酸的时间段。对甲苯甲酸途径可以包括至少一种编码对甲苯甲酸途径酶的外源核酸，所述对甲苯甲酸途径酶以足以生产对甲苯甲酸的量表达，所述对甲苯甲酸途径包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；3‑脱氢奎尼酸合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶；3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；和/或分支酸裂合酶(参见实施例IV和图6、步骤A‑H)。在另一个实施方案中，本发明的方法可以利用非天然存在的微生物体，所述微生物体另外包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径(参见实施例III和图5)。这样的(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径可以包括2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶、1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶和/或1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶(参见实施例III和图5)。
本发明另外提供了一种用于生产对苯二甲酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养含有对苯二甲酸途径的非天然存在的微生物体足以生产对苯二甲酸的时间段。这样的对苯二甲酸途径可以包括至少一种编码对苯二甲酸途径酶的外源核酸，所述对苯二甲酸途径酶以足以生产对苯二甲酸的量表达，所述对苯二甲酸途径包括：对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶还原酶；4‑羧基苯甲醇脱氢酶；和/或4‑羧基苄基醛脱氢酶。这样的微生物体可以另外包含对甲苯甲酸途径，其中所述对甲苯甲酸途径包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；3‑脱氢奎尼酸合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶；3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；和/或分支酸裂合酶(参见实施例IV和V和图6和7)。在另一个实施方案中，所述非天然存在的微生物体可以另外包含(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径(参见实施例III和图5)。在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产甲苯的方法，所述方法包括：培养具有甲苯途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码甲苯途径酶的外源核酸，所述甲苯途径酶以足以生产甲苯的量表达。甲苯途径可以选自下述的途径酶集合：a)对甲苯甲酸脱羧酶；b)对甲苯甲酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；c)对甲苯甲酸激酶、(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；d)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶、(对甲基苯甲酰氧基)膦酸还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶；和e)(对甲基苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、对甲基苯甲酰辅酶A还原酶和对甲基苯甲醛脱羰酶。可以在一定条件下培养所述非天然存在的微生物体足以生产甲苯的时间段。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体及其使用方法，其中所述微生物体含有对甲苯甲酸、对苯二甲酸或甲苯和(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的方法，所述方法包括：培养具有(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶的外源核酸，所述(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径酶以足以生产(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的量表达。所述(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径可以包括：赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶和(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产苯甲酸的方法，所述方法包括：培养具有苯甲酸途径的非天然存在的微生物体，所述途径包含至少一种编码苯甲酸途径酶的外源核酸，所述苯甲酸途径酶以足以生产苯甲酸的量表达。所述苯甲酸途径包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶；3‑脱氢奎尼酸合酶；3‑脱氢奎尼酸脱水酶；莽草酸脱氢酶；莽草酸激酶；3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶；分支酸合酶；和分支酸裂合酶。所述方法包括：在一定条件下培养所述非天然存在的生物体足以生产苯甲酸的时间段。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产苯的方法，所述方法包括：培养具有苯途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包含至少一种编码苯途径酶的外源核酸，所述苯途径酶以足以生产苯的量表达。所述苯途径选自下述的途径酶集合：a)苯甲酸脱羧酶；b)苯甲酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；c)苯甲酸激酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；d)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、磷酸苯甲酰基转移酶、(苯甲酰氧基)膦酸还原酶和苯甲醛脱羰酶；和e)(苯甲酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶)、苯甲酰辅酶A还原酶和苯甲醛脱羰酶。可以在一定条件下培养所述非天然存在的微生物体足以生产苯的时间段。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体及其使用方法，其中所述微生物体含有(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸和苯途径。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段，所述途径包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径选自：A)i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶;B)i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶;C)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶;D)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶；和E)i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶。
在有些实施方案中，本发明的方法使用具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：(A)1)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，2)4‑羟基‑2‑氧代戊酸还原酶，3)2,4‑二羟基戊酸2‑脱水酶，和4)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图12的步骤A、E、F和G中所示；和(B)1)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，2)4‑羟基‑2‑氧代戊酸还原酶，3)2,4‑二羟基戊酸4‑脱水酶，和4)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如在图12的步骤A、E、H和D中所示。
在有些实施方案中，本发明的方法使用具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：(A)1)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，2)2,4‑二氧代戊酸2‑还原酶，3)2‑羟基‑4‑氧代戊酸还原酶，4)2,4‑二羟基戊酸2‑脱水酶，和5)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图13的步骤E、H、I、G和D中所示，和(B)1)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，2)2,4‑二氧代戊酸2‑还原酶，3)2‑羟基‑4‑氧代戊酸还原酶，以及4)2,4‑二羟基戊酸‑2‑脱水酶和5)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶或4)2,4‑二羟基戊酸‑4‑脱水酶和5)2‑羟基戊烯酸脱水酶，分别如在图13的步骤E、H和I以及图12的步骤F和G或H和D中所示。也就是说，可以以任意次序进行2,4‑二羟基戊酸的双重脱水。
在有些实施方案中，本发明的方法使用具有AKP途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码AKP途径酶的外源核酸，所述AKP途径酶以足以生产AKP的量表达。所述AKP途径包括：鸟氨酸4,5‑氨基变位酶和2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶和/或4‑脱氢酶，如在图13的步骤M和N中所示。在有些实施方案中，所述具有AKP途径的微生物体包括2种外源酶，所述外源酶编码鸟氨酸4,5‑氨基变位酶和2,4‑二氨基戊酸4‑氨基转移酶或2,4‑二氨基戊酸4‑脱氢酶。在有些实施方案中，该AKP途径可以加入任一个前述的2,4‑戊二烯酸途径，且如在图13中所示。可替换地，通过加入AKP硫解酶，可以从丙氨酸得到AKP，如在图13的步骤A中所示，并供料给本文所述的和在图13以及图12中所示的各个2,4‑戊二烯酸途径。
在有些实施方案中，本发明的方法使用具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：(A)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸脱氨酶，和3)5‑氨基戊‑2‑烯酸脱氨酶，如在图14的步骤A‑C中所示，(B)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸脱氨酶，3)5‑氨基戊‑2‑烯酸氨基转移酶和/或脱氢酶，4)5‑氧代戊‑2‑烯酸还原酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图14的步骤A、B、H、F和G中所示，(C)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，3)3‑氨基‑5‑氧代戊酸脱氨酶，4)5‑氧代戊‑2‑烯酸还原酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图14的步骤A、D、E、F和G中所示，和(D)1)鸟氨酸2,3‑氨基变位酶，2)3,5‑二氨基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，3)3‑氨基‑5‑氧代戊酸还原酶，和4)3‑氨基‑5‑羟基戊酸脱氨酶，和5)5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图14的步骤A、D、I、J和G中所示。
在有些实施方案中，本发明的方法使用具有2,4‑戊二烯酸途径的非天然存在的微生物体，所述微生物体包括至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达。所述2,4‑戊二烯酸途径具有选自下述的酶集合：从3‑HP‑CoA或丙烯酰辅酶A开始，在图15中显示的众多途径中的任一个。
从3‑HP开始的示例性途径包括下述酶集合：(A)1)3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A还原酶，3)3,5‑二羟基戊酰辅酶A脱水酶，4)5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A脱水酶，和5)戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，如在图15的步骤A‑E中所示，和(B)1)3‑羟基丙酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，3)3‑氧代‑5‑羟基戊酸还原酶，4)3,5‑二羟基戊酸脱水酶，和55‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图15的步骤A、F、I、J和Q中所示。本领域技术人员会认识到，从3‑HP‑CoA开始限定途径(A)和(B)的酶集合可以通过可逆酶3,5‑羟基戊酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶（如在图15的步骤G中所示）和5‑羟基戊‑2‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶（如在图15的步骤H中所示）而混合。因而，3‑HP‑CoA至2,4‑戊二烯酸途径可以包括：在步骤A、B、G、J和Q、或步骤A、B、C、H和Q、或步骤A、B、G、J、H、D和E、或步骤A、F、I、G、C、D和E、或步骤、A、F、I、G、C、H和Q、或步骤A、F、I、J、H、D和E中的酶，各自显示在图15中。
从丙烯酰辅酶A开始的示例性途径包括下述酶集合：(C)1)丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，3)3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，4)3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶，如在图15的步骤M、O、P和S中所示，和(D)，1)丙烯酰辅酶A乙酰基转移酶，2)3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A还原酶，3)3‑羟基戊‑4‑烯酰辅酶A脱水酶，和4)戊‑2,4‑二烯酰辅酶A合成酶、转移酶和/或水解酶，如在步骤M、N、R和E中所示。本领域技术人员会认识到，从3‑HP‑CoA开始限定途径(A)和(B)和从丙烯酰辅酶A开始限定(C)和(D)的酶集合可以通过可逆酶3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶（如在图15的步骤K中所示）和3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A脱水酶（如在图15的步骤L中所示）而混合。因而，步骤K可以加入任一个列举的从丙烯酰辅酶A至2,4‑戊二烯酸的途径中，从而提供2,4‑戊二烯酸途径，诸如步骤K、M、N、R和E或步骤K、M、O、P和S。步骤K还可以用作步骤A的穿梭替代步骤，以从3‑HP‑CoA经由步骤K、M和L提供3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A。因而，利用步骤A的酶的任意前述途径可以替代性地利用步骤K、M和L的酶。通过经由图15的步骤K和A或M和L的酶的途径，可以从丙烯酰辅酶A得到相同的3‑氧代‑5‑羟基戊酰辅酶A中间体。因而，丙烯酰辅酶A可以用于接入可从3‑HP‑CoA介入的所有列举的途径。因而，例如，丙烯酰辅酶A至2,4‑戊二烯酸途径可以包括：来自步骤K、A、B、C、D和E、或步骤K、A、F、I、J和Q、或步骤K、A、B、G、J和Q、或步骤K、A、B、G、J、H、D和E、或步骤K、A、B、C、H和Q、或步骤K、A、F、I、G、C、D和E、或步骤K、A、F、I、G、C、H、Q、或步骤K、A、F、I、J、H、D和E、或步骤M、L、B、C、D和E、或步骤M、L、F、I、J和Q、或步骤M、L、B、G、J和Q、或步骤M、L、B、G、J、H、D和E、或步骤M、L、B、C、H和Q、或步骤M、L、F、I、G、C、D和E、或步骤M、L、F、I、G、C、H、Q、或步骤M、L、F、I、J、H、D和E的酶，都如在图15中所示。类似地，使用步骤L的酶，3‑HP‑CoA可以经由中间体3‑氧代戊‑4‑烯酰辅酶A供料进列举的丙烯酰辅酶A途径。因而，3‑HP‑CoA至2,4‑戊二烯酸途径可以包括：来自步骤A、L、N、R和E或步骤A、L、O、P和S的酶，每个途径显示在图15中。
在有些实施方案中，在本发明的方法中使用的非天然存在的微生物体可以包括2种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体可以包括3种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。例如，本发明的非天然存在的微生物体可以包括3种外源核酸，所述外源核酸编码：i)AKP脱氨酶，ii)乙酰基丙烯酸还原酶，和iii)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，从而提供丙氨酸或鸟氨酸经由AKP可到达2,4‑戊二烯酸的途径。本领域技术人员会认识到，这仅仅是示例性的，并且3种外源核酸可以是在图12‑15的任一个列举途径中的任意生产2,4‑戊二烯酸的非天然存在的生物体的基础。
在有些实施方案中，在本发明的方法中使用的非天然存在的微生物体微生物可以包括：任意4种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。例如，非天然存在的微生物体可以包括4种外源核酸，所述外源核酸编码：i)4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶，ii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iii)2‑氧代戊烯酸还原酶，和iv)2‑羟基戊烯酸脱水酶，从而限定从丙酮酸至2,4‑戊二烯酸的完整途径，如在图12中所示。本领域技术人员会认识到，这仅仅是示例性的，并且4种外源核酸可以是在图12‑15的任一个列举途径中的任意生产2,4‑戊二烯酸的非天然存在的生物体的基础。
在其它实施方案中，在本发明的方法中使用的非天然存在的微生物体可以包括5种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。具有5种外源核酸的本发明的示例性的非天然存在的微生物体可以包括这样的外源核酸，所述外源核酸编码：(A)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑2‑还原酶，iii)2‑羟基‑4‑氧代戊酸脱水酶，iv)乙酰基丙烯酸还原酶，和v)4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶，如在图13的步骤E、H、F、C和D中所示，或(B)i)AKP氨基转移酶和/或脱氢酶，ii)2,4‑二氧代戊酸‑4‑还原酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如在图13的步骤E和K以及图12步骤B、C和D中所示，或i)AKP还原酶，ii)2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶和/或脱氢酶，iii)4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水酶，iv)2‑氧代戊烯酸还原酶，和v)2‑羟基戊烯酸脱水酶，如在图13的步骤J和L、以及图12的步骤B、C和D中所示。本领域技术人员会认识到，这仅仅是示例性的，并且5种外源核酸可以是在图12‑15的任一个列举途径中的任意生产2,4‑戊二烯酸的非天然存在的生物体的基础。因而，在有些实施方案中，可以提供2,4‑戊二烯酸途径中的2、3、4、5、6种、最多所有酶来插入外源核酸。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物体具有至少一种是异源核酸的外源核酸。此外，在有些实施方案中，所述采用本发明的非天然存在的微生物体的方法可以使用基本上厌氧的培养基。
在有些实施方案中，在本发明的方法中使用的非天然存在的微生物体可以另外包括2,4‑戊二烯酸脱羧酶，所述2,4‑戊二烯酸脱羧酶以足以生产1,3‑丁二烯（通过将2,4‑戊二烯酸转化成1,3‑丁二烯）的量表达。因而，图12的任意2,4‑戊二烯酸途径可以形成进一步生产1,3‑丁二烯的基础，如图4中顺式或反式2,4‑戊二烯酸向1,3‑丁二烯的转化所示。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据本文所述的前述途径的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段。在一些这样的实施方案中，所述微生物体包括2、3、4、5、6、7或8种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。在一些这样的实施方案中，至少一种外源核酸是异源核酸。在一些这样的实施方案中，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据本文所述的前述途径的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。在一些这样的实施方案中，所述微生物体包括2、3、4、5、6、7或8种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。在一些这样的实施方案中，至少一种外源核酸是异源核酸。在一些这样的实施方案中，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产3‑丁烯‑1‑醇的方法，所述方法包括：在一定条件下培养根据本文所述的前述途径的非天然存在的微生物体足以生产3‑丁烯‑1‑醇的时间段。在一些这样的实施方案中，所述微生物体包括2、3、4、5、6或7种各自编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸。在一些这样的实施方案中，至少一种外源核酸是异源核酸。在一些这样的实施方案中，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。在一些这样的实施方案中，本发明的方法另外包括：将3‑丁烯‑1‑醇化学脱水，以得到1,3‑丁二烯。
从分离自发酵溶液的纯的3‑丁烯‑1‑醇开始，或从在发酵溶液的后处理中分离出的3‑丁烯‑1‑醇的水溶液或有机溶液开始，可以将3‑丁烯‑1‑醇化学脱水，形成1,3‑丁二烯。还可以在脱水步骤之前浓缩这样的3‑丁烯‑1‑醇溶液，例如借助于蒸馏，任选地在有合适的夹带剂存在下。
所述脱水反应可以在液相中或在气相中进行。所述脱水反应可以在有催化剂存在下进行，使用的催化剂的性质取决于进行气相还是液相反应。
合适的脱水催化剂包括酸性的催化剂和碱性的催化剂。具体地，酸性的催化剂可以表现出降低的形成寡聚体的趋势。脱水催化剂可以用作均相催化剂、非均相催化剂或它们的组合。非均相催化剂可以与合适的载体材料结合使用。这样的载体本身可以是酸性的或碱性的，并提供酸性的或碱性的脱水催化剂，或可以将催化剂施加于惰性载体上。
充当脱水催化剂的合适载体包括：天然的或合成的硅酸盐，诸如丝光沸石、蒙脱石、酸性沸石；用单碱、二碱或多碱无机酸（诸如磷酸）或用无机酸的酸性盐（诸如氧化物或硅酸盐，例如Al2O3、TiO2；氧化物和混合氧化物，诸如杂多酸的γ‑Al2O3和ZnO—Al2O3混合氧化物）包被的载体。起脱水催化剂和载体材料两种作用的碱性物质包括：碱、碱土金属、镧、镧系元素或它们的氧化物组合。可以实现脱水的另一类物质是离子交换剂，所述离子交换剂可以以碱性或酸性形式使用。
合适的均相脱水催化剂包括无机酸，诸如含磷的酸诸如磷酸。通过浸入或浸渍，可以将无机酸固定化在载体材料上。
在有些实施方案中，使用本领域已知的常规装置，例如管式反应器、管壳换热器和包括热板作为换热器的反应器，在气相中进行脱水反应。在有些实施方案中，气相脱水可以使用分离的3‑丁烯‑1‑醇或丁烯‑1‑醇溶液，所述丁烯‑1‑醇引入具有固定床催化剂的反应器中。在液相中的热脱水可以在200℃至350℃之间的温度进行，且在有些实施方案中，在250至300℃之间的温度进行。
利用熟知的方法，可以完成合适的纯化和/或测定，以测试甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生产。可对每种待测的工程改造的菌株培养合适的重复，诸如一式三份培养物。例如，可监测在工程改造的生产宿主中的产物和副产物形成。使用本领域熟知的常规操作，通过诸如HPLC(高效液相色谱法)、GC‑MS(气相色谱法‑质谱法)和LC‑MS(液相色谱法‑质谱法)等方法或其它合适的分析方法，可以分析最终产物和中间体以及其它有机化合物。还可以用培养物上清液检测发酵液中的产物的释放。通过HPLC，其中使用例如用于葡萄糖和醇的折射率检测器和用于有机酸的紫外检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775‑779(2005))，或本领域熟知的其它合适的测定法和检测方法，可以定量副产物和残留的葡萄糖。利用本领域熟知的方法，还可测定来自外源DNA序列的单一酶或蛋白质活性。例如，如Weiss等人(Weiss等人,Biochem,27:2197‑2205(1988))所述，使用偶联的光度测量测定法，使用醇脱氢酶作为辅助酶，可以测量苯丙酮酸脱羧酶的活性。如Schlieben等人(Schlieben等人,J.Mol.Biol.,349:801‑813(2005))所述，通过在340nm的分光光度计法，可以检测NADH‑和NADPH依赖性的酶，诸如乙酰苯还原酶。关于典型的烃测定方法，参见Manual on Hydrocarbon Analysis(ASTM Manula Series,A.W.Drews,编,第6版,1998,American Society for Testing and Materials,Baltimore,马里兰)。可以如下测定对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶活性：将纯化的酶与NADH、FeSO4和对甲苯甲酸底物一起在水浴中温育，通过沉淀出蛋白来停止反应，并通过HPLC分析上清液中的产物(Locher等人,J.Bacteriol.173:3741‑3748(1991))。
利用本领域熟知的多种方法，可以将甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯与培养物中的其它组分分离。这样的分离方法包括，例如，萃取操作以及包括连续液‑液萃取、渗透蒸发、膜式过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、吸附色谱法和超滤在内的方法。所有上述方法为本领域所熟知。
可以培养本文所述的任一种非天然存在的微生物体，以生产和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，可以培养甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产菌株，用于甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成生产。
为了生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯，在具有碳源以及其它必需营养物的培养基中培养重组菌株。有时希望且可以非常希望在发酵罐中维持厌氧条件，以降低全过程的成本。这样的条件可以如下得到：例如，首先用氮气喷射培养基，然后用隔膜和螺旋盖密封烧瓶。对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株，通过在隔膜上打出用于有限通气的小孔，可以施加微氧或基本上厌氧的条件。示例性的厌氧条件先前已有描述，且为本领域所熟知。例如，在2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中描述了示例性需氧和厌氧条件。如本文公开的，发酵可以以分批、补料分批或连续方式进行。
如果需要的话，通过根据需要添加碱（例如NaOH或其它碱）或酸，可以使培养基的pH维持在所需pH，尤其是中性pH，例如约7的pH，以将培养基维持在期望的pH。通过使用分光光度计（600nm）测量光密度，可以测定生长速率，并通过监测碳源随时间的消耗来测定葡萄糖摄取速率。
生长培养基可以包括，例如，可以向非天然存在的微生物提供碳源的任意碳水化合物来源。这类来源包括，例如，糖，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。其它碳水化合物来源包括，例如，可再生的原料和生物质。在本发明的方法中可以用作原料的生物质的示例性种类包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或部分原料。这样的生物质原料含有，例如，用作碳源的碳水化合物底物，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将理解，除上述示例的那些之外的可再生原料和生物质也可以用于培养本发明的微生物体，以生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。
除了诸如以上举例说明的那些可再生原料外，还可修饰本发明的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯微生物体，用于在作为其碳源的合成气上培养。在该具体实施方案中，在生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物体中表达一种或多种蛋白质或酶，以提供供合成气或其它气体碳源利用的代谢途径。
合成气体，亦称合成气或炉煤气，为煤和含碳材料（诸如生物质材料，包括农作物和残渣）的主要气化产物。合成气是主要由H2和CO组成的混合物，可经由气化任何有机原料（包括、但不限于：煤、煤油、天然气、生物质或有机废物）来获得。气化通常在高的燃料和氧气比率下进行。虽然合成气主要是H2和CO，但也可包含少量的CO2和其它气体。因此合成气会提供一种节省成本的气态碳源，例如CO和另外如CO2。
Wood‑Ljungdahl途径催化CO和H2转化为乙酰辅酶A和其它产物，例如乙酸。能利用CO和合成气的生物体一般也具有利用CO2和CO2/H2混合物的能力，这通过被Wood‑Ljungdahl途径所涵盖的相同基础酶集合和转化而实现。在揭示CO也可被相同的生物体利用且涉及相同的途径之前很久，公认微生物依赖于H2将CO2转化为乙酸。已经证实，许多产乙酸菌可在CO2存在下生长，且产生例如乙酸等化合物，只要存在氢以供应必需的还原当量即可(参见例如,Drake,产乙酸菌esis,第3‑60页Chapman and Hall,New York,(1994))。这可由下述方程式概括：
2CO2+4H2+n ADP+n Pi→CH3COOH+2H2O+n ATP
因此，具有Wood‑Ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可利用CO2与H2的混合物来生产乙酰辅酶A和其它所需产物。
Wood‑Ljungdahl途径在本领域中为人所熟知，且由可分为2个分支的12个反应组成：(1)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支将合成气转化为甲基四氢叶酸(甲基‑THF)，而羰基分支则将甲基‑THF转化为乙酰辅酶A。甲基分支中的反应是由下述酶或蛋白质依次催化：铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化脱水酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。羰基分支中的反应是由下述酶或蛋白质依次催化：甲基四氢叶酸:类咕啉蛋白甲基转移酶(例如，AcsE)、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白装配蛋白(例如AcsF)、铁氧还蛋白、乙酰辅酶A合成酶、一氧化碳脱氢酶和镍蛋白装配蛋白(例如CooC)。按照本文提供的关于引入足够数量的编码核酸以产生甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的方面的教导和指导，本领域的技术人员应当理解，在至少引入宿主生物中没有的编码Wood‑Ljungdahl酶或蛋白质的核酸方面，也可实施相同的工程改造设计。因此，将一种或多种编码核酸引入本发明的微生物体中以使经修饰的生物体含有完整的Wood‑Ljungdahl途径，会赋予合成气利用能力。
另外，与一氧化碳脱氢酶和/或氢化酶活性偶联的还原(反向)三羧酸循环还可以用于将CO、CO2和/或H2转化成乙酰辅酶A和其它产物诸如乙酸。能够通过还原TCA途径固定碳的生物体可以利用一种或多种下述酶：ATP柠檬酸‑裂合酶、柠檬酸裂合酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶和氢化酶。具体地，一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2提取的还原当量被用于通过还原TCA循环将CO2固定成乙酰辅酶A或乙酸。乙酸可以被下述酶转化成乙酰辅酶A：诸如乙酰辅酶A转移酶、乙酸激酶/磷酸乙酰基转移酶和乙酰辅酶A合成酶。乙酰辅酶A可以被丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和糖原异生酶转化成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯前体、甘油醛‑3‑磷酸、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸。按照本文提供的关于引入足够数量的编码核酸以产生甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的方面的教导和指导，本领域的技术人员应当理解，在至少引入宿主生物中没有的编码还原TCA途径酶或蛋白质的核酸方面，也可实施相同的工程改造设计。因此，将一种或多种编码核酸引入本发明的微生物体中以使经修饰的生物体含有完整的还原TCA途径，会赋予合成气利用能力。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径选自：(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(E)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；(F)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(G)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；和(H)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
在某些方面，所述非天然存在的微生物体包含2、3、4、5、6或7种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。例如，所述微生物体可以包含编码选自下述的每种酶的外源核酸：(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(E)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；(F)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶；(G)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶；和(H)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：(i)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；(ii)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。在本发明的有些方面，所述微生物体另外包含：(i)编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。在本发明的有些方面，所述微生物体另外包含(ii)编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含：(i)4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；其中所述微生物体包含：(ii)5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或其中所述微生物体包含：(iii)2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
在某些方面，本发明提供了如本文所述的非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。在另一个方面，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养如本文所述的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径选自：(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶。
在某些方面，所述微生物体包含2、3、4、5或6种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。例如，所述微生物体可以包含编码选自下述的每种酶的外源核酸：(A)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸脱羧酶；3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；(B)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸脱氢酶；2‑富马酰乙酸还原酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；(C)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A合成酶或3‑氧代己二酰辅酶A水解酶；3‑氧代己二酸还原酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶；和(D)琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代己二酰辅酶A还原酶；3‑羟基己二酰辅酶A转移酶，3‑羟基己二酰辅酶A合成酶或3‑羟基己二酰辅酶A水解酶；3‑羟基己二酸脱氢酶；3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶；和3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：(i)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；(ii)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。在某些方面，所述微生物体另外包含(i)编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。在某些方面，所述微生物体另外包含(ii)编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
在某些方面，所述非天然存在的微生物体包含：(i)4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；其中所述微生物体包含：(ii)5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或其中所述微生物体包含：(iii)2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
在某些方面，本发明提供了如上公开的非天然存在的微生物体，其中至少一种外源核酸是异源核酸。在某些方面，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养如本文所述的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其包括具有1,3‑丁二烯途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸，所述1,3‑丁二烯途径酶以足以生产1,3‑丁二烯的量表达，所述1,3‑丁二烯途径选自：(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(K)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(L)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(M)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(N)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；和(O)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所述的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体包含2、3、4、5、6或7种各自编码1,3‑丁二烯途径酶的外源核酸。例如，在某些方面，所述微生物体包含编码选自下述的每种酶的外源核酸：(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(K)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(L)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；(M)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和2,4‑戊二烯脱羧酶；(N)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶；和(O)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；和3‑丁烯‑1‑醇脱水酶。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所公开的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：(i)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；(ii)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。在某些方面，所述非天然存在的微生物体另外包含(i)编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。在某些方面，所述微生物体另外包含(ii)编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。在某些方面，所述微生物体包含：(i)4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；其中所述微生物体包含：(ii)5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或其中所述微生物体包含：(iii)2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
在某些方面，如本文公开的非天然存在的微生物体包括，其中至少一种外源核酸是异源核酸。在某些方面，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养如本文公开的非天然存在的微生物体足以生产1,3‑丁二烯的时间段。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，包括具有2,4‑戊二烯酸途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸，所述2,4‑戊二烯酸途径酶以足以生产2,4‑戊二烯酸的量表达，所述2,4‑戊二烯酸途径选自：(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
在某些方面，如上公开的非天然存在的微生物体包含2、3、4、5或6种各自编码2,4‑戊二烯酸途径酶的外源核酸。例如，所述微生物体包含编码选自下述的每种酶的外源核酸：(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶；和(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱水酶。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所公开的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：(i)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；(ii)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。在某些方面，所述微生物体另外包含(i)编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。在某些方面，所述非天然存在的微生物体另外包含(ii)编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。
在某些方面，如上公开的微生物体包含：(i)4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；其中所述微生物体包含：(ii)5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或其中所述微生物体包含：(iii)2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
在某些方面，如本文公开的非天然存在的微生物体包括，其中至少一种外源核酸是异源核酸。在某些方面，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产2,4‑戊二烯酸的方法，所述方法包括：在一定条件下培养如上公开的非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸的时间段。
在有些实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，包括具有3‑丁烯‑1‑醇途径的微生物体，所述途径包含至少一种编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸，所述3‑丁烯‑1‑醇途径酶以足以生产3‑丁烯‑1‑醇的量表达，所述3‑丁烯‑1‑醇途径选自：(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶。
在某些方面，如上公开的非天然存在的微生物体包含2、3、4或5种各自编码3‑丁烯‑1‑醇途径酶的外源核酸。例如，在某些方面，微生物体包含编码选自下述的每种酶的外源核酸：(A)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(B)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(醛还原)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(C)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(D)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(辅酶A还原和醇形成)；5‑羟基‑3‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(E)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(F)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3,5‑二氧代戊酸还原酶(酮还原)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(G)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；(H)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醛形成)；3‑羟基‑5‑氧代戊酸还原酶；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶；(I)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；3,5‑二羟基戊酸脱水酶；和5‑羟基戊‑2‑烯酸脱羧酶；和(J)丙二酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶；3‑氧代戊二酰辅酶A还原酶(酮还原)；3‑羟基戊二酰辅酶A还原酶(醇形成)；和3,5‑二羟基戊酸脱羧酶。
在有些实施方案中，本发明提供了如上所公开的非天然存在的微生物体，其中所述微生物体另外包含：(i)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；(ii)还原TCA途径，其包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，其中所述至少一种外源核酸选自：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶；或(iii)至少一种编码选自下述的酶的外源核酸：CO脱氢酶、H2氢化酶和它们的组合。在某些方面，所述非天然存在的微生物体另外包含(i)编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白和它们的组合。在某些方面，所述非天然存在的微生物体另外包含(ii)编码选自下述的酶的外源核酸：顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和它们的组合。在某些方面，所述非天然存在的微生物包含：(i)4种编码ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的外源核酸；其中所述微生物体包含：(ii)5种编码丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸；或其中所述微生物体包含：(iii)2种编码CO脱氢酶和H2氢化酶的外源核酸。
在某些方面，如本文公开的非天然存在的微生物体包括，其中至少一种外源核酸是异源核酸。在某些方面，所述非天然存在的微生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产3‑丁烯‑1‑醇的方法，所述方法包括：在一定条件下培养如上所公开的非天然存在的微生物体足以生产3‑丁烯‑1‑醇的时间段。
在有些实施方案中，本发明提供了一种用于生产1,3‑丁二烯的方法，所述方法包括：在一定条件下培养如上所公开的可以生产3‑丁烯‑1‑醇的非天然存在的微生物体足以生产3‑丁烯‑1‑醇的时间段，和将所述3‑丁烯‑1‑醇化学地转化成1,3‑丁二烯。应当理解，用于将3‑丁烯‑1‑醇化学地转化成1,3‑丁二烯的方法是本领域熟知的。
本发明还部分地涉及工程改造的生物合成途径，以提高穿过通向2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇,或1,3‑丁二烯的中枢代谢中间体的碳流量。本发明提供了非天然存在的微生物体，其具有一个或更多个外源基因，所述外源基因编码可以催化通向2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的各种酶促转化的酶。在有些实施方案中，这样的酶促转化是还原三羧酸(RTCA)循环的一部分，并被用于提高产物收率，包括、但不限于从基于碳水化合物的碳原料算起的产物收率。
在众多工程改造的途径中，基于碳水化合物原料的最大产物收率的实现受到下述因素的阻碍：还原当量不足，或还原当量缺失，和/或通向副产物的碳。根据一些实施方案，本发明如下增加2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇、或1,3‑丁二烯的收率：(i)增强经由还原TCA循环的碳固定，和/或(ii)从气态碳源和/或合成气组分（诸如CO、CO2和/或H2）获取额外的还原当量。除了合成气以外，这类气体的其它来源包括，但不限于，在自然界中存在的或产生的大气。
固定CO2的还原三羧酸(RTCA)循环是CO2同化的一个吸能合成代谢途径，其使用还原当量和ATP(图22)。RTCA循环的一个周期会将2摩尔CO2同化成1摩尔乙酰辅酶A，或将4摩尔CO2同化成1摩尔草酰乙酸。乙酰辅酶A的这种额外可用性会提高源自基于碳水化合物的碳原料的产物分子的最大理论收率。示例性的碳水化合物包括、但不限于：葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖和甘油。
在有些实施方案中，与一氧化碳脱氢酶和/或氢化酶偶联的还原TCA循环可以实现微生物对合成气、CO2、CO、H2和/或其它气态碳源的利用。合成气体(合成气)具体地是主要由H2和CO组成的混合物，有时包括一定量的CO2，其可以通过气化任何有机原料（诸如煤、煤油、天然气、生物质或有机废物）来获得。已经开发了众多气化方法，大多数设计是基于有机物在高温(500‑1500℃)的部分氧化，其中限制氧会避免充分燃烧，从而提供合成气作为0.5:1‑3:1H2/CO混合物。除了煤以外，许多类型的生物质已经用于合成气生产，并代表可再生的化学试剂和燃料的生物生产的廉价且灵活的原料。二氧化碳可以从大气中提供或以浓缩形式提供，例如，从圆柱罐或经由固体CO2的升华。类似地，CO和氢气体可以以试剂形式提供，和/或以任意希望的比例混合。其它气态碳形式可以包括，例如，甲醇或类似的挥发性的有机溶剂。
合成气和/或其它碳源的组分可以提供足够还原TCA循环运行的CO2、还原当量和ATP。RTCA循环的一个周期会将2摩尔CO2同化成1摩尔乙酰辅酶A，并需要2摩尔ATP和4摩尔还原当量。CO和/或H2分别借助于一氧化碳脱氢酶和氢化酶可以提供还原当量。还原当量可以以下述形式获得：NADH、NADPH、FADH、还原的醌、还原型铁氧还蛋白、还原的黄素氧还蛋白和硫氧还蛋白。所述还原当量，特别是NADH、NADPH和还原型铁氧还蛋白，可以充当RTCA循环酶的辅因子，所述RTCA循环酶例如苹果酸脱氢酶、延胡索酸还原酶、α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(可替换地称作2‑氧代戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、α‑酮戊二酸合酶或2‑氧代戊二酸合酶)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和异柠檬酸脱氢酶。来自这些还原当量的电子可以可替换地穿过生成离子梯度的电子传递链，它们经由所述链传递给受体诸如氧、硝酸盐、氧化的金属离子、质子或电极。所述离子梯度然后可以经由ATP合酶或类似的酶用于ATP产生。
在绿硫光合细菌泥生绿菌中最先报道了还原TCA循环(Evans等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.55:928‑934(1966))。已经在一些原核生物(变形杆菌、绿硫细菌和嗜热Knallgas细菌)和硫依赖性的古细菌中表征了类似途径(Hugler等人,J.Bacteriol.187:3020‑3027(2005;Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81‑92(2007))。在某些情况下，还原和氧化(Krebs)TCA循环存在于同一生物体中(Hugler等人,出处同上(2007);Siebers等人,J.Bacteriol.186:2179‑2194(2004))。一些产甲烷菌和专性厌氧菌具有不完全的氧化或还原TCA循环，所述循环可以起合成生物合成中间体的作用(Ekiel等人,J.Bacteriol.162:905‑908(1985);Wood等人,FEMS Microbiol.Rev.28:335‑352(2004))。
还原TCA循环的关键碳固定酶是α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和异柠檬酸脱氢酶。在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸的过程中，或在苹果酸酶将丙酮酸转化成苹果酸的过程中，可以固定其它碳。
在TCA循环中的许多酶是可逆的，且可以催化在还原和氧化方向的反应。但是，有些TCA循环反应在体内是不可逆的，因而使用不同的酶来在反向TCA循环所需的方向催化这些反应。这些反应是：(1)柠檬酸至草酰乙酸和乙酰辅酶A的转化，(2)延胡索酸至琥珀酸的转化，和(3)琥珀酰辅酶A至α‑酮戊二酸的转化。在TCA循环中，从草酰乙酸和乙酰辅酶A的缩合形成柠檬酸。反向反应（即柠檬酸裂解成草酰乙酸和乙酰辅酶A）是ATP依赖性的，并由ATP‑柠檬酸裂合酶或柠檬酰辅酶A合成酶和柠檬酰辅酶A裂合酶催化。可替换地，柠檬酸裂合酶可以与乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A转移酶或磷酸乙酰基转移酶和乙酸激酶偶联，以从柠檬酸形成乙酰辅酶A和草酰乙酸。琥珀酸至延胡索酸的转化由琥珀酸脱氢酶催化，而反向反应由延胡索酸还原酶催化。在TCA循环中，通过α‑酮戊二酸脱氢酶复合物对α‑酮戊二酸的NAD(P)+依赖性的脱羧化，形成琥珀酰辅酶A。反向反应由α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶催化。
能够利用反向三羧酸循环来生产乙酰辅酶A衍生的产物（基于1)CO、2)CO2和H2、3)CO和CO2、4)包含CO和H2的合成气体和5)包含CO、CO2和H2的合成气或其它气态碳源）的生物体可以包括任一种下述酶活性:ATP‑柠檬酸裂合酶，柠檬酸裂合酶，顺乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶，琥珀酰辅酶A合成酶，琥珀酰辅酶A转移酶，延胡索酸还原酶，延胡索酸酶，苹果酸脱氢酶，乙酸激酶，磷酸乙酰基转移酶，乙酰辅酶A合成酶，乙酰辅酶A转移酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶，NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶，一氧化碳脱氢酶，氢化酶，和铁氧还蛋白(参见图23)。上文描述了这些活性所需的酶和对应的基因。
经由反向TCA循环及其组分，可以固定来自合成气或其它气态碳源的碳。具体地，某些碳气体利用途径组分与用于从乙酰辅酶A形成2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的途径的组合，会如下导致这些产物的高收率：提供有效的机制，将存在于二氧化碳中的碳、外源地补给的碳或内源地从CO生成的碳固定进乙酰辅酶A中。
在有些实施方案中，在本发明的非天然存在的微生物体中的2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径可以利用下述的任意组合：(1)CO、(2)CO2、(3)H2或它们的混合物，以提高包含还原（包括加成以驱动还原TCA循环）的生物合成步骤的收率。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体包括至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸。所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；和至少一种选自下述的外源酶：一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白，所述外源酶以足以允许利用(1)CO、(2)CO2、(3)H2、(4)CO2和H2、(5)CO和CO2、(6)CO和H2或(7)CO、CO2和H2的量表达。
在有些实施方案中，方法包括：培养非天然存在的微生物体，所述微生物体具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径，且也包含至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸。所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。另外，这样的生物体还可以包括至少一种选自下述的外源酶：一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白，所述外源酶以足以允许利用(1)CO、(2)CO2、(3)H2、(4)CO2和H2、(5)CO和CO2、(6)CO和H2或(7)CO、CO2和H2来生成产物的量表达。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体另外包括至少一种编码还原TCA途径酶的外源核酸，所述外源核酸以足以增加穿过乙酰辅酶A的碳流量的量表达。所述至少一种外源核酸选自：ATP‑柠檬酸裂合酶，柠檬酸裂合酶，延胡索酸还原酶，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶，异柠檬酸脱氢酶，顺乌头酸酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体包括至少一种编码酶的外源核酸，所述酶以足够的量表达，以增加在有一氧化碳和/或氢存在下的还原当量可用性，从而增加氧化还原反应限制的产物经由基于碳水化合物的碳原料的收率。所述至少一种外源核酸选自：一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白。在有些实施方案中，本发明提供了一种方法，所述方法用于增加在有一氧化碳和/或氢存在下的还原当量可用性，从而增加氧化还原反应限制的产物经由基于碳水化合物的碳原料（诸如糖或气态碳源）的收率，所述方法包括：在一定条件下培养该非天然存在的微生物体足以生产2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的时间段。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体包括2种各自编码还原TCA途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体包括3种各自编码还原TCA途径酶的外源核酸。在有些实施方案中，所述非天然存在的微生物体包括3种外源核酸，所述外源核酸编码ATP‑柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。在有些实施方案中，所述非天然存在的微生物体包括3种外源核酸，所述外源核酸编码柠檬酸裂合酶、延胡索酸还原酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体另外包括编码选自下述的酶的外源核酸：丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和它们的组合。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体另外包括编码选自下述的酶的外源核酸：一氧化碳脱氢酶、乙酰辅酶A合酶、铁氧还蛋白、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和它们的组合。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体利用选自(1)CO、(2)CO2、(3)CO2和H2、(4)CO和H2或(5)CO、CO2和H2的碳原料。在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体利用氢作为还原当量。在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体利用CO作为还原当量。在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体利用CO和氢的组合作为还原当量。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体另外包括一种或多种编码选自下述的酶的核酸：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、丙酮酸羧化酶和苹果酸酶。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体另外包括一种或多种编码选自下述的酶的核酸：苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、琥珀酰辅酶A合成酶和琥珀酰辅酶A转移酶。
在有些实施方案中，具有2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的非天然存在的微生物体另外包括至少一种外源核酸，所述外源核酸编码：柠檬酸裂合酶、ATP‑柠檬酸裂合酶、柠檬酰辅酶A合成酶、柠檬酰辅酶A裂合酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酰辅酶A转移酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酰辅酶A合成酶和铁氧还蛋白。
在有些实施方案中，可以选择碳原料和其它细胞吸收来源诸如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物和其它卤素，以改变在1,3‑丁二烯或任何1,3‑丁二烯途径中间体中存在的原子的同位素分布。上面列举的各种碳原料和其它吸收来源将在本文中统称为“吸收来源”。吸收来源可以提供存在于下述物质中的任何原子的同位素富集：甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径产物，或通向它们的任何中间体。上面列举的各种碳原料和其它吸收来源将在本文中统称为“吸收来源”。吸收来源可以提供存在于下述物质中的任何原子的同位素富集：产物甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯，或甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中间体，包括在任意点处偏离所述途径而产生的任何甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯杂质。同位素富集可以针对任意靶原子实现，所述靶原子包括、例如，碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯或其它卤素。
在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变碳‑12、碳‑13和碳‑14比率。在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变氧‑16、氧‑17和氧‑18比率。在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变氢、氘和氚比率。在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变氮‑14和氮‑15比率。在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变硫‑32、硫‑33、硫‑34和硫‑35比率。在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变磷‑31、磷‑32和磷‑33比率。在有些实施方案中，可以选择吸收来源，以改变氯‑35、氯‑36和氯‑37比率。
在有些实施方案中，通过吸收来源的合成化学富集，可以得到吸收来源的靶同位素比率。这样的同位素富集的吸收来源可以商业地购买或在实验室中制备。在有些实施方案中，通过选择吸收来源在自然界中的起源，可以得到吸收来源的靶同位素比率。在一些这样的实施方案中，例如，碳源可以选自：化石燃料衍生的碳源（其可以相对地缺少碳‑14），或环境碳源，诸如CO2，其可以具有比它的石油衍生的对应物更大量的碳‑14。
使用本领域已知的技术，通过质谱法诸如稳定同位素比值质谱法(SIRMS)和位点特异性的天然的同位素分馏与核磁共振(SNIF‑NMR)，可以容易地评估同位素富集。这样的质谱技术可以与诸如液相色谱法(LC)和/或高效液相色谱法(HPLC)等分离技术相结合。
在有些实施方案中，本发明提供了甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯或甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯中间体，其具有反映大气碳吸收来源的碳‑12、碳‑13和碳‑14比率。在一些这样的实施方案中，所述吸收来源是CO2。在有些实施方案中，本发明提供了甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯中间体，其具有反映基于石油的碳吸收来源的碳‑12、碳‑13和碳‑14比率。在有些实施方案中，本发明提供了甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯或甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯中间体，其具有通过大气碳吸收来源与基于石油的吸收来源的组合得到的碳‑12、碳‑13和碳‑14比率。这样的吸收来源组合是可以改变碳‑12、碳‑13和碳‑14比率的一种方式。
因此，在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将理解，当在诸如碳水化合物等碳源上生长时，可以产生非天然存在的微生物体，其分泌本发明的生物合成的化合物。所述化合物包括，例如，甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯和在甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中的任何中间代谢物。仅需要工程改造一种或多种所需要的酶或蛋白质活性，即可实现期望化合物或中间体的生物合成，这包括，例如，引入甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生物合成途径的一些或全部。因此，本发明提供了一种非天然存在的微生物体，其当在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯，当在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌在甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径中呈现的任意中间代谢物。本发明的生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的微生物体可以从中间体开始合成，所述中间体是：例如，苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯乙醛、苯乙酸、苯甲酰辅酶A、3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A、[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐、苯甲酰基乙酸、乙酰苯、1‑苯基乙醇、反式,反式‑粘康酸、顺式,反式‑粘康酸、顺式,顺式‑粘康酸、反式‑2、4‑戊二烯酸和顺式‑2,4‑戊二烯酸。作为另一个实例，(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐途径中间体可以是1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸或C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸(参见实施例III和图5)。对甲苯甲酸途径中间体可以是，例如，2,4‑二羟基‑5‑甲基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸，1,3‑二羟基‑4‑甲基‑5‑氧代环己烷‑1‑甲酸，5‑羟基‑4‑甲基‑3‑氧代环己‑1‑烯‑1‑甲酸，3,5‑二羟基‑4‑甲基环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5‑羟基‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，5‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基‑3‑(膦酰氧基)环己‑1‑烯‑1‑甲酸，或3‑[(1‑羧基乙‑1‑烯‑1‑基)氧基]‑4‑甲基环己‑1,5‑二烯‑1‑甲酸(参见实施例IV和图6)。对苯二甲酸中间体可以是，例如，4‑羧基苯甲醇或4‑羧基苯甲醛(参见实施例V和图7)。
如本文所公开的，对甲苯甲酸盐和苯甲酸盐是可以作为非天然存在的微生物体的对象（subject）的示例性中间体。这样的羧酸酯可以以离子化形式或完全质子化形式存在。因此，后缀“‑酸盐”或酸形式可以可互换地用于描述游离酸形式以及任何去质子化形式，具体地，因为已知离子化形式依赖于所述化合物所存在的pH。应当理解，根据本发明可得到的丙酸产物包括酯形式，诸如O‑羧酸酯和S‑羧酸酯。O‑和S‑羧酸酯可以包括低级烷基，即C1至C6支链或直链羧酸酯。一些这样的O‑或S‑羧酸酯包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基的O‑或S‑羧酸酯，它们中的任一种可以进一步具有不饱和键，从而形成例如丙烯基、丁烯基、戊基和己烯基的O‑或S‑羧酸酯。O‑羧酸酯可以是生物合成途径的产物。通过生物合成途径得到的示例性的O‑羧酸酯包括、但不限于：丙酸甲酯、丙酸乙酯和丙酸正丙酯。其它通过生物合成可得到的O‑丙酸酯可以包括中链至长链基团，即从脂肪醇衍生出的C7‑C22的O‑丙酸酯，所述脂肪醇诸如庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、鲸蜡醇、棕榈油醇（palmitolyl alcohol）、十七醇、硬脂醇、十九醇、花生醇、二十一醇和山嵛醇，它们中的任一种可以任选地是支链的，和/或含有不饱和键。O‑丙酸酯还可以通过生化或化学方法得到，诸如游离羧酸产物的酯化或O‑或S‑丙酸酯的酯交换。S‑羧酸酯的实例是CoA S‑酯、半胱氨酰基S‑酯、烷基硫代酸酯和各种芳基和杂芳基硫代酸酯。
使用本文例证的本领域熟知的方法，构建本发明的非天然存在的微生物体，以外源地表达至少一种核酸，所述核酸编码甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶或蛋白，所述酶或蛋白的量足以生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。应当理解，在足以生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的条件下，培养本发明的微生物体。按照本文提供的教导和指导，本发明的非天然存在的微生物体可以实现甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成，从而达到约0.1‑200mM或更高的细胞内浓度。通常，甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的细胞内浓度是在约3‑150mM之间，特别是在约5‑125mM之间，更特别地在约8‑100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更高。从本发明的非天然存在的微生物体，也可以达到在这些示例范围之间和以上的细胞内浓度。
在有些实施方案中，培养条件包括厌氧的或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性的厌氧条件已经在前面有所描述，且是本领域熟知的。发酵过程的示例性的厌氧条件在本文中有所描述，且描述在例如2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。这些条件中的任一种可以与所述非天然存在的微生物体以及本领域熟知的其它厌氧条件一起使用。在这样的厌氧的或基本上厌氧的条件下，所述甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产菌株可以以5‑10mM或更高的细胞内浓度以及在本文中例证的所有其它浓度合成甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。应当理解，尽管上面的描述提及细胞内浓度，生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的微生物体可以在细胞内生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯，和/或将产物分泌进培养基中。
除了本文公开的培养和发酵条件以外，用于实现甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成的生长条件可以包括：将渗透保护剂加入培养条件中。在某些实施方案中，可以在有渗透保护剂存在下，如本文所述地维持、培养或发酵本发明的非天然存在的微生物体。简而言之，渗透保护剂是指这样的化合物：其起渗透物的作用，并帮助本文所述的微生物体度过渗透胁迫。渗透保护剂包括、但不限于：甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖.它们的非限制性实例是：甘氨酸甜菜碱(glycine betaine)、脯氨酸甜菜碱(praline betaine)、二甲基噻亭、二甲基磺基丙酸盐(dimethylslfonioproprionate)、3‑二甲基磺基‑2‑甲基丙酸盐、2‑哌啶甲酸、二甲基磺基乙酸盐、胆碱、L‑肉碱和ectoine。在一个方面，所述渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域普通技术人员应当理解，适用于保护本文所述的微生物体免于渗透胁迫的渗透保护剂的量和类型将取决于使用的微生物体。在培养条件中的渗透保护剂的量可以是，例如，不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约50mM、不超过约100mM或不超过约500mM。
所述培养条件可以包括，例如，液体培养操作以及发酵和其它大规模培养操作。如本文所述，在厌氧的或基本上厌氧的培养条件下，可以得到本发明的生物合成产物的特别有用的收率。
如本文所述，用于实现甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，可以在厌氧的或基本上厌氧的条件下，维持、培养或发酵本发明的非天然存在的微生物体。简而言之，厌氧条件是指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括，例如，培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持在饱和度的0‑10%之间。基本上厌氧的条件也包括在密封室内的液体培养基中或固体琼脂上培养或休眠细胞，所述密封室维持小于1%氧的气氛。例如，通过用N2/CO2混合物或其它合适的一种或多种无氧气体给培养物鼓泡，可以维持所述氧百分比。
本文所述的培养条件可以放大，并连续培养，用于生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。示例性的培养操作包括，例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法是本领域熟知的。发酵方法特别适用于商业数量的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物合成生产。一般而言，且象非连续培养操作一样，甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的连续的和/或接近连续的生产将包括：在足够的营养物和培养基中培养本发明的非天然存在的生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生物体，以维持和/或近似地维持生长处于指数期。在这样的条件下的连续培养可以包括，例如，培养1、2、3、4、5、6或7天或更久。另外，连续培养可以包括1、2、3、4或5或更多周的更长时间段，且最多达几个月。可替换地，如果适合具体应用，本发明的生物可以培养数小时。应当理解，连续的和/或接近连续的培养条件还可以包括，在这些示例性时期之间的所有时间间隔。进一步理解，培养本发明微生物体的时间为生产足够量期望目的的产物的足够时间。
发酵方法是本领域熟知的。简而言之，用于生物合成生产甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的发酵可以用于，例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵方法的实例是本领域熟知的。
除了使用本发明的甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产菌株来连续生产大量甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的上述发酵方法之外，例如，甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯生产菌株也可以同时进行化学合成操作，以将所述产物转化成其它化合物，或者可以从发酵培养物中分离产物，并在必要时顺序地进行化学转化，以将所述产物转化成其它化合物。
为了产生更好的生产菌株，可利用代谢模型优化生长条件。还可以使用模型来设计基因敲除体，其另外优化途径的应用(参见，例如，美国专利公开US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US2004/0009466,和美国专利号7,127,379)。模型化分析允许可靠地预测使代谢向甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的更有效生产转移对细胞生长的影响。
一种用于鉴定和设计有助于产物生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647‑657(2003))。OptKnock是一种提出基因缺失或破坏策略的代谢模型化和模拟程序，该基因缺失策略产生遗传稳定的微生物，所述微生物大量产生目标产物。具体而言，该框架检查微生物的完整代谢和/或生物化学网络，以提出迫使期望的生物化学变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过将生物化学生产与细胞生长经由策略性设置的基因缺失或其它功能性基因破坏偶联，在生物反应器中经历长时间之后，施加给改造菌株的生长选择压力，作为强迫性生长相关的生物化学生产的结果，引起性能的改进。最后，当构建基因缺失时，设计的菌株恢复到它们的野生型状态的可能性很微小，这是因为通过OptKnock选择的基因被完全从基因组除去。因此，该计算方法可以用于鉴定引起所需产物生物合成的可选途径，或与非天然存在的微生物体结合使用，用以进一步优化所需产物的生物合成。
简而言之，OptKnock是在本文用于指模拟细胞代谢的计算方法和系统的术语。OptKnock程序涉及模型框架和方法，所述方法将具体的约束引入通量平衡分析(FBA)模型中。这些约束包括，例如，定性动力学信息、定性调控信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock也计算各种代谢问题的解，其通过例如紧缩(tightening)由通量平衡模型产生的通量边界(flux boundary)以及随后在存在基因加成或缺失的情况下探究代谢网络的性能极限。OptKnock计算框架允许构建模型公式，该公式能够有效查询代谢网络的性能极限并且提供解决所产生的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢模型化和模拟方法描述在例如2002年1月10日提交的美国公开2002/0168654，2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660和2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。
鉴定和设计促成产物的生物合成产生的代谢改变的另一计算方法是称为的代谢模型化和模拟系统。该计算方法和系统描述在例如2002年6月14日提交的美国公开2003/0233218和2003年6月13日提交的国际专利申请号PCT/US03/18838中。是一种计算系统，其可以用于产生在计算机芯片上的网络模型和模拟经过生物系统的化学反应的质量、能量或电荷通量，以限定包含该系统中化学反应的任意和全部可能功能性的解空间，从而确定该生物系统的允许活性范围。该方法被称为基于约束的模型化，这是因为解空间由约束限定，所述约束诸如所包含反应的已知化学计量学以及与通过反应的最大通量相关的反应热力学和容量约束。由这些约束限定的空间可以被询问以确定生物系统或其生物化学组分的表型性能和行为。
这些计算方法与生物事实一致，这是因为生物系统是灵活的并且可以以许多不同的方式达到相同的结果。通过进化机理设计生物生物系统，该进化机理受所有生命系统必须面对的基础约束制约。因此，基于约束的模型化策略包含这些一般事实。进一步，通过紧缩约束对网络模型连续施加更多限制的能力引起解空间大小减小，从而提高用于预测生理学性能或表型的精确性。
在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员能够应用代谢模型化和模拟的各种计算框架，以设计和实施宿主微生物体中所需化合物的生物合成。这些代谢模型化和模拟方法包括，例如，上述示例的和OptKnock计算系统。为了说明本发明，本文参考OptKnock模型化和模拟计算框架描述了一些方法。本领域技术人员知道如何使用OptKnock将代谢改变的鉴定、设计和实施应用于本领域中熟知的任何此类其它的代谢模型化和模拟计算框架和方法。
上述方法将提供一组破坏的代谢反应。在该组中的每个反应或代谢修饰的消除可以在生物体的生长期产生所需产物作为专性产物。因为反应是已知的，双层OptKnock问题的解也会提供编码一种或多种酶的相关基因或多种基因，所述酶催化该组反应中的每个反应。对该组反应和其相应编码参与每个反应的酶的基因鉴定通常是一个自动的过程，通过关联反应与具有酶和编码基因之间关系的反应数据库来完成。
一旦鉴定，待被破坏以实现所需产物生产的反应组在目标细胞或者生物中通过至少一种编码该组中的每一代谢反应的基因的功能破坏来实施。一种实现反应组功能破坏的特别有用的方法是通过每个编码基因的缺失。然而，在一些情况下，通过其它遗传畸变‑‑例如包括诸如启动子或者调节因子的顺式结合部位的调节区的突变、缺失，或者通过在多个位置的任一处截短编码序列可以有利于破坏反应。例如当期望快速评估琥珀酸连接时，或者当遗传回复突变(genetic reversion)较不可能出现时，这些后面的畸变（产生小于基因组全部缺失）可以是有用的。
为了确定上述双层OptKnock问题的另外多产的解‑‑其导致了更多破坏反应组或者代谢修饰，所述反应组或代谢修饰可引起包括所需产物的生长相关生物合成在内的生物合成，可以实施被称为整数切割(integer cuts)的最优化方法。通过迭代求解上面示例的OptKnock问题，在每一次迭代引入被称为整数切割的另外约束，进行该方法。整数切割约束有效地防止求解过程选择在任意先前迭代所鉴定(确定)的完全相同的反应组，该反应组专性连接产物生物合成与生长。例如，如果先前确定的生长相关的代谢修饰指定反应1、2和3用于破坏，那么随后的约束防止相同的反应同时在随后的解中被考虑。整数切割方法在本领域是熟知的，并且可以发现描述于例如Burgard等，Biotechnol Prog，17：791‑797(2001)中。如同本文描述的所有方法参考其与OptKnock代谢模型化和模拟的计算框架结合使用，在迭代计算分析中减少冗余的整数切割方法也可以与本领域熟知的其它计算框架一起应用，所述计算框架包括，例如，
以上示例的方法使得能够构建进行生物合成生产的细胞和生物，包括目标生物化学产物与被改造以含有已鉴定遗传改变的细胞或生物生长的专性偶联生产。因此，本文描述的计算方法能够进行代谢修饰的鉴定和实施，该代谢修饰通过选自OptKnock或的计算机环境方法来鉴定。代谢修饰组可以包括，例如，一种或者多种生物合成途径酶的添加和/或一种或者多种代谢反应的功能破坏，其包括，例如，通过基因缺失的破坏。
如上文所讨论，OptKnock方法的开发是基于突变型微生物网络当经历长期生长选择时可朝向其以计算机预测的最大生长表型进化这一前提。换句话说，所述方法调节生物体在选择性压力下自我优化的能力。OptKnock框架允许对基于网络化学计量迫使生物化学生产与细胞生长偶联的基因缺失组合进行穷举。对于最佳基因/反应剔除的鉴别需要对二层优化问题求解，所述问题选择活性反应组，使得所得网络的最佳生长答案过量产生目的生物化学物(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647‑657(2003))。
大肠杆菌代谢的计算机环境化学计量模型可用于鉴别先前示例的代谢途径的必需基因，且描述于例如美国专利公开US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US 2004/0009466、以及美国专利号7,127,379中。如本文所公开，OptKnock数学框架可用于定位导致期望产物的生长偶联型生产的基因缺失。此外，双层OptKnock问题的解决方案仅提供一组缺失。为了列举所有有意义的解决方案、即导致生长偶联型生产形成的所有剔除集合，可实施被称作整数分割的优化技术。这要求对OptKnock问题迭代求解，其中在每次迭代时引入被称为整数切割的另外约束，如上文所讨论。
如本文所公开的，可以向宿主生物中引入核酸，所述核酸编码甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径的所需活性。在某些情况下，可以希望修改甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶或蛋白的活性，以增加甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的生产。例如，可以向编码核酸分子中引入会增加蛋白或酶的活性的已知突变。另外，可以应用优化方法来增加酶或蛋白的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节物的活性。
一种这样的优化方法是定向进化。定向进化是一种有效的方案，其包括引入靶向特定基因的突变，以便提高和/或改变酶的性质。通过灵敏的高处理量筛选测定的开发和实现，可以鉴别提高的和/或改变的酶，所述测定允许许多酶变体(例如，>104)的自动化筛选。通常进行诱变和筛选的反复循环，以得到具有优化的性质的酶。还已经开发了可以帮助鉴别用于诱变的目标区域的计算算法，且可以显著减少需要制备和筛选的酶变体的数目和。已经开发出众多定向进化技术(关于综述，参见Hibbert等人,Biomol.Eng22:11‑19(2005);Huisman和Lalonde,Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries第717‑742页(2007)，Patel(编)，CRC Press;Otten和Quax.Biomol.Eng22:1‑9(2005).；和Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol143:212‑223(2007))以有效地建立多种变体文库，且这些方法已经成功地用于提高许多酶类别的广范围的性质。通过定向进化技术已经改善和/或改变的酶特征包括，例如：选择性/特异性，用于非天然底物的转化；温度稳定性，用于稳健的高温处理；pH稳定性，用于在较低或较高pH条件下的生物处理；底物或产物耐受性，从而可以实现高产物滴度；结合(Km)，包括拓宽底物结合，以包括非天然的底物；抑制(Ki)，以除去产物、底物或关键中间体的抑制；活性(kcat)，以增加酶反应速率，从而实现所需的通量；表达水平，以增加蛋白收率和总途径通量；氧稳定性，用于在好氧条件下处理空气敏感的酶；和厌氧活性，用于在没有氧存在下处理需氧酶。
已经开发了许多示例性方法用于基因的诱变和多样化，以靶向特定酶的所需性质。这样的方法是本领域技术人员熟知的。这些方法中的任一种可以用于改变和/或优化甲苯、苯、对甲苯甲酸、对苯二甲酸、(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐、苯甲酸、苯乙烯、2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯途径酶或蛋白的活性。这样的方法包括，但不限于：EpPCR，其通过降低PCR反应中的DNA聚合酶的保真度而引入随机点突变(Pritchard等人,J.Theor.Biol.234:497‑509(2005))；易出错的滚环扩增(epRCA)，其类似于epPCR，但是使用整个环形质粒作为模板，并使用随机6‑聚体（其具有在最后2个核苷酸上的外切核酸酶抗性的硫代磷酸酯键）来扩增质粒，随后转化进细胞中，在所述细胞中，所述质粒在串联重复序列处重新环化(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493‑2497(2006));DNA或家族改组，其通常包括用核酸酶（诸如DNA酶I或EndoV）消化2种或更多种变体基因，以产生随机片段集合，所述片段通过在有DNA聚合酶存在下的退火和延伸循环而重新装配，以建立嵌合基因文库(Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:10747‑10751(1994)；和Stemmer,Nature370:389‑391(1994))；交错的延伸(StEP)，其需要模板引发，继之以变性和非常短持续时间(短至5秒)的退火/延伸的2步PCR的重复循环(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258‑261(1998))；随机引发重组(RPR)，其中使用随机序列引物来产生许多与模板的不同区段互补的短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res26:681‑683(1998))。
其它方法包括异源双链体重组，其中使用线性化的质粒DNA来形成异源双链体，后者通过错配修复进行修复(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；和Volkov等人,Methods Enzymol.328:456‑463(2000))；临时模板随机嵌合生长(RACHITT)，其采用DNA酶I片段化和单链DNA(ssDNA)的尺寸分级分离(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354‑359(2001))；截短模板重组延伸(RETT)，其在有用作模板集合的单向ssDNA片段存在下，需要从引物开始的单向生长链的模板转换(Lee等人,J.Molec.Catalysis26:119‑129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DOGS)，其中使用简并引物来控制分子之间的重组；(Bergquist和Gibbs,Methods Mol.Biol.352:191‑204(2007);Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63‑72(2005);Gibbs等人,Gene271:13‑20(2001))；渐增切割法产生杂合酶(ITCHY)，其用目标基因或基因片段的1碱基对删除来建立组合文库(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3562‑3567(1999)；和Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205‑1209(1999))；硫代‑渐增切割法产生杂合酶(THIO‑ITCHY)，其类似于ITCHY，但是使用硫代磷酸酯dNTPs来产生截短(Lutz等人,Nucleic Acids Res.29:E16(2001));SCRATCHY，其组合了用于重组基因的2种方法ITCHY和DNA改组(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:11248‑11253(2001));,随机漂移诱变(RNDM)，其中在通过epPCR产生突变以后，对保留可用活性的那些进行筛选/选择(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63‑72(2005));序列饱和诱变(SeSaM)，这是一种随机诱变方法，其使用硫代磷酸酯核苷酸的随机掺入和切割来产生随机长度片段集合，所述集合用作模板，以在有“通用”碱基诸如肌苷存在下进行延伸，并且含有肌苷的补体的复制会导致随机碱基掺入，并从而导致诱变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74‑82(2008);Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；和Wong等人,Anal.Biochem.341:187‑189(2005))；合成改组，其使用设计成编码“靶物中的所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸，并实现改组的后代的非常高的多样性(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251‑1255(2002))；核苷酸交换和切除技术（NexT），其利用dUTP掺入和随后用尿嘧啶DNA糖基化酶处理和再用哌啶处理（以进行端点DNA片段化）的组合(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。
其它方法包括不依赖序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)，其中使用接头来促进2个远相关的或无关的基因的融合，并在2个基因之间产生多种嵌合体，从而产生单杂交杂合体的文库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456‑460(2001));基因位点饱和诱变TM（Gene Site Saturation MutagenesisTM，GSSMTM），其中原料包括超螺旋的双链DNA(dsDNA)质粒，所述质粒含有1个插入片段和2个引物，所述引物在期望的突变位点处简并(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3‑11(2004))；组合的盒诱变(CCM)，其包括，使用短寡核苷酸盒来替代具有大量可能的氨基酸序列改变的有限区域(Reidhaar‑Olson等人Methods Enzymol.208:564‑586(1991)；和Reidhaar‑Olson等人Science 241:53‑57(1988))；组合的多盒诱变(CMCM)，其基本上类似于CCM，并以高突变率使用epPCR，以鉴别热点和热区，然后通过CMCM进行延伸，以覆盖给定的蛋白序列空间区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589‑3591(2001))；增变株技术，其中假定的ts增变株质粒，利用mutD5基因（其编码DNA聚合酶III的突变亚基），以允许在选择过程中使随机和天然突变频率增加20至4000倍，并在不需要选择时阻断有害突变的积累(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645‑3649(2001));Low等人,J.Mol.Biol.260:359‑3680(1996))。
其它示例性的方法包括：透视诱变(LTM)，这是一种多维诱变方法，其评估和优化选择的氨基酸的组合突变(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:8466‑8471(2005));基因重新装配，这是一种DNA改组方法，其可以同时应用于多个基因，或用于建立单个基因的大嵌合体文库(多种突变)(由Verenium Corporation提供的可调基因重新装配TM(Tunable GeneReassemblyTM，TGRTM)技术)，计算机环境蛋白设计自动化(PDA)，这是一种优化算法，其锚定结构上确定的具有特定折叠的蛋白主链，并检索用于氨基酸置换（其可以稳定化所述折叠和总蛋白能学）的序列空间，且通常最有效地作用于具有已知三维结构的蛋白(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15926‑15931(2002))；和迭代饱和诱变(ISM)，其包括：使用结构/功能知识来选择用于酶改善的可能位点，使用诱变方法诸如Stratagene QuikChange(Stratagene;San Diego CA)在选择的位点处执行饱和诱变，筛选/选择希望的性质，和，使用改善的克隆，从另一个位点开始，并继续重复直到得到所需活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891‑903(2007)；和Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745‑7751(2006))。
任意前述诱变方法可以单独使用，或以任意组合使用。另外，任意一种定向进化方法或它们的组合，可以与本文所述的适应进化技术结合使用。
实施例I
通向苯和甲苯的途径
本实施例显示了从苯丙氨酸至甲苯的途径、从苯丙氨酸至苯的途径和从苯甲酰辅酶A至苯乙烯的途径。
苯丙氨酸的酶促转化途径显示在图1中。第一步需要苯丙氨酸至苯丙酮酸的转化，该转化可以由氨基转移酶或脱氨氧化还原酶实现。然后在图1的步骤B中，将苯丙酮酸脱羧为苯乙醛。甲苯可以通过脱羰从苯乙醛直接地生成(图1、步骤E)，或经由苯乙酸中间体间接地生成(图1、步骤C和D)。苯乙醛可以被苯乙醛脱氢酶或苯乙醛氧化酶氧化为苯乙酸(图1、步骤C)。一种替代途径是，苯丙酮酸氧化酶将苯丙酮酸直接氧化脱羧为苯乙酸(图1、步骤F)。
苯丙氨酸至苯的酶促转化一步途径显示在图2中。苯丙氨酸和水向苯、丙酮酸和氨的转化，由具有苯丙氨酸苯‑裂合酶活性的酶催化。
从苯甲酰辅酶A至苯乙烯的酶促途径显示在图3中。苯甲酰辅酶A是众多生物合成和降解途径的共同代谢中间体。包括苯甲酰辅酶A的生物合成以及苯甲酰辅酶A作为降解产物产生的途径，是本领域已知的。在提议的苯乙烯途径中，苯甲酰辅酶A和乙酰辅酶A首先被β‑酮硫解酶转化成3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A(图3、步骤A)。3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A的CoA部分然后被CoA水解酶、转移酶或合酶释放(图3、步骤B)。可替换地，3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A在2个酶促步骤中被磷酸‑3‑氧代‑3‑苯基丙酰基转移酶和苯甲酰乙酸激酶转化成苯甲酰乙酸(图3、步骤F和G)。形成后，苯甲酰乙酸被脱羧、还原和脱水，形成苯乙烯(图3、步骤C,D和E)。
通过EC编号(表1)，将用于催化图1‑3所示的转化的酶分类，并在下面进一步描述。
标号功能步骤1.1.1.a氧化还原酶(氧代至醇)3D1.2.1.a氧化还原酶(醛至酸)1C1.2.3.a醛氧化酶1C/F1.4.1.a氧化还原酶(胺化/脱氨)1A2.3.1.a酰基转移酶(将磷酸盐基团转移给CoA)3F2.3.1.bβ‑酮硫解酶3A2.6.1.a氨基转移酶1A2.7.2.a磷酸转移酶，羧基受体(激酶)3G2.8.3.a辅酶A转移酶3B3.1.2.a硫羟酸酯水解酶(CoA特异性的)3B4.1.1.a羧基‑裂合酶1B/D,3C4.1.99.a脱羰酶1E4.1.99.b裂合酶24.2.1.a水解酶3E6.2.1.a酸‑硫醇连接酶3B
1.1.1.a氧化还原酶(氧代至醇)：乙酰苯至1‑苯基乙醇的还原(图3的步骤D)，是由具有乙酰苯还原酶活性的酮还原酶催化。已经在众多生物中表征了具有该活性的酶，且产物形成通常是立体选择性的。一种示例性的具有该活性的酶是短乳杆菌的R‑特异性的短链脱氢酶/还原酶，其已经得到广泛研究、结构表征，并被重新工程改造以偏好NADH（而不是NADPH）作为协同底物(Schlieben等人,J.Mol.Biol.349:801‑813(2005))。具有乙酰苯还原酶活性的其它酶由下述基因编码：荧光假单胞菌的adhF1(Hildebrandt等人,Appl.Microbiol Biotechnol.59:483‑487(2002))，嗜热栖热菌的adh(Pennacchio等人,Appl.Environ.Microbiol74:3949‑3958(2008))和Leifsoniasp.S749的LSADH(Inoue等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.70:418‑426(2006))。在除氮菌Aromatoleum aromaticum EbN1的乙基苯降解途径中表征了S‑特异性的酶(Kniemeyer等人,Arch.Microbiol.176:129‑135(2001))。该酶由ped编码，在低pH(4)偏好还原反向，而在中性pH偏好氧化方向。
基因GenBank登记号GI号生物LVIS_0347YP_794544.1116333017短乳杆菌adhF1AAL79772.118860822荧光假单胞菌adhTtYP_003977.146198310嗜热栖热菌LSADHBAD99642.167625613Leifsonia sp.S749pedYP_158329.156476740Aromatoleum aromaticum EbN1
多种醇脱氢酶会催化酮还原为醇官能团。这些酶也适用于催化乙酰苯的还原。大肠杆菌中的2种这样的酶由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。已经证实，得自富养产碱菌的乳酸脱氢酶会表现出对不同链长度的2‑酮酸的高活性，包括乳酸、2‑氧代丁酸、2‑氧代戊酸和2‑氧代戊二酸(Steinbuchel等人,Eur.J.Biochem.130:329‑334(1983))。α‑酮己二酸向α‑羟基己二酸的转化，可以由2‑酮己二酸还原酶催化，据报道，该酶存在于大鼠和人胎盘中(Suda等人,Arch.Biochem.Biophys.176:610‑620(1976);Suda等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586‑591(1977))。其它的氧化还原酶是得自人心脏的线粒体3‑羟基丁酸脱氢酶(bdh)，其已经被克隆并表征(Marks等人,J.Biol.Chem.267:15459‑15463(1992))。拜氏梭菌(Ismaiel等人,J.Bacteriol.175:5097‑5105(1993))和布氏热厌氧杆菌(Lamed等人,Biochem.J.195:183‑190(1981);Peretz等人,Biochemistry28:6549‑6555(1989))的醇脱氢酶会将丙酮转化成异丙醇。甲基乙基甲酮还原酶，或可替换地，2‑丁醇脱氢酶，会催化MEK还原形成2‑丁醇。在赤红球菌(Kosjek等人,Biotechnol Bioeng.86:55‑62(2004))和强烈火球菌(van der等人,Eur.J.Biochem.268:3062‑3068(2001))中可以发现示例性的MEK还原酶。
基因GenBank登记号GI号生物MdhAAC76268.11789632大肠杆菌ldhANP_415898.116129341大肠杆菌LdhYP_725182.1113866693富养产碱菌bdhAAA58352.1177198智人adhAAA23199.260592974拜氏梭菌NRRL B593adhP14941.1113443布氏热厌氧杆菌HTD4adhAAAC255563288810强烈火球菌sadhCAD3647521615553赤红球菌
1.2.1.a氧化还原酶(醛至酸)：苯乙醛至苯乙酸的氧化由苯乙醛脱氢酶催化(图1的步骤C)，该酶属于EC类别1.2.1.。已经在大肠杆菌、恶臭假单胞菌和金鱼草（Antirrhinum majus）中表征了NAD+依赖性的苯乙醛脱氢酶(EC1.2.1.39)(Long等人,PlantJ59:256‑265(2009);Arias等人,Environ.Microbiol10:413‑432(2008);Ferrandez等人,FEBS Lett.406:23‑27(1997))。还已经在哺乳动物（诸如欧洲牛、褐家鼠和智人）中表征了对苯乙醛具有高活性的NAD+依赖性的醛脱氢酶(Klyosov,Biochemistry35:4457‑4467(1996a);Lindahl等人,JBiol.Chem.259:11991‑11996(1984))。在人肝脏中发现的2种醛脱氢酶ALDH‑1和ALDH‑2具有对多种脂族醛、芳族醛和多环醛的宽底物范围，且表现出对苯乙醛的活性(Klyosov,Biochemistry35:4457‑4467(1996b))。由badh编码的恶臭假单胞菌的NADP+依赖性的苯甲醛脱氢酶也表现出对苯乙醛的活性(Yeung等人,Biochim.Biophys.Acta 1784:1248‑1255(2008))。还已经在哺乳动物（诸如欧洲牛、褐家鼠和智人）中表征了对苯乙醛具有高活性的NAD+依赖性的醛脱氢酶(Klyosov,Biochemistry35:4457‑4467(1996a);Lindahl等人,JBiol.Chem.259:11991‑11996(1984))。在人肝脏中发现的2种醛脱氢酶ALDH‑1和ALDH‑2具有对多种脂族醛、芳族醛和多环醛的宽底物范围，且表现出对苯乙醛的活性(Klyosov,Biochemistry35:4457‑4467(1996b))。
基因GenBank登记号GI号生物feaBAAC74467.287081896大肠杆菌peaEABR57205.1150014683恶臭假单胞菌BALDHACM89738.1223452696金鱼草ALDH‑2P05091.2118504智人badhP39849.1731175恶臭假单胞菌
1.2.3.a醛氧化酶：可以采用O2依赖性的醛氧化酶将苯乙醛或苯丙酮酸转化成苯乙酸(图1的步骤C和F)。苯乙醛氧化酶会将苯乙醛、水和O2转化成苯乙酸和过氧化氢。示例性的苯乙醛氧化酶存在于甲基芽孢杆菌属各种、假单胞菌属、温和链霉菌、天竺鼠和玉米中(Koshiba等人,Plant Physiol110:781‑789(1996))。玉米的2种含有黄素和钼的醛氧化酶由zmAO‑1和zmAO‑2编码(Sekimoto等人,JBiol.Chem.272:15280‑15285(1997))。还已经证实了燕麦的吲哚‑3‑乙醛氧化酶(EC1.2.3.7)的苯乙醛氧化酶活性，尽管迄今为止尚未鉴别出与该活性有关的基因，且该基因与玉米的醛氧化酶基因没有显著同源性(Rajagopal,Physiol.Plant24:272‑281(1971))。通过与玉米基因的序列同源性，可以推断出其它苯乙醛氧化酶，且如下所示。
基因GenBank登记号GI号生物zmAO‑1NP_001105308.1162458742玉米zmAO‑2BAA23227.12589164玉米Aox1O54754.220978408小家鼠ALDO1_ORYSJQ7XH05.175296231水稻AAO3BAA82672.15672672拟南芥XDHDAA24801.1296482686欧洲牛
苯丙酮酸氧化酶会将苯丙酮酸和O2转化成苯乙酸、CO2和水(图1的步骤F)。经证实，得自球形节杆菌的4‑羟苯丙酮酸氧化酶(EC1.2.3.13)会在酪氨酸分解代谢过程中催化苯丙酮酸至苯乙酸的O2依赖性的氧化(Blakley，Can.J Microbiol23:1128‑1139(1977))。在细胞提取物中证实了该酶促活性；但是，迄今为止尚未鉴别出鉴别该酶的基因。
1.4.1.a氧化还原酶(脱氨):苯丙氨酸至苯丙酮酸的NAD(P)+依赖性的氧化(图1的步骤A)由苯丙氨酸氧化还原酶(脱氨)催化，该酶也称作苯丙氨酸脱氢酶。已经在栗褐芽孢杆菌、球形赖氨酸杆菌（Lysinibacillus sphaericus）和中间型嗜热放线菌中表征了由pdh基因编码的NAD+依赖性的苯丙氨酸脱氢酶(Yamada等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:1994‑1995(1995);Takada等人,JBiochem.109:371‑376(1991);Okazaki等人,Gene63:337‑341(1988))。
基因GenBank登记号GI号生物pdhBAA08816.11228936栗褐芽孢杆菌pdhAAA22646.1529017球形赖氨酸杆菌pdhP22823.1118598中间型嗜热放线菌
2.3.1.a酰基转移酶(磷酸转乙酰酶)：将3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A磷酸化为[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐(图3的步骤F)，需要具有磷酸苯甲酰基转移酶活性的酶。迄今为止尚未表征具有该活性的酶。示例性的转磷酸的酰基转移酶包括磷酸乙酰基转移酶(EC2.3.1.8)和磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)。得自大肠杆菌的pta基因编码磷酸乙酰基转移酶，该酶将乙酰辅酶A可逆地转化成乙酰磷酸(Suzuki，Biochim.Biophys.Acta191:559‑569(1969))。在几种生物中的磷酸乙酰基转移酶也会催化丙酰辅酶A转化成丙酰基磷酸盐。这样的酶包括大肠杆菌(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477‑492(1998))、枯草芽孢杆菌(Rado等人,Biochim.Biophys.Acta321:114‑125(1973))、克鲁氏梭状芽孢杆菌(Stadtman,1:596‑599(1955))和海栖热袍菌(Bock等人,JBacteriol.181:1861‑1867(1999))的pta基因产物。得自丙酮丁醇梭杆菌的ptb基因编码磷酸丁酰基转移酶，该酶将丁酰辅酶A可逆地转化成丁酰基‑磷酸盐(Wiesenborn等人,Appl Environ.Microbiol55:317‑322(1989);Walter等人,Gene134:107‑111(1993))。在产丁酸细菌L2‑50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099‑2106(2004))和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol42:345‑349(2001))中发现了其它ptb基因。
基因GenBank登记号GI号生物ptaNP_416800.171152910大肠杆菌ptaP39646730415枯草芽孢杆菌ptaA5N801146346896克鲁氏梭状芽孢杆菌ptaQ9X0L46685776海栖热袍菌ptbNP_34967634540484丙酮丁醇梭杆菌ptbAAR19757.138425288产丁酸细菌L2‑50ptbCAC07932.110046659巨大芽孢杆菌
2.3.1.bβ‑酮硫解酶。将苯甲酰辅酶A和乙酰辅酶A转化成3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A，需要β‑酮硫解酶(图3的步骤A)。未知该转化会天然地发生。合适的β‑酮硫解酶包括3‑氧代己二酰辅酶A硫解酶(EC2.3.1.174)、3‑氧代庚二酰辅酶A:戊二酰辅酶A酰基转移酶(EC2.3.1.16)、3‑氧代戊酰辅酶A硫解酶和乙酰乙酰辅酶A硫解酶(EC2.1.3.9)。
3‑氧代己二酰辅酶A硫解酶(EC2.3.1.174)会将β‑酮己二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，且是芳族化合物降解的β‑酮己二酸途径的关键酶。该酶广泛地分布于土壤细菌和真菌中，包括恶臭假单胞菌(Harwood等人,J Bacteriol.176:6479‑6488(1994))和醋酸钙不动杆菌(Doten等人,J Bacteriol.169:3168‑3174(1987))。由假单胞菌菌株B13中的pcaF(Kaschabek等人,J Bacteriol.184:207‑215(2002))、恶臭假单胞菌U中的phaD(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A95:6419‑6424(1998))、荧光假单胞菌ST中的paaE(Di等人,Arch.Microbiol188:117‑125(2007))和得自大肠杆菌的paaJ(Nogales等人,Microbiology153:357‑365(2007))编码的基因产物也会催化该转化。几种β‑酮硫解酶在氧代己二酰辅酶A形成方向表现出显著的且选择性的活性，包括得自恶臭假单胞菌的bkt、得自铜绿假单孢菌PAO1的pcaF和bkt、得自BurkholderiaambifariaAMMD的bkt、得自大肠杆菌的paaJ和得自恶臭假单胞菌的phaD。
基因名称GI号GenBank登记号生物paaJ16129358NP_415915.1大肠杆菌pcaF17736947AAL02407Pseudomonas knackmussii(B13)phaD3253200AAC24332.1恶臭假单胞菌pcaF506695AAA85138.1恶臭假单胞菌pcaF141777AAC37148.1醋酸钙不动杆菌paaE106636097ABF82237.1荧光假单胞菌bkt115360515YP_777652.1Burkholderia ambifaria AMMDbkt9949744AAG06977.1铜绿假单孢菌PAO1pcaF9946065AAG03617.1铜绿假单孢菌PAO1
3‑氧代庚二酰辅酶A硫解酶会催化戊二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成3‑氧代庚二酰辅酶A(EC2.3.1.16)。催化该转化的酶由富养产碱菌(以前称作真养产碱菌)中的基因bktB和bktC编码(Slater等人,J.Bacteriol.180:1979‑1987(1998);Haywood等人,FEMS Microbiology Letters52:91‑96(1988))。已知BktB蛋白的序列，但是迄今为止尚未报道BktC蛋白的序列。沼泽红假单胞菌的pim操纵子也编码β‑酮硫解酶，该酶由pimB编码，预测会在苯甲酰辅酶A降解过程中在降解方向催化该转化(Harrison等人,Microbiology151:727‑736(2005))。通过与bktB的序列同源性(43%同一性,e值=1e‑93)，鉴别出在S.aciditrophicus中的β‑酮硫解酶。
基因名称GI号GenBank登记号生物bktB11386745YP_725948富养产碱菌pimB39650633CAE29156沼泽红假单胞菌syn_0264285860483YP_462685.1Syntrophus aciditrophicus
催化从乙酰辅酶A和丙酰辅酶A形成3‑氧代戊酸的β‑酮硫解酶也可以能够催化3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A的形成。生枝动胶菌具有2种可以从丙酰辅酶A和乙酰辅酶A形成β‑酮戊酰辅酶A的酮硫解酶，且富养产碱菌具有也能够催化该转化的β‑氧化酮硫解酶(Gruys等人,(1999))。尚未报道这些基因或它们翻译的蛋白的序列，但是基于与得自富养产碱菌的bktB的序列同源性，可以鉴别出在富养产碱菌、生枝动胶菌或其它生物中的几种基因，并列出在下面。
基因名称GI号GenBank登记号生物phaA113867452YP_725941.1富养产碱菌h16_A1713113867716YP_726205.1富养产碱菌pcaF116694155YP_728366.1富养产碱菌h16_B1369116695312YP_840888.1富养产碱菌h16_A0170113866201YP_724690.1富养产碱菌h16_A0462113866491YP_724980.1富养产碱菌h16_A1528113867539YP_726028.1富养产碱菌h16_B0381116694334YP_728545.1富养产碱菌h16_B0662116694613YP_728824.1富养产碱菌h16_B0759116694710YP_728921.1富养产碱菌h16_B0668116694619YP_728830.1富养产碱菌h16_A1720113867723YP_726212.1富养产碱菌h16_A1887113867867YP_726356.1富养产碱菌phbA135759P07097.4生枝动胶菌bktB194289475YP_002005382.1台湾贪铜菌Rmet_136294310304YP_583514.1Ralstonia metalliduransBphy_0975186475740YP_001857210.1Burkholderia phymatum
其它酶包括已知会将2个乙酰辅酶A分子转化成乙酰乙酰辅酶A的β‑酮硫解酶(EC2.1.3.9)。示例性的乙酰乙酰辅酶A硫解酶包括：得自大肠杆菌的atoB(Martin等人,Nat.Biotechnol21:796‑802(2003))、得自丙酮丁醇梭杆菌的thlA和thlB(Hanai等人,Appl Environ Microbiol73:7814‑7818(2007);Winzer等人,J.Mol.Microbiol Biotechnol2:531‑541(2000))和得自酿酒酵母的ERG10(Hiser等人,J.Biol.Chem.269:31383‑31389(1994))的基因产物。
基因名称GI号GenBank登记号生物atoB16130161NP_416728大肠杆菌thlA15896127NP_349476.1丙酮丁醇梭杆菌thlB15004782NP_149242.1丙酮丁醇梭杆菌ERG106325229NP_015297酿酒酵母
2.6.1.a氨基转移酶：将苯丙氨酸转化成苯丙酮酸(图1的步骤A)，需要在EC类别2.6.1中的苯丙氨酸氨基转移酶或转氨酶。多种酶会催化该转化，包括苯乙酸氨基转移酶、芳族氨基酸氨基转移酶、色氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、支链氨基酸氨基转移酶和其它酶。在大肠杆菌中的具有苯丙氨酸氨基转移酶活性的酶是由tyrB、ilvE和aspC编码(Lee‑Peng等人,JBacteriol.139:339‑345(1979);Powell等人,Eur.JBiochem.87:391‑400(1978))。在其它生物中的具有苯丙氨酸氨基转移酶活性的示例性酶包括：由ARO9编码的酿酒酵母的芳族氨基酸氨基转移酶(Iraqui等人,Mol.Gen.Genet.257:238‑248(1998))和由TAA1编码的拟南芥的色氨酸氨基转移酶(Tao等人,Cell133:164‑176(2008))。
基因GenBank登记号GI号生物tyrBAAC77024.11790488大肠杆菌ilvEAAT48207.148994963大肠杆菌aspCNP_415448.116128895大肠杆菌ARO9NP_012005.16321929酿酒酵母TAA1NP_177213.115223183拟南芥
2.7.2.a磷酸转移酶：在EC类别2.7.2中的磷酸转移酶会将羧酸转化成膦酸，并同时水解1摩尔ATP。在图3的步骤g中，将[(3‑氧代‑3‑苯基丙酰基)氧基]膦酸盐和ADP转化成苯甲酰乙酸和ATP，需要磷酸转移酶。迄今为止尚未表征具有该确切活性的酶。示例性酶包括丁酸激酶(EC2.7.2.7)、异丁酸激酶(EC2.7.2.14)、天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)和γ‑谷氨酰基激酶(EC2.7.2.11)。天冬氨酸激酶会催化天冬氨酸的ATP依赖性的磷酸化，并参与几种氨基酸的合成。在大肠杆菌中的天冬氨酸激酶III酶（由lysC编码）具有宽底物范围，包括芳族化合物天冬氨酸1‑苄基酯，并且已经阐明了在底物特异性中涉及的催化残基(Keng等人,Arch.Biochem.Biophys.335:73‑81(1996))。在大肠杆菌中的另外2种激酶包括乙酸激酶和γ‑谷氨酰基激酶。由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt等人,J.Biol.Chem.251:6775‑6783(1976))除了会磷酸化乙酸盐以外，还磷酸化丙酸盐(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477‑492(1998))。由proB编码的大肠杆菌γ‑谷氨酰基激酶(Smith等人,J.Bacteriol.157:545‑551(1984))会磷酸化谷氨酸的γ碳酸基团。在丙酮丁醇梭杆菌的产酸过程中，丁酸激酶进行丁酰基‑磷酸盐至丁酸盐的可逆转化(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol56:1576‑1583(1990))。该酶由2种buk基因产物中的任一种编码(Huang等人,J Mol.Microbiol Biotechnol2:33‑38(2000))。其它丁酸激酶存在于酪酸梭菌和破伤风形梭菌(TWAROG等人,JBacteriol.86:112‑117(1963))中。在大肠杆菌中表达了有关酶，即得自海栖热袍菌的异丁酸激酶，并结晶(Diao等人,J Bacteriol.191:2521‑2529(2009);Diao等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100‑1102(2003))。
基因名称GI号GenBank登记号生物lysC16131850NP_418448.1大肠杆菌ackA16130231NP_416799.1大肠杆菌proB16128228NP_414777.1大肠杆菌buk115896326NP_349675丙酮丁醇梭杆菌buk220137415Q97II1丙酮丁醇梭杆菌buk26685256Q9X278.1海栖热袍菌
2.8.3.a CoA转移酶：CoA转移酶会催化CoA部分部分从一个分子向另一个分子的可逆转移。图3的步骤B由具有3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A转移酶活性的酶催化。在该转化中，通过CoA向CoA受体（诸如乙酸、琥珀酸或其它）的转移，从3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A形成苯甲酰乙酸。与类似底物反应的示例性的CoA转移酶包括肉桂酰辅酶A转移酶(EC2.8.3.17)和苄基琥珀酰辅酶A转移酶。肉桂酰辅酶A转移酶（由在生孢梭菌中的fldA编码）会将CoA部分从肉桂酰辅酶A转移至多种芳族酸底物，包括苯乙酸、3‑苯基丙酸和4‑苯基丁酸(Dickert等人,Eur.J Biochem.267:3874‑3884(2000))。苄基琥珀酰辅酶A转移酶利用琥珀酸或马来酸作为CoA受体，从苄基琥珀酰辅酶A形成苄基琥珀酸。该酶的特征在于除氮菌芳香族需氧去氮菌中的反向方向，其中它由bbsEF编码(Leutwein等人,J Bacteriol.183:4288‑4295(2001))。
基因GenBank登记号GI号生物fldAAAL18808.116417587生孢梭菌bbsEAAF89840.19622535芳香族需氧去氮菌bbsFAAF89841.19622536芳香族需氧去氮菌
具有不同底物范围的其它CoA转移酶包括：琥珀酰辅酶A转移酶、4‑羟基丁酰辅酶A转移酶、丁酰辅酶A转移酶、戊烯二酰辅酶A转移酶和乙酰乙酰辅酶A转移酶。已经证实，克鲁氏梭状芽孢杆菌的cat1、cat2和cat3的基因产物分别会表现出琥珀酰辅酶A、4‑羟基丁酰辅酶A和丁酰辅酶A转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A105:2128‑2133(2008);Sohling等人,J Bacteriol.178:871‑880(1996))。类似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411‑1418(2008))和布鲁斯锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337‑45346(2004))中。得自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酰辅酶A转移酶(EC2.8.3.12)会与戊烯二酰辅酶A和3‑丁烯酰辅酶A反应(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41‑51(1994))。编码该酶的基因是gctA和gctB。该酶表现出降低的、但是可检测的活性，具有几种替代性的底物，包括戊二酰辅酶A、2‑羟基戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A、巴豆酰辅酶A和丙烯酰辅酶A(Buckel等人,Eur.J Biochem.118:315‑321(1981))。该酶已经在大肠杆菌中克隆和表达(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41‑51(1994))。还已经在球孢梭菌和共生梭菌中检测出戊烯二酸辅酶A‑转移酶活性。乙酰乙酰辅酶A转移酶利用乙酰辅酶A作为CoA供体。该酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码(Korolev等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116‑2121(2002);Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902‑908(1968))。该酶具有宽底物范围(Sramek等人,Arch.Biochem.Biophys.171:14‑26(1975))，且已经被证实会将CoA部分从乙酰辅酶A转移至多种底物，包括异丁酸盐(Matthies等人,Appl Environ.Microbiol58:1435‑1439(1992))、戊酸盐和丁酸盐(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902‑908(1968))。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,Appl.Environ.Microbiol68:5186‑5190(2002))、丙酮丁醇梭杆菌(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol56:1576‑1583(1990);Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol55:323‑329(1989))和Clostridium saccharoperbutylacetonicum(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58‑68(2007))中。
基因GenBank登记号GI号生物cat1P38946.1729048克鲁氏梭状芽孢杆菌cat2P38942.2172046066克鲁氏梭状芽孢杆菌cat3EDK35586.1146349050克鲁氏梭状芽孢杆菌TVAG_395550XP_001330176123975034阴道毛滴虫G3Tb11.02.0290XP_82835271754875布鲁斯锥虫gctACAA57199.1559392发酵氨基酸球菌
基因GenBank登记号GI号生物gctBCAA57200.1559393发酵氨基酸球菌gctAACJ24333.1212292816共生梭菌gctBACJ24326.1212292808共生梭菌atoAP76459.12492994大肠杆菌K12atoDP76458.12492990大肠杆菌K12actAYP_226809.162391407谷氨酸棒杆菌cg0592YP_224801.162389399谷氨酸棒杆菌ctfANP_149326.115004866丙酮丁醇梭杆菌ctfBNP_149327.115004867丙酮丁醇梭杆菌ctfAAAP42564.131075384Clostridium saccharoperbutylacetonicumctfBAAP42565.131075385Clostridium saccharoperbutylacetonicum
3.1.2.a CoA水解酶：在EC类别3.1.2中的CoA水解酶或硫酯酶可以将3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A水解为它的对应酸(图3的步骤B)。水解芳族底物的示例性的CoA硫代酸酯包括苯甲酰辅酶A水解酶、4‑羟基苯甲酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.23)和苯基乙酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.25)。埃文固氮弧菌基因orf1编码具有苯甲酰辅酶A水解酶活性的酶，该酶参与苯甲酸代谢(Ismail,Arch.Microbiol190:451‑460(2008))。当在大肠杆菌中异源地表达时，该酶表现出对许多替代底物的活性。通过序列相似性，在向磁磁螺菌、Jannaschia sp.CCS1和Sagittula stellataE‑37的苯甲酸盐降解基因簇中鉴别出了其它苯甲酰辅酶A水解酶(Ismail,Arch.Microbiol190:451‑460(2008))。假单胞菌属CBS3的4‑羟基苯甲酰辅酶A水解酶表现出对替代底物苯甲酰辅酶A和对甲基苯甲酰辅酶A的活性，且已经在大肠杆菌中异源地表达和表征(Song等人,Bioorg.Chem.35:1‑10(2007))。具有芳基‑CoA水解酶活性的其它酶包括结核分枝杆菌的棕榈酰辅酶A水解酶(Wang等人,Chem.Biol.14:543‑551(2007))和由entH编码的大肠杆菌的酰基‑CoA水解酶(Guo等人,Biochemistry48:1712‑1722(2009))。
基因GenBank登记号GI号生物orf1AAN39365.123664428埃文固氮弧菌Magn03011230ZP_0020779446200680向磁磁螺菌Jann_0674YP_50861689053165Jannaschia sp.CCS1SSE37_24444ZP_01745221126729407Sagittula stellataEF569604.1:4745..5170ABQ44580.1146761194假单胞菌属CBS3Rv0098NP_214612.115607240结核分枝杆菌entHAAC73698.11786813大肠杆菌
几种其它的具有宽底物范围的CoA水解酶适用于水解苯甲酰辅酶A和/或对甲基苯甲酰辅酶A。例如，由得自褐家鼠脑的acot12编码的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959‑965(1976))可以与丁酰辅酶A、己酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应。由acot8编码的人二羧酸硫酯酶会表现出对戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A、环庚基‑CoA、癸二酰辅酶A和十二烷二酰基‑CoA的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125‑38132(2005))。与该酶最接近的大肠杆菌同系物tesB还可以水解许多CoA硫羟酸酯(Naggert等人,J Biol Chem266:11044‑11050(1991))。还已经在大鼠肝中表征了类似的酶(Deana R.,Biochem Int26:767‑773(1992))。在大肠杆菌中的具有水解酶活性的其它酶包括：ybgC、paaI和ybdB(Kuznetsova,等人,FEMS Microbiol Rev,2005,29(2):263‑279;Song等人,J Biol Chem,2006,281(16):11028‑38)。
基因名称GenBank登记号GI号生物acot12NP_570103.118543355褐家鼠tesBNP_41498616128437大肠杆菌acot8CAA155023191970智人acot8NP_57011251036669褐家鼠tesANP_41502716128478大肠杆菌ybgCNP_41526416128711大肠杆菌paaINP_41591416129357大肠杆菌ybdBNP_41512916128580大肠杆菌
4.1.1a.羧基‑裂合酶：催化图1‑3中的几种转化，需要在EC类别4.1.1中的脱羧酶。苯丙酮酸至苯乙醛的转化(图1的步骤B)是由酮酸脱羧酶催化。苯乙酸脱羧为甲苯(图1的步骤D)，是由具有苯乙酸脱羧酶活性的酶催化。苯甲酰乙酸脱羧为乙酰苯(图7的步骤C)，需要3‑酮酸脱羧酶。脱羧酶(也称作羧基裂合酶)会催化从具有羧酸官能团的有机化合物或细胞代谢物脱去二氧化碳。脱羧酶普遍存在于自然界中，且可以需要磷酸吡哆醛或丙酮酸盐作为辅因子，尽管许多不需要结合的辅因子。已经报道了超过50种脱羧酶，并通过生化方法和/或分析方法进行了表征。
苯乙酸脱羧为甲苯(图1的步骤D)，需要苯乙酸脱羧酶的催化。迄今为止，尚未在表征的脱羧酶中检测出这样的活性。催化类似的反应的一种酶是4‑羟基苯乙酸脱羧酶(EC4.1.1.83)，该酶天然地将4‑羟基苯乙酸脱羧为对甲酚。得自难辨梭菌和粪味梭菌的表征的4‑羟基苯乙酸脱羧酶是由2个亚基组成，并需要特异性的活化酶的活化(Yu等人,Biochemistry45:9584‑9592(2006)；和rei等人,Eur.J Biochem.271:2225‑2230(2004))。已经在大肠杆菌中异源地表达了这些酶（由粪味梭菌中的csdABC和难辨梭菌中的hpdABC编码）。另一种合适的酶是阴沟肠杆菌的芳基丙二酸脱羧酶(EC4.1.1.76)，该酶具有对结构上相关的底物2‑苯基丙酸盐的活性(Yatake等人,Appl.Microbiol Biotechnol.78:793‑799(2008))。该酶的序列可在Yatake等人的出版物中得到；但是，迄今为止尚未给该酶分配GenBank登录号。最近将由AMDA_BORBR编码的得自支气管炎博德特菌的一种有关酶(98%氨基酸同一性)结晶(Kuettner等人,JMol.Biol.377:386‑394(2008))。
基因名称GenBank登记号GI号生物csdAABB05048.177863917粪味梭菌csdBABB05046.177863915粪味梭菌csdCABB05047.177863916粪味梭菌hpdACAD65891.128300943难辨梭菌hpdBCAD65889.128300939难辨梭菌hpdCCAD65890.128300941难辨梭菌AMDA_BORBRQ05115.1728844支气管炎博德特菌
苯丙酮酸至苯乙醛的转化(图1、步骤B)，是由具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶催化。几种酮酸脱羧酶已经表现出对苯丙酮酸的活性，包括苯丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.43)、丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)、支链α‑酮酸脱羧酶(EC4.1.1.72)和苄基甲酸脱羧酶(EC4.1.1.7)。一种示例性的苯丙酮酸脱羧酶是由巴西固氮螺菌的ipdC基因编码(Spaepen等人,JBacteriol.189:7626‑7633(2007))。苯丙酮酸盐是该酶的偏好底物。由基因PDC1、PDC5、PDC6和ARO10编码的酿酒酵母酶也表现出苯丙酮酸脱羧酶活性(Dickinson等人,J Biol.Chem.278:8028‑8034(2003))。具有苯丙酮酸脱羧酶活性的其它酶包括：Zygosaccharomyces bisporus的丙酮酸脱氢酶(Neuser等人,Biol.Chem.381:349‑353(2000))、结核分枝杆菌H37Rv和乳酸乳球菌的支链2‑酮酸脱羧酶(Gocke等人,Adv.Synth.Catal.349:1425‑1435(2007);Werther等人,J Biol.Chem.283:5344‑5354(2008))、和恶臭假单胞菌的苄基甲酸脱羧酶(Siegert等人,Protein Eng Des Sel18:345‑357(2005))。另一种合适的酶是得自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶，因为该酶具有宽底物范围，且已经成为改变底物特异性的定向工程改造研究的对象(Siegert等人,Protein Eng Des Sel18:345‑357(2005))。
蛋白GenBank IDGI号生物ipdCP51852.11706320巴西固氮螺菌PDC1P06169.730923172酿酒酵母PDC5P16467.41352225酿酒酵母PDC6P26263.3118389酿酒酵母ARO10Q06408.150400299酿酒酵母pdc1CAB65554.16689662Zygosaccharomyces bisporusRv0853cNP_215368.115607993结核分枝杆菌H37RvkdcAAAS49166.144921617乳酸乳球菌mdlCP20906.23915757恶臭假单胞菌pdcP06672.1118391运动发酵单胞菌
苯甲酰乙酸脱羧为乙酰苯(图3的步骤C)，是由具有苯甲酰乙酸脱羧酶活性的酶催化。在Aromatoleum aromaticum EbN1中的乙基苯降解过程中，一种具有该活性的ATP依赖性的酶乙酰苯羧化酶在反向(羧化)方向工作(Rabus等人,Arch.Micrpbiol178:506‑516(2002))。该酶是由5个亚基（由apc1‑5编码）组成，且在羧化方向是ATP依赖性的(AMP形成)。通过序列同源性，在维涅兰德固氮菌和Rubrobacter xylanohilus中发现了类似的酶。
基因名称GenBank登记号GI号生物apc1YP_158351.156476762Aromatoleum aromaticum EbN1apc2YP_158350.156476761Aromatoleum aromaticum EbN1apc3YP_158349.156476760Aromatoleum aromaticum EbN1apc4YP_158348.156476759Aromatoleum aromaticum EbN1apc5YP_158347.156476758Aromatoleum aromaticum EbN1apc1YP__002798345.1226943272维涅兰德固氮菌apc2ACO77369.1226718198维涅兰德固氮菌apc3YP_002798343.1226943270维涅兰德固氮菌apc4YP_002798342.1226943269维涅兰德固氮菌apc1YP_644617.1108804680Rubrobacter xylanophilusapc2YP_644616.1108804679Rubrobacter xylanophilusapc3YP_644615.1108804678Rubrobacter xylanophilusapc4YP_644614.1108804677Rubrobacter xylanophilusapc5YP_644613.1108804676Rubrobacter xylanophilus
可替换地，3‑酮酸脱羧酶可以将苯甲酰乙酸转化成乙酰苯。一种示例性的3‑酮酸脱羧酶是乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)，该酶天然地将乙酰乙酸转化为丙酮和CO2。得自丙酮丁醇梭杆菌的酶（由adc编码）具有宽底物范围，且已经被证实会催化期望的苯甲酰乙酸脱羧为乙酰苯(Rozzel等人,J.Am.Chem.Soc.106:4937‑4941(1984);Benner等人,J.Am.Chem.Soc.103:993‑994(1981);Autor等人,J Biol.Chem.245:5214‑5222(1970))。已经在拜氏梭菌中表征了一种有关的乙酰乙酸脱羧酶(Ravagnani等人,Mol.Microbiol37:1172‑1185(2000))。得自多粘芽孢杆菌的乙酰乙酸脱羧酶（在无细胞的提取物中表征）也具有对3‑酮酸的宽底物特异性，且可以将3‑氧代戊酸脱羧(Matiasek等人,Curr.Microbiol42:276‑281(2001))。迄今为止尚未鉴别出编码该酶的基因，多粘芽孢杆菌的基因组序列仍不可得到。另一种adc存在于Clostridium saccharoperbutylacetonicum中(Kosaka,等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58‑68(2007))。通过序列同源性，可以推断出在其它生物（包括肉毒梭菌和解淀粉芽孢杆菌FZB42）中的其它基因。
蛋白GenBank IDGI号生物adcNP_149328.115004868丙酮丁醇梭杆菌adcAAP42566.131075386Clostridium saccharoperbutylacetonicumadcYP_001310906.1150018652拜氏梭菌CLL_A2135YP_001886324.1187933144肉毒梭菌RBAM_030030YP_001422565.1154687404解淀粉芽孢杆菌
4.1.99.a脱羰酶：将苯乙醛转化为甲苯(图1的步骤E)，需要脱羰酶。脱羰酶会催化植物、哺乳动物、昆虫和细菌中的烷烃生物合成的最后一步(Dennis等人,Arch.Biochem.Biophys.287:268‑275(1991))。非氧化性的脱羰酶会将醛转化成烷烃，同时释放出CO，而氧化脱羧酶是细胞色素P450酶，其利用NADPH和O2作为辅因子，并释放出CO2、水和NADP+。示例性的脱羰酶包括十八醛脱羰酶(EC4.1.99.5)、甾醇去饱和酶和脂肪醛脱羰酶。在藻类布朗葡萄藻中纯化和表征了含有钴‑卟啉的脱羰酶；但是，迄今为止没有将基因与该活性相关联(Dennis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A89:5306‑5310(1992))。还纯化和表征了得自豌豆的含有铜的脱羰酶(Schneider‑Belhaddad等人,Arch.Biochem.Biophys.377:341‑349(2000))。拟南芥的CER1基因编码参与上表皮蜡形成的脂肪酸脱羰酶(US6,437,218)。其它脂肪酸脱羰酶存在于蒺藜状苜蓿、葡萄和水稻中(美国专利申请2009/0061493).
蛋白GenBank IDGI号生物CER1NP_850932145361948拟南芥MtrDRAFT_AC153128g2v2ABN07985124359969蒺藜状苜蓿VITISV_029045CAN60676147781102葡萄OSJNBa0004N05.14CAE03390.238345317水稻
氧化脱羰酶是由家蝇和黑腹果蝇的CYP4G2v1和CYP4G1基因产物编码(美国专利申请2010/0136595)。通过序列同源性，可以在其它生物（例如甘蓝夜蛾、谷实夜蛾和豌豆蚜）中鉴别出具有氧化脱羰酶活性的其它酶。
蛋白GenBank IDGI号生物CYP4G2v1ABV48808.1157382740家蝇CYP4G1NP_525031.117933498黑腹果蝇CYP4G25BAD81026.156710314天蚕CYP4M6AAM54722.121552585谷实夜蛾LOC100164072XP_001944205.1193650239豌豆蚜
4.1.99.b裂合酶：在图2中苯丙氨酸至苯的转化，是由具有苯丙氨酸苯‑裂合酶活性的酶催化。需要的新活性类似于酪氨酸苯酚‑裂合酶(EC4.1.99.2)的活性，后者会可逆地互变酪氨酸和苯酚，伴随地释放丙酮酸和氨。由tutA编码的得自成团泛菌(以前的草生欧文氏菌)的酶，会与许多被取代的衍生物反应，包括二羟基苯丙氨酸(Foor等人,Appl.Environ.Microbiol 59:3070‑3075(1993))。该酶在大肠杆菌中异源地表达，并用于从儿茶酚、丙酮酸和氨合成二羟基苯丙氨酸。其它酪氨酸苯酚‑裂合酶存在于中间柠檬酸杆菌(Nagasawa等人,Eur.J Biochem.117:33‑40(1981))、弗氏柠檬酸杆菌(Phillips等人,Biochim.Biophys.Acta1647:167‑172(2003))和Symbiobacterium thermophilum(Hirahara等人,Appl.Microbiol Biotechnol.39:341‑346(1993))中。已经在结构上表征了弗氏柠檬酸杆菌酶，并鉴别出参与底物结合的残基(Milic等人,JBiol.Chem.283:29206‑29214(2008))。苯丙氨酸不是任何表征的酪氨酸苯酚‑裂合酶的天然底物；相反，已经证实，它起一些酶的抑制剂的作用。可能需要本领域熟知的定向进化或其它蛋白工程改造方法来获得该活性并提高性能。
蛋白GenBank IDGI号生物tutAAAA66390.1806897成团泛菌tplABI75028.1114451977弗氏柠檬酸杆菌tplBAA00763.1216675中间柠檬酸杆菌tplYP_076671.151893980Symbiobacterium thermophilum
催化类似反应的一种酶是色氨酸吲哚‑裂合酶(EC4.1.99.1)，也称作色氨酸酶，该酶将色氨酸和水转化成吲哚和丙酮酸。示例性的色氨酸吲哚‑裂合酶包括：大肠杆菌的tnaA、Symbiobacterium thermophilum的tna1和产气肠杆菌的tnaA的基因产物(Kogan等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2073‑2075(2004)；川崎等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:1938‑1943(1995);Suzuki等人,Agric.Biol.Chem.55:3059‑3066(1991))。
蛋白GenBank IDGI号生物tnaANP_418164.490111643大肠杆菌tna1BAA24688.12842554Symbiobacterium thermophilumtnaAQ59342.12501228产气肠杆菌
4.2.1.a脱水酶：图3的步骤E采用脱水酶(EC4.1.2.‑)将1‑苯基乙醇转化为苯乙烯。用于催化该反应的示例性酶包括：延胡索酸酶(EC4.2.1.2)，柠苹酸水合酶(EC4.2.1.34)和二甲基马来酸水合酶(EC4.2.1.85)。延胡索酸酶天然地催化苹果酸可逆脱水为延胡索酸。尽管迄今为止尚未在文献中描述1‑苯基乙醇作为延胡索酸酶的底物的适用性，关于该酶的结构信息资源是得到的，研究人员已经成功地工程改造该酶以改变活性、抑制和定位(Weaver,61:1395‑1401(2005))。大肠杆菌具有3种延胡索酸酶：FumA、FumB和FumC，它们受生长条件调节。FumB是氧敏感的，仅在厌氧条件下有活性。FumA在微厌氧条件下有活性，FumC是在需氧生长期间有活性的唯一酶(Tseng等人,183:461‑467(2001);Woods等人,954:14‑26(1988);Guest等人,J GenMicrobiol131:2971‑2984(1985))。其它酶存在于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.JBiochem.CellBiol31:961‑975(1999))、嗜热栖热菌(Mizobata等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49‑55(1998))和褐家鼠(Kobayashi等人,89:1923‑1931(1981))中。具有高序列同源性的类似酶包括：得自拟南芥的fum1和得自谷氨酸棒杆菌的fumC。得自Pelotomaculum thermopropionicum的mmcBC延胡索酸酶是另一类延胡索酸酶，其具有2个亚基(Shimoyama等人,270:207‑213(2007))。柠苹酸水解酶天然地将2‑甲基苹果酸脱水为中康酸。已经在通向2‑氧代丁酸的丙酮酸途径的背景下在詹氏甲烷球菌中研究了该酶，其中已经证实它具有宽底物特异性(Drevland等人,J Bacteriol.189:4391‑4400(2007))。也在破伤风形梭菌、摩氏摩根菌、丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌中检测到该酶活性，其中认为它参与谷氨酸降解(Kato和Asano,Arch.Microbiol168:457‑463(1997))。詹氏甲烷球菌蛋白序列与这些生物中的基因没有显著的同源性。二甲基马来酸水合酶是顺乌头酸酶家族中的一种可逆的Fe2+依赖性的和氧敏感的酶，其水合二甲基马来酸以形成(2R,3S)‑2,3‑二甲基苹果酸。该酶是由巴氏真杆菌中的dmdAB编码(Alhapel等人,出处同上;Kollmann‑Koch等人,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847‑857(1984))。
蛋白GenBank IDGI号生物fumANP_416129.116129570大肠杆菌fumBNP_418546.116131948大肠杆菌fumCNP_416128.116129569大肠杆菌fumCO692949789756空肠弯曲杆菌fumCP8412775427690嗜热栖热菌fumHP14408120605褐家鼠fum1P9303339931311拟南芥fumCQ8NRN839931596谷氨酸棒杆菌mmcBYP_001211906147677691Pelotomaculum thermopropionicummmcCYP_001211907147677692Pelotomaculum thermopropionicumleuDQ58673.13122345詹氏甲烷球菌dmdAABC8840886278276巴氏真杆菌dmdBABC88409.186278277巴氏真杆菌
6.2.1.a酸‑硫醇连接酶：3‑氧代‑3‑苯基丙酰辅酶A至苯甲酰乙酸的转化(图3的步骤B)，可以由在EC类别6.2.1中的CoA合成酶或酸‑硫醇连接酶催化。迄今为止尚未表征催化该确切转化的形成ATP的CoA合成酶；但是，在文献中已经描述了几种具有宽底物特异性的酶。经证实，得自闪烁古球菌的形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(ACD,EC6.2.1.13)（由AF1211编码）作用于多种直链和支链底物，包括异丁酸、异戊酸和延胡索酸(Musfeldt等人,J Bacteriol.184:636‑644(2002))。也经证实，在闪烁古球菌中的第二种可逆ACD（由AF1983编码）具有宽底物范围，对芳族化合物苯乙酸和吲哚乙酸具有高活性(Musfeldt等人,出处同上)。得自死海嗜盐古细菌的酶（注解为琥珀酰辅酶A合成酶）接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并经证实会在正向和反向工作(Brasen等人,Arch.Microbiol182:277‑287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，其与乙酰辅酶A、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol182:277‑287(2004))。定向进化或工程改造可以用于修饰该酶，以在宿主生物的生理温度工作。得自闪烁古生菌、死海嗜盐古细菌和P.aerophilum的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol 182:277‑287(2004);Musfeldt和Schonheit,JBacteriol.184:636‑644(2002))。其它酶是由大肠杆菌中的sucCD编码，其天然地催化从琥珀酸形成琥珀酰辅酶A，伴随地消耗1摩尔ATP，该反应在体内是可逆的(Buck等人,Biochemistry24:6245‑6252(1985))。已经证实，得自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶会作用于几种脂族底物（包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸）和芳族化合物（诸如苯乙酸和苯氧乙酸）(Fernandez‑Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149‑1154(1993))。得自豌豆根瘤菌的相关酶丙二酰基CoA合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸（即乙基‑、丙基‑、烯丙基‑、异丙基‑、二甲基‑、环丙基‑、环丙基亚甲基‑、环丁基‑和苄基‑丙二酸）转化成它们的对应的单硫代酸酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822‑5823(2001))。
基因GenBank登记号GI号生物AF1211NP_070039.111498810闪烁古球菌AF1983NP_070807.111499565闪烁古球菌scsYP_135572.155377722死海嗜盐古细菌PAE3250NP_560604.118313937Pyrobaculum aerophilum菌株 IM2sucCNP_415256.116128703大肠杆菌sucDAAC73823.11786949大肠杆菌paaFAAC24333.222711873恶臭假单胞菌matBAAC83455.13982573豌豆根瘤菌
实施例II
从粘康酸异构体至1,3‑丁二烯的途径
本实施例显示了从粘康酸异构体至1,3‑丁二烯的途径。
图4显示了脱羧酶将粘康酸异构体转化为1,3‑丁二烯。顺式,顺式‑粘康酸、顺式,反式‑粘康酸或反式,反式‑粘康酸首先脱羧为顺式‑2,4‑戊二烯酸或反式‑2,4‑戊二烯酸(图4的步骤A、B、C和D)。2,4‑戊二烯酸随后脱羧，形成1,3‑丁二烯(图4的步骤E、F)。
应当理解，任何粘康酸异构体的脱羧可以充当通向1,3‑丁二烯的途径的一部分。顺式,顺式‑粘康酸的生物生产是本领域熟知的(Draths和Frost.J Am Chem Soc.116:399‑400(1994);Niu等人Biotechnol Prog.18:201‑211(2002);Bang和Choi.J Ferm Bioeng.79(4):381‑383(1995))。在EC类别5.2.1中的粘康酸异构酶，可以互变粘康酸的异构体。
进一步理解，2,4‑戊二烯酸的任一种异构体的脱羧会形成1,3‑丁二烯。2,4‑戊二烯酸的异构体可以可替换地从除了粘康酸以外的原料形成(例如，经由戊‑2‑烯酸或戊‑4‑烯酸的脱氢而引入第二个双键；经由水解酶、合成酶或转移酶从2,4‑戊二烯酰辅酶A除去CoA，分别经由醛或醛/醇脱氢酶将2,4‑戊二烯醛或2,4‑戊二烯醇脱氢)。在EC类别:5.2.1中的异构酶可以互变2,4‑戊二烯酸的异构体。
已经表征了众多脱羧酶，且证实会将具有与粘康酸或2,4‑戊二烯酸异构体类似结构的底物脱羧。示例性的酶包括：山梨酸脱羧酶、乌头酸脱羧酶(EC4.1.1.16)、4‑草酰巴豆酸脱羧酶(EC4.1.1.77)、肉桂酸脱羧酶和阿魏酸脱羧酶。这些酶适用于本发明中，以将粘康酸和/或2,4‑戊二烯酸脱羧，如图4所示。
一种具有密切相关功能的脱羧酶是山梨酸脱羧酶，其将山梨酸转化为1,3‑戊二烯。黑曲霉的山梨酸脱羧需要3个基因：padA1、ohbA1和sdrA(Plumridge等人Fung.Genet.Bio,47:683‑692(2010)。PadA1被注解为苯基丙烯酸脱羧酶，ohbA1是假定的4‑羟基苯甲酸脱羧酶，sdrA是山梨酸脱羧酶调节剂。还已经证实，其它物种会将山梨酸脱羧，包括几种真菌和酵母物种(Kinderlerler和Hatton,Food Addit Contam.,7(5):657‑69(1990);Casas等人,Int J Food Micro.,94(1):93‑96(2004);Pinches和Apps,Int.J.Food Microbiol.116:182‑185(2007))。例如，已经证实，米曲霉和费希新萨托菌会将山梨酸脱羧，且具有与padA1、ohbA1和sdrA接近的同系物。
基因名称GenBankIDGI号生物padA1XP_001390532.1145235767黑曲霉ohbA1XP_001390534.1145235771黑曲霉sdrAXP_001390533.1145235769黑曲霉padA1XP_001818651.1169768362米曲霉ohbA1XP_001818650.1169768360米曲霉sdrAXP_001818649.1169768358米曲霉padA1XP_001261423.1119482790费希新萨托菌ohbA1XP_001261424.1119482792费希新萨托菌sdrAXP_001261422.1119482788费希新萨托菌
乌头酸脱羧酶是本发明的另一种有用的酶。在假丝酵母菌株中，以及在丝状真菌土曲霉中，该酶催化衣康酸生物合成的最后一步(Bonnarme等人J Bacteriol.177:3573‑3578(1995);Willke和Vorlop,Appl Microbiol.Biotechnol56:289‑295(2001))已经从土曲霉纯化出乌头酸脱羧酶，并进行了表征(Dwiarti等人,J.Biosci.Bioeng.94(1)：29‑33(2002))。以前报道了顺式‑乌头酸脱羧酶(CAD)的基因和蛋白序列(EP2017344A1;WO2009/014437A1)，在下表中列出了几种接近的同系物。
基因名称GenBankIDGI号生物CADXP_001209273115385453土曲霉 XP_001217495115402837土曲霉 XP_001209946115386810土曲霉 BAE6606383775944米曲霉 XP_001393934145242722黑曲霉 XP_39131646139251玉米赤霉 XP_001389415145230213黑曲霉 XP_001383451126133853Pichia stipitis YP_891060118473159耻垢分枝杆菌 NP_96118741408351鸟分枝杆菌副结核亚种 YP_880968118466464鸟分枝杆菌 ZP_01648681119882410Salinispora arenicola
4‑草酰巴豆酸脱羧酶会催化4‑草酰巴豆酸脱羧为2‑氧代戊酸。已经从众多生物中分离出该酶，并进行了表征。编码该酶的基因包括：在假单胞菌属(菌株600)中的dmpH和dmpE(Shingler等人,174:711‑724(1992))，得自恶臭假单胞菌的xylII和xylIII(Kato等人,Arch.Microbiol168:457‑463(1997);Stanley等人,Biochemistry39:3514(2000);Lian等人,J.Am.Chem.Soc.116:10403‑10411(1994))，和得自富养产碱菌JMP134的Reut_B5691和Reut_B5692(Hughes等人,158:79‑83(1984))。已经在大肠杆菌中克隆和表达了得自假单胞菌属(菌株600)的编码该酶的基因(Shingler等人,174:711‑724(1992))。
基因名称GenBankIDGI号生物dmpHCAA43228.145685假单胞菌属CF600dmpECAA43225.145682假单胞菌属CF600xylIIYP_709328.1111116444恶臭假单胞菌xylIIIYP_709353.1111116469恶臭假单胞菌Reut_B5691YP_299880.173539513富养产碱菌JMP134Reut_B5692YP_299881.173539514富养产碱菌JMP134
最后，已经表征了一类脱羧酶，它们会催化肉桂酸(苯基丙烯酸)和取代的肉桂酸衍生物向它们的对应苯乙烯衍生物的转化。这些酶常见于多种生物中，已经在大肠杆菌中克隆和表达的编码这些酶的具体基因包括：得自酿酒酵母的pad 1(Clausen等人,Gene142:107‑112(1994))，得自植物乳杆菌的pdc(Barthelmebs等人,67:1063‑1069(2001);Qi等人,MetabEng9:268‑276(2007);Rodriguez等人,J.Agric.Food Chem.56:3068‑3072(2008))，得自产酸克雷伯菌(Uchiyama等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:116‑123(2008);Hashidoko等人,Biosci.Biotech.Biochem.58:217‑218(1994))、戊糖片球菌(Barthelmebs等人,67:1063‑1069(2001))的pofK(pad)，和得自枯草芽孢杆菌和短小芽胞杆菌的padC (Shingler等人,174:711‑724(1992))。也已经纯化和表征了得自荧光假单胞菌的阿魏酸脱羧酶(Huang等人,J.Bacteriol.176:5912‑5918(1994))。该类酶是稳定的，且不需要外源的或内部结合的辅因子，因而使得这些酶可理想地适用于生物转化(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61:51‑69(2007))。
基因名称GenBankIDGI号生物pad1BAG32372.1188496949酿酒酵母pdcAAC45282.11762616植物乳杆菌pofK(pad)BAF65031.1149941607产酸克雷伯菌padCAAC46254.12394282枯草芽孢杆菌padCAC16793.111322457戊糖片球菌padCAC18719.111691810短小芽胞杆菌
上面列出的每种脱羧酶代表对于图4所示的期望转化而言可能合适的酶。如果在期望的转化(例如，粘康酸至2,4‑戊二烯酸、2,4‑戊二烯酸至丁二烯)中没有观察到所述酶的希望的活性或生产力，可以使用已知的蛋白工程改造方法来进化脱羧酶，以实现需要的性能。重要的是，通过使用嵌合酶证实，脱羧酶的C‑端区域似乎负责底物特异性(Barthelmebs,L.;Divies,C.;Cavin,J.‑F.2001.Expression in Escherichia coli of Native and Chimeric Phenolic Acid Decarboxylases with Modified Enzymatic Activities and Method for Screening Recombinant E.coli Strains Expressing These Enzymes,Appl.Environ.Microbiol.67,1063‑1069)。因此，定向进化实验（为了拓宽脱羧酶的特异性，以便获得对粘康酸或2,4‑戊二烯酸的活性）可以聚焦于这些酶的C‑端区域。
催化图4的转化所需的有些脱羧酶可以表现出对粘康酸或2,4‑戊二烯酸的特定异构体更高的活性。可以使用异构酶，将粘康酸和2,4‑戊二烯酸的不太合乎需要的异构体转化成更合乎需要的异构体用于脱羧。催化类似转化和因而代表适用于本发明的酶的示例性异构酶包括：马来酸顺反异构酶(EC5.2.1.1)，马来酰丙酮顺反异构酶(EC5.2.1.2)和脂肪酸顺反异构酶。马来酸顺反异构酶会将延胡索酸转化成马来酸。该酶是由得自粪产碱菌(Hatakeyama,等人,1997,Gene Cloning and Characterization of Maleate cis‑trans Isomerase from Alcaligenes faecalis,Biochem.Biophys.Research Comm.239,74‑79)或粘质沙雷菌(Hatakeyama等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.64:1477‑1485(2000))的maiA基因编码。通过序列同源性可以鉴别的类似基因包括：得自嗜热脂肪土芽孢杆菌、皮氏罗尔斯顿菌12D和富养产碱菌H16的那些。其它马来酸顺反异构酶是由这样的酶编码，所述酶的氨基酸序列参考文献中的序列ID1‑4提供(Mukouyama等人,美国专利6,133,014)。马来酰丙酮顺式,反式‑异构酶会催化4‑马来酰‑乙酰乙酸转化成4‑富马酰‑乙酰乙酸，即顺式至反式转化。该酶是由在铜绿假单孢菌(Fernandez‑Canon等人,JBiol.Chem.273:329‑337(1998)))和霍乱弧菌(Seltzer,JBiol.Chem.248:215‑222(1973))中的maiA编码。通过序列同源性，在大肠杆菌O157中鉴别出了类似酶。cti基因产物会催化顺式‑不饱和脂肪酸(UFA)转化成反式‑UFA。已经在恶臭假单胞菌中表征了该酶(Junker等人,J Bacteriol.181:5693‑5700(1999))。类似酶存在于斯瓦尼菌属MR‑4和霍乱弧菌中。
基因名称GenBankIDGI号生物maiABAA23002.12575787粪产碱菌maiABAA96747.18570038粘质沙雷菌maiABAA772964760466嗜热脂肪土芽孢杆菌Rpic12DDRAFT_0600ZP_02009633153888491皮氏罗尔斯顿菌12DmaiAYP_725437113866948富养产碱菌H16maiANP_25069715597203铜绿假单孢菌maiANP_23099115641359霍乱弧菌maiAEDU73766189355347大肠杆菌O157ctiAAD412525257178恶臭假单胞菌ctiYP_732637113968844斯瓦尼菌属MR‑4ctiZP_04395785229506276霍乱弧菌
实施例III
用于生产(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐的示例性途径
本实施例描述了用于生产对苯二甲酸(PTA)前体(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H3M4OP)的示例性途径。
对甲苯甲酸和PTA途径的前体是2H3M4OP。在图5所示的3个酶促步骤中，可以从中枢代谢物甘油醛‑3‑磷酸(G3P)和丙酮酸衍生出该化学物质。前2个步骤是大肠杆菌和利用甲基赤藓醇磷酸盐(非甲羟戊酸)途径进行类异戊二烯生物合成的其它生物天然具有的。首先由DXP合酶缩合丙酮酸和G3P，以形成1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸(DXP)。随后，由DXP还原异构酶催化碳主链的还原和重排。最后，新颖的二醇脱水酶将2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸转化成对甲苯甲酸前体2H3M4OP。
A.1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸(DXP)合酶。由DXP合酶(EC2.2.1.7)缩合丙酮酸和G3P，以形成DXP。该酶催化类异戊二烯生物合成的非甲羟戊酸途径的第一步。该酶需要硫胺素二磷酸作为辅因子，也需要还原的FAD，尽管不存在净氧化还原变化。该大肠杆菌酶的晶体结构是可得到的(Xiang等人,J.Biol.Chem.282:2676‑2682(2007))。已经在结核分枝杆菌(Bailey等人,Glycobiology12:813‑820(2002)和根瘤土壤杆菌(Lee等人,J.Biotechnol.128:555‑566(2007))中克隆并表征了其它酶。将得自枯草芽孢杆菌和集胞藻属PCC6803的DXP合酶克隆进大肠杆菌中(Harker和Bramley，FEBSLett.448:115‑119(1999))。
基因GenBank登记号GI号生物dxsAAC73523.11786622大肠杆菌dxsP0A554.161222979结核分枝杆菌dxs11AAP56243.137903541根瘤土壤杆菌dxsP54523.11731052枯草芽孢杆菌sll1945BAA17089.11652165集胞藻属PCC 6803
B.1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶(EC 1.1.1.267)。在类异戊二烯生物合成的非甲羟戊酸途径的第二步中，1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸(DXP)至2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸的NAD(P)H依赖性的还原和重排，是由DXP还原异构酶(DXR,EC1.1.1.267)催化。所述NADPH依赖性的大肠杆菌酶是由dxr编码(Takahashi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:9879‑9884(1998))。在大肠杆菌中功能性地表达了得自拟南芥的重组酶(Carretero‑Paulet等人,Plant Physiol.129:1581‑1591(2002))。已经表征了得自运动发酵单胞菌和结核分枝杆菌的DXR酶，且可得到晶体结构(Grolle等人,FEMS Microbiol.Lett.191:131‑137(2000));Henriksson等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.62:807‑813(2006))。大多数表征的DXR酶是严格地NADPH依赖性的，但是得自拟南芥和结核分枝杆菌的酶会在低速率与NADH反应(Argyrou和Blanchard,Biochemistry 43:4375‑4384(2004));Rohdich等人,FEBS J.273:4446‑4458(2006))。
基因GenBank登记号GI号生物dxrAAC73284.11786369大肠杆菌dxrAAF73140.18131928Arabisopsis thalianadxrCAB60758.16434139运动发酵单胞菌dxrNP_217386.257117032结核分枝杆菌
C.2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸脱水酶。将2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸转化成对甲苯甲酸前体酶，需要二醇脱水酶(Altmiller和Wagner,Arch.Biochem.Biophys.138:160‑170(1970))。尽管尚未实验性地证实该转化，几种酶会催化类似的转化，包括二羟酸脱水酶(EC4.2.1.9)、丙二醇脱水酶(EC4.2.1.28)、甘油脱水酶(EC4.2.1.30)和肌‑肌醇单酮（myo‑inositose）脱水酶(EC4.2.1.44)。能够将次要的二醇2,3‑丁二醇转化成2‑丁酮的二醇脱水酶或丙二醇脱水酶(EC4.2.1.28)是该转化的优良候选物。腺苷基钴胺素依赖性的二醇脱水酶含有α、β和γ亚基，它们都为酶功能所需。示例性的基因候选物存在于肺炎克雷伯菌(Tobimatsu等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.62:1774‑1777(1998);Toraya等人,.Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475‑480(1976))、鼠伤寒沙门菌(Bobik等人,J.Bacteriol.179:6633‑6639(1997))、产酸克雷伯菌(Tobimatsu等人,J.Biol.Chem.270:7142‑7148(1995))和丘状菌落乳杆菌(Sauvageot等人,FEMS Microbiol.Lett.209:69‑74(2002))中。用于分离在其它生物中的二醇脱水酶基因候选物的方法是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号5,686,276)。
基因GenBank登记号GI号生物pddABAA08099.1868006产酸克雷伯菌pddBBAA08100.1868007产酸克雷伯菌pddCBAA08101.1868008产酸克雷伯菌pduCAAB84102.12587029鼠伤寒沙门菌pduDAAB84103.12587030鼠伤寒沙门菌pduEAAB84104.12587031鼠伤寒沙门菌pduCCAC82541.118857678丘状菌落乳杆菌pduDCAC82542.118857679丘状菌落乳杆菌pduECAD01091.118857680丘状菌落乳杆菌pddAAAC98384.14063702肺炎克雷伯菌pddBAAC98385.14063703肺炎克雷伯菌pddCAAC98386.14063704肺炎克雷伯菌
甘油脱水酶家族中的酶(EC4.2.1.30)还可以用于脱水2‑C‑甲基‑D‑赤藓醇‑4‑磷酸。示例性的基因候选物由在肺炎克雷伯菌中的gldABC和dhaB123 (WO2008/137403)和(Toraya等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475‑480(1976))，在巴斯德梭菌中的dhaBCE (Macis等人,FEMS Microbiol Lett.164:21‑28(1998))和在弗氏柠檬酸杆菌中的dhaBCE (Seyfried等人,J.Bacteriol.178:5793‑5796(1996))编码。通过在β亚基的2个残基中引入突变，最近工程改造了得自肺炎克雷伯氏菌的B12依赖性的二醇脱水酶变体，其具有增强了80‑336倍的活性(Qi等人,J.Biotechnol.144:43‑50(2009))。DuPont使用易出错的PCR，开发出了具有降低的失活动力学的二醇脱水酶(WO2004/056963)。
基因GenBank登记号GI号生物gldAAAB96343.11778022肺炎克雷伯菌gldBAAB96344.11778023肺炎克雷伯菌gldCAAB96345.11778024肺炎克雷伯菌dhaB1ABR78884.1150956854肺炎克雷伯菌dhaB2ABR78883.1150956853肺炎克雷伯菌dhaB3ABR78882.1150956852肺炎克雷伯菌dhaBAAC27922.13360389巴斯德梭菌dhaCAAC27923.13360390巴斯德梭菌dhaEAAC27924.13360391巴斯德梭菌dhaBP45514.11169287弗氏柠檬酸杆菌dhaCAAB48851.11229154弗氏柠檬酸杆菌dhaEAAB48852.11229155弗氏柠檬酸杆菌
如果使用B12依赖性的二醇脱水酶，推荐异源地表达对应的再活化因子。B12依赖性的二醇脱水酶是底物和一些下游产物的基于机制的自杀活化的对象。由无活性的钴胺素的紧密相连造成的灭活，可以在ATP依赖性的过程中被二醇脱水酶再活化因子克服。B12辅因子的再生需要额外的ATP。二醇脱水酶再生因子是双亚基蛋白。示例性的候选物存在于产酸克雷伯菌(Mori等人,J.Biol.Chem.272:32034‑32041(1997))、鼠伤寒沙门菌(Bobik等人,J.Bacteriol.179:6633‑6639(1997);Chen等人,J.Bacteriol.176:5474‑5482(1994))、丘状菌落乳杆菌(Sauvageot等人,FEMS Microbiol.Lett.209:69‑74(2002)),和肺炎克雷伯菌(WO2008/137403)中。
基因GenBank登记号GI号生物ddrAAAC15871.13115376产酸克雷伯菌ddrBAAC15872.13115377产酸克雷伯菌
pduGAAL20947.116420573鼠伤寒沙门菌pduHAAL20948.116420574鼠伤寒沙门菌pduGYP_002236779206579698肺炎克雷伯菌pduHYP_002236778206579863肺炎克雷伯菌pduGCAD0109229335724丘状菌落乳杆菌pduHCAD0109329335725丘状菌落乳杆菌
不依赖于B12的二醇脱水酶使用S‑腺苷基甲硫氨酸(SAM)作为辅因子，在严格厌氧条件下起作用，并需要特定活化酶的活化(Frey等人,Chem.Rev.103:2129‑2148(2003))。已经确定地表征了酪酸梭菌的甘油脱氢酶和对应的活化因子（由dhaB1和dhaB2编码）(O'Brien等人,Biochemistry43:4635‑4645(2004);Raynaud等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA 100:5010‑5015(2003))。该酶最近被用于过量生产1,3‑丙二醇的大肠杆菌菌株中，且能够实现非常高的产物滴度(Tang等人,Appl.Environ.Microbiol.75:1628‑1634(2009))。得自Roseburia inulinivorans的其它的不依赖于B12的二醇脱水酶和活化因子，经证实会催化2,3‑丁二醇至2‑丁酮的转化(美国公开2009/09155870).
基因GenBank登记号GI号生物dhaB1AAM54728.127461255酪酸梭菌dhaB2AAM54729.127461256酪酸梭菌rdhtAABC25539.183596382Roseburia inulinivoransrdhtBABC25540.183596383Roseburia inulinivorans
二羟酸脱水酶(DHAD,EC4.2.1.9)是一种参与支链氨基酸生物合成的不依赖于B12的酶。在它的天然作用中，它会将2,3‑二羟基‑3‑甲基戊酸转化成2‑酮‑3‑甲基‑戊酸，后者是异亮氨酸的前体。在缬氨酸生物合成中，该酶催化2,3‑二羟基‑异戊酸脱水为2‑氧代异戊酸。得自硫矿硫化叶菌的DHAD具有宽底物范围，并且在大肠杆菌中表达的重组酶表现出对多种糖醛酸的活性(Kim和Lee,J.Biochem.139:591‑596(2006))。所述硫矿硫化叶菌酶是氧耐受性的，这不同于许多二醇脱水酶。所述大肠杆菌酶（由ilvD编码）是对氧敏感的，其会灭活它的铁‑硫簇(Flint等人,J.Biol.Chem.268:14732‑14742(1993))。已经在粗糙链孢霉(Altmiller和Wagner,Arch.Biochem.Biophys.138:160‑170(1970))和鼠伤寒沙门菌(Armstrong等人,Biochim.Biophys.Acta498:282‑293(1977))中表征了类似酶。
基因GenBank登记号GI号生物ilvDNP_344419.115899814硫矿硫化叶菌
ilvDAAT48208.148994964大肠杆菌ilvDNP_462795.116767180鼠伤寒沙门菌ilvDXP_958280.185090149粗糙链孢霉
二醇脱水酶肌‑肌醇单酮‑2‑脱水酶(EC4.2.1.44)是另一种示例性的候选物。肌‑肌醇单酮是含有相邻醇基的6‑元环。已经在肌‑肌醇降解的背景下在克雷伯产气杆菌中研究了编码肌‑肌醇单酮‑2‑脱水酶功能的纯化酶(Berman和Magasanik,J.Biol.Chem.241:800‑806(1966))，但是迄今为止尚未与基因相关联。在大肠杆菌中克隆并功能性地表达了费氏中华根瘤菌的肌‑肌醇单酮‑2‑脱水酶(Yoshida等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.70:2957‑2964(2006))。还已经研究了得自枯草芽孢杆菌的类似酶，其由iolE 编码(Yoshida等人,Microbiology150:571‑580(2004))。
基因GenBank登记号GI号生物iolEP42416.11176989枯草芽孢杆菌iolEAAX24114.160549621费氏中华根瘤菌
实施例IV
由莽草酸途径酶从(2‑羟基‑3‑甲基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐合成对甲苯甲酸的示例性途径
本实施例描述了使用莽草酸途径酶合成对甲苯甲酸的示例性途径。
对甲苯甲酸的化学结构非常类似于对羟基苯甲酸，后者是电子载体泛醌的前体。在细菌、植物和真菌中发现的莽草酸途径的酶，会从中枢代谢前体合成4‑羟基苯甲酸。所述莽草酸途径包括7个酶促步骤，所述步骤将D‑赤藓糖‑4‑磷酸(E4P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化成分支酸。途径酶包括：2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸(DAHP)合酶、脱氢奎尼酸(DHQ)合酶、DHQ脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、5‑烯醇丙酮酰基莽草酸‑3‑磷酸(EPSP)合酶和分支酸合酶。在该途径的第一步中，DAHP合酶连接赤藓糖‑4‑磷酸和磷酸烯醇丙酮酸，形成3‑脱氧‑D‑阿拉伯‑庚酮糖酸‑7‑磷酸。该化合物然后去磷酸化，脱水，并还原，形成莽草酸。莽草酸通过三种酶的作用转化成分支酸：莽草酸激酶、3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶和分支酸合酶。随后的分支酸至4‑羟基苯甲酸的转化是由分支酸裂合酶催化。
对甲苯甲酸的合成以类似的方式进行，如图6所示。该途径起源于PEP和2H3M4OP，后者是与E4P类似的化合物，用甲基替代E4P的3‑羟基。E4P的羟基不直接参与莽草酸途径反应的化学过程，所以预期甲基‑取代的2H3M4OP前体会作为替代底物进行反应。定向进化或适应进化可以用于改善2H3M4OP和下游衍生物作为底物的优先选择。这样的方法是本领域熟知的。
用于提高通过莽草酸途径酶的通量效率的菌株工程改造策略也适用于这里。通过改变葡萄糖运输系统，可以增加该途径前体PEP的可用性(Yi等人,Biotechnol.Prog.19:1450‑1459(2003))。借助于过量表达3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合酶的反馈不敏感的同工酶，工程改造过量生产4‑羟基苯甲酸的菌株，以提高通过莽草酸途径的通量(Barker和Frost,Biotechnol.Bioeng.76:376‑390(2001))。另外，增强了莽草酸途径酶和分支酸裂合酶的表达水平。类似的策略可以用于过量生产对甲苯甲酸的菌株中。
A.2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸合酶(EC2.5.1.54)。赤藓糖‑4‑磷酸和磷酸烯醇丙酮酸的缩合，是由2‑脱氢‑3‑脱氧磷酸庚糖酸(DAHP)合酶(EC2.5.1.54)催化。该酶的3种同工酶由大肠杆菌基因组中的aroG、aroF和aroH编码，并分别受到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的反馈抑制。在培养于基本培养基上的野生型细胞中，aroG、aroF和aroH基因产物分别促成80%、20%和1%的DAHP合酶活性(Hudson和Davidson,J.Mol.Biol.180:1023‑1051(1984))。发现AroG的2个残基会减轻苯丙氨酸的抑制(Kikuchi等人,Appl.Environ.Microbiol.63:761‑762(1997))。通过单个碱基对变化，除去了酪氨酸对AroF的反馈抑制(Weaver和Herrmann,J.Bacteriol.172:6581‑6584(1990))。在过量生产4‑羟基苯甲酸的大肠杆菌菌株中过量表达了酪氨酸不敏感的DAHP合酶(Barker和Frost,Biotechnol.Bioeng.76:376‑390(2001))。经证实，aroG基因产物会接受多种替代性的4‑和5‑碳长度底物(Sheflyan等人,J.Am.Chem.Soc.120(43):11027‑11032(1998);Williamson等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.15:2339‑2342(2005))。该酶可有效地与(3S)‑2‑脱氧赤藓糖‑4‑磷酸反应，该底物类似于赤藓糖‑4‑磷酸，但是缺少在2‑位处的醇(Williamson等人,出处同上2005)。得自幽门螺杆菌和强烈火球菌的酶也接受该替代底物(Schofield等人,Biochemistry44:11950‑11962(2005));Webby等人,Biochem.J.390:223‑2302005))，且已经在大肠杆菌中表达。经证实，DAHP合酶的一种进化变体（与野生型大肠杆菌AroG酶相差7个氨基酸）表现出Kcat/KM的60倍提高(Ran和Frost,J.Am.Chem.Soc.129:6130‑6139(2007))。
基因GenBank登记号GI号生物aroGAAC73841.11786969大肠杆菌aroFAAC75650.11788953大肠杆菌aroHAAC74774.11787996大肠杆菌aroFQ9ZMU581555637幽门螺杆菌PF1690NP_579419.118978062强烈火球菌
B.3‑脱氢奎尼酸合酶(EC4.2.3.4)。图2所示的底物(2)(2,4‑二羟基‑5‑甲基‑6‑[(膦酰氧基)甲基]氧杂环己烷‑2‑甲酸)去磷酸化为底物(3)(1,3‑二羟基‑4‑甲基环己‑1‑酮‑1‑甲酸)，类似于3‑脱氢奎尼酸合酶对3‑脱氧‑阿拉伯‑庚酮糖酸‑7‑磷酸的去磷酸化。已经在大肠杆菌(Mehdi等人,Methods Enzymol.142:306‑314(1987)、枯草芽孢杆菌(Hasan和Nester,J.Biol.Chem.253:4999‑5004(1978))和结核分枝杆菌H37Rv(deMendonca等人,J.Bacteriol.189:6246‑6252(2007))中表征了该酶。该大肠杆菌酶受到L‑酪氨酸的抑制(Barker和Frost,Biotechnol.Bioeng.76:376‑3902001))。
基因GenBank登记号GI号生物aroBAAC76414.11789791大肠杆菌aroBNP_390151.116079327枯草芽孢杆菌aroBCAB06200.11781064结核分枝杆菌
C.3‑脱氢奎尼酸脱水酶(EC4.2.1.10)。3‑脱氢奎尼酸脱水酶，也称作3‑脱氢奎尼酸酶(DHQase)，天然地催化3‑脱氢奎尼酸脱水为3‑脱氢莽草酸，这类似于图2的对甲苯甲酸途径中的步骤C。基于机制、立体化学和序列同源性，可以将DHQase酶分成2类(Gourley等人,Nat.Struct.Biol.6:521‑525.(1999))。一般而言，1型酶参与生物合成，而2型酶在反向(降解)方向工作。已经克隆和表征了得自大肠杆菌(Kinghorn等人,Gene14:73‑80.1981))、伤寒沙门菌(Kinghorn等人,出处同上1981;Servos等人,J.Gen.Microbiol.137:147‑152(1991))和枯草芽孢杆菌(Warburg等人,Gene32:57‑661984))的1型酶。示例性的II型3‑脱氢奎尼酸脱水酶存在于结核分枝杆菌、天蓝色链霉菌(Evans等人,FEBS Lett.530:24‑30(2002))和幽门螺杆菌(Lee等人,Proteins51:616‑7(2003))中。
基因GenBank登记号GI号生物aroDAAC74763.11787984大肠杆菌aroDP24670.217433709伤寒沙门菌aroCNP_390189.116079365枯草芽孢杆菌aroDP0A4Z6.261219243结核分枝杆菌aroQP15474.38039781天蓝色链霉菌aroQQ48255.22492957幽门螺杆菌
D.莽草酸脱氢酶(EC1.1.1.25)。莽草酸脱氢酶催化3‑脱氢莽草酸至莽草酸的NAD(P)H依赖性的还原，类似于图2的步骤D。大肠杆菌基因组编码2种具有不同辅因子特异性的莽草酸脱氢酶旁系同源物。由aroE编码的该酶是NADPH特异性的，而ydiB基因产物是可以利用NADH(优选的)或NADPH作为辅因子的奎尼酸/莽草酸脱氢酶(Michel等人,J.Biol.Chem.278:19463‑19472(2003))。在大肠杆菌中功能性地表达了得自结核分枝杆菌(Zhang等人,J.Biochem.Mol.Biol.38:624‑631(2005))、流感嗜血杆菌(Ye等人,J.Bacteriol.185:4144‑4151(2003))和幽门螺杆菌(Han等人,FEBS J.273:4682‑4692(2006))的NADPH依赖性的酶。
基因GenBank登记号GI号生物aroEAAC76306.11789675大肠杆菌ydiBAAC74762.11787983大肠杆菌aroENP_217068.115609689结核分枝杆菌aroEP43876.11168510流感嗜血杆菌aroEAAW 22052.156684731幽门螺杆菌
E.莽草酸激酶(EC2.7.1.71)。莽草酸激酶催化莽草酸的3‑羟基的ATP依赖性的磷酸化，类似于图2的步骤E。2种莽草酸激酶是由在大肠杆菌中的aroK(SK1)和aroL(SK2)编码(DeFeyter和Pittard,J.Bacteriol.165:331‑333(1986);Lobner‑Olesen和Marinus,J. Bacteriol.174:525‑529(1992))。由aroL编码的SK2的Km比SK1的Km低100倍，这指示，该酶负责芳族生物合成(DeFeyter等人,出处同上1986)。已经在大肠杆菌中克隆了得自结核分枝杆菌(Gu等人,J.Mol.Biol.319:779‑789(2002));Oliveira等人,Proteins Expr.Purif.22:430‑435(2001)(doi:10.1006/prep.2001.1457,doi;S1046‑5928(01)91457‑3,pii)、幽门螺杆菌(Cheng等人,J.Bacteriol.187:8156‑8163(2005))和菊欧文氏菌(Krell等人,Proteins Sci.10:1137‑1149(2001))的其它莽草酸激酶。
基因GenBank登记号GI号生物aroKYP_026215.290111581大肠杆菌aroLNP_414922.116128373大肠杆菌aroKCAB06199.11781063结核分枝杆菌aroKNP_206956.115644786幽门螺杆菌SKCAA32883.142966菊欧文氏菌
F.3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶(EC2.5.1.19)。3‑磷酸莽草酸‑2‑羧乙烯基转移酶，也称作5‑烯醇丙酮酰基莽草酸‑3‑磷酸合酶(EPSPS)，催化磷酸烯醇丙酮酸的烯醇丙酮酰基部分向莽草酸‑3‑磷酸的5‑羟基的转移。该酶是由大肠杆菌中的aroA编码(Anderson等人,Biochemistry27:1604‑1610(1988))。已经在大肠杆菌中克隆并功能性地表达了得自结核分枝杆菌(Oliveira等人,Proteins Expr.Purif.22:430‑435(2001))、杜氏盐藻(Yi等人,J.Microbiol.45:153‑157(2007))和金黄色葡萄球菌(Priestman等人,FEBSLett.579:728‑732(2005))的EPSPS酶。
基因GenBank登记号GI号生物aroAAAC73994.11787137大肠杆菌aroAAAA25356.1149928结核分枝杆菌aroAAAA71897.1152956金黄色葡萄球菌aroAABM68632.1122937807杜氏盐藻
G.分支酸合酶(EC4.2.3.5)。分支酸合酶是莽草酸途径中的第7种酶，其催化5‑烯醇丙酮酰基莽草酸‑3‑磷酸转化为分支酸。该酶需要还原型黄素单核苷酸(FMN)作为辅因子，尽管该酶的净反应不包括氧化还原变化。与在植物和细菌中发现的该酶不同，在真菌中的分支酸合酶也能够以NADPH为代价还原FMN(Macheroux等人,Planta207:325‑334(1999))。代表性的单功能酶是由大肠杆菌(White等人,Biochem.J.251:313‑322(1988))和肺炎链球菌(Maclean和Ali,Structure11:1499‑1511(2003)(doi:S0969212603002648,pii)的aroC编码。双功能的真菌酶存在于粗糙链孢霉(Kitzing等人,J.Biol.Chem.276:42658‑42666(2001))和酿酒酵母(Jones等人,Mol.Microbiol.5:2143‑2152(1991))中。
基因GenBank登记号GI号生物aroCNP_416832.116130264大肠杆菌aroCACH47980.1197205483肺炎链球菌U25818.1:19..1317AAC49056.1976375粗糙链孢霉ARO2CAA42745.13387酿酒酵母
H.分支酸裂合酶(EC4.1.3.40)。分支酸裂合酶催化泛醌生物合成中的第一个关键步骤：从分支酸除去丙酮酸，以形成4‑羟基苯甲酸。该酶反应的速度受到4‑羟基苯甲酸产物的缓慢释放的限制(Gallagher等人,Proteins 44:304‑311(2001))，所述产物被认为在4‑羟基苯甲酸向下游膜结合的酶的递送中起作用。克隆和表征了大肠杆菌的分支酸裂合酶，且已经将该酶结晶(Gallagher等人,出处同上2001;Siebert等人,FEBSLett.307:347‑350(1992))。结构研究暗示，G90残基会促成产物抑制(Smith等人,Arch.Biochem.Biophys.445:72‑80(2006))。2个表面活性的半胱氨酸残基的修饰会减少蛋白聚集(Holden等人,Biochim.Biophys.Acta1594:160‑167(2002))。在大肠杆菌中克隆和表征了重组形式的结核分枝杆菌分支酸裂合酶(Stadthagen等人,J. Biol.Chem.280:40699‑407062005))。
基因GenBank登记号GI号生物ubiCAAC77009.287082361大肠杆菌Rv2949cNP_217465.115610086结核分枝杆菌
B‑F.多功能的AROM蛋白。在大多数细菌中，莽草酸途径的酶由分开的多肽编码。在微生物真核生物中，5种酶功能由多功能蛋白催化，所述多功能蛋白由五功能的超基因编码(Campbell等人,Int.J.Parasitol.34:5‑13(2004))。多功能的AROM蛋白复合物会催化与图2的反应B‑F类似的反应。已经在真菌中表征了AROM蛋白复合物，所述真菌包括构巢曲霉、粗糙链孢霉、酿酒酵母和卡氏肺孢菌(Banerji等人,J.Gen.Microbiol.139:2901‑2914(1993);Charles等人,Nucleic Acids Res.14:2201‑2213(1986);Coggins等人,Methods Enzymol.142:325‑341(1987);Duncan,K.,Biochem.J.246:375‑386(1987))。已经证实，AROM的几种组分作为单个多肽独立地起作用。例如，脱氢奎尼酸合酶(DHQS)会形成AROM的氨基‑端结构域，且当克隆进大肠杆菌中时，可以独立地起作用(Moore等人,Biochem.J.301(Pt1):297‑304(1994))。得自构巢曲霉的AROM组分的几种晶体结构，会提供对催化机制的洞察(Carpenter等人,Nature394:299‑302(1998))。
基因GenBank登记号GI号生物AROMP07547.3238054389构巢曲霉AROMP08566.1114166酿酒酵母AROMP07547.3238054389构巢曲霉AROMQ12659.12492977卡氏肺孢菌
实施例V
对甲苯甲酸至对苯二甲酸的酶促转化的示例性途径
本实施例描述了对甲苯甲酸至对苯二甲酸(PTA)的转化的示例性途径。
通过在图3所示的3个酶促步骤中将甲基氧化为酸，可以使对甲苯甲酸进一步转化成PTA。该途径包括对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶还原酶、4‑羧基苯甲醇脱氢酶和4‑羧基苄基醛脱氢酶。在第一步中，在有O2存在下，对甲苯甲酸甲基‑单加氧酶将对甲苯甲酸氧化成4‑羧基苯甲醇。已经纯化和表征了睾丸酮丛毛平胞菌酶(tsaBM)，该酶也与4‑甲苯磺酸盐底物反应(Locher等人,J.Bacteriol.173:3741‑3748(1991))。4‑羧基苯甲醇脱氢酶(tsaC)随后将4‑羧基苯甲醇转化成醛。醛至酸转化是由4‑羧基苯甲醛脱氢酶(tsaD)催化。催化这些反应的酶存在于睾丸酮丛毛平胞菌T‑2中，该生物能够利用对甲苯甲酸作为唯一碳源和能源(Junker等人,J.Bacteriol.179:919‑927(1997))。通过序列同源性，具体地通过与伯霍尔德杆菌属、产碱菌属、假单胞菌属、假平胞菌属和丛毛平胞菌属中的变形杆菌的序列同源性，可以发现将对甲苯甲酸转化成PTA的其它基因(美国专利号6,187,569和美国公开2003/0170836)。下面列出了与睾丸酮丛毛平胞菌酶有关的Genbank标识符。
基因GenBank登记号GI号生物tsaBAAC44805.11790868睾丸酮丛毛平胞菌tsaMAAC44804.11790867睾丸酮丛毛平胞菌tsaCAAC44807.11790870睾丸酮丛毛平胞菌tsaDAAC44808.11790871睾丸酮丛毛平胞菌
实施例VI
从2H4OP合成苯甲酸
本实施例显示了通过莽草酸途径酶从2H4OP合成苯甲酸(图9)和用于生产苯甲酸途径前体2H4OP的示例性途径(图8)。
象对甲苯甲酸一样，苯甲酸的化学结构类似于对羟基苯甲酸，后者是上面在实施例IV中描述的莽草酸途径的产物。在该实施例中，使用莽草酸途径酶，通过图9所示的途径，从途径前体(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H4OP)合成苯甲酸。任选地通过定向进化或适应进化来优化莽草酸途径酶对在苯甲酸形成中使用的2H4OP和替代底物的反应性，从而提高2H4OP和下游衍生物作为底物的优先选择。这样的方法是本领域熟知的，且描述在本文中。
用于合成苯甲酸途径前体(2‑羟基‑4‑氧代丁氧基)膦酸盐(2H4OP)的一个示例性的且新颖的途径显示在图8中。在该途径中，在2个酶促步骤中，从中枢代谢物赤藓糖‑4‑磷酸衍生出2H4OP。在第一步中，二醇脱水酶将赤藓糖‑4‑磷酸转化成(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸盐(24DBP)。随后，具有24DBP还原酶活性的氧化还原酶将24DBP的2‑酮基团还原为2H4OP的醇。下面呈现了图8的步骤A和B的示例性酶。
A.赤藓糖‑4‑磷酸脱水酶：使用在EC类别4.2.1中的二醇脱水酶，将赤藓糖‑4‑磷酸转化成24DBP(图4、步骤A)。尽管尚未指示催化该转化的酶，几种酶会催化类似的转化，包括二羟酸脱水酶(EC4.2.1.9)、丙二醇脱水酶(EC4.2.1.28)、甘油脱水酶(EC4.2.1.30)和肌‑肌醇单酮(myo‑inositose)脱水酶(EC4.2.1.44)。在上面在实施例III中描述了示例性的二醇脱水酶。
能够将次要的二醇2,3‑丁二醇转化成2‑丁酮的二醇脱水酶或丙二醇脱水酶(EC4.2.1.28)可以用于该转化。腺苷基钴胺素‑或B12依赖性的二醇脱水酶含有α、β和γ亚基，它们都为酶功能所需。示例性的基因存在于肺炎克雷伯菌(Tobimatsu等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.62:1774‑1777(1998);Toraya等人,.Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475‑480(1976))、鼠伤寒沙门菌(Bobik等人,J. Bacteriol.179:6633‑6639(1997))、产酸克雷伯菌(Tobimatsu等人,J.Biol.Chem.270:7142‑7148(1995))和丘状菌落乳杆菌(Sauvageot等人,FEMS Microbiol.Lett.209:69‑74(2002))中。用于分离在其它生物中的二醇脱水酶基因的方法是本领域熟知的，如在美国专利号5,686,276中所示，该专利通过引用整体并入本文。
基因GenBank登记号GI号生物pddABAA08099.1868006产酸克雷伯菌pddBBAA08100.1868007产酸克雷伯菌pddCBAA08101.1868008产酸克雷伯菌pduCAAB84102.12587029鼠伤寒沙门菌pduDAAB84103.12587030鼠伤寒沙门菌pduEAAB84104.12587031鼠伤寒沙门菌pduCCAC82541.118857678丘状菌落乳杆菌
pduDCAC82542.118857679丘状菌落乳杆菌pduECAD01091.118857680丘状菌落乳杆菌pddAAAC98384.14063702肺炎克雷伯菌pddBAAC98385.14063703肺炎克雷伯菌pddCAAC98386.14063704肺炎克雷伯菌
甘油脱水酶家族中的酶(EC4.2.1.30)还可以用于脱水赤藓糖‑4‑磷酸。示例性的基因包括：在肺炎克雷伯菌中的gldABC和dhaB123(WO2008/137403)和(Toraya等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.69:475‑480(1976))，在巴斯德梭菌中的dhaBCE(Macis等人,FEMSMicrobiol Lett.164:21‑28(1998))和在弗氏柠檬酸杆菌中的dhaBCE(Seyfried等人,J.Bacteriol.178:5793‑5796(1996))。通过在β亚基的2个残基中引入突变，最近工程改造了得自肺炎克雷伯氏菌的B12依赖性的二醇脱水酶变体，其具有增强了80‑336倍的活性(Qi等人,J.Biotechnol.144:43‑50(2009))。DuPont使用易出错的PCR，开发出了具有降低的失活动力学的二醇脱水酶(WO2004/056963)。
基因GenBank登记号GI号生物gldAAAB96343.11778022肺炎克雷伯菌gldBAAB96344.11778023肺炎克雷伯菌gldCAAB96345.11778024肺炎克雷伯菌dhaB1ABR78884.1150956854肺炎克雷伯菌dhaB2ABR78883.1150956853肺炎克雷伯菌dhaB3ABR78882.1150956852肺炎克雷伯菌dhaBAAC27922.13360389巴斯德梭菌dhaCAAC27923.13360390巴斯德梭菌dhaEAAC27924.13360391巴斯德梭菌dhaBP45514.11169287弗氏柠檬酸杆菌dhaCAAB48851.11229154弗氏柠檬酸杆菌dhaEAAB48852.11229155弗氏柠檬酸杆菌
如果使用B12依赖性的二醇脱水酶，异源地表达对应的再活化因子是有用的。B12依赖性的二醇脱水酶是底物和一些下游产物的基于机制的自杀活化的对象。由无活性的钴胺素的紧密相连造成的灭活，可以在ATP依赖性的过程中被二醇脱水酶再活化因子克服。B12辅因子的再生是ATP依赖性的。二醇脱水酶再生因子是双亚基蛋白。示例性的基因存在于产酸克雷伯菌(Mori等人,J. Biol. Chem.272:32034‑32041(1997))、鼠伤寒沙门菌(Bobik等人,J. Bacteriol.179:6633‑6639(1997);Chen等人,J.Bacteriol.176:5474‑5482(1994))、丘状菌落乳杆菌(Sauvageot等人,FEMS Microbiol.Lett.209:69‑74(2002)),和肺炎克雷伯菌(WO2008/137403)中。
基因GenBank登记号GI号生物ddrAAAC15871.13115376产酸克雷伯菌ddrBAAC15872.13115377产酸克雷伯菌pduGAAL20947.116420573鼠伤寒沙门菌pduHAAL20948.116420574鼠伤寒沙门菌pduGYP_002236779206579698肺炎克雷伯菌pduHYP_002236778206579863肺炎克雷伯菌pduGCAD0109229335724丘状菌落乳杆菌pduHCAD0109329335725丘状菌落乳杆菌
不依赖于B12的二醇脱水酶使用S‑腺苷基甲硫氨酸(SAM)作为辅因子，在严格厌氧条件下起作用，并需要特定活化酶的活化(Frey等人,Chem.Rev.103:2129‑2148(2003))。已经确定地表征了酪酸梭菌的甘油脱氢酶和对应的活化因子（由dhaB1和dhaB2编码）(O'Brien等人,Biochemistry43:4635‑4645(2004);Raynaud等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA 100:5010‑5015(2003))。该酶最近被用于过量生产1,3‑丙二醇的大肠杆菌菌株中，且能够实现非常高的产物滴度(Tang等人,Appl.Environ.Microbiol.75:1628‑1634(2009))。得自Roseburia inulinivorans的其它的不依赖于B12的二醇脱水酶和活化因子，经证实会催化2,3‑丁二醇至2‑丁酮的转化(美国公开2009/09155870)。
基因GenBank登记号GI号生物dhaB1AAM54728.127461255酪酸梭菌dhaB2AAM54729.127461256酪酸梭菌rdhtAABC25539.183596382Roseburia inulinivoransrdhtBABC25540.183596383Roseburia inulinivorans
二羟酸脱水酶(DHAD,EC4.2.1.9)是一种参与支链氨基酸生物合成的不依赖于B12的酶。在它的天然作用中，它会将2,3‑二羟基‑3‑甲基戊酸转化成2‑酮‑3‑甲基‑戊酸，后者是异亮氨酸的前体。在缬氨酸生物合成中，该酶催化2,3‑二羟基‑异戊酸脱水为2‑氧代异戊酸。得自硫矿硫化叶菌的DHAD具有宽底物范围，并且在大肠杆菌中表达的重组酶表现出对多种糖醛酸的活性(Kim和Lee,J.Biochem.139:591‑596(2006))。所述硫矿硫化叶菌酶是氧耐受性的，这不同于许多二醇脱水酶。所述大肠杆菌酶（由ilvD编码）是对氧敏感的，其会灭活它的铁‑硫簇(Flint等人,J.Biol.Chem.268:14732‑14742(1993))。已经在粗糙链孢霉(Altmiller和Wagner,Arch.Biochem.Biophys.138:160‑170(1970))和鼠伤寒沙门菌(Armstrong等人,Biochim.Biophys.Acta498:282‑293(1977))中表征了类似酶。
基因GenBank登记号GI号生物ilvDNP_344419.115899814硫矿硫化叶菌ilvDAAT48208.148994964大肠杆菌ilvDNP_462795.116767180鼠伤寒沙门菌ilvDXP_958280.185090149粗糙链孢霉
二醇脱水酶肌‑肌醇单酮‑2‑脱水酶(EC4.2.1.44)是另一种示例性的候选物。肌‑肌醇单酮是含有相邻醇基的6‑元环。已经在肌‑肌醇降解的背景下在克雷伯产气杆菌中研究了编码肌‑肌醇单酮‑2‑脱水酶功能的纯化酶(Berman和Magasanik,J.Biol.Chem.241:800‑806(1966))，但是迄今为止尚未与基因相关联。在大肠杆菌中克隆并功能性地表达了费氏中华根瘤菌的肌‑肌醇单酮‑2‑脱水酶(Yoshida等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.70:2957‑2964(2006))。还已经研究了得自枯草芽孢杆菌的类似酶，其由iolE编码(Yoshida等人,Microbiology150:571‑580(2004))。
基因GenBank登记号GI号生物iolEP42416.11176989枯草芽孢杆菌iolEAAX24114.160549621费氏中华根瘤菌
B.(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶：使用具有(2,4‑二氧代丁氧基)膦酸还原酶活性的酶，将24DBP转化成2H4OP。尽管该化合物不是醇脱氢酶的已知底物，在EC类别1.1.1中的几种酶会催化类似的反应。可以还原磷酸化的底物的酮的示例性酶包括：甘油‑3‑磷酸脱氢酶(EC1.1.1.8)、3‑磷酸甘油酸脱氢酶(EC1.1.1.95)和赤酮酸‑4‑磷酸脱氢酶(EC1.1.1.290)。甘油‑3‑磷酸脱氢酶催化二羟基丙酮‑磷酸至甘油‑3‑磷酸的NAD(P)H依赖性的还原。该酶是由大肠杆菌的gpsA编码(Kito等人,JBiol.Chem.244:3316‑3323(1969))。3‑磷酸甘油酸脱氢酶在几种生物中催化丝氨酸生物合成的第一步，所述生物包括大肠杆菌，其中它是由基因serA编码(Tobey等人,JBiol.Chem.261:12179‑12183(1986))。赤酮酸‑4‑磷酸脱氢酶(EC1.1.1.290)催化2‑氧代‑3‑羟基‑4‑磷酸丁酸向赤酮酸‑4‑磷酸的可逆还原。在吡哆醛5’‑磷酸生物合成的背景下，该酶（由大肠杆菌的pdxB编码）通常在反向工作(Schoenlein等人,JBacteriol.171:6084‑6092(1989))。已经在大肠杆菌中表征了并异源地表达了由铜绿假单孢菌中的pdxB编码的类似酶(Ha等人,Acta Crystallogr.Sect.F.Struct.Biol.Cryst.Commun.62:139‑141(2006))。
基因GenBank登记号GI号生物gpsAAAC76632.11790037大肠杆菌serAAAC75950.11789279大肠杆菌pdxBAAC75380.11788660大肠杆菌pdxBAAG04764.19947319铜绿假单孢菌
多种醇脱氢酶催化酮还原为醇官能团。得自大肠杆菌的2种这样的酶是由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。已经证实，得自富养产碱菌的乳酸脱氢酶会表现出对不同链长度的2‑酮酸的高活性，所述2‑酮酸包括乳酸、2‑氧代丁酸、2‑氧代戊酸和2‑氧代戊二酸(Steinbuchel等人,Eur.J.Biochem.130:329‑334(1983))。α‑酮己二酸向α‑羟基己二酸的转化，可以由2‑酮己二酸还原酶催化，据报道，该酶存在于大鼠和人胎盘中(Suda等人,Arch.Biochem.Biophys.176:610‑620(1976);Suda等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586‑591(1977))。其它的氧化还原酶是得自人心脏的线粒体3‑羟基丁酸脱氢酶(bdh)，其已经被克隆和表征(Marks等人,J.Biol.Chem.267:15459‑15463(1992))。拜氏梭菌(Ismaiel等人,J.Bacteriol.175:5097‑5105(1993))和布氏热厌氧杆菌(Lamed等人,Biochem.J.195:183‑190(1981);Peretz等人,Biochemistry.28:6549‑6555(1989))的醇脱氢酶会将丙酮转化成异丙醇。甲基乙基甲酮还原酶，或可替换地，2‑丁醇脱氢酶，会催化MEK的还原，以形成2‑丁醇。在赤红球菌(Kosjek等人,Biotechnol Bioeng.86:55‑62(2004))和强烈火球菌(van der等人,Eur.J.Biochem.268:3062‑3068(2001))中可以发现示例性酶。
基因GenBank登记号GI号生物mdhAAC76268.11789632大肠杆菌ldhANP_415898.116129341大肠杆菌ldhYP_725182.1113866693富养产碱菌bdhAAA58352.1177198智人adhAAA23199.260592974拜氏梭菌NRRL B593
adhP14941.1113443布氏热厌氧杆菌HTD4adhAAAC255563288810强烈火球菌sadhCAD3647521615553赤红球菌
许多生物可以催化4‑羟基‑2‑丁酮还原为1,3‑丁二醇，包括属于芽孢杆菌属、短颈细菌属、假丝酵母属和克雷伯菌属以及其它属的那些，如Matsuyama等人((1995))所述。还已经证实，突变的红球菌属苯乙醛还原酶(Sar268)和Leifonia醇脱氢酶会在高收率催化该转化(Itoh等人,Appl.MicrobiolBiotechnol.75:1249‑1256(2007))。
高丝氨酸脱氢酶(EC1.1.1.13)催化天冬氨酸半醛向高丝氨酸的NAD(P)H依赖性的还原。在许多生物（包括大肠杆菌）中，高丝氨酸脱氢酶是一种双功能酶，其也催化天冬氨酸向天冬氨酰基‑4‑磷酸的ATP依赖性的转化(Starnes等人,Biochemistry11:677‑687(1972))。功能结构域没有催化依赖性，并通过接头区相连(Sibilli等人,JBiol.Chem.256:10228‑10230(1981))，且两个结构域受到苏氨酸的变构抑制。从天冬氨酸激酶结构域中分离出了由thrA编码的大肠杆菌酶的高丝氨酸脱氢酶结构域，进行了表征，并发现其会表现出高催化活性和减少的苏氨酸抑制(James等人,Biochemistry41:3720‑3725(2002))。这可以应用于其它双功能的苏氨酸激酶，包括、例如，植物乳杆菌(Cahyanto等人,Microbiology152:105‑112(2006))和拟南芥的hom1。已经在大肠杆菌中功能性地表达和表征了由酿酒酵母中的hom6(Jacques等人,Biochim.Biophys.Acta1544:28‑41(2001))和植物乳杆菌中的hom2(Cahyanto等人,Microbiology152:105‑112(2006))编码的单功能的高丝氨酸脱氢酶。
基因GenBank登记号GI号生物thrAAAC73113.11786183大肠杆菌K12akthr2O8185275100442拟南芥hom6CAA896711015880酿酒酵母hom1CAD6481928271914植物乳杆菌hom2CAD6318628270285植物乳杆菌
实施例VII
通向苯和甲苯的途径
本实施例显示了从苯甲酸和苯甲酰辅酶A至苯的途径、以及从对甲苯甲酸和对甲基苯甲酰辅酶A至甲苯的途径。
在图10中显示了从苯甲酸或苯甲酰辅酶A酶促地生产苯的途径。苯甲酸和苯甲酰辅酶A是不同芳族化合物降解途径共有的天然存在的代谢中间体。苯甲酸还可以通过本文所述的替代莽草酸途径生成。在图10中显示了从苯甲酸和/或苯甲酰辅酶A至苯的几种途径。首先，通过脱羧，可以从苯甲酸直接生成苯(图10、途径E)。可替换地，可以如下将所述酸部分还原为醛：通过苯甲酸还原酶的直接地(图10、途径B)，或通过苯甲酰辅酶A和/或(苯甲酰氧基)膦酸盐中间体间接地(图10、途径A和D、途径B、途径H和G或途径A、F和G)。随后可以将苯甲醛脱羰，以形成苯(图10、途径C)。
在图11中显示了从对甲苯甲酸和/或对甲基苯甲酰辅酶A酶促地生产甲苯的类似途径。对甲苯甲酸可以通过本文所述的替代莽草酸途径生成。用于将对甲苯甲酸(也称作对甲基苯甲酸)和/或对甲基苯甲酰辅酶A转化成甲苯的途径，类似于上述的苯甲酸或苯甲酰辅酶A至苯的转化。通过EC编号，将用于催化图10和11所示的转化的酶分类，并进一步描述在下面。
标号功能图‑途径1.2.1.b氧化还原酶(酰基辅酶A至醛)6/7‑D1.2.1.d氧化还原酶(磷酸化/去磷酸化)6/7‑G1.2.1.e氧化还原酶(酸至醛)6/7‑B2.3.1.a酰基转移酶(将磷酸盐基团转移给CoA；磷酸转乙酰酶)6/7‑F2.7.2.a磷酸转移酶，羧基受体(激酶)6/7‑H2.8.3.a辅酶A转移酶6/7‑A3.1.2.a硫羟酸酯水解酶(CoA特异性的)6/7‑A4.1.1.a羧基‑裂合酶6/7‑E4.1.99.a脱羰酶6/7‑C6.2.1.a酸‑硫醇连接酶6/7‑A
1.2.1.b氧化还原酶(酰基辅酶A至醛)：使用具有苯甲酰辅酶A还原酶活性的酶，将苯甲酰辅酶A转化成苯甲醛(图10的途径D)。类似地，对甲基苯甲酰辅酶A至对甲基苯甲醛(也称作对甲苯甲醛)的还原，是由具有对甲基苯甲酰辅酶A还原酶活性的酶催化(图11的途径D)。尽管尚未表征具有这些活性的酶，催化类似反应的酶是肉桂酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.44)。该酶催化肉桂酰辅酶A和取代的芳族衍生物（诸如香豆酰基辅酶A和阿魏酰基辅酶A）的NAD(P)H依赖性的还原。已经在生物中表征了该酶，所述生物包括拟南芥(Lauvergeat等人,Phytochemistry57:1187‑1195(2001))、小麦(Ma,J Exp.Bot.58:2011‑2021(2007))和柳枝稷(Escamilla‑Trevino等人,New Phytol.185:143‑155(2010))。表征了得自拟南芥和柳枝稷的酶，并在大肠杆菌中异源地表达。
基因GenBank登记号GI号生物TACCR1ABE01883.190902167小麦AtCCR1AAU45042.152355804拟南芥AtCCR2AAG53687.112407990拟南芥PvCCR1ACZ74580.1270315096柳枝稷PvCCR2ACZ74585.1270315106柳枝稷
几种其它的确定地表征的酰基‑CoA还原酶会将酰基‑CoA还原为它的对应醛。示例性的酶包括：脂肪酰酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)、琥珀酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.76)、乙酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.10)和丁酰辅酶A还原酶。示例性的脂肪酰基‑CoA还原酶是由醋酸钙不动杆菌(Reiser等人,179:2969‑2975(1997))和不动杆菌属M‑1(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192‑1195(2002))的acr1编码。具有琥珀酰辅酶A还原酶活性的酶是由克鲁氏梭状芽孢杆菌的sucD(Sohling等人,J Bacteriol.178:871‑880(1996a);Sohling等人,178:871‑80(1996))和龈紫单胞菌的sucD(Takahashi等人,J.Bacteriol.182:4704‑4710(2000))编码。其它琥珀酰辅酶A还原酶参与嗜热古细菌的3‑羟基丙酸/4‑羟基丁酸循环，所述嗜热古细菌诸如勤奋生金球菌(Berg等人,Science.318:1782‑1786(2007))和嗜中性热变形菌(Ramos‑Vera等人,JBacteriol.191:4286‑4297(2009))。由Msed_0709编码的勤奋生金球菌CoA还原酶是NADPH依赖性的，并且具有丙二酰辅酶A还原酶活性。所述嗜中性热变形菌酶在具有NADPH和NADH时是有活性的。已经证实，假单胞菌属中的酰化乙醛脱氢酶（由bphG编码）会将乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化和酰化成它们的对应的CoA‑酯(Powlowski等人,175:377‑385(1993))。除了将乙酰辅酶A还原为乙醇以外，已经证实，肠膜明串珠菌中由adhE编码的酶会将支链化合物异丁醛氧化成异丁酰辅酶A(Koo等人,Biotechnol Lett.27:505‑510(2005))。在产溶剂性生物诸如Clostridium saccharoperbutylacetonicum中，丁醛脱氢酶催化类似的反应，将丁酰辅酶A转化为丁醛(Kosaka等人,Biosci.BiotechnolBiochem.71:58‑68(2007))。已经证实，在拜氏梭菌中由ald编码的酰基‑CoA还原酶会将乙酰辅酶A和丁酰辅酶A还原为它们的对应醛(Toth等人,ApplEnviron.Microbiol65:4973‑4980(1999))。该酶表现出与由eutE编码的鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌的CoA依赖性的乙醛脱氢酶的高序列同源性(Toth等人,Appl Environ.Microbiol65:4973‑4980(1999))。

其它的CoA还原酶是丙二酰辅酶A还原酶，其将丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛。丙二酰辅酶A还原酶是在嗜热嗜酸古细菌中通过3‑羟基丙酸循环进行自养碳固定的一种关键酶(Berg等人,318:1782‑1786(2007);Thauer,318:1732‑1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子，且已经在生金球形菌属和硫化叶菌属中表征(Alber等人,188:8551‑8559(2006);Hugler等人,184:2404‑2410(2002))。该酶是由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,188:8551‑8559(2006);Berg等人,318:1782‑1786(2007))。在大肠杆菌中克隆和异源地表达了得自Sulfolobus tokodaii的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因(Alber等人,188:8551‑8559(2006))。还已经证实，该酶催化甲基丙二酰辅酶A转化成它的对应醛(WO/2007/141208)。两种丙二酰辅酶A还原酶候选物与天冬氨酸‑半醛脱氢酶具有高序列相似性，所述天冬氨酸‑半醛脱氢酶是催化天冬氨酰基‑4‑磷酸至天冬氨酸半醛的还原和同时去磷酸化的酶。通过与蛋白的序列同源性，可以在其它生物（包括硫矿硫化叶菌和酸热硫化叶菌）中发现其它基因。
基因GenBank登记号GI号生物MSED_0709YP_001190808.1146303492勤奋生金球菌mcrNP_378167.115922498Sulfolobus tokodaiiasd‑2NP_343563.115898958硫矿硫化叶菌Saci_2370YP_256941.170608071酸热硫化叶菌
1.2.1.d氧化还原酶(磷酸化/去磷酸化)(10/11G)：(苯甲酰氧基)膦酸盐至苯甲醛的还原(图10的途径g)和(对甲基苯甲酰氧基)膦酸盐至对甲基苯甲醛的还原(图11的途径g)，由具有膦酸还原酶活性的酶催化。尽管迄今为止尚未鉴别出催化这些转化的酶，确定地记录了由甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(EC1.2.1.12)、天冬氨酸‑半醛脱氢酶(EC1.2.1.11)、乙酰基谷氨酰基磷酸还原酶(EC1.2.1.38)和谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶(EC1.2.1.)催化的类似转化。天冬氨酸半醛脱氢酶(ASD,EC1.2.1.11)催化4‑天冬氨酰基磷酸盐至天冬氨酸‑4‑半醛的NADPH依赖性的还原。ASD参与氨基酸生物合成，最近已经作为抗微生物靶标进行了研究(Hadfield等人,Biochemistry40:14475‑14483(2001))。已经破解了大肠杆菌ASD结构(Hadfield等人,J Mol.Biol.289:991‑1002(1999))，且已经证实，该酶接受替代底物β‑3‑甲基天冬氨酰基磷酸盐(Shames等人,JBiol.Chem.259:15331‑15339(1984))。流感嗜血杆菌酶已经成为酶工程改造研究的对象，以改变在活性部位处的底物结合亲合力(Blanco等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1388‑1395(2004))。其它ASD基因/酶存在于结核分枝杆菌(Shafiani等人,J Appl Microbiol98:832‑838(2005))、詹氏甲烷球菌(Faehnle等人,J Mol.Biol.353:1055‑1068(2005)),和传染性的微生物霍乱弧菌和幽门螺杆菌(Moore等人,ProteinsExpr.Purif.25:189‑194(2002))中。相关酶是乙酰基谷氨酰基磷酸还原酶(EC1.2.1.38)，即天然地将乙酰基谷氨酰基磷酸盐还原为乙酰基谷氨酸‑5‑半醛的酶，该酶存在于酿酒酵母(Pauwels等人,Eur.J Biochem.270:1014‑1024(2003))，枯草芽孢杆菌(O'Reilly等人,Microbiology 140(Pt 5):1023‑1025(1994))，大肠杆菌(Parsot等人,Gene.68:275‑283(1988))和其它生物中。大肠杆菌的其它磷酸还原酶包括：由gapA编码的甘油醛3‑磷酸脱氢酶(Branlant等人,Eur.J.Biochem.150:61‑66(1985))和由proA编码的谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶(Smith等人,J.Bacteriol.157:545‑551(1984b))。在大肠杆菌中克隆和表达了得自鼠伤寒沙门菌(Mahan等人,J Bacteriol.156:1249‑1262(1983))和空肠弯曲杆菌(Louie等人,Mol.Gen.Genet.240:29‑35(1993))的编码谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶的基因。
蛋白GenBank IDGI号生物asdNP_417891.116131307大肠杆菌asdYP_248335.168249223流感嗜血杆菌asdAAB499961899206结核分枝杆菌VC2036NP_23167015642038霍乱弧菌asdYP_002301787.1210135348幽门螺杆菌ARG5,6NP_010992.16320913酿酒酵母argCNP_389001.116078184枯草芽孢杆菌argCNP_418393.116131796大肠杆菌gapAP0A9B2.271159358大肠杆菌proANP_414778.116128229大肠杆菌proANP_459319.116763704鼠伤寒沙门菌proAP53000.29087222空肠弯曲杆菌
1.2.1.e氧化还原酶(酸至醛)：苯甲酸至苯甲醛的直接转化、或对甲苯甲酸至对甲基苯甲醛的直接转化(图10和11的途径B)是由羧酸还原酶催化。示例性的酶包括：羧酸还原酶、α‑氨基己二酸还原酶和视黄酸还原酶。羧酸还原酶(CAR)催化羧酸向它们的对应醛的镁、ATP和NADPH依赖性的还原(Venkitasubramanian等人,J Biol.Chem.282:478‑485(2007))。该酶的天然底物是苯甲酸，且该酶表现出对芳族底物的宽接受性，包括对甲苯甲酸(Venkitasubramanian等人,Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries.CRC press(2006))。在大肠杆菌中克隆并功能性地表达了得自Nocardia iowensis的酶，其由car编码(Venkitasubramanian等人,J Biol.Chem.282:478‑485(2007))。CAR需要磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的翻译后活化，所述PPTase将无活性的脱辅酶转化成有活性的全酶(Hansen等人,Appl.Environ.Microbiol75:2765‑2774(2009))。npt基因（其编码特定的PPTase）的表达，会提高该酶的活性。在灰色链霉菌中发现的类似酶是由griC和griD基因编码。已经证实，该酶会将3‑氨基‑4‑羟基苯甲酸转化成3‑氨基‑4‑羟基苯甲醛，因为griC或griD的缺失会导致细胞外的3‑乙酰基氨基‑4‑羟基苯甲酸的积累，后者是3‑氨基‑4‑羟基苯甲酸代谢的支路产物(Suzuki,等人,J.Antibiot.60(6):380‑387(2007))。通过与Nocardia iowensis npt基因的序列同源性预测，灰色链霉菌PPTase可能由SGR_665编码。
基因GenBank登记号GI号生物carAAR91681.140796035Nocardia iowensisnptABI83656.1114848891Nocardia iowensisgriCYP_001825755.1182438036灰色链霉菌griDYP_001825756.1182438037灰色链霉菌SGR_665YP_001822177.1182434458灰色链霉菌
在一些真菌物种中，具有类似特征的酶α‑氨基己二酸还原酶(AAR,EC1.2.1.31)参与赖氨酸生物合成途径。该酶天然地将α‑氨基己二酸还原为α‑氨基己二酸半醛。首先，通过腺苷酸的ATP依赖性的形成，活化羧基，然后通过NAD(P)H的还原，得到醛和AMP。象CAR一样，该酶利用镁，且会被PPTase活化。用于AAR的酶和它的对应PPTase存在于酿酒酵母(Morris等人,Gene98:141‑145(1991))、白色假丝酵母(Guo等人,Mol.Genet.Genomics 269:271‑279(2003)),和粟酒裂殖酵母(Ford等人,Curr.Genet.28:131‑137(1995))中。当在大肠杆菌中表达时，得自粟酒裂殖酵母的AAR表现出显著的活性(Guo等人,Yeast21:1279‑1288(2004))。得自产黄青霉的AAR接受S‑羧甲基‑L‑半胱氨酸作为替代底物，但是不会与己二酸、L‑谷氨酸或二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,J Biol.Chem.278:8250‑8256(2003))。迄今为止尚未鉴别出编码产黄青霉PPTase的基因，通过序列对比同源性检索也没有鉴别出高置信度命中。
基因GenBank登记号GI号生物LYS2AAA34747.1171867酿酒酵母LYS5P50113.11708896酿酒酵母LYS2AAC02241.12853226白色假丝酵母LYS5AAO26020.128136195白色假丝酵母LyslpP40976.313124791粟酒裂殖酵母Lys7pQ10474.11723561粟酒裂殖酵母Lys2CAA74300.13282044产黄青霉
2.3.1.a酰基转移酶(磷酸转乙酰酶)：使用具有磷酸苯甲酰基转移酶活性的酶，互变苯甲酰辅酶A和(苯甲酰氧基)膦酸盐(图10的途径F)。具有磷酸‑对甲基苯甲酰基转移酶活性的类似酶，会互变对甲基苯甲酰辅酶A和(对甲基苯甲酰氧基)膦酸盐(图11的途径F)。示例性的转磷酸的酰基转移酶包括磷酸乙酰基转移酶(EC2.3.1.8)和磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)。得自大肠杆菌的pta基因编码磷酸乙酰基转移酶，该酶将乙酰辅酶A可逆地转化成乙酰磷酸(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta191:559‑569(1969))。该酶也会催化丙酰辅酶A转化成丙酰基磷酸盐(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477‑492(1998))。表现出对丙酰辅酶A的活性的其它磷酸乙酰基转移酶存在于枯草芽孢杆菌(Rado等人,Biochim.Biophys.Acta321:114‑125(1973))、克鲁氏梭状芽孢杆菌(Stadtman,1:596‑599(1955))和海栖热袍菌(Bock等人,JBacteriol.181:1861‑1867(1999))中。类似地，得自丙酮丁醇梭杆菌的ptb基因编码磷酸丁酰基转移酶，该酶将丁酰辅酶A可逆地转化成丁酰基‑磷酸盐(Wiesenborn等人,Appl Environ.Microbiol55:317‑322(1989);Walter等人,Gene134:107‑111(1993))。在产丁酸细菌L2‑50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099‑2106(2004))和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol42:345‑349(2001))中发现了其它ptb基因。
基因GenBank登记号GI号生物ptaNP_416800.171152910大肠杆菌ptaP39646730415枯草芽孢杆菌ptaA5N801146346896克鲁氏梭状芽孢杆菌ptaQ9X0L46685776海栖热袍菌ptbNP_34967634540484丙酮丁醇梭杆菌ptbAAR19757.138425288产丁酸细菌L2‑50ptbCAC07932.110046659巨大芽孢杆菌
2.7.2.a磷酸转移酶，羧基受体(激酶)：激酶或磷酸转移酶会将羧酸转化成膦酸，并同时水解1摩尔ATP。这样的酶用于将苯甲酸转化成(苯甲酰氧基)膦酸盐(图10、途径H)和将对甲苯甲酸转化成(对甲基苯甲酰氧基)膦酸盐(图11、途径H)。迄今为止尚未证实这些确切的转化。示例性的酶包括：丁酸激酶(EC2.7.2.7)、异丁酸激酶(EC2.7.2.14)、天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)和γ‑谷氨酰基激酶(EC2.7.2.11)。在梭菌物种的产酸过程中，丁酸激酶催化丁酰基‑磷酸盐至丁酸盐的可逆转化(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol56:1576‑1583(1990))。丙酮丁醇梭杆菌酶由2种buk基因产物中的任一种编码(Huang等人,JMol.Microbiol Biotechnol2:33‑38(2000))。其它丁酸激酶存在于酪酸梭菌和破伤风形梭菌(TWAROG等人,J Bacteriol.86:112‑117(1963))中。在大肠杆菌中表达了有关酶，即得自海栖热袍菌的异丁酸激酶，并结晶(Diao等人,J Bacteriol.191:2521‑2529(2009);Diao等人,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100‑1102(2003))。天冬氨酸激酶会催化天冬氨酸的ATP依赖性的磷酸化，并参与几种氨基酸的合成。在大肠杆菌中的天冬氨酸激酶III酶（由lysC编码）具有宽底物范围，并且已经阐明了在底物特异性中涉及的催化残基(Keng等人,Arch.Biochem.Biophys.335:73‑81(1996))。在大肠杆菌中的另外2种激酶包括乙酸激酶和γ‑谷氨酰基激酶。由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt等人,J.Biol.Chem.251:6775‑6783(1976))除了会磷酸化乙酸盐以外，还磷酸化丙酸盐(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477‑492(1998))。由proB编码的大肠杆菌γ‑谷氨酰基激酶(Smith等人,J.Bacteriol.157:545‑551(1984a))会磷酸化谷氨酸的γ碳酸基团。
基因GenBank IDGI号生物buk1NP_34967515896326丙酮丁醇梭杆菌buk2Q97II120137415丙酮丁醇梭杆菌buk2Q9X278.16685256海栖热袍菌lysCNP_418448.116131850大肠杆菌ackANP_416799.116130231大肠杆菌proBNP_414777.116128228大肠杆菌
2.8.3.a CoA转移酶(10/11A)：CoA转移酶会催化CoA部分部分从一个分子向另一个分子的可逆转移。图10的途径A由具有苯甲酰辅酶A转移酶活性的酶催化。在该转化中，通过CoA基团从CoA供体（诸如乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A或其它CoA供体）的转移，从苯甲酸形成苯甲酰辅酶A。对甲基苯甲酰辅酶A转移酶催化图11的途径A中的从对甲苯甲酸开始的类似反应。与类似底物反应的示例性的CoA转移酶包括肉桂酰辅酶A转移酶(EC2.8.3.17)和苄基琥珀酰辅酶A转移酶。肉桂酰辅酶A转移酶（由在生孢梭菌中的fldA编码）会将CoA部分从肉桂酰辅酶A转移至多种芳族酸底物，包括苯乙酸、3‑苯基丙酸和4‑苯基丁酸(Dickert等人,Eur.J Biochem.267:3874‑3884(2000))。苄基琥珀酰辅酶A转移酶利用琥珀酰辅酶A或马来酰辅酶A作为CoA受体，从苄基琥珀酸形成苄基琥珀酰辅酶A。在除氮菌芳香族需氧去氮菌中表征了该酶，其中它由bbsEF 编码(Leutwein等人,J Bacteriol.183:4288‑4295(2001))。
基因GenBank登记号GI号生物fldAAAL18808.116417587生孢梭菌
基因GenBank登记号GI号生物bbsEAAF89840.19622535芳香族需氧去氮菌bbsFAAF89841.19622536芳香族需氧去氮菌
具有不同底物范围的其它CoA转移酶包括：琥珀酰辅酶A转移酶、4‑羟基丁酰辅酶A转移酶、丁酰辅酶A转移酶、戊烯二酰辅酶A转移酶和乙酰乙酰辅酶A转移酶。已经证实，克鲁氏梭状芽孢杆菌的cat1、cat2和cat3的基因产物分别会表现出琥珀酰辅酶A、4‑羟基丁酰辅酶A和丁酰辅酶A转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A105:2128‑2133(2008);Sohling等人,J Bacteriol.178:871‑880(1996b))。类似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411‑1418(2008))和布鲁斯锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337‑45346(2004))中。得自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酰辅酶A转移酶(EC2.8.3.12)酶会与戊烯二酰辅酶A和3‑丁烯酰辅酶A反应(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41‑51(1994))。编码该酶的基因是gctA和gctB。该酶具有降低的、但是对其它CoA衍生物具有可检测的活性，所述其它CoA衍生物包括戊二酰辅酶A、2‑羟基戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A、巴豆酰辅酶A和丙烯酰辅酶A(Buckel等人、Eur.JBiochem.118:315‑321(1981))。该酶已经在大肠杆菌中克隆和表达(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41‑51(1994))。还已经在球孢梭菌和共生梭菌中检测出戊烯二酸辅酶A‑转移酶活性。乙酰乙酰辅酶A转移酶利用乙酰辅酶A作为CoA供体。该酶是由大肠杆菌atoA (α亚基)和atoD(β亚基)基因编码(Korolev等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116‑2121(2002);Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902‑908(1968))。该酶具有宽底物范围(Sramek等人,Arch.Biochem.Biophys.171:14‑26(1975))，且已经被证实会将CoA部分从乙酰辅酶A转移至多种底物，包括异丁酸盐(Matthies等人,Appl Environ.Microbiol58:1435‑1439(1992))、戊酸盐(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902‑908(1968))和丁酸盐(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902‑908(1968))。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,Appl.Environ.Microbiol68:5186‑5190(2002))、丙酮丁醇梭杆菌(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol56:1576‑1583(1990);Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol55:323‑329(1989))和Clostridium saccharoperbutylacetonicum(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58‑68(2007))中。
基因GenBank登记号GI号生物cat1P38946.1729048克鲁氏梭状芽孢杆菌cat2P38942.2172046066克鲁氏梭状芽孢杆菌cat3EDK35586.1146349050克鲁氏梭状芽孢杆菌TVAG_395550XP_001330176123975034阴道毛滴虫G3Tb11.02.0290XP_82835271754875布鲁斯锥虫gctACAA57199.1559392发酵氨基酸球菌gctBCAA57200.1559393发酵氨基酸球菌gctAACJ24333.1212292816共生梭菌gctBACJ24326.1212292808共生梭菌atoAP76459.12492994大肠杆菌K12atoDP76458.12492990大肠杆菌K12actAYP_226809.162391407谷氨酸棒杆菌cg0592YP_224801.162389399谷氨酸棒杆菌ctfANP_149326.115004866丙酮丁醇梭杆菌ctfBNP_149327.115004867丙酮丁醇梭杆菌ctfAAAP42564.131075384Clostridium saccharoperbutylacetonicumctfBAAP42565.131075385Clostridium saccharoperbutylacetonicum
3.1.2.a CoA水解酶(10/11A)：在EC类别3.1.2中的CoA水解酶或硫酯酶，可以将苯甲酰辅酶A和对甲基苯甲酰辅酶A水解为它们的对应酸(图10和11的途径A)。水解苯甲酰辅酶A和/或类似底物的示例性的CoA硫代酸酯包括4‑羟基苯甲酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.23)和苯基乙二醛‑CoA水解酶(EC3.1.2.25)。埃文固氮弧菌基因orfl编码具有苯甲酰辅酶A水解酶活性的酶，该酶参与苯甲酸代谢(Ismail,Arch.Microbiol 190:451‑460(2008))。当在大肠杆菌中异源地表达时，该酶表现出对许多替代底物的活性。通过序列相似性，在向磁磁螺菌、Jannaschiasp.CCS1和Sagittula stellataE‑37的苯甲酸盐降解基因簇中鉴别出了其它苯甲酰辅酶A水解酶(Ismail,Arch.Microbiol 190:451‑460(2008))。假单胞菌属CBS3的4‑羟基苯甲酰辅酶A水解酶接受苯甲酰辅酶A和对甲基苯甲酰辅酶A作为底物，且已经在大肠杆菌中异源地表达和表征(Song等人,Bioorg.Chem.35:1‑10(2007))。具有经证实的苯甲酰辅酶A水解酶活性的其它酶包括结核分枝杆菌的棕榈酰辅酶A水解酶(Wang等人,Chem.Biol.14:543‑551(2007))和由entH编码的大肠杆菌的酰基‑CoA水解酶(Guo等人,Biochemistry48:1712‑1722(2009))。
基因GenBank登记号GI号生物orflAAN39365.123664428埃文固氮弧菌Magn03011230ZP_0020779446200680向磁磁螺菌Jann_0674YP_50861689053165Jannaschia sp.CCS1SSE37_24444ZP_01745221126729407Sagittula stellataEF569604.1:4745..5170ABQ44580.1146761194假单胞菌属CBS3Rv0098NP_214612.115607240结核分枝杆菌entHAAC73698.11786813大肠杆菌
几种具有宽底物范围的CoA水解酶是适用于水解苯甲酰辅酶A和/或对甲基苯甲酰辅酶A的酶。例如，由得自褐家鼠脑的acot12编码的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959‑965(1976))可以与丁酰辅酶A、己酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应。由acot8编码的人二羧酸硫酯酶会表现出对戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A、环庚基‑CoA、癸二酰辅酶A和十二烷二酰基‑CoA的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125‑38132(2005))。与该酶最接近的大肠杆菌同系物tesB还可以水解许多CoA硫羟酸酯(Naggert等人,J Biol Chem 266:11044‑11050(1991))。还已经在大鼠肝中表征了类似的酶(Deana R.,Biochem Int 26:767‑773(1992))。
基因名称GI号GenBank登记号生物acot1218543355NP_570103.1褐家鼠tesB16128437NP_414986大肠杆菌acot83191970CAA15502智人acot851036669NP_570112褐家鼠tesA16128478NP_415027大肠杆菌ybgC16128711NP_415264大肠杆菌paaI16129357NP_415914大肠杆菌ybdB16128580NP_415129大肠杆菌
4.1.1a.羧基‑裂合酶(6/7E)：使用在EC类别4.1.1中的脱羧酶，将苯甲酸转化成苯(图10的途径E)和将对甲苯甲酸转化成甲苯(图11的途径E)。与这些或类似底物反应的示例性酶包括苯羧化酶、香子兰酸脱羧酶、肉桂酸脱羧酶、氨基苯甲酸脱羧酶和多种羟基苯甲酸脱羧酶。脱羧酶可以是氧化性的或非氧化性的，这取决于使用的辅因子(Lupa等人，Genomics 86:342‑351(2005a))。在梭菌细菌富集培养克隆BF中，鉴别出了一种预测具有苯甲酸羧化酶活性的酶(Abu等人,Environ.Microbiol(2010))。
基因GenBank登记号GI号生物abcAADJ94002.1300245889梭菌细菌富集培养克隆BFabcDADJ94001.1300245887梭菌细菌富集培养克隆BF
许多具有经证实的对羟基化芳族化合物（诸如4‑羟基苯甲酸、2,3‑二羟基苯甲酸、3,4‑二羟基苯甲酸、2,6‑二羟基苯甲酸和4,5‑二羟基邻苯二甲酸）的活性的表征过的脱羧酶，还可以表现出对替代底物（诸如对甲苯甲酸或苯甲酸）的活性。示例性的羟基苯甲酸脱羧酶包括睾丸酮丛毛平胞菌的4,5‑二羟基邻苯二甲酸脱羧酶(Nakazawa等人,Appl.Environ.Microbiol 36:264‑269(1978))、黑曲霉的2,3‑二羟基苯甲酸脱羧酶(Kamath等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.145:586‑595(1987))和大肠杆菌的3‑八异戊二烯基‑4‑羟基苯甲酸脱羧酶(Zhang等人,JBacteriol.182:6243‑6246(2000))。示例性的4‑羟基苯甲酸脱羧酶是由Sedimentibacter hydroxybenzoicus(以前的Clostridium hydroxbenzoicum)的shdBD和ubiD和阴沟肠杆菌P240的ubiD编码(Matsui等人,Arch.Microbiol186:21‑29(2006a);He等人,Eur.JBiochem.229:77‑82(1995))。已经测试了得自兼性厌氧菌阴沟肠杆菌的4‑羟基苯甲酸脱羧酶（由ubiD编码）对多种底物的活性，且经证实会被4‑羟基苯甲酸和4‑氨基苯甲酸诱导(Matsui等人,Arch.Microbiol186:21‑29(2006b))。枯草芽孢杆菌的bsdBCD基因编码可逆的非氧化性的4‑羟基苯甲酸/香子兰酸脱羧酶(Lupa等人,Can.JMicrobiol54:75‑81(2008))。在大肠杆菌中异源地表达了该酶。已经在几种其它生物中指出了类似的脱羧酶(Lupa等人，Genomics 86:342‑351(2005b))，这些脱羧酶中的一些的基因如下所示。
基因GenBank登记号GI号生物phtDQ59727.13914354睾丸酮丛毛平胞菌dhbDCAK48106.1134075758黑曲霉ubiDNP_418285.116131689大肠杆菌shdDAAY67851.167462198Sedimentibacter hydroxybenzoicusshdBAAY67850.167462197Sedimentibacter hydroxybenzoicusubiDAAD50377.15739200Sedimentibacter hydroxybenzoicusubiDBAE97712.1110331749阴沟肠杆菌P240bsdBCAB12157.12632649枯草芽孢杆菌bsdCCAB12158.12632650枯草芽孢杆菌bsdDCAB12159.12632651枯草芽孢杆菌STM292NP_461842.116766227鼠伤寒沙门菌LT2
STM2922NP_461843.116766228鼠伤寒沙门菌LT2STM2923NP_461844.116766229鼠伤寒沙门菌LT2kpdBYP_002236894.1206580833肺炎克雷伯菌342kpdCYP_002236895.1206576360肺炎克雷伯菌342kpdDYP_002236896.1206579343肺炎克雷伯菌342pad1NP_311620.115832847大肠杆菌O157yclCNP_311619.115832846大肠杆菌O157yclDNP_311618.115832845大肠杆菌O157
已经表征了另一类脱羧酶，它们会催化肉桂酸(苯基丙烯酸)和取代的肉桂酸衍生物的脱羧。这些酶常见于多种生物中，已经在大肠杆菌中克隆和表达的编码这些酶的具体基因包括：得自酿酒酵母的pad 1(Clausen等人,Gene142:107‑112(1994))，得自植物乳杆菌的pdc(Barthelmebs等人,67:1063‑1069(2001);Qi等人,MetabEng9:268‑276(2007);Rodriguez等人,J.Agric.Food Chem.56:3068‑3072(2008))，得自产酸克雷伯菌(Uchiyama等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:116‑123(2008);Hashidoko等人,Biosci.Biotech.Biochem.58:217‑218(1994))、戊糖片球菌(Barthelmebs等人,67:1063‑1069(2001))的pofK(pad)，和得自枯草芽孢杆菌和短小芽胞杆菌的padC(Shingler等人,174:711‑724(1992))。也已经纯化和表征了得自荧光假单胞菌的阿魏酸脱羧酶(Huang等人,J，Bacteriol.176:5912‑5918(1994))。该类酶已经被证实是稳定的，且不需要外源的或内部结合的辅因子，因而使得这些酶适用于生物转化(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61:51‑69(2007))。
蛋白GenBank IDGI号生物pad1AAB64980.11165293酿酒酵母pdcAAC45282.11762616植物乳杆菌padBAF65031.1149941608产酸克雷伯菌padCNP_391320.116080493枯草芽孢杆菌padYP_804027.1116492292戊糖片球菌padCAC18719.111691810短小芽胞杆菌
4.1.99.a脱羰酶：使用脱羰酶，将苯甲醛转化为苯(图10的途径C)和将对甲基苯甲醛转化为甲苯(图11的途径C)。脱羰酶会催化植物、哺乳动物、昆虫和细菌中的烷烃生物合成的最后一步(Dennis等人,Arch.Biochem.Biophys.287:268‑275(1991))。非氧化性的脱羰酶会将醛转化成烷烃，同时释放出CO。示例性的脱羰酶包括十八醛脱羰酶(EC4.1.99.5)、甾醇去饱和酶和脂肪醛脱羰酶。拟南芥的CER1基因编码参与上表皮蜡形成的脂肪酸脱羰酶(US6,437,218)。其它脂肪酸脱羰酶存在于蒺藜状苜蓿、葡萄和水稻中(美国专利申请2009/0061493)。在藻类布朗葡萄藻中纯化和表征了含有钴‑卟啉的脱羰酶；但是，迄今为止没有将基因与该活性相关联(Dennis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A89:5306‑5310(1992))。还纯化和表征了得自豌豆的含有铜的脱羰酶，但是，迄今为止仍然未与基因相关联(Schneider‑Belhaddad等人,Arch.Biochem.Biophys.377:341‑349(2000))。
基因GenBank登记号GI号生物CER1NP_850932145361948拟南芥MtrDRAFT_AC153128g2v2ABN07985124359969蒺藜状苜蓿VITISV_029045CAN60676147781102葡萄OSJNBa0004N05.14CAE03390.238345317水稻
可替换地，氧化脱羰酶可以将醛转化成烷烃。氧化脱羧酶是细胞色素P450酶，其利用NADPH和O2作为辅因子，并释放出CO2、水和NADP+。在家蝇和黑腹果蝇的CYP4G2v1和CYP4G1基因产物中证实了该活性(美国专利申请2010/0136595)。通过序列同源性，可以在其它生物（例如甘蓝夜蛾、谷实夜蛾和豌豆蚜）中鉴别出具有氧化脱羰酶活性的其它酶。
蛋白GenBank IDGI号生物CYP4G2v1ABV48808.1157382740家蝇CYP4G1NP_525031.117933498黑腹果蝇CYP4G25BAD81026.156710314天蚕CYP4M6AAM54722.121552585谷实夜蛾LOC100164072XP_001944205.1193650239豌豆蚜
6.2.1.a酸‑硫醇连接酶(8A,11B)：苯甲酸至苯甲酰辅酶A或对甲苯甲酸至对甲基苯甲酰辅酶A的ATP依赖性的活化(图10和11的途径A)，是由CoA合成酶或酸‑硫醇连接酶催化。形成AMP的CoA连接酶会将芳族酸活化为它们的对应CoA衍生物，而形成ADP的CoA连接酶通常是可逆的。已经表征了得自芳香族需氧去氮菌和固氮弧菌菌株CIB的示例性的形成AMP的苯甲酰辅酶A连接酶(Lopez Barragan等人,J Bacteriol.186:5762‑5774(2004);Schuhle等人,J.Bacteriol.185:4920‑4929(2003))。可替换地，与结构上类似的底物反应的形成AMP的CoA连接酶可以具有对苯甲酸或对甲苯甲酸的活性。确定地表征了得自沼泽红假单胞菌的、形成AMP的环己烷甲酸盐CoA‑连接酶（其由aliA编码），且已经证实，活性部位的改变会影响该酶的底物特异性(Samanta等人,Mol.Microbiol55:1151‑1159(2005))。该酶也在厌氧苯环降解过程中起环己‑1‑烯‑1‑甲酸CoA‑连接酶的作用(Egland等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 94:6484‑6489(1997))。其它示例性的CoA连接酶包括：2种表征过的、得自产黄青霉的苯乙酸‑CoA连接酶(Lamas‑Maceiras等人,Biochem.J395:147‑155(2006);Wang等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.360:453‑458(2007));Wang等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.360:453‑458(2007))，得自恶臭假单胞菌的苯乙酸‑CoA连接酶(Martinez‑Blanco等人,J Biol.Chem.265:7084‑7090(1990))，和得自枯草芽孢杆菌的6‑羧基己酸‑CoA连接酶(Bower等人,JBacteriol.178:4122‑4130(1996))。
基因GenBank登记号GI号生物bclAQ8GQN9.175526585芳香族需氧去氮菌bzdAAAQ08820.145649073固氮弧菌菌株CIBaliAAAC239192190573沼泽红假单胞菌phlCAJ15517.177019264产黄青霉phlBABS19624.1152002983产黄青霉paaFAAC24333.222711873恶臭假单胞菌bioWNP_390902.250812281枯草芽孢杆菌
迄今为止尚未表征催化这些确切转化的形成ADP的CoA连接酶；但是，在文献中已经描述了几种具有宽底物特异性的酶。经证实，得自闪烁古球菌的形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(ACD,EC6.2.1.13)（由AF1211编码）作用于多种直链和支链底物，包括异丁酸、异戊酸和延胡索酸(Musfeldt等人,J Bacteriol.184:636‑644(2002))。也经证实，在闪烁古球菌中的第二种可逆ACD（由AF1983编码）具有宽底物范围，对芳族化合物苯乙酸和吲哚乙酸具有高活性(Musfeldt等人,出处同上)。得自死海嗜盐古细菌的酶（注解为琥珀酰辅酶A合成酶）接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并经证实会在正向和反向工作(Brasen等人,Arch.Microbiol182:277‑287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，与乙酰辅酶A、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol182:277‑287(2004))。定向进化或工程改造可以用于修饰该酶，以在宿主生物的生理温度工作。得自闪烁古生菌、死海嗜盐古细菌和P.aerophilum的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol182:277‑287(2004);Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636‑644(2002))。其它酶是由大肠杆菌中的sucCD编码，其天然地催化从琥珀酸形成琥珀酰辅酶A，伴随地消耗1摩尔ATP，该反应在体内是可逆的(Buck等人,Biochemistry24:6245‑6252(1985))。已经证实，得自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶会作用于几种脂族底物（包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸）和芳族化合物（诸如苯乙酸和苯氧乙酸）(Fernandez‑Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149‑1154(1993))。得自豌豆根瘤菌的相关酶丙二酰基CoA合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸（即乙基‑、丙基‑、烯丙基‑、异丙基‑、二甲基‑、环丙基‑、环丙基亚甲基‑、环丁基‑和苄基‑丙二酸）转化成它们的对应的单硫代酸酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822‑5823(2001))。
基因GenBank登记号GI号生物AF1211NP_070039.111498810闪烁古球菌AF1983NP_070807.111499565闪烁古球菌scsYP_135572.155377722死海嗜盐古细菌PAE3250NP_560604.118313937Pyrobaculum aerophilum 菌株IM2sucCNP_415256.116128703大肠杆菌sucDAAC73823.11786949大肠杆菌paaFAAC24333.222711873恶臭假单胞菌matBAAC83455.13982573豌豆根瘤菌
实施例VIII
从丙酮酸、鸟氨酸和丙氨酸至2,4‑戊二烯酸的途径
本实施例显示了从丙酮酸、鸟氨酸和丙氨酸至2,4‑戊二烯酸的途径。
图12显示了丙酮酸至2,4‑戊二烯酸的转化。该转化可以在4个酶促步骤中完成。首先，4‑羟基‑2‑酮戊酸醛缩酶将丙酮酸和乙醛缩合成4‑羟基‑2‑氧代戊酸(图12的步骤A)。所述4‑羟基‑2‑氧代戊酸产物接着脱水为2‑氧代戊烯酸(图12的步骤B)。随后将2‑氧代戊烯酸还原和脱水，得到2,4‑戊二烯酸(图12的步骤C/D)。
图13显示了从丙氨酸或鸟氨酸至2,4‑戊二烯酸的途径。在图13的步骤A中，AKP硫解酶连接丙氨酸和乙酰辅酶A，以形成AKP。在一个途径中，AKP脱氨为乙酰基丙烯酸(步骤B)。然后还原乙酰基丙烯酸的4‑氧代基团，并脱水为2,4‑戊二烯酸(步骤C/D)。在一个替代途径中，氨基转移酶或脱氢酶将AKP转化成2,4‑二氧代戊酸(步骤E)。还原2,4‑二氧代戊酸的2‑或4‑氧代基团，分别得到2‑羟基‑4‑氧代戊酸(步骤H)或4‑羟基‑2‑氧代戊酸(步骤K)。可替代地，可以如下形成4‑羟基‑2‑氧代戊酸：将AKP还原为2‑氨基‑4‑羟基戊酸(步骤J)，随后氨基交换或氧化脱氨(步骤L)。形成后，可以在图12所示的3个酶促步骤(图12的步骤B/C/D)中，将4‑羟基‑2‑氧代戊酸转化成2,4‑戊二烯酸。所述2‑羟基‑4‑氧代戊酸中间体可以脱水为乙酰基丙烯酸(步骤F)，随后还原和脱水(步骤C/D)。
向图13所示的从AKP开始的途径中的一种替代进入点是鸟氨酸。首先需要鸟氨酸氨基变位酶，将鸟氨酸转化成2,4‑二氨基戊酸(步骤M)。然后通过氨基交换或氧化脱氨，将所述2,4‑二氨基戊酸中间体转化成AKP(步骤N)。
应当理解，丙氨酸或鸟氨酸的任一种D‑或L‑立体异构体都可以充当通向图13所示的2,4‑戊二烯酸途径的前体或中间体。丙氨酸消旋酶或鸟氨酸消旋酶可以容易地互变丙氨酸或鸟氨酸的D‑和L‑立体异构体。
通过EC编号，将用于催化图5和6所示的转化的酶分类(表2)，并进一步描述在下面。
标号功能步骤1.1.1.a氧化还原酶(氧代至醇)1C,2C/H/K/J1.4.1.a氧化还原酶(胺化/脱氨)2E/L/N2.6.1.a氨基转移酶2E/L/N4.1.3.a裂合酶1A4.2.1.a水解酶1B/D,2D/F4.3.1.a氨‑裂合酶2B5.1.1.aD/L消旋酶2A/M5.4.3.a氨基变位酶2M其它AKP硫解酶2A
1.1.1.a氧化还原酶(氧代至醇)：在图5和6中的许多转化包括酮还原为醇。在图12的步骤C中，将2‑氧代戊烯酸还原为2‑羟基戊烯酸。一种类似转化是，将酮酸2,4‑二氧代戊酸还原为它的对应羟酸2‑羟基‑4‑氧代戊酸(图13的步骤H)。图13的步骤C、J和K能够将AKP、2,4‑二氧代戊酸和乙酰基丙烯酸的4‑氧代基团还原为它们的对应醇。这些转化由EC类别1.1.1中的氧化还原酶催化。
几种示例性的醇脱氢酶会将酮转化成醇官能团。得自大肠杆菌的2种这样的酶是由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。另外，已经证实，得自富养产碱菌的乳酸脱氢酶会表现出对不同链长度的2‑酮酸的高活性，包括乳酸、2‑氧代丁酸、2‑氧代戊酸和2‑氧代戊二酸(Steinbuchel等人,Eur.J.Biochem.130:329‑334(1983))。α‑酮己二酸向α‑羟基己二酸的转化，是由2‑酮己二酸还原酶催化，该酶存在于大鼠和人胎盘中(Suda等人,Arch.Biochem.Biophys.176:610‑620(1976);Suda等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586‑591(1977))。其它的候选物氧化还原酶是得自人心脏的线粒体3‑羟基丁酸脱氢酶(bdh)，其已经被克隆并表征(Marks等人,J.Biol.Chem.267:15459‑15463(1992))。拜氏梭菌(Ismaiel等人,J.Bacteriol.175:5097‑5105(1993))和布氏热厌氧杆菌(Lamed等人,Biochem.J.195:183‑190(1981);Peretz等人,Biochemistry28:6549‑6555(1989))的醇脱氢酶会将丙酮转化成异丙醇。甲基乙基甲酮还原酶会催化MEK还原形成2‑丁醇。在赤红球菌(Kosjek等人,Biotechnol Bioeng.86:55‑62(2004))和强烈火球菌(van der等人,Eur.J.Biochem.268:3062‑3068(2001))中可以发现示例性的MEK还原酶。
基因GenBank IDGI号生物mdhAAC76268.11789632大肠杆菌ldhANP_415898.116129341大肠杆菌ldhYP_725182.1113866693富养产碱菌bdhAAA58352.1177198智人adhAAA23199.260592974拜氏梭菌NRRL B593adhP14941.1113443布氏热厌氧杆菌HTD4sadhCAD3647521615553赤红球菌adhAAAC255563288810强烈火球菌
1.4.1.a氧化还原酶(脱氨)：在EC类别1.4.1中的酶会催化氨基的氧化脱氨，使用NAD+、NADP+或FAD作为受体。催化AKP至2,4‑二氧代戊酸(图13、步骤E)、2‑氨基‑4‑羟基戊酸至4‑羟基‑2‑氧代戊酸(图13、步骤L)和2,4‑二氨基戊酸至AKP(图13、步骤N)的氧化脱氨，需要这样的酶。2,4‑二氨基戊酸至AKP的转化(图13的步骤N)，是由2,4‑二氨基戊酸脱氢酶(EC1.4.1.12)催化。已经在经历鸟氨酸的厌氧发酵的生物中，表征了2,4‑二氨基戊酸脱氢酶，诸如斯蒂克兰德梭菌的ord基因产物(Fonknechten,J.Bacteriol.印刷中:(2009))。通过与ord基因产物的序列相似性，可以在其它生物中推断出其它2,4‑二氨基戊酸脱氢酶基因候选物。相关酶3,5‑二氨基己酸脱氢酶(EC1.4.1.11)，催化3,5‑二氨基己酸至5‑氨基‑3‑氧代己酸的氧化脱氨。最近在具核梭杆菌中鉴别出了编码该酶的基因kdd(Kreimeyer等人,JBiol.Chem.282:7191‑7197(2007))。已经在其它生物纯化和表征了发酵赖氨酸的酶，但是迄今为止尚未鉴别出与这些酶有关的基因(Baker等人,JBiol.Chem.247:7724‑7734(1972);Baker等人,Biochemistry 13:292‑299(1974))。通过序列同源性，可以推断出出在黄色粘球菌、龈紫单胞菌W83和其它测序的生物中的候选物。
基因GenBank IDGI号生物ordCAQ42978.1226885213斯蒂克兰德梭菌Hore_21120YP_002509852.1220932944奥伦氏盐发菌CD0442YP_001086913.1126698016难辨梭菌kddAAL93966.119713113具核梭杆菌mxan_4391ABF87267.1108462082黄色粘球菌pg_1069AAQ66183.134397119龈紫单胞菌
底物AKP和2‑氨基‑4‑羟基戊酸(图13的步骤E和L)与α‑氨基酸类似，且可以充当诸如谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2)、亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)和天冬氨酸脱氢酶(EC1.4.1.21)等氨基酸脱氢酶的替代底物。谷氨酸脱氢酶催化谷氨酸至2‑氧代戊二酸的可逆的NAD(P)+依赖性的转化。示例性酶是由下述基因编码：在大肠杆菌中的gdhA(McPherson等人,Nucleic.Acids Res.11:5257‑5266(1983);Korber等人,J.Mol.Biol.234:1270‑1273(1993))，在海栖热袍菌中的gdh(Kort等人,Extremophiles1:52‑60(1997);Lebbink等人,J.Mol.Biol.280:287‑296(1998);Lebbink等人,J.Mol.Biol.289:357‑369(1999))，和在Halobacterium salinarum中的gdhA1(Ingoldsby等人,Gene.349:237‑244(2005))。已经在下述生物中表征了其它谷氨酸脱氢酶：枯草芽孢杆菌(Khan等人,Biosci.Biotechnol Biochem.69:1861‑1870(2005))，烟草(Purnell等人,Planta 222:167‑180(2005))，水稻(Abiko等人,Plant Cell Physiol 46:1724‑1734(2005))，地中海极嗜盐菌(Diaz等人,Extremophiles.10:105‑115(2006))和Halobactreium salinarum(Hayden等人,FEMS Microbiol Lett.211:37‑41(2002))。所述烟草酶是由α和β亚基组成，所述亚基由gdh1和gdh2编码(Purnell等人,Planta222:167‑180(2005))。一种示例性的亮氨酸脱氢酶是由蜡状芽孢杆菌的ldh编码。该酶会与多种底物反应，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和2‑氨基丁酸(Stoyan等人,J.Biotechnol54:77‑80(1997);Ansorge等人,Biotechnol Bioeng.68:557‑562(2000))。得自海栖热袍菌的天冬氨酸脱氢酶（由nadX编码）参与NAD的生物合成(Yang等人,J.Biol.Chem.278:8804‑8808(2003))。
基因GenBank IDGI号生物gdhAP00370118547大肠杆菌gdhP96110.46226595海栖热袍菌gdhA1NP_279651.115789827Halobacterium salinarumrocGNP_391659.116080831枯草芽孢杆菌gdh1AAR11534.138146335烟草gdh2AAR11535.138146337烟草GDHQ852M075243660水稻GDHQ977U674499858地中海极嗜盐菌GDHP29051118549Halobactreium salinarumGDH2NP_010066.16319986酿酒酵母ldhP0A39361222614蜡状芽孢杆菌nadXNP_229443.115644391海栖热袍菌
2.6.1.a氨基转移酶：图13中的几种转化是由氨基转移酶或转氨酶催化，包括AKP至2,4‑二氧代戊酸的转化(步骤E)、2‑氨基‑4‑羟基戊酸至4‑羟基‑2‑氧代戊酸的转化(步骤L)和2,4‑二氨基戊酸至AKP的转化(步骤N)。几种氨基转移酶会将氨基酸和衍生物转化成它们的对应2‑酮酸。这样的酶特别适用于催化在图13的步骤E和L中描绘的转化(即AKP氨基转移酶和2‑氨基‑4‑羟基戊酸氨基转移酶)。适合这些转化的氨基酸氨基转移酶的选择，取决于底物的立体化学。当底物是处于D‑构型时，可以使用D‑氨基酸氨基转移酶(EC2.6.1.21)，而L‑立体异构体是L‑氨基酸氨基转移酶诸如天冬氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.1)的优选底物。天冬氨酸氨基转移酶天然地将氧代基团从草酰乙酸转移至谷氨酸，形成α‑酮戊二酸和天冬氨酸。天冬氨酸氨基转移酶活性是由例如下述基因的基因产物催化：得自大肠杆菌的aspC(Yagi等人,100:81‑84(1979);Yagi等人,113:83‑89(1985))，得自酿酒酵母的AAT2(Yagi等人,92:35‑43(1982))和得自拟南芥的ASP5(Kwok等人,55:595‑604(2004);de la等人,46:414‑425(2006);Wilkie等人,Proteins Expr.Purif. 12:381‑389(1998))。已经证实，得自褐家鼠的酶会促进诸如2‑氨基己二酸和2,4‑二氨基丁酸等替代底物的转氨(Recasens等人,Biochemistry 19:4583‑4589(1980))。作用于其它L‑氨基酸底物的氨基转移酶也可以能够催化这些转化。缬氨酸氨基转移酶会催化缬氨酸和丙酮酸转化为2‑酮异戊酸和丙氨酸。大肠杆菌基因avtA编码类似的酶(Whalen等人,J.Bacteriol.150:739‑746(1982))，该酶也催化α‑酮丁酸的氨基交换，以产生α‑氨基丁酸，尽管尚未鉴别出在该反应中的氨基供体(Whalen等人,J.Bacteriol.158:571‑574(1984))。另一种酶候选物是α‑氨基己二酸氨基转移酶(EC2.6.1.39)，即在有些生物中参与赖氨酸生物合成和降解的酶。该酶使用α‑酮戊二酸作为氨基受体，互变2‑氨基己二酸和2‑氧代己二酸。基因候选物存在于智人(Okuno等人,Enzyme Protein47:136‑148(1993))和嗜热栖热菌(Miyazaki等人,Microbiology150:2327‑2334(2004))中。嗜热栖热菌酶（由lysN编码）对几种替代底物是有活性的，所述替代底物包括草酰乙酸、2‑氧代异己酸、2‑氧代异戊酸和2‑氧代‑3‑甲基戊酸。
基因GenBank IDGI号生物aspCNP_415448.116128895大肠杆菌AAT2P23542.31703040酿酒酵母ASP5P46248.220532373拟南芥got2P00507112987褐家鼠avtAYP_026231.149176374大肠杆菌lysNBAC76939.131096548嗜热栖热菌AadAT‑IIQ8N5Z0.246395904智人
如果所述底物以D‑立体异构体的形式存在，氨基交换可以由D‑氨基转移酶(EC2.6.1.21)催化，所述酶也称作D‑氨基酸氨基转移酶和D‑丙氨酸氨基转移酶(DAAT)。这类酶的特点是它的宽底物特异性，它似乎物种特异性的。已经克隆和测序了得自芽孢杆菌属物种YM‑1的D‑氨基转移酶，其由dat编码(Tanizawa等人,JBiol.Chem.264:2450‑2454(1989))，并已经解释了晶体结构(Peisach等人,Biochemistry37:4958‑4967(1998))。还已经工程改造该酶，以改变底物特异性(Gutierrez等人,Eur.J Biochem.267:7218‑7223(2000);Gutierrez等人,Protein Eng11:53‑58(1998))。其它基因候选物存在于地衣芽孢杆菌ATCC10716(Taylor等人,Biochim.Biophys.Acta1350:38‑40(1997))、溶血性葡萄球菌(Pucci等人,JBacteriol.177:336‑342(1995))和枯草芽孢杆菌(Martinez‑Carrion等人,JBiol.Chem.240:3538‑3546(1965))中。
基因GenBank IDGI号生物datP19938118222芽孢杆菌属YM‑1datP546921706292地衣芽孢杆菌ATCC 10716datP546941706294溶血性葡萄球菌datO07597.13121979枯草芽孢杆菌
2,4‑二氨基戊酸至AKP的转化(图13的步骤N)，是由具有2,4‑二氨基戊酸氨基转移酶活性的酶催化。尽管迄今为止尚未表征酶的该活性，几种酶会催化类似的转化，即2,4‑二氨基丁酸至天冬氨酸‑4‑半醛的转化。示例性酶候选物包括：β‑丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.18)、二氨基丁酸氨基转移酶(EC2.6.1.46和EC2.6.1.76)和γ‑氨基丁酸(GABA)氨基转移酶(EC2.6.1.19)。一种示例性的二氨基丁酸氨基转移酶是由在鲍氏不动杆菌和流感嗜血杆菌中的dat基因产物编码(Ikai等人,JBacteriol.179:5118‑5125(1997);Ikai等人,Biol Pharm.Bull.21:170‑173(1998))。除了它的天然底物2,4‑二氨基丁酸以外，鲍氏不动杆菌DAT会促进赖氨酸、4‑氨基丁酸和鸟氨酸的末端胺的转氨。其它二氨基丁酸氨基转移酶基因候选物包括：嗜盐海球菌和Halobacillus dabanensis的ectB基因产物(Zhao等人，Curr Microbiol 53:183‑188(2006);Louis等人，Microbiology143(Pt4):1141‑1149(1997))和铜绿假单孢菌的pvdH基因产物(Vandenende等人,J Bacteriol.186:5596‑5602(2004))。在EC类别2.6.1.76中，包括使用α‑酮戊二酸作为氨基受体的二氨基丁酸氨基转移酶。这样的酶存在于鲍氏不动杆菌中。
荧光假单胞菌的β‑丙氨酸氨基转移酶也接受2,4‑二氨基丁酸作为底物(Hayaishi等人,J Biol Chem236:781‑790(1961))；但是，该活性迄今为止尚未与基因相关联。γ‑氨基丁酸氨基转移酶天然地进行琥珀半醛和谷氨酸至4‑氨基丁酸和α‑酮戊二酸的互变。通常，GABA氨基转移酶会与宽范围的替代底物反应(Schulz等人,56:1‑6(1990);Liu等人,43:10896‑10905(2004))。在大肠杆菌中的2种GABA转氨酶是由gabT(Bartsch等人,J Bacteriol.172:7035‑7042(1990))和puuE(Kurihara等人,J.Biol.Chem.280:4602‑4608(2005))编码。已经证实，gabT基因产物具有宽底物特异性(Schulz等人,56:1‑6(1990);Liu等人,43:10896‑10905(2004))。已经证实，在小家鼠和野猪中的GABA氨基转移酶会与许多替代底物反应(Cooper,Methods Enzymol.113:80‑82(1985))。
基因GenBank IDGI号生物datP56744.16685373鲍氏不动杆菌datP44951.11175339流感嗜血杆菌ectBAAB57634.12098609嗜盐海球菌ectBAAZ57191.171979940Halobacillus dabanensispvdHAAG05801.19948457铜绿假单孢菌gabTNP_417148.116130576大肠杆菌puuENP_415818.116129263大肠杆菌AbatNP_766549.237202121小家鼠gabTYP_257332.170733692荧光假单胞菌AbatNP_999428.147523600野猪
4.1.3.a裂合酶：丙酮酸和乙醛缩合为4‑羟基‑2‑氧代戊酸(图12的步骤A)，是由4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶(EC4.1.3.39)催化。该酶参与苯酚、甲酚和儿茶酚的降解途径。由mhpE编码的大肠杆菌酶对乙醛受体是高度特异性的，但是接受替代底物2‑酮丁酸或苯丙酮酸作为供体(Pollard等人,Appl Environ Microbiol64:4093‑4094(1998))。类似的酶是由恶臭假单胞菌的cmtG和todH基因编码(Lau等人,Gene146:7‑13(1994);Eaton,JBacteriol.178:1351‑1362(1996))。在假单胞菌属CF600中，该酶是由dmpFG编码的双功能的醛缩酶‑脱氢酶异源二聚体的一部分(Manjasetty等人，Acta Crystallogr.D.Biol Crystallogr,57:582‑585(2001))。所述脱氢酶功能性会互变乙醛和乙酰辅酶A，从而提供下述优点：降低对有些细胞有毒的乙醛的细胞浓度。
基因GenBank IDGI 号生物mhpEAAC73455.11786548大肠杆菌cmtGAAB62295.11263190恶臭假单胞菌todHAAA61944.1485740恶臭假单胞菌dmpGCAA43227.145684假单胞菌属CF600dmpFCAA43226.145683假单胞菌属CF600
4.2.1.a脱水酶：4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水为2‑氧代戊烯酸(图12的步骤B)，是由4‑羟基‑2‑氧代戊酸水合酶(EC4.2.1.80)催化。催化4‑羟基戊‑2‑烯酸脱水为2,4‑戊二烯酸，需要类似的酶(图13的步骤D)。4‑羟基‑2‑氧代戊酸水合酶参与芳族化合物降解途径，且通常与编码具有4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶活性的酶的基因共转录。示例性的基因产物是由下述基因编码：大肠杆菌的mhpD(Ferrandez等人,JBacteriol.179:2573‑2581(1997);Pollard等人,Eur JBiochem.251:98‑106(1998))，恶臭假单胞菌的todG和cmtF(Lau等人,Gene146:7‑13(1994);Eaton,JBacteriol.178:1351‑1362(1996))，丛毛平胞菌属各种的cnbE CNB‑1(Ma等人,Appl Environ Microbiol73:4477‑4483(2007))，和Burkholderia xenovorans的mhpD (Wang等人,FEBS J 272:966‑974(2005))。一种密切相关的酶2‑氧代庚‑4‑烯‑1,7‑二酸水合酶参与4‑羟基苯乙酸降解，其中它使用镁作为辅因子，将2‑氧代‑庚‑4‑烯‑1,7‑二酸(OHED)转化成2‑氧代‑4‑羟基‑庚‑1,7‑二酸(Burks等人,J.Am.Chem.Soc.120:(1998))。已经在大肠杆菌C(Roper等人,Gene156:47‑51(1995);Izumi等人,JMol.Biol.370:899‑911(2007))和大肠杆菌W(Prieto等人,J Bacteriol.178:111‑120(1996))中鉴别和表征了OHED水合酶候选物。序列对比揭示了宽范围的细菌、植物和动物中的同系物。在肺炎克雷伯菌(91%同一性,eval=2e‑138)和肠道沙门氏菌(91%同一性,eval=4e‑138)以及其它物种中含有具有高度相似的序列的酶。
基因GenBank IDGI号生物mhpDAAC73453.287081722大肠杆菌cmtFAAB62293.11263188恶臭假单胞菌todGAAA61942.1485738恶臭假单胞菌cnbEYP_001967714.1190572008丛毛平胞菌属各种CNB‑1mhpDQ13VU0123358582Burkholderia xenovoranshpcGCAA57202.1556840大肠杆菌ChpaHCAA86044.1757830大肠杆菌WhpaHABR80130.1150958100肺炎克雷伯菌Sari_01896ABX21779.1160865156肠道沙门氏菌
用于催化2‑羟基戊烯酸(图12、步骤D)或2‑羟基‑4‑氧代戊酸(图13、步骤F)的脱水的酶候选物包括：延胡索酸酶(EC4.2.1.2)、柠苹酸水合酶(EC4.2.1.34)和二甲基马来酸水合酶(EC4.2.1.85)。延胡索酸酶天然地催化苹果酸可逆脱水为延胡索酸。尽管迄今为止尚未在文献中描述延胡索酸酶与2‑羟基戊烯酸或2‑羟基‑4‑氧代戊酸底物反应的能力，关于该酶的结构信息资源是得到的，研究人员已经成功地工程改造该酶以改变活性、抑制和定位(Weaver,61:1395‑1401(2005))。大肠杆菌具有3种延胡索酸酶：FumA、FumB和FumC，它们受生长条件调节。FumB是氧敏感的，仅在厌氧条件下有活性。FumA在微厌氧条件下有活性，FumC是在需氧生长期间有活性的唯一酶(Tseng等人,183:461‑467(2001);Woods等人,954:14‑26(1988);Guest等人,J Gen Microbiol131:2971‑2984(1985))。其它酶候选物存在于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.JBiochem.Cell Biol31:961‑975(1999))、嗜热栖热菌(Mizobata等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49‑55(1998))和褐家鼠(Kobayashi等人,89:1923‑1931(1981))中。具有高序列同源性的类似酶包括：得自拟南芥的fum1和得自谷氨酸棒杆菌的fumC。得自Pelotomaculum thermopropionicum的mmcBC延胡索酸酶是另一类延胡索酸酶，其具有2个亚基(Shimoyama等人,270:207‑213(2007))。柠苹酸水解酶天然地将2‑甲基苹果酸脱水为中康酸。已经在通向2‑氧代丁酸的丙酮酸途径的背景下在詹氏甲烷球菌中研究了该酶，其中已经证实它具有宽底物特异性(Drevland等人,J Bacteriol.189:4391‑4400(2007))。也在破伤风形梭菌、摩氏摩根菌、丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌中检测到该酶活性，其中认为它参与谷氨酸降解(Kato等人,Arch.Microbiol 168:457‑463(1997))。詹氏甲烷球菌蛋白序列与这些生物中的基因没有显著的同源性。二甲基马来酸水合酶是顺乌头酸酶家族中的一种可逆的Fe2+依赖性的和氧敏感的酶，其水合二甲基马来酸以形成(2R,3S)‑2,3‑二甲基苹果酸。该酶是由巴氏真杆菌中的dmdAB编码(Alhapel等人,出处同上;Kollmann‑Koch等人,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847‑857(1984))。
基因GenBank IDGI号生物fumANP_416129.116129570大肠杆菌fumBNP_418546.116131948大肠杆菌fumCNP_416128.116129569大肠杆菌fumCO692949789756空肠弯曲杆菌fumCP8412775427690嗜热栖热菌fumHP14408120605褐家鼠fum1P9303339931311拟南芥fumCQ8NRN839931596谷氨酸棒杆菌mmcBYP_001211906147677691Pelotomaculum thermopropionicummmcCYP_001211907147677692Pelotomaculum thermopropionicumleuDQ58673.13122345詹氏甲烷球菌dmdAABC8840886278276巴氏真杆菌
基因GenBank IDGI号生物dmdBABC88409.186278277巴氏真杆菌
4.3.1.a氨‑裂合酶：在图13的步骤B中，催化2‑氨基‑4‑氧代戊酸(AKP)脱氨为乙酰基丙烯酸，需要氨裂合酶。尚未鉴别出催化该确切转化的酶。但是，AKP在结构上类似于天冬氨酸，后者是天冬氨酸酶(EC4.3.1.1.)的天然底物。天冬氨酸酶是在微生物中广泛分布的酶，且已经广泛地表征(Viola,74:295‑341(2000))。已经证实，大肠杆菌酶会与多种替代底物反应，所述替代底物包括天冬氨酸苯基甲基酯、天冬酰胺、苄基‑天冬氨酸和苹果酸(Ma等人,672:60‑65(1992))。另外，已经将定向进化应用于该酶，以改变底物特异性(Asano等人,22:95‑101(2005))。已经解释了由aspA编码的大肠杆菌天冬氨酸酶的晶体结构(Shi等人,36:9136‑9144(1997))。还已经在流感嗜血杆菌(Sjostrom等人,Biochim.Biophys.Acta1324:182‑190(1997))、荧光假单胞菌(Takagi等人,J.Biochem.96:545‑552(1984))、枯草芽孢杆菌(Sjostrom等人,1324:182‑190(1997))和粘质沙雷菌(Takagi等人,161:1‑6(1985))中表征了具有天冬氨酸酶功能性的酶。
基因GenBank IDGI号生物aspANP_41856290111690大肠杆菌K12的MG1655亚种aspAP44324.11168534流感嗜血杆菌aspAP07346.1114273荧光假单胞菌ansBP26899.1251757243枯草芽孢杆菌aspAP33109.1416661粘质沙雷菌
用于催化AKP的脱氨的另一种酶候选物是3‑甲基天冬氨酸酶(EC4.3.1.2)。该酶也称作β‑甲基天冬氨酸酶和3‑甲基天冬氨酸氨‑裂合酶，天然地催化苏式‑3‑甲基天冬氨酸脱氨为中康酸。已经在大肠杆菌中克隆并功能性地表达了得自破伤风形梭菌的3‑甲基天冬氨酸酶，并结晶(Asuncion等人,57:731‑733(2001);Asuncion等人,J Biol Chem.277:8306‑8311(2002);Botting等人,27:2953‑2955(1988);Goda等人,31:10747‑10756(1992))。在丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌中，该酶是由BAA28709编码(Kato和Asano,Arch.Microbiol168:457‑463(1997))。已经从大肠杆菌YG1002结晶了3‑甲基天冬氨酸酶(Asano等人,FEMS MicrobiolLett.118:255‑258(1994))，尽管蛋白序列未列在公开数据库诸如GenBank中。序列同源性可以用于鉴别其它的候选基因，包括在破伤风梭菌中的CTC_02563和在大肠杆菌O157:H7中的ECs0761。
基因GenBank IDGI号生物malAAB24070.1259429破伤风形梭菌BAA28709BAA28709.13184397丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌CTC_02563NP_783085.128212141破伤风梭菌ECs0761BAB34184.113360220大肠杆菌O157:H7
5.1.1.a消旋酶：在EC类别5.1.1中的消旋酶会异构化D‑和L‑氨基酸。增加D‑丙氨酸和/或D‑鸟氨酸的生物利用度并从而增强丙氨酸至AKP的转化(图13的步骤A)或鸟氨酸至2,4‑二氨基戊酸的转化(图13的步骤M)，可以需要的这样的酶。已经表征了具有丙氨酸消旋酶(EC5.1.1.1)和鸟氨酸消旋酶(EC5.1.1.12)活性的酶。丙氨酸消旋酶会互变丙氨酸的L和D立体异构体。大肠杆菌具有2种丙氨酸氨基变位酶，分别由alr和dadX编码(Lilley等人,Gene129:9‑16(1993);Wild等人,Mol GenGenet.198:315‑322(1985))。当在大肠杆菌中表达时，鹑鸡肠球菌的vanT基因也表现出丙氨酸消旋酶活性(Arias等人,Microbiology 146(Pt7):1727‑1734(2000))。已经在枯草芽孢杆菌和结核分枝杆菌中表征了其它丙氨酸消旋酶候选物(Pierce等人,FEMS Microbiol Lett.283:69‑74(2008);Strych等人,FEMS MicrobiolLett.196:93‑98(2001))。D‑鸟氨酸和L‑鸟氨酸的互变是由鸟氨酸消旋酶催化。纯化和表征了由斯氏梭菌的orr基因产物编码的酶(Fonknechten,J.Bacteriol.印刷中:(2009))。通过序列相似性，可以在诸如难辨梭菌和牙槽梭杆菌等生物中鉴别其它鸟氨酸消旋酶基因候选物。
基因GenBank IDGI号生物alrNP_418477.116131879大肠杆菌dadXAAC74274.11787439大肠杆菌vanTQ9X3P3.120140922鹑鸡肠球菌yncDNP_389646.116078827枯草芽孢杆菌alrNP_338056.115843019结核分枝杆菌CDC1551alrNP_217940.115610559结核分枝杆菌H37RvorrCAQ42981.1226885219斯蒂克兰德梭菌CdifA_020200002638ZP_05349631.1255305459难辨梭菌FUSPEROL 00295ZP_06025693.1262066081牙槽梭杆菌
5.4.3.a氨基变位酶：鸟氨酸氨基变位酶(EC5.4.3.5)催化鸟氨酸至2,4‑二氨基戊酸的转化(图13的步骤M)。已经克隆、测序并在大肠杆菌中表达了具有该活性的B12依赖性的酶，该酶由斯蒂克兰德梭菌的oraSE编码(Chen等人,J.Biol.Chem.276:44744‑44750(2001))。该酶优先与鸟氨酸的D‑立体异构体反应(Fonknechten,J.Bacteriol.印刷中:(2009))。迄今为止尚未表征在其它生物中的鸟氨酸氨基变位酶。通过序列相似性，可以鉴别在诸如Alkaliphilus oremlandii和难辨梭菌等生物中的类似酶。赖氨酸氨基变位酶催化2种类似的转化：赖氨酸与2,5‑二氨基己酸的互变(EC5.4.3.4)，和3,6‑二氨基己酸与3,5‑二氨基己酸的互变(EC5.4.3.3)。该酶参与赖氨酸至乙酸和丁酸的发酵，且已经在斯蒂克兰德梭菌(Berkovitch等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:15870‑15875(2004))和龈紫单胞菌(Tang等人,Biochemistry41:8767‑8776(2002))中表征。
基因GenBank IDGI号生物ordEAAK72502.117223685斯蒂克兰德梭菌oraSAAK72501.117223684斯蒂克兰德梭菌oraE(Clos_1695)YP_001513231.1158320724Alkaliphilus oremlandiioraS(Clos_1696)YP_001513232.1158320725Alkaliphilus oremlandiiordEZP_05349629.1255305457难辨梭菌oraSZP_05349628.1255305456难辨梭菌kamDAAC79717.13928904斯蒂克兰德梭菌kamEAAC79718.13928905斯蒂克兰德梭菌kamDNP_905288.134540809龈紫单胞菌W83kamENP_905289.134540810龈紫单胞菌W83
其它:由AKP硫解酶从丙氨酸和乙酰辅酶A形成2‑氨基‑4‑氧代戊酸(AKP)(图13中的步骤A)。AKP硫解酶(AKPT，没有EC编号)是参与斯蒂克兰德梭菌中的鸟氨酸降解的磷酸吡哆醛依赖性的酶(Jeng等人,Biochemistry 13:2898‑2903(1974);Kenklies等人,Microbiology145(Pt4):819‑826(1999))。最近描述了编码AKPT的α和β亚基的基因簇(or‑2(ortA)和or‑3(ortB))，并表征了该酶的生化性质(Fonknechten,J.Bacteriol.印刷中:(2009))。该酶能够在两个方向工作，并与丙氨酸的D‑异构体反应。酶工程改造或定向进化可以使该酶用L‑丙氨酸作为底物，从而提供在基本底物方面的额外的途径多样性。可替换地，丙氨酸消旋酶的共表达可以增强底物可用性。具有高序列同源性的酶存在于难辨梭菌、Alkaliphilus metalliredigenes QYF、高温厌氧杆菌属X514和Thermoanaerobacter tengcongensis MB4中(Fonknechten,J.Bacteriol.印刷中:(2009))。
基因GenBank IDGI号生物ortACAQ42979.1226885215斯蒂克兰德梭菌ortBCAQ42980.1GI:226885217斯蒂克兰德梭菌ortAYP_001086914.1126698017难辨梭菌630ortBYP_001086915.1126698018难辨梭菌630Amet_2368YP_001320181.1150390132Alkaliphilus metalliredigenes QYFAmet_2369YP_001320182.1150390133Alkaliphilus metalliredigenes QYFTeth514_1478YP_001663101.1167040116高温厌氧杆菌属X514Teth514_1479)YP_001663102.1167040117高温厌氧杆菌属X514TTE1235NP_622858.120807687Thermoanaerobacter tengcongensis MB4thrCNP_622859.120807688Thermoanaerobacter tengcongensis MB4
实施例IX
用于从合成气提取还原当量的示例性的氢化酶和CO脱氢酶以及示例性的还原TCA循环酶
可用于本发明的非天然存在的微生物体中的还原TCA循环的酶包括，ATP‑柠檬酸裂合酶和3种CO2固定酶（异柠檬酸脱氢酶、α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶）中的一种或多种。ATP‑柠檬酸裂合酶或柠檬酸裂合酶和α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的存在，指示有活性的还原TCA循环在生物体中的存在。下面显示了还原TCA循环的每个步骤的酶。
ATP‑柠檬酸裂合酶(ACL,EC2.3.3.8)也称作ATP柠檬酸合酶，其催化柠檬酸至草酰乙酸和乙酰辅酶A的ATP依赖性的裂解。ACL是已经在绿硫细菌泥生绿菌和Chlorobium tepidum中研究的RTCA循环酶。在大肠杆菌中克隆和表征了得自泥生绿菌的α(4)β(4)异聚体酶(Kanao等人,Eur.J.Biochem.269:3409‑3416(2002)。由aclAB编码的泥生绿菌酶是不可逆的，该酶的活性受ADP/ATP的比率调节。还在阐明α和β亚基在催化机制中的作用的研究中，在大肠杆菌中表达了得自Chlorobium tepidum的重组ACL，并在体外重构了全酶(Kim和Tabita,J.Bacteriol.188:6544‑6552(2006)。还已经在Balnearium lithotrophicum、Sulfurihydrogenibium subterraneum和细菌产水菌门的其它成员中鉴别了ACL酶(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81‑92(2007))。还已经在一些真菌中报道了该活性。示例性生物包括：Sordaria macrospora(Nowrousian等人，Curr.Genet.37:189‑93(2000)、构巢曲霉、解脂耶氏酵母(Hynes和Murray，Eukaryotic Cell，July:1039‑1048，(2010)和黑曲霉(Meijer等人J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36:1275‑1280(2009)。基于序列同源性，可以发现其它候选物。关于这些酶的信息列在下表中：
蛋白GenBank IDGI号生物aclABAB21376.112407237泥生绿菌aclBBAB21375.112407235泥生绿菌aclAAAM72321.121647054Chlorobium tepidumaclBAAM72322.121647055Chlorobium tepidumaclAABI50076.1114054981Balneariuml ithotrophicumaclBABI50075.1114054980Balnearium lithotrophicumaclAABI50085.1114055040Sulfurihydrogenibium subterraneumaclBABI50084.1114055039Sulfurihydrogenibium subterraneumaclAAAX76834.162199504Sulfurimonas denitrificansaclBAAX76835.162199506Sulfurimonas denitrificansacl1XP_504787.150554757解脂耶氏酵母acl2XP_503231.150551515解脂耶氏酵母SPBC1703.07NP_596202.119112994粟酒裂殖酵母SPAC22A12.16NP_593246.119114158粟酒裂殖酵母acl1CAB76165.17160185Sordaria macrosporaacl2CAB76164.17160184Sordaria macrosporaaclACBF86850.1259487849构巢曲霉aclBCBF86848259487848构巢曲霉
在有些生物中，柠檬酸至草酰乙酸和乙酰辅酶A的转化通过柠檬酰辅酶A中间体进行，且由2种单独的酶催化：柠檬酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.18)和柠檬酰辅酶A裂合酶(EC4.1.3.34)(Aoshima,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.75:249‑255(2007)。柠檬酰辅酶A合成酶催化柠檬酸活化为柠檬酰辅酶A。所述嗜热氢杆菌酶是由大和小亚基组成，所述亚基分别由ccsA和ccsB编码(Aoshima等人,Mol.Micrbiol.52:751‑761(2004))。Aquifex aeolicus的柠檬酰辅酶A合成酶是由α和β亚基组成，所述亚基由sucC1和sucD1编码(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81‑92(2007))。柠檬酰辅酶A裂合酶会将柠檬酰辅酶A裂解成草酰乙酸和乙酰辅酶A。该酶是由下述基因编码的同源三聚体：在嗜热氢杆菌中的ccl(Aoshima等人,Mol.Microbiol.52:763‑770(2004))，和在Aquifex aeolicus中的aq_150(Hugler等人,出处同上(2007))。最近，已经在Chlorobium tepidum中报道了将柠檬酸转化成草酰乙酸和柠檬酰辅酶A的该机制的基因(Eisen等人,PNAS99(14)：9509‑14(2002))。
蛋白GenBank IDGI号生物ccsABAD17844.146849514嗜热氢杆菌ccsBBAD17846.146849517嗜热氢杆菌sucC1AAC072852983723Aquifex aeolicussucD1AAC076862984152Aquifex aeolicus
蛋白GenBank IDGI号生物cclBAD17841.146849510嗜热氢杆菌aq 150AAC064862982866Aquifex aeolicusCT0380NP_66128421673219Chlorobium tepidumCT0269NP_661173.121673108Chlorobium tepidumCT1834AAM73055.121647851Chlorobium tepidum
苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.37)会将草酰乙酸转化成苹果酸，该酶在正向和反向两个方向起作用。酿酒酵母具有苹果酸脱氢酶的3个拷贝：MDH1(McAlister‑Henn和Thompson,J.Bacteriol.169:5157‑5166(1987)，MDH2(Minard和McAlister‑Henn,Mol.Cell.Biol.11:370‑380(1991);Gibson和McAlister‑Henn,J.Biol.Chem.278:25628‑25636(2003))，和MDH3(Steffan和McAlister‑Henn,J.Biol.Chem.267:24708‑24715(1992))，它们分别局部于线粒体、胞质溶胶和过氧化物酶体。已知大肠杆菌具有由mdh编码的有活性的苹果酸脱氢酶。
蛋白GenBank IDGI号生物MDH1NP_0128386322765酿酒酵母MDH2NP_014515116006499酿酒酵母MDH3NP_0102056320125酿酒酵母MdhNP_417703.116131126大肠杆菌
延胡索酸水合酶(EC4.2.1.2)催化the可逆的水合of延胡索酸to苹果酸。所述three延胡索酸酶of大肠杆菌,encoded by fumA,fumB和fumC,are regulated under不同的conditions of氧availability。FumB is氧sensitive和is有活性的under厌氧条件。FumA is有活性的under微厌氧条件,和FumC is有活性的under需氧生长条件s(Tseng等人,J.Bacteriol.183:461‑467(2001);Woods等人,Biochim.Biophys.Acta954:14‑26(1988);Guest等人,J. Gen.Microbiol.131:2971‑2984(1985))。酿酒酵母contains one copy of a延胡索酸酶‑encoding基因,FUM1,whose product局部的izes to both the胞质溶胶和线粒体(Sass等人,J.Biol.Chem.278:45109‑45116(2003))。其它延胡索酸酶存在于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.J.Biochem.Cell.Biol.31:961‑975(1999))，嗜热栖热菌(Mizobata等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49‑55(1998))和褐家鼠(Kobayashi等人,J.Biochem.89:1923‑1931(1981))。类似酶with高序列同源性include fum1 from拟南芥和fumC from谷氨酸棒杆菌。所述MmcBC延胡索酸酶from Pelotomaculum thermopropionicum是另一种class of延胡索酸酶with two亚基s(Shimoyama等人,FEMS Microbiol.Lett.270:207‑213(2007))。
蛋白GenBank IDGI号生物fumANP_416129.116129570大肠杆菌fumBNP_418546.116131948大肠杆菌fumCNP_416128.116129569大肠杆菌FUM1NP_0150616324993酿酒酵母fumCQ8NRN8.139931596谷氨酸棒杆菌fumCO69294.19789756空肠弯曲杆菌fumCP8412775427690嗜热栖热菌fumHP14408.1120605褐家鼠MmcBYP_001211906147677691Pelotomaculum thermopropionicumMmcCYP_001211907147677692Pelotomaculum thermopropionicum
延胡索酸还原酶催化延胡索酸还原为琥珀酸。大肠杆菌的延胡索酸还原酶（由frdABCD编码的4个亚基组成）是膜结合的，且在厌氧条件下是有活性的。该反应的电子供体是甲基萘醌，在该反应中生成的2个质子不会促成质子梯度(Iverson等人,Science284:1961‑1966(1999))。酵母基因组编码2种可溶性的延胡索酸还原酶同工酶，所述同工酶由FRDS1(Enomoto等人,DNARes.3:263‑267(1996))和FRDS2(Mu大鼠ubaki等人,Arch.Biochem.Biophys.352:175‑181(1998))编码，它们分别局限于胞质溶胶和前线粒体，并在葡萄糖上厌氧生长过程中使用(Arikawa等人,FEMS Microbiol.Lett.165:111‑116(1998))。
蛋白GenBank IDGI号生物FRDS1P32614418423酿酒酵母FRDS2NP_0125856322511酿酒酵母frdANP_418578.116131979大肠杆菌frdBNP_418577.116131978大肠杆菌frdCNP_418576.116131977大肠杆菌frdDNP_418475.116131877大肠杆菌
琥珀酸至琥珀酰辅酶A的ATP依赖性的酰化，是由琥珀酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.5)催化。酿酒酵母的LSC1和LSC2基因和大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物天然地形成琥珀酰辅酶A合成酶复合物，后者催化从琥珀酸形成琥珀酰辅酶A，并伴随地消耗1摩尔的ATP，该反应在体内是可逆的(Buck等人,Biochemistry 24:6245‑6252(1985))。下面鉴定出这些蛋白:
蛋白GenBank IDGI号生物LSC1NP_0147856324716酿酒酵母
蛋白GenBank IDGI号生物LSC2NP_0117606321683酿酒酵母sucCNP_415256.116128703大肠杆菌sucDAAC73823.11786949大肠杆菌
α‑酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(EC1.2.7.3)也称作2‑氧代戊二酸合酶或2‑氧代戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(OFOR)，其从CO2和琥珀酰辅酶A形成α‑酮戊二酸，同时消耗2个还原型铁氧还蛋白当量。OFOR和丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)是2‑酮酸:铁氧还蛋白(黄素氧还蛋白)氧化还原酶的不同家族的成员，它们使用焦磷酸硫胺素、CoA和铁‑硫簇作为辅因子，并使用铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白和FAD作为电子载体(Adams等人,Archaea.Adv.Protein Chem.48:101‑180(1996))。该类酶是可逆的，并在通过RTCA循环固定碳的生物中在羧化方向起作用，所述生物诸如嗜热氢杆菌、嗜水脱硫菌和绿菌属物种(Shiba等人1985;Evans等人,Proc.Natl.Acad.ScI.U.S.A.55:92934(1966);Buchanan,1971)。已经在大肠杆菌中克隆和表达了得自嗜热氢杆菌的双亚基酶，该酶由korAB编码(Yun等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.282:589‑594(2001))。最近在大肠杆菌中鉴别和表达了得自相同生物的5亚基OFOR，其具有对琥珀酰辅酶A的严格底物特异性，由forDABGE编码(Yun等人2002)。已经表征了两种嗜热氢杆菌OFOR酶的CO2固定动力学(Yamamoto等人,Extremophiles14:79‑85(2010))。已经纯化和表征了得自嗜硫代硫酸盐绿菌的固定CO2的OFOR，但是迄今为止尚未鉴别出编码该酶的基因。通过与嗜热氢杆菌基因的序列相似性，可以推断出在绿菌属物种中的酶候选物。例如，泥生绿菌基因组编码2种类似的蛋白。预测诸如热醋穆尔氏菌等产乙酸细菌会编码2种OFOR酶。据预测，由Moth_0034编码的酶会在CO2‑同化方向起作用。迄今为止尚未通过实验验证与该酶有关的基因Moth_0034，但是通过与已知的OFOR酶的序列相似性可以推断出。
在生理条件下在脱羧方向起作用的OFOR酶还可以催化反向反应。已经广泛地研究了得自嗜热嗜酸古细菌硫化叶菌属菌株7的OFOR，其由ST2300编码(Zhang等人1996.A plasmid‑based expression system has been developed for efficiently expressing this protein inE.coli(Fukuda等人,Eur.J.Biochem.268:5639‑5646(2001))，并确定了在底物特异性中涉及的残基(Fukuda和Wakagi,Biochim.Biophys.Acta1597:74‑80(2002))。最近，将得自Aeropyrum pernix菌株K1的Ape1472/Ape1473编码的OFOR克隆进大肠杆菌中，表征，并发现其与2‑氧代戊二酸和宽范围的2‑酮酸反应(Nishizawa等人,FEBS Lett.579:2319‑2322(2005))。另一种示例性的OFOR是由幽门螺杆菌中的oorDABC编码(Hughes等人1998)。已经在芳香族需氧去氮菌中报道了对α‑酮戊二酸特异性的酶(Dorner和Boll,J,Bacteriol.184(14)，3975‑83(2002)。通过序列同源性，可以在红红螺菌中发现一种类似的酶。还在Chlorobium tepidum中鉴别出了双亚基酶(Eisen等人,PNAS99(14)：9509‑14(2002))。
蛋白GenBank IDGI号生物korABAB2149412583691嗜热氢杆菌korBBAB2149512583692嗜热氢杆菌forDBAB62132.114970994嗜热氢杆菌forABAB62133.114970995嗜热氢杆菌forBBAB62134.114970996嗜热氢杆菌forGBAB62135.114970997嗜热氢杆菌forEBAB62136.114970998嗜热氢杆菌Clim_0204ACD89303.1189339900泥生绿菌Clim_0205ACD89302.1189339899泥生绿菌Clim_1123ACD90192.1189340789泥生绿菌Clim_1124ACD90193.1189340790泥生绿菌Moth_1984YP_430825.183590816热醋穆尔氏菌Moth_1985YP_430826.183590817热醋穆尔氏菌Moth_0034YP_428917.183588908热醋穆尔氏菌ST2300NP_378302.115922633硫化叶菌属菌株7Ape1472BAA80470.15105156Aeropyrum pernixApe1473BAA80471.2116062794Aeropyrum pernixoorDNP_207383.115645213幽门螺杆菌oorANP_207384.115645214幽门螺杆菌oorBNP_207385.115645215幽门螺杆菌oorCNP_207386.115645216幽门螺杆菌CT0163NP_661069.121673004Chlorobium tepidumCT0162NP_661068.121673003Chlorobium tepidumkorACAA12243.219571179芳香族需氧去氮菌korBCAD27440.119571178芳香族需氧去氮菌Rru_A2721YP_427805.183594053红红螺菌Rru_A2722YP_427806.183594054红红螺菌
异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸至2‑氧代戊二酸的可逆脱羧，同时还原NAD(P)+。在酿酒酵母和大肠杆菌中的IDH酶分别是由IDP1和icd编码(Haselbeck和McAlister‑Henn,J. Biol.Chem.266:2339‑2345(1991);Nimmo,H.G.,Biochem.J.234:317‑2332(1986))。得自泥生绿菌的NADPH依赖性的固定CO2的IDH，有助于还原TCA循环中的反向反应，即2‑氧代戊二酸至异柠檬酸的还原羧化，所述IDH在大肠杆菌中功能性地表达(Kanao等人,Eur.J.Biochem.269:1926‑1931(2002))。除了下面列出的一些其它候选物以外，在C.tepidum基因组中发现了具有95%序列同一性的类似酶。
蛋白GenBank IDGI号生物IcdACI84720.1209772816大肠杆菌IDP1AAA34703.1171749酿酒酵母IdhBAC00856.121396513泥生绿菌IcdAAM71597.121646271Chlorobium tepidumicdNP_952516.139996565Geobacter sulfurreducensicdYP_393560.78777245Sulfurimonas denitrificans
在嗜热氢杆菌中，2‑氧代戊二酸至异柠檬酸的还原羧化是由2种酶催化：2‑氧代戊二酸羧化酶和草酰琥珀酸还原酶。2‑氧代戊二酸羧化酶(EC6.4.1.7)催化α‑酮戊二酸至草酰琥珀酸的ATP依赖性的羧化(Aoshima和Igarashi,Mol.Microbiol.62:748‑759(2006))。该酶是由2个亚基组成的大复合物。酶功能需要大(A)亚基的生物素化(Aoshima等人,Mol.Microbiol.51:791‑798(2004))。草酰琥珀酸还原酶(EC1.1.1.‑)催化草酰琥珀酸至D‑苏式‑异柠檬酸的NAD依赖性的转化。该酶是由嗜热氢杆菌中的icd编码的同源二聚体。该酶的动力学参数指示，该酶在体内仅在还原羧化方向工作，这不同于在其它生物中的异柠檬酸脱氢酶(Aoshima和Igarashi,J.Bacteriol.190:2050‑2055(2008))。基于序列同源性，还已经在脱氮硫杆菌和Thermocrinis albus中发现了基因候选物。
蛋白GenBank IDGI号生物cfiABAF34932.1116234991嗜热氢杆菌cifBBAF34931.1116234990嗜热氢杆菌IcdBAD02487.138602676嗜热氢杆菌Tbd_1556YP_31531474317574脱氮硫杆菌Tbd_1555YP_31531374317573脱氮硫杆菌Tbd_0854YP_31461274316872脱氮硫杆菌Thal_0268YP_003473030289548042Thermocrinis albusThal_0267YP_003473029289548041Thermocrinis albusThal_0646YP_003473406289548418Thermocrinis albus
顺乌头酸酶(EC4.2.1.3)是一种含有铁‑硫的蛋白，其催化柠檬酸和异柠檬酸经由中间体顺式‑乌头酸的可逆异构化。2种顺乌头酸酶是由大肠杆菌基因组中的acnA和acnB编码。AcnB是主要的分解代谢酶，而AcnA是更稳定的，且表现得在氧化或酸应激条件下是有活性的(Cunningham等人,Microbiology143(Pt12):3795‑3805(1997))。在鼠伤寒沙门菌中的顺乌头酸酶的2种同工酶是由acnA和acnB编码(Horswill和Escalante‑Semerena,Biochemistry 40:4703‑4713(2001))。由ACO1编码的酿酒酵母顺乌头酸酶局限于：线粒体，它在这里参与TCA循环(Gangloff等人,Mol.Cell.Biol.10:3551‑3561(1990))，和胞质溶胶，它在这里参与乙醛酸分路(Regev‑Rudzki等人,Mol.Biol.Cell.16:4163‑4171(2005))。
蛋白GenBank IDGI号生物acnAAAC7438.11787531大肠杆菌acnBAAC73229.12367097大肠杆菌acnANP_460671.116765056鼠伤寒沙门菌HP0779NP_207572.115645398幽门螺杆菌26695H16_B0568CAJ95365.1113529018富养产碱菌DesfrDRAFT_3783ZP_07335307.1303249064食果糖脱硫弧菌JJSuden_1040(acnB)ABB44318.178497778Sulfurimonas denitrificansHydth_0755ADO45152.1308751669嗜热氢杆菌CT0543(acn)AAM71785.121646475Chlorobium tepidumClim_2436YP_001944436.1189347907泥生绿菌Clim_0515ACD89607.1189340204泥生绿菌acnBNP_459163.116763548鼠伤寒沙门菌ACO1AAA34389.1170982酿酒酵母
丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)催化丙酮酸的可逆氧化，以形成乙酰辅酶A。已经在大肠杆菌中克隆和表达了得自非洲脱硫弧菌的PFOR，从而得到有活性的重组酶，该酶在有氧存在下可稳定数天(Pieulle等人,J. Bacteriol.179:5684‑5692(1997))。氧稳定性在PFOR中是相对罕见的，据信是通过在非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60个残基延伸来赋予。在该酶中的2个半胱氨酸残基会形成二硫键，所述二硫键保护它免于以氧形式灭活。该二硫键和还已经在其它脱硫弧菌物种中发现了在有氧存在下的稳定性(Vita等人,Biochemistry,47:957‑64(2008))。也确定地表征了热醋穆尔氏菌PFOR(Menon和Ragsdale,Biochemistry 36:8484‑8494(1997))，并证实了在自养生长过程中在丙酮酸合成方向具有高活性(Furdui和Ragsdale,J.Biol.Chem.275:28494‑28499(2000))。此外，大肠杆菌具有未表征的开放读码框ydbK，其编码与热醋穆尔氏菌PFOR具有51%同一性的蛋白。已经描述了大肠杆菌中的丙酮酸氧化还原酶活性的证据(Blaschkowski等人,Eur.J.Biochem.123:563‑569(1982))。还已经描述了在其它生物中的PFOR，所述生物包括Rhodobacter capsulatas(Yakunin和Hallenbeck，Biochimica et Biophysica Acta1409(1998)39‑49(1998))和Choloboum tepidum(Eisen等人,PNAS99(14)：9509‑14(2002))。将得自嗜热氢杆菌的5亚基PFOR（其由porEDABG编码）克隆进大肠杆菌中，并证实了在脱羧方向和CO2‑同化方向起作用(Ikeda等人2006;Yamamoto等人,Extremophiles 14:79‑85(2010))。同系物也存在于C.carboxidivorans P7中。在下述综述中描述了几种其它的PFOR酶(Ragsdale,S.W.,Chem.Rev.103:2333‑2346(2003))。最后，黄素氧还蛋白还原酶(例如，得自幽门螺杆菌或空肠弯曲杆菌的fqrB)(St Maurice等人,J.Bacteriol.189:4764‑4773(2007))或Rnf‑型蛋白(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128‑2133(2008)；和Herrmann,J.Bacteriol190:784‑791(2008))会提供从由PFOR产生的还原型铁氧还蛋白生成NADH或NADPH的途径。下面鉴别出这些蛋白。


丙酮酸向乙酰辅酶A的转化，可以由几种其它的酶或它们的组合催化。例如，丙酮酸脱氢酶可以将丙酮酸转化成乙酰辅酶A，伴随地将NAD分子还原为NADH。它是催化一系列部分反应的多酶复合物，其导致丙酮酸的酰化氧化脱羧。该酶包括3个亚基：丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。该酶天然地存在于几种生物中，包括大肠杆菌和酿酒酵母。在大肠杆菌酶中，在E1组分中的特定残基负责底物特异性(Bisswanger,H.,J.Biol.Chem.256:815‑82(1981);Bremer,J.,Eur.J.Biochem.8:535‑540(1969);Gong等人,J.Biol.Chem.275:13645‑13653(2000))。酶工程改造工作已经提高了在厌氧条件下的大肠杆菌PDH酶活性(Kim等人,J.Bacteriol.190:3851‑3858(2008);Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.73:1766‑1771(2007);Zhou等人,Biotechnol.Lett.30:335‑342(2008))。与大肠杆菌PDH不同，枯草芽孢杆菌酶复合物在厌氧条件下有活性且是生长所必需(Nakano等人,J.Bacteriol.179:6749‑6755(1997))。肺炎克雷伯菌PDH（在甘油上培养期间进行表征）在厌氧条件下也是有活性的(5)。得自牛肾的酶复合物(18)和得自维涅兰德固氮菌的E2催化域(4)的晶体结构，是可得到的。可催化该转化的另一种酶是丙酮酸甲酸裂合酶。该酶催化丙酮酸和CoA转化成乙酰辅酶A和甲酸。丙酮酸甲酸裂合酶是原核生物中的一种共有酶，其用于辅助调控厌氧的氧化还原平衡。示例性酶存在于：大肠杆菌（由pflB编码）(Knappe和Sawers,FEMS.Microbiol Rev.6:383‑398(1990))、乳酸乳球菌(Melchiorsen等人,Appl Microbiol Biotechnol58:338‑344(2002))和变异链球菌(Takahashi‑Abbe等人,Oral.Microbiol Immunol.18:293‑297(2003))中。大肠杆菌具有由tdcE编码的其它的丙酮酸甲酸裂合酶，该酶催化丙酮酸或2‑氧代丁酸分别转化为乙酰辅酶A或丙酰辅酶A(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477‑492(1998))。得自大肠杆菌的pflB和tdcE都需要由pflA编码的丙酮酸甲酸裂合酶活化酶的存在。此外，在大肠杆菌中由yfiD编码的短蛋白可以与氧裂解的丙酮酸甲酸裂合酶结合和恢复后者的活性(Vey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:16137‑16141(2008)。应当指出，在酿酒酵母中表达了得自大肠杆菌的pflA和pflB，作为增加用于丁醇生产的细胞溶质乙酰辅酶A的方法，如在WO/2008/080124中所述。在巴斯德梭菌中发现了其它丙酮酸甲酸裂合酶和活化酶候选物，它们分别由pfl和act编码(Weidner等人,JBacteriol.178:2440‑2444(1996))。
此外，可以组合使用不同的酶，以将丙酮酸转化成乙酰辅酶A。例如，在酿酒酵母中，如下在胞质溶胶中得到乙酰辅酶A：首先将丙酮酸脱羧，以形成乙醛；后者被乙醛脱氢酶氧化为乙酸，随后被乙酰辅酶A合成酶活化，以形成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A合成酶是在几种其它生物中的天然酶，所述生物包括大肠杆菌(Kumari等人,J.Bacteriol.177:2878‑2886(1995))、肠道沙门氏菌(Starai等人,Microbiology151:3793‑3801(2005);Starai等人,J.Biol.Chem.280:26200‑26205(2005))和热醋穆尔氏菌(已经描述过)。可替换地，乙酸激酶和磷酸乙酰基转移酶可以活化乙酸，以形成乙酰辅酶A。乙酸激酶首先将乙酸转化成乙酰磷酸，伴随地使用ATP分子。接着，磷酸乙酰基转移酶将乙酰磷酸和CoA转化成乙酰辅酶A，并释放出1摩尔磷酸。乙酸激酶和磷酸乙酰基转移酶都是在几种梭菌和嗜热甲烷八叠球菌中充分研究的酶。
将丙酮酸转化成乙酰辅酶A的另一种方式是，通过丙酮酸氧化酶。丙酮酸氧化酶使用泛醌作为电子受体，将丙酮酸转化成乙酸。在大肠杆菌中，该活性是由poxB编码。PoxB具有与酿酒酵母和运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶的相似性。该酶具有焦磷酸硫胺素辅因子(Koland和Gennis,Biochemistry 21:4438‑4442(1982));O'Brien等人,Biochemistry 16:3105‑3109(1977);O'Brien和Gennis,J.Biol.Chem.255:3302‑3307(1980))和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子。然后如前所述，由乙酰辅酶A合成酶，或由乙酸激酶和磷酸乙酰基转移酶，可以将乙酸转化成乙酰辅酶A。这些酶中的一些还可以催化从乙酰辅酶A至丙酮酸的反向反应。
就使用NADH或NADPH形式的还原当量的酶而言，通过从还原型铁氧还蛋白转移电子，可以产生这些还原的载体。2种酶催化电子从还原型铁氧还蛋白至NAD(P)+的可逆转移：铁氧还蛋白:NAD+氧化还原酶(EC1.18.1.3)和铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR,EC1.18.1.2)。铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR,EC1.18.1.2)具有非共价地结合的FAD辅因子，后者会促进电子从NADPH至低势受体（诸如铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白）的可逆转移(Blaschkowski等人,Eur.J.Biochem.123:563‑569(1982);Fujii等人,1977)。由HP1164(fqrB)编码的幽门螺杆菌FNR与丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)活性相偶联，后者导致NADPH的丙酮酸依赖性的生产(St等人2007)。在空肠弯曲杆菌中发现了一种类似的酶(St等人2007)。铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶由大肠杆菌基因组中的fpr编码(Bianchi等人1993)。铁氧还蛋白:NAD+氧化还原酶使用还原型铁氧还蛋白从NAD+产生NADH。在包括大肠杆菌在内的几种生物中，该酶是多功能的双加氧酶复合物的组分。大肠杆菌的铁氧还蛋白:NAD+氧化还原酶（由hcaD编码）是参与芳族酸利用的3‑苯基丙酸双加氧酶系统的组分(Diaz等人1998)。在嗜热氢杆菌菌株TK‑6的细胞提取物中检测到NADH:铁氧还蛋白还原酶活性，尽管尚未指出具有该活性的基因(Yoon等人2006)。最后，保存能量的膜相关的Rnf‑型蛋白(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128‑2133(2008);Herrmann等人,J.Bacteriol.190:784‑791(2008))会提供从还原型铁氧还蛋白产生NADH或NADPH的途径。已经注解了在Clostridium carboxydivoran P7中的其它铁氧还蛋白:NAD(P)+氧化还原酶。
蛋白GenBank IDGI号生物HP1164NP_207955.115645778幽门螺杆菌RPA3954CAE29395.139650872沼泽红假单胞菌fprBAH29712.1225320633嗜热氢杆菌yumCNP_391091.2255767736枯草芽孢杆菌CJE0663AAW35824.157167045空肠弯曲杆菌fprP28861.4399486大肠杆菌hcaDAAC75595.11788892大肠杆菌LOC100282643NP_001149023.1226497434玉米RnfCEDK33306.1146346770克鲁氏梭状芽孢杆菌RnfDEDK33307.1146346771克鲁氏梭状芽孢杆菌RnfGEDK33308.1146346772克鲁氏梭状芽孢杆菌RnfEEDK33309.1146346773克鲁氏梭状芽孢杆菌RnfAEDK33310.1146346774克鲁氏梭状芽孢杆菌RnfBEDK33311.1146346775克鲁氏梭状芽孢杆菌CcarbDRAFT_2639ZP_05392639.1255525707Clostridium carboxidivorans P7
CcarbDRAFT_2638ZP_05392638.1255525706Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_2636ZP_05392636.1255525704Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_5060ZP_05395060.1255528241Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_2450ZP_05392450.1255525514Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_1084ZP_05391084.1255524124Clostridium carboxidivorans P7
铁氧还蛋白是含有一个或更多个铁‑硫簇的小酸性蛋白，所述铁‑硫簇的作用是，作为具有低还原电位的细胞内电子载体。还原型铁氧还蛋白贡献电子给Fe依赖性的酶，诸如铁氧还蛋白‑NADP+氧化还原酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)和2‑氧代戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(OFOR)。嗜热氢杆菌基因fdx1编码[4Fe‑4S]‑型铁氧还蛋白，该铁氧还蛋白是OFOR和PFOR分别对2‑氧代戊二酸和丙酮酸的可逆羧化所必需的(Yamamoto等人,Extremophiles14:79‑85(2010))。与硫矿硫化叶菌2‑酮酸:铁氧还蛋白还原酶有关的铁氧还蛋白是单体二簇[3Fe‑4S][4Fe‑4S]型铁氧还蛋白(Park等人2006)。尽管与该蛋白有关的基因尚未完全测序，N‑端结构域与得自酸热硫化叶菌的zfx铁氧还蛋白具有93%同源性。大肠杆菌基因组编码具有未知生理功能的可溶性的铁氧还蛋白fdx。一些证据指示，该蛋白可以在铁‑硫簇装配中起作用(Takahashi和Nakamura,1999)。已经在幽门螺杆菌(Mukhopadhyay等人2003)和空肠弯曲杆菌(van Vliet等人2001)中表征了其它铁氧还蛋白蛋白。已经在大肠杆菌中克隆和表达了得自巴斯德梭菌的2Fe‑2S铁氧还蛋白(Fujinaga和Meyer,Biochemical and Biophysical Research Communications,192(3)：(1993))。据预测，诸如热醋穆尔氏菌、Clostridium carboxidivorans P7和红红螺菌等产乙酸细菌会编码在下表中列出的几种铁氧还蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物fdx1BAE02673.168163284嗜热氢杆菌M11214.1AAA83524.1144806巴斯德梭菌ZfxAAY79867.168566938嗜酸热硫化叶菌FdxAAC75578.11788874大肠杆菌hp_0277AAD07340.12313367幽门螺杆菌fdxACAL34484.1112359698空肠弯曲杆菌Moth_0061ABC18400.183571848热醋穆尔氏菌Moth_1200ABC19514.183572962热醋穆尔氏菌Moth_1888ABC20188.183573636热醋穆尔氏菌Moth_2112ABC20404.183573852热醋穆尔氏菌Moth_1037ABC19351.183572799热醋穆尔氏菌CcarbDRAFT_4383ZP_05394383.1255527515Clostridium carboxidivorans P7
CcarbDRAFT_2958ZP_05392958.1255526034Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_2281ZP_05392281.1255525342Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_5296ZP_05395295.1255528511Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_1615ZP_05391615.1255524662Clostridium carboxidivorans P7CcarbDRAFT_1304ZP_05391304.1255524347Clostridium carboxidivorans P7cooFAAG29808.111095245生氢氧化碳嗜热菌fdxNCAA35699.146143荚膜红杆菌Rru_A2264ABC23064.183576513红红螺菌Rru_A1916ABC22716.183576165红红螺菌Rru_A2026ABC22826.183576275红红螺菌cooFAAC45122.11498747红红螺菌fdxNAAA26460.1152605红红螺菌Alvin_2884ADC63789.1288897953Allochromatium vinosum DSM 180fdxYP_002801146.1226946073维涅兰德固氮菌DJCKL_3790YP_001397146.1153956381克鲁氏梭状芽孢杆菌DSM 555fer1NP_949965.139937689沼泽红假单胞菌CGA009fdxCAA12251.13724172芳香族需氧去氮菌CHY_2405YP_361202.178044690生氢氧化碳嗜热菌ferYP_359966.178045103生氢氧化碳嗜热菌ferAAC83945.11146198枯草芽孢杆菌fdx1NP_249053.115595559铜绿假单孢菌PA01yfhLAP_003148.189109368大肠杆菌K‑12
琥珀酰辅酶A转移酶催化琥珀酰辅酶A至琥珀酸的转化，同时将CoA部分转移给CoA受体分子。许多转移酶具有宽特异性，且可以使用多种CoA受体，诸如乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、2‑甲基乙酰乙酸、3‑酮己酸、3‑酮戊酸、戊酸、巴豆酸、3‑巯基丙酸、丙酸、乙烯基乙酸和丁酸、以及其它。
琥珀酸至琥珀酰辅酶A的转化，可以由不需要直接消耗ATP或GTP的转移酶实现。这类反应是在许多生物中共有的。琥珀酸至琥珀酰辅酶A的转化还可以由琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶催化。已经证实，克鲁氏梭状芽孢杆菌的cat1的基因产物会表现出琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶活性(Sohling和Gottschalk，J.Bacteriol.178:871‑880(1996))。另外，该活性存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等人2008)和布鲁斯锥虫(Riviere等人2004)中。得自醋酸醋杆菌的琥珀酰辅酶A:乙酸CoA‑转移酶（由aarC编码）可替代变体TCA循环中的琥珀酰辅酶A合成酶(Mullins等人2008)。类似的琥珀酰辅酶A转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等人2008)、布鲁斯锥虫(Riviere等人2004)和克鲁氏梭状芽孢杆菌(Sohling和Gottschalk,1996c)中。由恶臭假单胞菌中的pcaI和pcaJ编码的β‑酮己二酸:琥珀酰辅酶A转移酶是另一种候选物(Kaschabek等人2002)。下面鉴别出了前述蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物cat1P38946.1729048克鲁氏梭状芽孢杆菌TVAG_395550XP_001330176123975034阴道毛滴虫G3Tb11.02.0290XP_82835271754875布鲁斯锥虫pcaIAAN69545.124985644恶臭假单胞菌pcaJNP_746082.126990657恶臭假单胞菌aarCACD85596.1189233555醋酸醋杆菌
可将琥珀酸转化成琥珀酰辅酶A并同时将3‑酮酰辅酶A转化成3‑酮酸的其它示例性转移酶是琥珀酰辅酶A:3:酮酸‑CoA转移酶(EC2.8.3.5)。示例性的琥珀酰辅酶A:3:酮酸‑CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy‑Theulaz等人1997)、枯草芽孢杆菌和智人(Fukao等人2000;Tanaka等人2002)中。下面鉴别出了前述蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物HPAG1_0676YP_627417108563101幽门螺杆菌HPAG1_0677YP_627418108563102幽门螺杆菌ScoANP_39177816080950枯草芽孢杆菌ScoBNP_39177716080949枯草芽孢杆菌OXCT1NP_0004274557817智人OXCT2NP_07140311545841智人
琥珀酰辅酶A:3:酮酸‑CoA转移酶将琥珀酸转化成琥珀酰辅酶A，需要3‑酮酰辅酶A（诸如乙酰乙酰辅酶A）至3‑酮酸（诸如乙酰乙酸）的同时转化。3‑酮酸转化回3‑酮酰辅酶A，可以由乙酰乙酰辅酶A:乙酸:CoA转移酶催化。乙酰乙酰辅酶A:乙酸:CoA转移酶会将乙酰乙酰辅酶A和乙酸转化成乙酰乙酸和乙酰辅酶A，或反之亦然。示例性的酶包括下述基因的基因产物：得自大肠杆菌的atoAD(Hanai等人,ApplEnviron Microbiol73:7814‑7818(2007)，得自丙酮丁醇梭杆菌的ctfAB(Jojima等人,Appl Microbiol Biotechnol77:1219‑1224(2008)，和得自Clostridium saccharoperbutylacetonicum的ctfAB(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58‑68(2007))，如下所示。
蛋白GenBank IDGI号生物AtoANP_416726.12492994大肠杆菌AtoDNP_416725.12492990大肠杆菌CtfANP_149326.115004866丙酮丁醇梭杆菌CtfBNP_149327.115004867丙酮丁醇梭杆菌CtfAAAP42564.131075384Clostridium saccharoperbutylacetonicumCtfBAAP42565.131075385Clostridium saccharoperbutylacetonicum
另一种可能的CoA受体是苄基琥珀酸。琥珀酰辅酶A:(R)‑苄基琥珀酸CoA‑转移酶的作用是，作为诸如芳香族需氧去氮菌等生物中的甲苯厌氧降解途径的一部分(Leutwein和Heider,J.Bact。183(14)4288‑4295(2001))。在固氮弧菌属T、Aromatoleum aromaticum EbN1和Geobacter metallireducens GS‑15中可以发现同系物。下面鉴别出了前述蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物bbsEAAF898409622535Thauera芳族BbsfAAF898419622536Thauera芳族bbsEAAU45405.152421824固氮弧菌属TbbsFAAU45406.152421825固氮弧菌属TbbsEYP_158075.156476486Aromatoleum aromaticum EbN1bbsFYP_158074.156476485Aromatoleum aromaticum EbN1Gmet_1521YP_384480.178222733Geobacter metallireducens GS‑15Gmet_1522YP_384481.178222734Geobacter metallireducens GS‑15
另外，ygfH编码大肠杆菌中的丙酰基CoA:琥珀酸CoA转移酶(Haller等人,Biochemistry,39(16)4622‑4629)。接近的同系物可以存在于，例如，杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种血清变型和中间耶尔森菌ATCC29909中。下面鉴别出了前述蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物ygfHNP_417395.116130821大肠杆菌K‑12菌株MG1655亚株CIT292_04485ZP_03838384.1227334728杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220SARI_04582YP_001573497.1161506385肠道沙门氏菌亚利桑那亚种血清变型yinte0001_14430ZP_04635364.1238791727中间耶尔森菌ATCC 29909
柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.6)催化一系列反应，从而导致柠檬酸裂解为乙酸和草酰乙酸。该酶在厌氧条件下有活性的，且是由3个亚基组成：酰基‑载体蛋白(ACP,γ)、ACP转移酶(α)和酰基裂合酶(β)。酶活化使用罕见辅基2’‑(5”‑磷酸核糖基)‑3‑‘‑脱磷酸‑CoA的共价结合和乙酰化，后者的结构与乙酰辅酶A类似。酰化是由CitC（一种柠檬酸裂合酶合成酶）催化。使用2种额外的蛋白CitG和CitX，将脱辅酶转化成有活性的全酶(Schneider等人,Biochemistry39:9438‑9450(2000))。野生型大肠杆菌不具有柠檬酸裂合酶活性；但是，具有钼辅因子合成缺陷的突变体具有有活性的柠檬酸裂合酶(Clark,FEMS Microbiol.Lett.55:245‑249(1990))。所述大肠杆菌酶是由citEFD编码，且所述柠檬酸裂合酶合成酶是由citC编码(Nilekani和SivaRaman,Biochemistry22:4657‑4663(1983))。已经在大肠杆菌中克隆、表征和表达了肠膜明串珠菌柠檬酸裂合酶(Bekal等人,J.Bacteriol.180:647‑654(1998))。还在使用柠檬酸作为碳源和能源的肠道菌中鉴别出了柠檬酸裂合酶，所述肠道菌包括鼠伤寒沙门菌和肺炎克雷伯菌(Bott,Arch.Microbiol.167:78‑88(1997);Bott和Dimroth,Mol.Microbiol.14:347‑356(1994))。前述蛋白列在下表中。
蛋白GenBank IDGI号生物citFAAC73716.11786832大肠杆菌CiteAAC73717.287081764大肠杆菌citDAAC73718.11786834大肠杆菌citCAAC73719.287081765大肠杆菌citGAAC73714.11786830大肠杆菌citXAAC73715.11786831大肠杆菌citFCAA71633.12842397肠膜明串珠菌CiteCAA71632.12842396肠膜明串珠菌citDCAA71635.12842395肠膜明串珠菌citCCAA71636.13413797肠膜明串珠菌citGCAA71634.12842398肠膜明串珠菌citXCAA71634.12842398肠膜明串珠菌citFNP_459613.116763998鼠伤寒沙门菌citeAAL19573.116419133鼠伤寒沙门菌citDNP_459064.116763449鼠伤寒沙门菌citCNP_459616.116764001鼠伤寒沙门菌citGNP_459611.116763996鼠伤寒沙门菌citXNP_459612.116763997鼠伤寒沙门菌citFCAA56217.1565619肺炎克雷伯菌citeCAA56216.1565618肺炎克雷伯菌citDCAA56215.1565617肺炎克雷伯菌citCBAH66541.1238774045肺炎克雷伯菌citGCAA56218.1565620肺炎克雷伯菌citXAAL60463.118140907肺炎克雷伯菌
乙酸激酶(EC2.7.2.1)催化乙酸至乙酰基磷酸的可逆的ATP依赖性的磷酸化。已经在许多生物中表征了示例性的乙酸激酶，所述生物包括：大肠杆菌、丙酮丁醇梭杆菌和嗜热甲烷八叠球菌(Ingram‑Smith等人,J.Bacteriol.187:2386‑2394(2005);Fox和Roseman,J.Biol.Chem.261:13487‑13497(1986);Winzer等人,Microbioloy 143(Pt10):3279‑3286(1997))。还已经在大肠杆菌purT的基因产物中证实了乙酸激酶活性(Marolewski等人,Biochemistry 33:2531‑2537(1994)。一些丁酸激酶(EC2.7.2.7)，例如得自丙酮丁醇梭杆菌的buk1和buk2，也接受乙酸作为底物(Hartmanis,M.G.,J.Biol.Chem.262:617‑621(1987))。
蛋白GenBank IDGI号生物ackANP_416799.116130231大肠杆菌AckAAB18301.11491790丙酮丁醇梭杆菌AckAAA72042.1349834嗜热甲烷八叠球菌purTAAC74919.11788155大肠杆菌buk1NP_34967515896326丙酮丁醇梭杆菌buk2Q97II120137415丙酮丁醇梭杆菌
从乙酰基磷酸形成乙酰辅酶A，是由磷酸乙酰基转移酶(EC2.3.1.8)催化。得自大肠杆菌的pta基因编码将乙酰辅酶A可逆地转化成乙酰磷酸的酶(Suzuki,T.,Biochim.Biophys.Acta191:559‑569(969))。已经在枯草芽孢杆菌(Rado和Hoch,Biochim.Biophys.Acta321:114‑125(1973)、克鲁氏梭状芽孢杆菌(Stadtman,E.,Methods Enzymol.1:5896‑599(1955)和海栖热袍菌(Bock等人,J.Bacteriol.181:1861‑1867(1999))中表征了其它乙酰基转移酶。该反应也由一些磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)催化，所述酶包括得自丙酮丁醇梭杆菌的ptb基因产物(Wiesenborn等人,App.Environ.Microbiol.55:317‑322(1989);Walter等人,Gene134:107‑111(1993))。其它ptb基因存在于产丁酸细菌L2‑50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099‑2106(2004)和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol.42:345‑349(2001)中。
蛋白GenBank IDGI号生物PtaNP_416800.171152910大肠杆菌PtaP39646730415枯草芽孢杆菌PtaA5N801146346896克鲁氏梭状芽孢杆菌PtaQ9X0L46685776海栖热袍菌PtbNP_34967634540484丙酮丁醇梭杆菌PtbAAR19757.138425288产丁酸细菌L2‑50PtbCAC07932.110046659巨大芽孢杆菌
乙酸酰化为乙酰辅酶A，是由具有乙酰辅酶A合成酶活性的酶催化。2种催化该反应的酶是：形成AMP的乙酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.1)和形成ADP的乙酰辅酶A合成酶(EC6.2.1.13)。形成AMP的乙酰辅酶A合成酶(ACS)是乙酸活化为乙酰辅酶A的主要酶。示例性的ACS酶存在于大肠杆菌(Brown等人,J. Gen.Microbiol.102:327‑336(1977))、富养产碱菌(Priefert和Steinbuchel,J. Bacteriol.174:6590‑6599(1992))、Methanothermobacter thermautotrophicus(Ingram‑Smith和Smith,古细菌2:95‑107(2007))、肠道沙门氏菌(Gulick等人,Biochemistry42:2866‑2873(2003))和酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry43:1425‑1431(2004))中。形成ADP的乙酰辅酶A合成酶是具有通常宽底物范围的可逆酶(Musfeldt和Schonheit,J.Bacteriol.184:636‑644(2002))。形成ADP的乙酰辅酶A合成酶的2种同工酶是由闪烁古球菌基因组中的AF1211和AF1983编码(Musfeldt和Schonheit,出处同上(2002))。得自死海嗜盐古细菌的酶(注解为琥珀酰辅酶A合成酶)也接受乙酸作为底物，且证实了该酶的可逆性(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol.182:277‑287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，其与乙酸、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen和Schonheit,出处同上(2004))。定向进化或工程改造可以用于修饰该酶，以在宿主生物的生理温度工作。得自闪烁古生菌、死海嗜盐古细菌和P.aerophilum的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Brasen和Schonheit,出处同上(2004);Musfeldt和Schonheit,出处同上(2002))。其它候选物包括：由大肠杆菌中的sucCD编码的琥珀酰辅酶A合成酶(Buck等人,Biochemistry24:6245‑6252(1985))，和得自恶臭假单胞菌的酰基‑CoA连接酶(Fernandez‑Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149‑1154(1993))。前述蛋白列在下表中。

乙酰辅酶A至丙二酰辅酶A的转化，可以由乙酰辅酶A羧化酶实现。这些酶含有多个亚基。下面提供了这些酶中的3种。
基因生物登录号GI号accA大肠杆菌K‑12AAC73296.11786382accB大肠杆菌K‑12AAC76287.11789653accC大肠杆菌K‑12AAC76288.11789654accD大肠杆菌K‑12AAC75376.11788655    accA肠道沙门氏菌CAD08690.116501513accB肠道沙门氏菌CAD07894.116504441accC肠道沙门氏菌CAD07895.116504442accD肠道沙门氏菌CAD07598.116503590    YMR207C酿酒酵母NP_013934.16323863YNR016C酿酒酵母NP_014413.16324343YGR037C酿酒酵母NP_011551.16321474YKL182W酿酒酵母NP_012739.16322666YPL231W酿酒酵母NP_015093.16325025
合成还原的发酵产物（诸如2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯）的微生物细胞的每C‑mol底物的产物收率，受限于碳水化合物原料中不足的还原当量。分别使用一氧化碳脱氢酶(CODH)和氢化酶，可以从诸如CO和H2等合成气体组分中提取还原当量或电子。所述还原当量然后传递给受体诸如氧化的铁氧还蛋白、氧化的醌、氧化的细胞色素、NAD(P)+、水或过氧化氢，以分别形成还原的铁氧还蛋白、还原的醌、还原的细胞色素、NAD(P)H、H2或水。还原型铁氧还蛋白和NAD(P)H是特别有用的，因为它们可以充当各种Wood‑Ljungdahl途径和还原TCA循环酶的氧化还原载体。
在下文中描述了用于从合成气组分提取还原当量的酶和对应的基因。CODH是互变CO和CO2的可逆酶，并消耗或获得电子。CODH在ACS/CODH复合物中的天然生理作用是，将CO2转化成CO，用于由乙酰辅酶A合酶掺入乙酰辅酶A中。尽管如此，由于这些酶的可逆性质，这样的CODH酶适用于从CO提取还原当量。在没有ACS存在下表达这些CODH酶，会使它们在与它们的天然生理作用相反的方向(即，CO氧化)工作。
在热醋穆尔氏菌、生氢氧化碳嗜热菌、C.carboxidivorans P7和几种其它生物中，其它CODH编码基因位于ACS/CODH操纵子之外。这些酶会提供从一氧化碳向二氧化碳的转化中提取电子(或还原当量)的途径。热醋穆尔氏菌基因(Genbank登录号:YP_430813)本身在操纵子中表达，其被认为会在“Ping‑pong”反应中将电子从CO转移至外部介质如铁氧还蛋白。还原的介质然后与其它还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD(P)H)载体或铁氧还蛋白依赖性的细胞过程相偶联(Ragsdale,Annals of the New York Academy of Sciences 1125:129‑136(2008))。克隆和测序了编码生氢氧化碳嗜热菌CODH‑II和CooF（一种邻接蛋白）的基因(Gonzalez和Robb,FEMS Microbiol Lett.191:243‑247(2000))。得到的复合物是膜结合的，尽管经证实CODH‑II的细胞质级分会催化NADPH的形成，这提示合成代谢作用(Svetlitchnyi等人,JBacteriol.183:5134‑5144(2001))。CODH‑II的晶体结构也是可得到的(Dobbek等人,Science293:1281‑1285(2001))。类似的不含ACS的CODH酶可以存在于多种生物中，包括Geobacter metallireducens GS‑15、褐杆状绿菌DSM266、解纤维素梭菌H10、脱硫脱硫弧菌脱硫亚种ATCC 27774菌株、Pelobacter carbinolicus DSM2380和曲形弯曲杆菌525.92。


在某些情况下，编码氢化酶的基因位于CODH附近。在红红螺菌中，编码的CODH/氢化酶蛋白会形成膜结合的酶复合物，已知指示，该酶复合物是从CO和H2O至CO2和H2的转化产生能量（以质子梯度的形式）的部位(Fox等人,JBacteriol.178:6200‑6208(1996))。已经提出，生氢氧化碳嗜热菌的CODH‑I和它的邻近基因会催化类似的功能作用，这基于它们与红红螺菌CODH/氢化酶基因簇的相似性(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005))。还证实，生氢氧化碳嗜热菌CODH‑I当与电极相连时会表现出强烈的CO氧化和CO2还原活性(Parkin等人,JAm.Chem.Soc.129:10328‑10329(2007))。通过下述GenBank登录号，可以鉴别出示例性的CODH和氢化酶基因的蛋白序列。
蛋白GenBank IDGI号生物CODH‑I(CooS‑I)YP_36064478043418生氢氧化碳嗜热菌CooFYP_36064578044791生氢氧化碳嗜热菌HypAYP_36064678044340生氢氧化碳嗜热菌CooHYP_36064778043871生氢氧化碳嗜热菌CooUYP_36064878044023生氢氧化碳嗜热菌CooXYP_36064978043124生氢氧化碳嗜热菌CooLYP_36065078043938生氢氧化碳嗜热菌CooKYP_36065178044700生氢氧化碳嗜热菌CooMYP_36065278043942生氢氧化碳嗜热菌CooCYP_360654.178043296生氢氧化碳嗜热菌CooA‑1YP_360655.178044021生氢氧化碳嗜热菌CooLAAC451181515468红红螺菌CooXAAC451191515469红红螺菌CooUAAC451201515470红红螺菌CooHAAC451211498746红红螺菌CooFAAC451221498747红红螺菌CODH(CooS)AAC451231498748红红螺菌CooCAAC451241498749红红螺菌CooTAAC451251498750红红螺菌CooJAAC451261498751红红螺菌
大肠杆菌和其它肠细菌天然地具有多个编码最多4种氢化酶的基因(Sawers,G.,Antonie Van Leeuwenhoek66:57‑88(1994);Sawers等人,JBacteriol.164:1324‑1331(1985);Sawers和Boxer，Eur.J Biochem.156:265‑275(1986);Sawers等人,JBacteriol.168:398‑404(1986))。鉴于酶活性的多样性，大肠杆菌或其它宿主生物可以提供足够的氢化酶活性，以裂解进入的分子氢和还原对应的受体。大肠杆菌具有2种吸收氢化酶Hyd‑1和Hyd‑2，它们分别由hyaABCDEF和hybOABCDEFG基因簇编码(Lukey等人,How E.coli is equipped to oxidize hydrogen under different redox conditions,J Biol Chem published online Nov16,2009)。Hyd‑1是氧耐受的、不可逆的，且经由hyaC细胞色素与醌还原相偶联。Hyd‑2是对O2敏感的、可逆的，并将电子转移给周质铁氧还蛋白hybA，后者又经由hybB嵌入膜蛋白还原醌。还原的醌可以在TCA循环的还原支路中充当延胡索酸还原酶的电子来源。还原型铁氧还蛋白可以被诸如NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶等酶用于产生NADPH或NADH。它们可以可替换地用作反应的电子供体，诸如丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶、AKG铁氧还蛋白氧化还原酶和5,10‑亚甲基‑H4叶酸还原酶。
蛋白GenBank IDGI号生物HyaAAAC74057.11787206大肠杆菌HyaBAAC74058.11787207大肠杆菌HyaCAAC74059.11787208大肠杆菌HyaDAAC74060.11787209大肠杆菌HyaEAAC74061.11787210大肠杆菌HyaFAAC74062.11787211大肠杆菌
蛋白GenBank IDGI号生物HybOAAC76033.11789371大肠杆菌HybAAAC76032.11789370大肠杆菌HybBAAC76031.12367183大肠杆菌HybCAAC76030.11789368大肠杆菌HybDAAC76029.11789367大肠杆菌HybEAAC76028.11789366大肠杆菌HybFAAC76027.11789365大肠杆菌HybGAAC76026.11789364大肠杆菌
大肠杆菌的水解酶系统包括：氢化酶3（即使用铁氧还蛋白作为受体的膜结合的酶复合物）和氢化酶4（其也使用铁氧还蛋白受体）。氢化酶3和4分别是由hyc和hyf基因簇编码。已经证实，氢化酶3是可逆酶(Maeda等人,Appl Microbiol Biotechnol76(5):1035‑42(2007))。在大肠杆菌中的氢化酶活性也依赖于hyp基因的表达，所述hyp基因的对应蛋白参与氢化酶复合物的装配(Jacobi等人,Arch.Microbiol158:444‑451(1992);Rangarajan等人,J.Bacteriol.190:1447‑1458(2008))。
蛋白GenBank IDGI号生物HycANP_41720516130632大肠杆菌HycBNP_41720416130631大肠杆菌HycCNP_41720316130630大肠杆菌HycDNP_41720216130629大肠杆菌HycENP_41720116130628大肠杆菌HycFNP_41720016130627大肠杆菌HycGNP_41719916130626大肠杆菌HycHNP_41719816130625大肠杆菌HycINP_41719716130624大肠杆菌
蛋白GenBank IDGI号生物HyfANP_41697690111444大肠杆菌HyfBNP_41697716130407大肠杆菌HyfCNP_41697890111445大肠杆菌HyfDNP_41697916130409大肠杆菌HyfENP_41698016130410大肠杆菌HyfFNP_41698116130411大肠杆菌HyfGNP_41698216130412大肠杆菌HyfHNP_41698316130413大肠杆菌HyflNP_41698416130414大肠杆菌HyfJNP_41698590111446大肠杆菌HyfRNP_41698690111447大肠杆菌
蛋白GenBank IDGI号生物HypANP_41720616130633大肠杆菌HypBNP_41720716130634大肠杆菌HypCNP_41720816130635大肠杆菌HypDNP_41720916130636大肠杆菌HypENP_417210226524740大肠杆菌HypFNP_41719216130619大肠杆菌
热醋穆尔氏菌氢化酶适用于缺乏足够的内源氢化酶活性的宿主。热醋穆尔氏菌可以使用CO2作为唯一碳源进行生长，这指示，从H2提取还原当量以实现经由Wood‑Ljungdahl途径的乙酰辅酶A合成(Drake,H.L.,J.Bacteriol.150:702‑709(1982);Drake和Daniel,Res.Microbiol.155:869‑883(2004);Kellum和Drake,J.Bacteriol.160:466‑469(1984))(参见图22)。热醋穆尔氏菌具有得自大肠杆菌的几种hyp、hyc和hyf基因的同系物。通过下述GenBank登录号，鉴别出这些基因编码的蛋白序列。
下面显示了热醋穆尔氏菌中的蛋白，所述蛋白的基因与大肠杆菌hyp基因同源。
蛋白GenBank IDGI号生物Moth_2175YP_43100783590998热醋穆尔氏菌Moth_2176YP_43100883590999热醋穆尔氏菌Moth_2177YP_43100983591000热醋穆尔氏菌Moth_2178YP_43101083591001热醋穆尔氏菌Moth_2179YP_43101183591002热醋穆尔氏菌Moth_2180YP_43101283591003热醋穆尔氏菌Moth_2181YP_43101383591004热醋穆尔氏菌
在下表中列出了热醋穆尔氏菌中的与大肠杆菌氢化酶3和/或4蛋白同源的蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物Moth_2182YP_43101483591005热醋穆尔氏菌Moth_2183YP_43101583591006热醋穆尔氏菌Moth_2184YP_43101683591007热醋穆尔氏菌Moth_2185YP_43101783591008热醋穆尔氏菌Moth_2186YP_43101883591009热醋穆尔氏菌Moth_2187YP_43101983591010热醋穆尔氏菌Moth_2188YP_43102083591011热醋穆尔氏菌Moth_2189YP_43102183591012热醋穆尔氏菌Moth_2190YP_43102283591013热醋穆尔氏菌Moth_2191YP_43102383591014热醋穆尔氏菌Moth_2192YP_43102483591015热醋穆尔氏菌
另外，编码氢化酶功能性的几个基因簇存在于热醋穆尔氏菌中，它们的对应蛋白序列提供在下面。
GenBank IDGI号生物蛋白Moth_0439YP_42931383589304热醋穆尔氏菌Moth_0440YP_42931483589305热醋穆尔氏菌Moth_0441YP_42931583589306热醋穆尔氏菌Moth_0442YP_42931683589307热醋穆尔氏菌Moth_0809YP_42967083589661热醋穆尔氏菌Moth_0810YP_42967183589662热醋穆尔氏菌Moth_0811YP_42967283589663热醋穆尔氏菌Moth_0812YP_42967383589664热醋穆尔氏菌Moth_0814YP_42967483589665热醋穆尔氏菌Moth_0815YP_42967583589666热醋穆尔氏菌Moth_0816YP_42967683589667热醋穆尔氏菌Moth_1193YP_43005083590041热醋穆尔氏菌Moth_1194YP_43005183590042热醋穆尔氏菌Moth_1195YP_43005283590043热醋穆尔氏菌
Moth_1196YP_43005383590044热醋穆尔氏菌Moth_1717YP_43056283590553热醋穆尔氏菌Moth_1718YP_43056383590554热醋穆尔氏菌Moth_1719YP_43056483590555热醋穆尔氏菌Moth_1883YP_43072683590717热醋穆尔氏菌Moth_1884YP_43072783590718热醋穆尔氏菌Moth_1885YP_43072883590719热醋穆尔氏菌Moth_1886YP_43072983590720热醋穆尔氏菌Moth_1887YP_43073083590721热醋穆尔氏菌Moth_1888YP_43073183590722热醋穆尔氏菌Moth_1452YP_43030583590296热醋穆尔氏菌Moth_1453YP_43030683590297热醋穆尔氏菌Moth_1454YP_43030783590298热醋穆尔氏菌
富养产碱菌H16使用氢作为能源，使用氧作为末端电子受体。它的膜结合的吸收[NiFe]‑氢化酶是“耐O2的”氢化酶(Cracknell,等人Proc Nat Acad Sci,106(49)20681‑20686(2009))，所述氢化酶是周质朝向的，且通过b‑型细胞色素与呼吸链相连(Schink和Schlegel,Biochim.Biophys.Acta,567,315‑324(1979);Bernhard等人,Eur.J.Biochem.248,179‑186(1997))。富养产碱菌也含有耐O2的可溶性的氢化酶，所述氢化酶由Hox操纵子编码，是细胞质的，且以氢为代价直接地还原NAD+(Schneider和Schlegel,Biochim.Biophys.Acta452,66‑80(1976);Burgdorf,J.Bact.187(9)3122‑3132(2005))。可溶性的氢化酶另外存在于几种其它的生物中，包括Geobacter sulfurreducens(Coppi,Microbiology151,1239‑1254(2005))、集胞藻菌株PCC6803(Germer,J.Biol.Chem.,284(52)，36462‑36472(2009))和桃红荚硫菌(Rakhely，Appl.Environ.Microbiol.70(2)722‑728(2004))。集胞藻酶能够从氢产生NADPH。得自集胞藻菌株PCC6803的Hox操纵子和得自念珠藻菌株PCC7120的Hyp操纵子编码的附加基因的过量表达，会导致与单独的Hox基因表达相比增加的氢化酶活性(Germer，J.Biol.Chem.284(52)，36462‑36472(2009))。
蛋白GenBank IDGI号生物HoxFNP_942727.138637753富养产碱菌H16HoxUNP_942728.138637754富养产碱菌H16HoxYNP_942729.138637755富养产碱菌H16HoxHNP_942730.138637756富养产碱菌H16HoxWNP_942731.138637757富养产碱菌H16HoxINP_942732.138637758富养产碱菌H16
HoxENP_953767.139997816Geobacter sulfurreducensHoxFNP_953766.139997815Geobacter sulfurreducensHoxUNP_953765.139997814Geobacter sulfurreducensHoxYNP_953764.139997813Geobacter sulfurreducensHoxHNP_953763.139997812Geobacter sulfurreducensGSU2717NP_953762.139997811Geobacter sulfurreducensHoxENP_441418.116330690集胞藻菌株PCC 6803HoxFNP_441417.116330689集胞藻菌株PCC 6803未知功能NP_441416.116330688集胞藻菌株PCC 6803HoxUNP_441415.116330687集胞藻菌株PCC 6803HoxYNP_441414.116330686集胞藻菌株PCC 6803未知功能NP_441413.116330685集胞藻菌株PCC 6803未知功能NP_441412.116330684集胞藻菌株PCC 6803HoxHNP_441411.116330683集胞藻菌株PCC 6803HypFNP_484737.117228189念珠藻菌株PCC 7120HypCNP_484738.117228190念珠藻菌株PCC 7120HypDNP_484739.117228191念珠藻菌株PCC 7120未知功能NP_484740.117228192念珠藻菌株PCC 7120HypENP_484741.117228193念珠藻菌株PCC 7120HypANP_484742.117228194念珠藻菌株PCC 7120HypBNP_484743.117228195念珠藻菌株PCC 7120
Hox1EAAP50519.137787351桃红荚硫菌Hox1FAAP50520.137787352桃红荚硫菌Hox1UAAP50521.137787353桃红荚硫菌Hox1YAAP50522.137787354桃红荚硫菌Hox1HAAP50523.137787355桃红荚硫菌
下面描述了几种酶和对应的基因，它们用于将二氧化碳固定为丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸，以形成TCA循环中间体草酰乙酸或苹果酸。
磷酸烯醇丙酮酸至草酰乙酸的羧化，是由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化。示例性的PEP羧化酶是由下述基因编码：大肠杆菌中的ppc(Kai等人,Arch.Biochem.Biophys.414:170‑179(2003)，扭脱甲基杆菌AM1中的ppcA(Arps等人,J. Bacteriol.175:3776‑3783(1993)，和谷氨酸棒杆菌中的ppc(Eikmanns等人,Mol.Gen.Genet.218:330‑339(1989).
蛋白GenBank IDGI号生物PpcNP_41839116131794大肠杆菌ppcAAAB5888328572162扭脱甲基杆菌PpcABB5327080973080谷氨酸棒杆菌
将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的一种替代酶是PEP羧基激酶，其在羧化PEP的同时形式ATP。在大多数生物中，PEP羧基激酶发挥糖原异生功能，并以1摩尔ATP为代价将草酰乙酸转化成PEP。酿酒酵母是一种这样的生物，它的天然PEP羧基激酶PCK1发挥糖原异生作用(Valdes‑Hevia等人,FEBSLett.258:313‑316(1989)。大肠杆菌是另一种这样的生物，因为认为与PEP羧化酶（其不形成ATP，可能是由于PEP羧基激酶对碳酸氢盐的更高Km）相比，PEP羧基激酶在生产草酰乙酸中的作用是次要的(Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.70:1238‑1241(2004))。尽管如此，最近已经在大肠杆菌K‑12的ppc突变体中证实了天然的大肠杆菌PEP羧基激酶从PEP向草酰乙酸的活性(Kwon等人,J.Microbiol.Biotechnol.16:1448‑1452(2006))。这些菌株没有表现出生长缺陷，且在高NaHCO3浓度具有增加的琥珀酸生产。大肠杆菌的突变株可以采用Pck作为适应进化以后的优势CO2固定酶(Zhang等人2009)。在有些生物、特别是瘤胃细菌中，PEP羧基激酶可非常有效地从PEP生成草酰乙酸，并产生ATP。已经克隆进大肠杆菌中的PEP羧基激酶基因的实例包括：得自产琥珀酸曼氏杆菌(Lee等人,Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95‑99(2002))、产琥珀酸厌氧螺菌(Laivenieks等人,Appl.Environ.Microbiol.63:2273‑2280(1997)和产琥珀酸放线杆菌(Kim等人出处同上)的那些。由流感嗜血杆菌编码的PEP羧基激酶可有效地从PEP形成草酰乙酸。
蛋白GenBank IDGI号生物PCK1NP_0130236322950酿酒酵母pckNP_417862.116131280大肠杆菌pckAYP_089485.152426348产琥珀酸曼氏杆菌pckAO09460.13122621产琥珀酸厌氧螺菌pckAQ6W6X575440571产琥珀酸放线杆菌pckAP43923.11172573流感嗜血杆菌
以1摩尔ATP为代价，丙酮酸羧化酶(EC6.4.1.1)将丙酮酸直接转化为草酰乙酸。丙酮酸羧化酶是由下述基因编码：在酿酒酵母中的PYC1(Walker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210‑1217(1991)和PYC2(Walker等人,出处同上)，和在耻垢分枝杆菌中的pyc(Mukhopadhyay和Purwantini,Biochim.Biophys.Acta1475:191‑206(2000))。
蛋白GenBank IDGI号生物PYC1NP_0114536321376酿酒酵母PYC2NP_0097776319695酿酒酵母PycYP_890857.1118470447耻垢分枝杆菌
以1个还原当量为代价，苹果酸酶可以用于将CO2和丙酮酸转化成苹果酸。用于该目的的苹果酸酶可以包括、但不限于：苹果酸酶(NAD依赖性的)和苹果酸酶(NADP依赖性的)。例如，可以表达大肠杆菌苹果酸酶(Takeo,J.Biochem.66:379‑387(1969))或具有更高活性的类似酶之一，以实现丙酮酸和CO2向苹果酸的转化。通过将碳固定为丙酮酸（而不是PEP），苹果酸酶允许丙酮酸激酶保留得自PEP的高能磷酸键，由此在丙酮酸的形成中或通过磷酸转移酶系统产生ATP，用于葡萄糖运输。尽管通常假定苹果酸酶在从苹果酸形成丙酮酸的方向工作，已经证实，由maeA编码的NAD依赖性的酶的过量表达会增加大肠杆菌中的琥珀酸生产，同时通过在碳固定方向的工作而修复在厌氧条件下致命的Δpfl‑ΔldhA表型(Stols和Donnelly,Appl.Environ.Microbiol.63(7)2695‑2701(1997))。在大肠杆菌中过量表达得自猪蛔虫的苹果酸酶以后，得到类似的观察结果(Stols等人,Appl.Biochem.Biotechnol.63‑65(1)，153‑158(1997))。第二种大肠杆菌苹果酸酶（由maeB编码）是NADP依赖性的，也会将草酰乙酸和其它α‑酮酸脱羧(Iwakura等人,J.Biochem.85(5):1355‑65(1979))。
蛋白GenBank IDGI号生物maeANP_41599690111281大肠杆菌maeBNP_41695816130388大肠杆菌NAD‑MEP27443126732猪蛔虫
用于通过TCA循环的还原支路将草酰乙酸(由例如PEP羧化酶、PEP羧基激酶或丙酮酸羧化酶形成)或苹果酸(由例如苹果酸酶或苹果酸脱氢酶形成)转化成琥珀酰辅酶A的酶是：苹果酸脱氢酶、延胡索酸脱水酶(延胡索酸酶)、延胡索酸还原酶和琥珀酰辅酶A转移酶。上文描述了每种酶的基因。
用于工程改造微生物中的从琥珀酰辅酶A至各种产物的途径的酶、基因和方法，现在是本领域已知的。当使用基于碳水化合物的原料时，如本文所公开地从CO和/或H2得到的额外还原当量会提高2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的收率。例如，通过在图20中图解的途径，可以从琥珀酰辅酶A生成2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯。用于将琥珀酰辅酶A转化为2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇或1,3‑丁二烯的示例性酶包括：琥珀酰辅酶A:乙酰辅酶A酰基转移酶，3‑氧代己二酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，3‑氧代己二酸脱氢酶，2‑富马酰乙酸脱羧酶，3‑氧代戊‑4‑烯酸还原酶，3‑羟基戊‑4‑烯酸脱水酶，3‑氧代己二酰辅酶A还原酶，3‑羟基己二酰辅酶A转移酶、合成酶或水解酶，3‑羟基己二酸脱氢酶，3‑羟基己‑4‑烯二酸脱羧酶，3‑氧代己二酸还原酶，2‑富马酰乙酸还原酶，3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶，2,4‑戊二烯酸脱羧酶。
用于工程改造微生物中的从糖酵解中间体至各种产物的途径的酶、基因和方法，是本领域已知的。如本文所述从CO和H2得到的额外还原当量会提高以碳水化合物为原料的所有这些产物的收率。
实施例X
用于处理CO和厌氧培养物的方法
本实施例描述了用于处理CO和厌氧培养物的方法。
A.处理少量CO以用于分析和小规模培养。CO是一种无嗅、无色且无味的有毒气体。因此，需要对利用CO的培养和分析作特别处理。若干种分析（包括CO氧化、乙酰辅酶A合成、使用肌红蛋白的CO浓度、和在小批次培养物中的CO耐受/利用）需要在通风橱内分配和处理少量CO气体。生化分析要求先用CO饱和极小量（<2ml)的生化分析培养基或缓冲液，然后进行所述分析。所有的CO处理步骤都是在通风橱中执行，其中将橱框设定在适当高度，并开启鼓风机；从压缩气体贮气筒和与Schlenk管线相连的调节器，分配CO。所述调节器确保，将等浓度的CO分配至几个可能的容器或瓶中的每一个。Schlenk管线被设置为在输入侧具有氧洗涤器，且在另一侧具有油压释放鼓泡器和排气口。分析容器是无氧的，但含有CO。因此，分析容器用橡胶塞完全密封，使用气密性的针头和注射器进行试剂的添加或移除。其次，在密封塞好的血清瓶中，使小量（约50ml)培养物在饱和CO下生长。和生化分析一样，使用Schlenk管线配置，在通风橱中平衡CO饱和的微生物培养物。生化分析和微生物培养都是在便携式密封容器中以小体积进行，这有助于通风橱外部的安全处理。压缩CO储罐与通风橱紧邻。
通常，使用Schlenk管线将CO分配到容器，所述容器各自通风。用19或20号一次性注射器针头刺穿容器上的橡胶塞，并通过所述针头通风。油鼓泡器与CO储罐和氧洗涤器一起使用。分光光度计的玻璃或石英比色皿在顶部具有圆孔，其中安装有Kontes止动套筒Sz7774250‑0007。CO检测器单元安置在通风橱附近。
B.供给到大规模培养物的较大量CO的处理。对发酵培养物供给CO或CO和H2的混合物，以模拟在发酵生产中作为原料的合成气。因此，1升到几升范围内的细胞数量可以包括添加CO气体以增加CO在培养基中的溶解浓度。在这些情况下，向培养物中添加连续施用的相当大量的CO气体。在不同点，收集培养物或移出样品。或者，使用作为发酵罐的一部分的集成式连续流离心机，收集细胞。
发酵过程在厌氧条件下进行。在一些情况下，为了确保足够的氧饱和度以便提供呼吸环境，将氧气或空气泵入发酵罐中是不经济的。此外，厌氧发酵期间产生的还原力可能是产物形成而不是呼吸所必需的。此外，用于不同途径的许多酶具有不同程度的氧敏感性。诸如热醋穆尔氏菌等经典产乙酸菌是专性厌氧菌，且Wood‑Ljungdahl途径中的酶非常容易由分子氧引起不可逆的失活。虽然存在耐氧的产乙酸菌，但Wood‑Ljungdahl途径中的全部酶可能在氧存在下都是不相容的，因为大多数是金属酶，关键组分是铁氧还蛋白，且调控可使代谢从Wood‑Ljungdahl途径偏离，使能量获得最大化。同时，培养物中的细胞充当氧清除剂，其缓和在大规模细胞生长的存在下对极端措施的需求。
C.厌氧培养室和条件。示例性厌氧培养室可从市面购得(参见，例如，Vacuum Atmospheres Company，Hawthorne CA;MBraun,Newburyport MA)。条件包括1ppm或以下的O2浓度和1atm的纯N2。在一个实施例中，使用3个氧洗漆器/催化剂再生器，且培养室包括1个O2电极(诸如Teledyne;City of Industry CA)。在打开内部室门之前，几乎所有的物品和试剂都在培养室的气压过渡舱中循环4次。体积大于5ml的试剂在引入培养室之前经纯N2鼓泡。手套每年更换2次，且当培养室对氧水平变化所作出的反应日益缓慢时，定期再生催化剂容器。通过由螺线管启动的单向阀，控制培养室的压力。这种特征允许将培养室压力设定在高于环境的水平，以便能经由放气阀转移非常小的容器。
厌氧培养室会实现始终很低的且为对氧高度敏感的厌氧条件所必需的O2水平。然而，细胞的生长和处理通常不需要所述预防措施。在一个替代性的厌氧培养室配置中，铂或钯可用作催化剂，其需要混合物中存在一些氢气。不是使用电磁阀，压力释放可由鼓泡器控制。不是使用基于仪器的O2监测，可替代性地使用测试条（test strip)。
D.厌氧微生物学。如上文关于CO处理所述，处理小规模培养物。具体地，用厚橡胶塞装备血清或培养基瓶，并使用铝封皮密封瓶子。以常规方式制备例如Terrific Broth等培养基，并分配到适当大小的血清瓶中。用氮气充填瓶子，维持约30分钟的中等起泡。这会从培养基中移除大部分的氧，且在此步骤之后，每个瓶子都用橡胶塞（例如Bellco20mm隔膜塞；Bellco,Vineland,NJ)盖好，并用封皮密封(Bellco20mm)。然后，使用缓慢（液体）排气循环，用对培养基瓶进行高压灭菌。在高压灭菌期间，至少有时用针头戳穿塞子以提供排气；所述针头需要在瓶子从高压锅移除之后立即移除。经由注射器和针头向无菌培养基中添加其余的培养基组分，例如缓冲液或抗生素。在添加还原剂之前，用氮（或CO，这取决于用途）将瓶子平衡30‑60分钟。可添加例如100x150mM硫化钠、200mM半胱氨酸‑HCl等还原剂。这可如下完成：将硫化钠称重到干燥烧杯中，并将半胱氨酸称重到血清瓶中，将两者放到厌氧培养室中，在无氧水中溶解硫化钠，然后将其添加到血清瓶内的半胱氨酸中。血清瓶应立即塞好，因为硫化钠溶液会在接触半胱氨酸之后产生硫化氢气体。当注射入培养物时，使用注射器式滤器来灭菌溶液。经由注射器针头添加其它组分，例如B12（10μM氰基钴胺素）、氯化镍（NiCl2,20μM终浓度，从在培养室中在无氧水中的40mM储备液制备，并通过高压灭菌或通过在注射入培养物之后使用注射器式滤器进行灭菌）和硫酸亚铁铵（最终浓度是100μM，在培养室中在无氧水中制备为100‑1000x储备溶液，并通过高压灭菌或通过在注射入培养物之后使用注射器式滤器进行灭菌）。为了促进在厌氧条件下更快地生长，用50mL厌氧生长的预培养物接种1升瓶子。通过添加最终浓度为0.2mM的异丙基β‑D‑1‑硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在载体中诱导pA1‑lacO1启动子，且所述过程进行约3小时。
在鼓泡的同时，使用连续气体添加，在较大瓶子中培养大规模培养物。在培养基添加以后，将具有金属鼓泡器的橡胶塞放于瓶子中，并在装配瓶子的剩余部分之前，用氮气鼓泡30分钟或以上。将每个瓶子装配到一起，使得无菌过滤器可对鼓入的气体除菌，且瓶子上的软管可用小C型夹钳压缩。用磁力搅拌棒搅拌培养基和细胞。一旦添加完所有的培养基组分和细胞，在培养箱中在室内空气中温育瓶子，但是用氮气向瓶子连续鼓泡。
实施例XI
CO氧化（CODH)分析
本实施例描述了用于测量CO氧化(CO脱氢酶;CODH)的分析方法。
将热醋穆尔氏菌的7基因CODH/ACS操纵子克隆到大肠杆菌表达载体中。克隆完整的约10kbp DNA片段，在此区域中的一些基因可能从其自身的内源启动子表达，且所有基因都含有内源核糖体结合位点。使用定量测量CODH活性的分析，对这些克隆的CO氧化进行分析。将热醋穆尔氏菌基因产物的抗血清用于蛋白质印迹，以估测比活度。热醋穆尔氏菌是革兰氏阳性菌，且预期核糖体结合位点元件可在大肠杆菌中良好工作。估测的活性（在下文更详细地描述）为热醋穆尔氏菌比活度的约1/50。重组大肠杆菌细胞的CODH活性可能受限于下述事实：热醋穆尔氏菌酶具有约55℃的最佳温度。因此，嗜温的CODH/ACS途径可能是有利的，例如嗜温且不具有表观完整的CODH/ACS操纵子和Wood‑Ljungdahl途径的穆尔氏菌的近亲物种，即Desulfitobacterium hafniense。作为潜在宿主生物的产乙酸菌包括、但不限于：红红螺菌、热醋穆尔氏菌和Desulfitobacterium hafniense。
CO氧化在CODH/ACS分析中是最灵敏的也是最可靠的。基于大肠杆菌的合成气利用系统最终可能需要像梭菌（即穆尔氏菌）系统一样厌氧，特别是对于最大活性来说。对CODH的改进是可能的，但最终会受CO气体的水溶性限制。
最初，将每种基因单独地克隆到表达载体中。产生用于每个复合物中多个亚基的组合表达单元。在蛋白质水平测定在大肠杆菌中的表达。获得组合的热醋穆尔氏菌CODH/ACS操纵子和单个表达克隆。
CO氧化分析。所述分析是Wood‑Ljungdahl途径内的酶活性的更简单、更可靠且更通用的分析法之一，并且用于测试CODH(Seravalli等人,Biochemistry 43:3944‑3955(2004))。热醋穆尔氏菌CODH比活度的典型活性是，在55℃是500U，或在25℃是约60U。该分析利用在CO存在下甲基紫精的还原作用。这在塞紧的无氧玻璃容器中在578nm进行测量。
更详细地说，如下制备用橡胶塞塞紧的玻璃容器：首先用去离子水洗涤该容器4次，并用丙酮洗涤1次。将少量的真空润滑脂涂抹在橡胶垫圈的顶部。用CO给容器充气，并用22号针头和排气针头干燥10分钟。使用22号针头添加0.98mL体积的反应缓冲液(50mM Hepes,pH8.5,2mM二硫苏糖醇(DTT))，其中排气针头开启，并存在100%CO。甲基紫精（CH3紫精）储备液为1M水溶液。每个分析使用20微升，最终浓度为20mM。当添加甲基紫精时，使用18号针头（部分）作为夹套，以利于使用Hamilton注射器抽出CH3紫精。抽出4‑5个等分试样并丢弃，以对注射器进行洗涤和气体平衡。在制备CH3紫精储备液时，添加少量的连二亚硫酸钠（0.1M储备液），以稍微还原CH3紫精。在被加热的Olis分光光度计(Bogart GA)中，将温度平衡到55℃。首先进行空白反应（CH3紫精+缓冲液），以测量CH3紫精还原的基准速率。ACS90和ACS91(分别具有和不具有第一个cooC的热醋穆尔氏菌的CODH‑ACS操纵子）的粗制大肠杆菌细胞提取物。每次添加10微升提取物，混合并分析。被还原的CH3紫精变成紫色。分析结果显示在表I中。
表I.粗制提取物的CO氧化活性。

Mta98/Mta99是表达来自热醋穆尔氏菌的甲醇甲基转移酶基因的大肠杆菌MG1655菌株，且因此是含有热醋穆尔氏菌CODH操纵子的ACS90ACS91大肠杆菌菌株的阴性对照。
如果约1%的细胞蛋白是CODH，那么这些数字将是纯的热醋穆尔氏菌CODH的500U/mg活性的大约1/100。基于蛋白质印迹的实际估算值是0.5%的细胞蛋白，因此活性是热醋穆尔氏菌CODH的约1/50。尽管如此，所述实验证实重组大肠杆菌中的CO氧化活性，在阴性对照中的量远远更小。在阴性对照中观察到的少量CO氧化(CH3紫精还原）表明，大肠杆菌可能具有有限的还原CH3紫精的能力。
为了估测CODH和Mtr蛋白的最终浓度，对用于CO氧化、ACS、甲基转移酶和类咕啉Fe‑S分析中的相同细胞提取物执行SDS‑PAGE和随后的蛋白质印迹分析。所用抗血清是针对纯化的热醋穆尔氏菌CODH‑ACS和Mtr蛋白的多克隆，并使用碱性磷酸酶‑连接的山羊‑抗‑兔第二抗体显影。执行蛋白质印迹分析，结果显示在图24中。通过与对照泳道对比，估测ACS90和ACS91中的CODH量为50ng。经由蛋白质印迹分析，确认包含2个CODH亚基的CODH‑ACS操纵子基因和甲基转移酶的表达。因此，重组大肠杆菌细胞表达7基因操纵子的多个组分。此外，甲基转移酶和类咕啉铁硫蛋白在相同的大肠杆菌细胞中皆具有活性。这些蛋白质是克隆到相同细胞中的相同操纵子的部分。
使用热醋穆尔氏菌细胞的提取物作为阳性对照，重复CO氧化分析。虽然在大肠杆菌ACS90和ACS91中的CODH活性是可测量的，但其只有热醋穆尔氏菌对照的约1/130‑1/150。分析结果显示在图25中。简言之，如上文所述，培养细胞（具有CODH/ACS操纵子的热醋穆尔氏菌或大肠杆菌；ACS90或ACS91或空载体:pZA33S)，并制备提取物。在提取物制备当天的各个时间点，如上所述在55℃执行分析。历经120秒时程，在578nm跟踪甲基紫精的还原。
这些结果描述了CO氧化（CODH)分析和结果。重组大肠杆菌细胞表达CO氧化活性，后者通过甲基紫精还原分析来测量。
实施例XII
大肠杆菌CO耐受实验和CO浓度分析（肌红蛋白分析）
本实施例描述了大肠杆菌对于高浓度CO的耐受性。
为了测试大肠杆菌是否可在饱和量的CO存在下厌氧生长，如上文关于厌氧微生物学所述，以小体积在具有50ml Terrific Broth培养基（加入还原溶液、NiCl2、Fe(II)NH4SO4、氰基钴胺素、IPTG和氯霉素）的120ml血清瓶中进行培养。这些瓶子中的一半用氮气平衡30分钟，另一半则用CO气体平衡30分钟。使用空载体(pZA33)作为对照，并用N2和CO测试含有pZA33空载体以及ACS90和ACS91二者的培养物。接种所有培养物，并在37℃于振荡（250rpm)下培养36小时。在36小时时段结束时，检查烧瓶，发现总共有大量的生长。观察到的生长在过夜后整体发生较长迟滞。
鉴于所有培养物似乎在CO存在下都良好生长，确认了最终CO浓度。这通过分析肌红蛋白在暴露于CO后的谱移来进行。经连二亚硫酸钠还原的肌红蛋白具有在435nm的吸收峰；该峰在使用CO的情况下迁移至423nm。因为低波长并且需要记录从300nm向上的全波谱，所以必须使用石英比色皿。相对于标准曲线，测量CO浓度，且其取决于在20℃和1大气压时的最大水溶解度为970微摩尔的CO的亨利定律常数。
就CO浓度的肌红蛋白试验而言，将容器用水洗涤10次，用丙酮洗涤1次，然后与CODH分析一样用塞子塞紧。向容器中吹入N2，持续约10分钟。用Hamilton注射器，向空白(未经CO平衡）中添加1ml体积的无氧缓冲液(HEPES,pH8.0,2mM DTT)。添加10微升体积的肌红蛋白（约1mM，可变化，只不过需要相当大的量）和1微升连二亚硫酸盐（20mM储备液）。使用以1微升的增量添加的CO饱和缓冲液，获得CO标准曲线。记录每个增量的峰高和峰移。测试的培养物是pZA33/CO、ACS90/CO和ACS91/CO。这些培养物各自是以1微升的增量添加到同一容器中。在实验中途，设置第二容器并加以使用。结果显示在表II中。
表II.一氧化碳浓度，36小时。

表II所示的结果表明，无论菌株是否在CO存在下培养，培养物都可生长。这些结果表明，大肠杆菌可耐受在厌氧条件下向CO的暴露，并且表达CODH‑ACS操纵子的大肠杆菌细胞可代谢一些CO。
这些结果证实，大肠杆菌细胞无论是否表达CODH/ACS，都能在饱和量的CO存在下生长。此外，这些细胞与用氮替换CO的对照组一样好地生长。这个实验证实，大肠杆菌实验室菌株对在正常大气压下执行的合成气计划中可实现的水平的CO不敏感。此外，初步实验表明，表达CODH/ACS的重组大肠杆菌细胞实际上消耗一些CO，可能是通过氧化为二氧化碳。
实施例XIII
用于形成1,3‑丁二烯和3‑丁烯‑1‑醇的3‑羟酸脱羧酶
3‑羟酸脱羧酶催化ATP驱动的3‑羟酸向烯烃衍生物的脱羧。最近已经描述，3‑羟酸脱羧酶催化异丁烯、丙烯和乙烯的形成(WO2010/001078，和Gogerty和Bobik，Appl.Environ.Microbiol.,第8004‑8010页,第76卷,第24期(2010))。我们在这里提议，使用类似的酶催化3‑羟基戊‑4‑烯酸(3HP4)向1,3‑丁二烯的转化（显示在图16中）和3,5‑二羟基戊酸向3‑丁烯‑1‑醇的转化（显示在图17中）。3‑丁烯‑1‑醇产物然后可以通过化学脱水或生物脱水（经由3‑丁烯‑1‑醇脱水酶）转化成丁二烯。
3‑羟基戊‑4‑烯酸向丁二烯的转化是由3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶实现。类似地，3,5‑二羟基戊酸向3‑丁烯‑1‑醇的转化是由3,5‑二羟基戊酸脱羧酶实现。这样的酶可以具有与焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶或二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的相似性。一种潜在的3‑羟基戊‑4‑烯酸脱羧酶是酿酒酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(ScMDD或ERG19)，其经证实会将3‑羟基‑3‑甲基丁酸(3‑HMB)转化成异丁烯(Gogerty和Bobik,2010,Appl.Environ.Microbiol.,第8004‑8010页,第76卷,第24期)。所述酶的2种改进变体ScMDD1(I145F)和ScMDD2(R74H)，经证实会实现与野生型His‑标记的酶相比19倍和38倍增加。下面提供了ERG19和其它酶候选物。

实施例XIV
3‑丁烯‑1‑醇化学脱水为丁二烯
通过在适当的条件下与合适的脱水催化剂反应，可以将醇转化成烯烃。将醇（诸如丁醇和戊醇）转化成烯烃的典型脱水催化剂包括：各种酸处理过的和未处理过的氧化铝（例如，γ‑氧化铝）和二氧化硅催化剂和包括沸石在内的粘土（例如，β‑型沸石、ZSM‑5或Y‑型沸石、氟化物处理过的β‑沸石催化剂、氟化物处理过的粘土催化剂等），磺酸树脂（例如，磺化的苯乙烯树脂诸如15），强酸诸如磷酸和硫酸，路易斯酸诸如三氟化硼和三氯化铝，和许多不同类型的金属盐，包括金属氧化物（例如，氧化锆或二氧化钛）和金属氯化物（例如，Latshaw B E，Dehydration of Isobutanol to Isobutylene in a Slurry Reactor,Department of Energy Topical Report（能源部主题报告）,1994年2月）。
使用非均相和均相催化剂系统，在许多不同的反应器构型中，可以在气相和液相中进行脱水反应。通常，使用的催化剂对在反应中产生的水是稳定的。通常从含有产物的反应区中除去水。得到的烯烃作为气相或液相(例如，取决于反应器条件)离开反应器并被下游纯化过程捕获，或者进一步在所述反应器中转化成本文所述的其它化合物(诸如丁二烯或异戊二烯)。由脱水反应产生的水与未反应的醇和烯烃产物一起离开反应器，并通过蒸馏或相分离进行分离。因为在脱水步骤中产生大量的水，使用的脱水催化剂通常可耐受水，并且用于从底物和产物中除去水的方法可以是含有脱水步骤的任何过程的一部分。因为该原因，可能使用湿的(即，按重量计算，最多约95%或98%的水)醇作为脱水反应的底物，并将该水与脱水反应产生的水一起除去(例如，使用在美国专利号4,698,452和4,873,392中所述的沸石催化剂)。另外，中性氧化铝和沸石会将醇脱水为烯烃，但是与这些催化剂的酸性形式相比，通常在更高的温度和压力。
将3‑丁烯‑1‑醇脱水为丁二烯，是本领域熟知的(Gustav.Egloff和George.Hulla,Chem.Rev.,1945,36(1)，pp63‑141)。例如，在1,4‑丁二醇脱水为1,3‑丁二烯的过程中，3‑丁烯‑1‑醇作为中间体形成(Sato,等人,Catalysis Communications,5(8)，2004,第397‑400页)。
实施例XV
通向2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇和1,3‑丁二烯的途径
本实施例描述了通向2,4‑戊二烯酸、3‑丁烯‑1‑醇和1,3‑丁二烯的途径。通向中间体3HP4、3,5‑二羟基戊酸和3‑丁烯‑1‑醇的新颖途径显示在图18‑21中。通向3HP4的途径显示在图18、19和20中(新的)。通向3,5‑二羟基戊酸和3‑丁烯‑1‑醇的途径显示在图19和21中(新的)。通向丁二烯前体2,4‑戊二烯酸的其它途径显示在图19、20和21中(新的)。
在以前的实施例(参见例如，图4、12、13、14和15)中公开了通向2,4‑戊二烯酸的几种途径。2,4‑戊二烯酸的水合会产生3‑羟基戊‑4‑烯酸，如图18所示(新的)。3‑羟基戊‑4‑烯酸随后可以被3‑羟酸脱羧酶脱羧为丁二烯，也如上所述。
从丙烯酰辅酶A和3‑HP‑CoA至2,4‑戊二烯酸的其它途径显示在图19中。在这里也显示了通向3HP4、3‑丁烯‑1‑醇和丁二烯的途径。
从丙烯酰辅酶A至3HP4的途径包括：步骤M/O/P、步骤M/N/T。
从3‑HP‑CoA至3HP4的途径包括：步骤A/L/O/P、步骤A/L/N/T。
从琥珀酰辅酶A至3HP4和24PD的途径显示在图20中。首先由3‑氧代己二酰辅酶A硫解酶连接琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，以形成3‑氧代己二酰辅酶A(步骤A)。在一个途径中，3‑氧代己二酰辅酶A的3‑氧代基团被还原，以形成3‑羟基己二酰辅酶A(步骤G)。然后由CoA水解酶、合成酶或转移酶，将CoA部分转化成酸基团。然后氧化3‑羟基己二酸，以形成3‑羟基己‑4‑烯二酸(步骤I)。然后将该产物脱羧，以形成3HP4。在一个替代途径中，在步骤B中，由CoA转移酶、合成酶或水解酶，将3‑氧代己二酰辅酶A转化成3‑氧代己二酸。然后将3‑氧代己二酸还原为3‑羟基己二酸(步骤K)，后者如前所述转化成3HP4。可替换地，在步骤C中，将3‑氧代己二酸转化成2‑富马酰乙酸。然后将2‑富马酰乙酸的3‑氧代基团还原为3‑羟基己‑4‑烯二酸，后者脱羧为3HP4。在另一个实施方案中，将所述2‑富马酰乙酸脱羧，以形成3‑氧代戊‑4‑烯酸(步骤D)，后者随后还原为3HP4(步骤E)。3HP4然后可以如下转化成丁二烯：在一步中，通过3HP4脱羧酶的脱羧(步骤M)，或在两步中，先脱水为2,4‑戊二烯，再脱羧(步骤F,N)。
从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A至3‑丁烯‑1‑醇、丁二烯和2,4‑戊二烯酸的途径显示在图21中。在这些途径中，由硫解酶连接丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A，以形成3‑氧代戊二酰辅酶A。然后通过几个替代途径(步骤B/C/D，步骤B/G，步骤H/I/J，步骤H/L/D、K/J)，可以将该中间体转化成3,5‑二羟基戊酸。形成后，可以通过3‑羟酸脱羧酶将3,5‑二羟基戊酸脱羧，以形成3‑丁烯‑1‑醇(步骤M)。随后通过3‑丁烯‑1‑醇脱氢酶或化学催化剂进行脱水，得到丁二烯(步骤O)。可替换地，可以将3,5‑二羟基戊酸脱水为5‑羟基戊‑2‑烯酸，如在步骤E中所示。然后可以将该中间体脱羧为3‑丁烯‑1‑醇(步骤N)，或进一步脱水为2,4‑戊二烯酸(步骤F)。
通过EC编号(表1)，将用于催化图18‑21所示的转化的酶分类，并进一步描述在下面。

在图19‑21中显示的几种反应是由醇脱氢酶催化。这些反应包括：图19的步骤B、I、N和P，图20的步骤E、G、K和L，和图21的步骤B、D、I、J和L。
编码催化醛还原为醇的酶(即醇脱氢酶，或等同地称作醛还原酶)的示例性基因包括：编码C2‑C14的中链醇脱氢酶的alrA(Tani等人,Appl.Environ.Microbiol.66:5231‑5235(2000))，得自大肠杆菌的yqhD和fucO(Sulzenbacher等人,342:489‑502(2004)),和得自丙酮丁醇梭杆菌的bdh I和bdh II，其将丁醛转化成丁醇(Walter等人,174:7149‑7158(1992))。YqhD会催化宽范围的醛的还原，使用NADPH作为辅因子，偏好长于C(3)的链长度(Sulzenbacher等人,342:489‑502(2004);Perez等人,J Biol.Chem.283:7346‑7353(2008))。已经证实，得自运动发酵单胞菌E的adhA基因产物具有对许多醛的活性，所述醛包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛(Kinoshita等人,Appl Microbiol Biotechnol22:249‑254(1985))。其它醛还原酶候选物是由下述基因编码：在C.saccharoperbutylacetonicum中的bdh，和在拜氏梭菌中的Cbei_1722、Cbei_2181和Cbei_2421。在酿酒酵母中的其它醛还原酶基因候选物包括：醛还原酶GRE3、ALD2‑6和HFD1，乙醛酸还原酶GOR1和YPL113C，和甘油脱氢酶GCY1(WO2011/022651A1;Atsumi等人,Nature 451:86‑89(2008))。以前描述的用于催化甲基乙二醛还原为丙酮醇或乳醛的酶候选物也是合适的乳醛还原酶候选物。
蛋白GENBANK IDGI号生物alrABAB12273.19967138不动杆菌菌株M‑1ADH2NP_014032.16323961酿酒酵母yqhDNP_417484.116130909大肠杆菌fucONP_417279.116130706大肠杆菌bdhINP_349892.115896543丙酮丁醇梭杆菌bdhIINP_349891.115896542丙酮丁醇梭杆菌adhAYP_162971.156552132运动发酵单胞菌bdhBAF45463.1124221917Clostridium saccharoperbutylaetonicumCbei_1722YP_001308850150016596拜氏梭菌Cbei_2181YP_001309304150017050拜氏梭菌Cbei_2421YP_001309535150017281拜氏梭菌GRE3P38715.1731691酿酒酵母ALD2CAA89806.1825575酿酒酵母ALD3NP_013892.16323821酿酒酵母ALD4NP_015019.16324950酿酒酵母ALD5NP_010996.2330443526酿酒酵母ALD6ABX39192.1160415767酿酒酵母HFD1Q04458.12494079酿酒酵母GOR1NP_014125.16324055酿酒酵母YPL113CAAB68248.11163100酿酒酵母GCY1CAA99318.11420317酿酒酵母
表现出4‑羟基丁酸脱氢酶活性的酶(EC1.1.1.61)也属于此类。已经在富养产碱菌(Bravo等人,J Forens Sci,49:379‑387(2004))、克鲁氏梭状芽孢杆菌(Wolff等人,Proteins Expr.Purif.6:206‑212(1995))和拟南芥(Breitkreuz等人,J Biol Chem,278:41552‑41556(2003))中表征了这样的酶。在酵母中克隆和表征了拟南芥酶(Breitkreuz等人,J.Biol.Chem.278:41552‑41556(2003))。另一个基因是得自热葡糖苷酶土芽孢杆菌的醇脱氢酶adhI(Jeon等人,JBiotechnol135:127‑133(2008))。
蛋白GENBANK IDGI号生物4hbdYP_726053.1113867564富养产碱菌H164hbdL21902.1146348486克鲁氏梭状芽孢杆菌DSM 5554hbdQ94B0775249805拟南芥adhIAAR91477.140795502热葡糖苷酶土芽孢杆菌
另一种示例性的醛还原酶是甲基丙二酸半醛还原酶，也称作3‑羟基异丁酸脱氢酶(EC1.1.1.31)。该酶参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，并且已在细菌、真核生物和哺乳动物中鉴定。已在结构上表征了由得自嗜热栖热菌HB8的P84067编码的该酶(Lokanath等人,J MolBiol,352:905‑17(2005))。利用同位素标记的底物，证实了人3‑羟基异丁酸脱氢酶的可逆性(Manning等人,Biochem J，231:481‑4(1985))。编码该酶的其它基因包括：在智人(Hawes等人,Methods Enzymol,324:218‑228(2000))和穴兔(Hawes等人,出处同上;Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043‑2047(1996))中的3hidh，在铜绿假单孢菌和恶臭假单胞菌中的mmsB，和在恶臭假单胞菌中的dhat(Aberhart等人,J Chem.Soc.[Perkin1]6:1404‑1406(1979);Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043‑2047(1996);Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol Biochem.67:438‑441(2003))。已经表征了在还原方向的几种3‑羟基异丁酸脱氢酶，包括：得自铜绿假单孢菌的mmsB(Gokarn等人,美国专利739676,(2008))和得自恶臭假单胞菌的mmsB。
蛋白GENBANK IDGI号生物P84067P8406775345323嗜热栖热菌3hidhP31937.212643395智人3hidhP32185.1416872穴兔mmsBNP_746775.126991350恶臭假单胞菌mmsBP28811.1127211铜绿假单孢菌dhatQ59477.12842618恶臭假单胞菌
存在几种示例性的醇脱氢酶，它们将酮转化为羟基官能团。得自大肠杆菌的两种这样的酶是由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。另外，已经证实，得自富养产碱菌的乳酸脱氢酶表现出对不同链长度的2‑酮酸的高活性，包括乳酸、2‑氧代丁酸、2‑氧代戊酸和2‑氧代戊二酸(Steinbuchel等人,Eur.J.Biochem.130:329‑334(1983))。α‑酮己二酸转化为α‑羟己二酸，可由2‑酮己二酸还原酶催化，据报道该酶存在于大鼠和人胎盘中(Suda等人,Arch.Biochem.Biophys.176:610‑620(1976);Suda等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586‑591(1977))。
其它的氧化还原酶是得自人心脏的线粒体3‑羟基丁酸脱氢酶(bdh)，其已经被克隆并表征(Marks等人,J.Biol.Chem.267:15459‑15463(1992))。拜氏梭菌(Ismaiel等人,J.Bacteriol.175:5097‑5105(1993))和布氏热厌氧杆菌(Lamed等人,Biochem.J.195:183‑190(1981);Peretz等人,Biochemistry28:6549‑6555(1989))的醇脱氢酶会将丙酮转化成异丙醇。甲基乙基甲酮还原酶会催化MEK还原为2‑丁醇。在赤红球菌(Kosjek等人,Biotechnol Bioeng.86:55‑62(2004))和强烈火球菌(van der等人,Eur.J.Biochem.268:3062‑3068(2001))中可以发现示例性的MEK还原酶。
蛋白GenBank登记号GI号生物mdhAAC76268.11789632大肠杆菌ldhANP_415898.116129341大肠杆菌ldhYP_725182.1113866693富养产碱菌bdhAAA58352.1177198智人adhAAA23199.260592974拜氏梭菌NRRL B593adhP14941.1113443布氏热厌氧杆菌HTD4sadhCAD3647521615553赤红球菌adhAAAC255563288810强烈火球菌
许多生物可以催化4‑羟基‑2‑丁酮还原为1,3‑丁二醇，包括属于芽孢杆菌属、短颈细菌属、假丝酵母属和克雷伯菌属以及其它属的那些，如Matsuyama等人((1995))所述。还已经证实，突变的红球菌属苯乙醛还原酶(Sar268)和Leifonia醇脱氢酶会在高收率催化该转化(Itoh等人,Appl.Microbiol Biotechnol.75:1249‑1256(2007))。
将3‑氧代酰基辅酶A底物还原为它们的对应3‑羟酰辅酶A产物的醇脱氢酶，也与图19‑21描绘的途径有关。3‑氧代酰基辅酶A脱氢酶(EC1.1.1.35)会将3‑氧代酰基辅酶A分子转化成3‑羟酰辅酶A分子，并经常参与脂肪酸β‑氧化或苯乙酸分解代谢。例如，在大肠杆菌中的2种脂肪酸氧化复合物（由fadB和fadJ编码）的亚基起3‑羟酰辅酶A脱氢酶的作用(Binstock等人,Methods Enzymol.71Pt C:403‑411(1981))。鉴于大肠杆菌中的paaH与苯乙酸降解操纵子中的其它基因的近似(Nogales等人,153:357‑365(2007))和paaH突变体不能在苯乙酸上生长的事实(Ismail等人,Eur.JBiochem.270:3047‑3054(2003))，预见到，大肠杆菌paaH基因也编码3‑羟酰辅酶A脱氢酶。乙酰乙酰辅酶A还原酶在几种梭菌物种中参与乙酰辅酶A至丁酸的发酵途径，且已经被详细地研究(Jones等人,Microbiol Rev.50:484‑524(1986))。已经在大肠杆菌中克隆并功能性地表达了得自丙酮丁醇梭杆菌的该酶，其由hbd编码(Youngleson等人,J Bacteriol.171:6800‑6807(1989))。经证实会将乙酰乙酰辅酶A还原为3‑羟基丁酰辅酶A的其它基因是：得自生枝动胶菌的phbB(Ploux等人,Eur.J Biochem.174:177‑182(1988))和得自球形红杆菌的phaB(Alber等人,Mol.Microbio l61:297‑309(2006))。前一种基因是NADPH依赖性的，已经确定了它的核苷酸序列(Peoples等人,Mol.Microbiol3:349‑357(1989))，并已经在大肠杆菌中表达了该基因。对该基因的底物特异性研究已经得出结论，除了乙酰乙酰辅酶A以外，它还接受3‑氧代丙酰辅酶A作为底物(Ploux等人,Eur.JBiochem.174:177‑182(1988))。其它基因包括：在脱氮副球菌中的phaB，在克鲁氏梭状芽孢杆菌中的Hbd1(C‑端结构域)和Hbd2(N‑端结构域)(Hillmer和Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta3334:12‑23(1974))，和在欧洲牛中的HSD17B10(Wakil等人,JBiol.Chem.207:631‑638(1954))。已经在大肠杆菌中功能性地表达和表征了得自脱氮副球菌的该酶(Yabutani等人,FEMS Microbiol Lett.133:85‑90(1995))。已经在其它梭菌物种中和在勤奋生金球菌中发现了许多类似的酶(Berg等人,Science.318:1782‑1786(2007))。得自热带念珠菌的该酶是过氧化物酶体脂肪酸β‑氧化多功能酶2型(MFE‑2)的组分。该蛋白的脱氢酶B结构域对乙酰乙酰辅酶A具有催化活性。在大肠杆菌中功能性地表达了所述结构域，其晶体结构是可得到的，且其催化机制得到较好的理解(Ylianttila等人,Biochem Biophys Res Commun324:25‑30(2004);Ylianttila等人,J MolBiol 358:1286‑1295(2006))。
蛋白GENBANK IDGI号生物fadBP21177.2119811大肠杆菌fadJP77399.13334437大肠杆菌paaHNP_415913.116129356大肠杆菌Hbd2EDK34807.1146348271克鲁氏梭状芽孢杆菌Hbd1EDK32512.1146345976克鲁氏梭状芽孢杆菌HSD17B10O02691.33183024欧洲牛phbBP23238.1130017生枝动胶菌phaBYP_353825.177464321球形红杆菌phaBBAA08358675524脱氮副球菌HbdNP_349314.115895965丙酮丁醇梭杆菌HbdAAM14586.120162442拜氏梭菌Msed_1423YP_001191505146304189勤奋生金球菌Msed_0399YP_001190500146303184勤奋生金球菌Msed_0389YP_001190490146303174勤奋生金球菌Msed_1993YP_001192057146304741勤奋生金球菌
蛋白GENBANK IDGI号生物Fox2Q02207399508热带念珠菌
双功能的氧化还原酶会将酰基‑CoA成它的对应醇。将3‑羟基戊二酰辅酶A转化为3,5‑二羟基戊酸(图21、步骤G)和将3‑氧代戊二酰辅酶A转化为5‑羟基‑3‑氧代戊酸(图21、步骤K)，需要具有该活性的酶。
将酰基‑CoA转化为醇的示例性的双功能的氧化还原酶包括：将例如乙酰辅酶A等底物转化为乙醇(例如得自大肠杆菌的dhE(Kessler等人,FEBS.Lett.281:59‑63(1991)))和将丁酰辅酶A转化为丁醇(例如得自丙酮丁醇梭杆菌的adhE2(Fontaine等人,J.Bacteriol.184:821‑830(2002)))的那些氧化还原酶。由bdh I和bdh II编码的丙酮丁醇梭杆菌酶(Walter,等人,J.Bacteriol.174:7149‑7158(1992))分别会将乙酰辅酶A和丁酰辅酶A还原为乙醇和丁醇。除了将乙酰辅酶A还原为乙醇外，已经证实，肠膜明串珠菌的adhE所编码的酶会将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰辅酶A(Kazahaya等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43‑55(1972);Koo等人,Biotechnol Lett，27:505‑510(2005))。另一种示例性酶可将丙二酰辅酶A转化为3‑HP。已经在橙色绿屈挠菌中表征了具有此活性的NADPH依赖性的酶，其中所述酶参与3‑羟基丙酸循环(Hugler等人,J Bacteriol,184:2404‑2410(2002);Strauss等人,Eur JBiochem,215:633‑643(1993))。所述酶的质量为300kDa，其具有高度的底物特异性，且与其它已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler等人,出处同上)。没有证实在其它生物中的酶可催化所述特异性反应；然而，有生物信息学证据证明，其它生物可能具有类似的途径(Klatt等人,EnvMicrobiol,9:2067‑2078(2007))。通过序列相似性，可以推断出在其它生物中的酶候选物，所述生物包括卡氏玫瑰弯菌、赤杆菌属NAP1和和海洋γ变形杆菌HTCC2080。
蛋白GenBank IDGI号生物adhENP_415757.116129202大肠杆菌adhE2AAK09379.112958626丙酮丁醇梭杆菌bdh INP_349892.115896543丙酮丁醇梭杆菌bdh IINP_349891.115896542丙酮丁醇梭杆菌adhEAAV66076.155818563肠膜明串珠菌mcrAAS20429.142561982橙色绿屈挠菌Rcas_2929YP_001433009.1156742880卡氏玫瑰弯菌NAP1_02720ZP_01039179.185708113赤杆菌属NAP1
蛋白GenBank IDGI号生物MGP2080_00535ZP_01626393.1119504313海洋γ变形杆菌HTCC2080
更长链的酰基‑CoA分子可被诸如希蒙得木(加州希蒙得木)FAR等酶还原为它们的对应醇，所述FAR编码形成醇的脂肪酰基‑CoA还原酶。其在大肠杆菌中的过表达会导致FAR活性和脂肪醇的积累(Metz等人,PlantPhysiol,122:635‑644(2000))。
蛋白GenBank IDGI号生物FARAAD38039.15020215加州希蒙得木
用于催化这些步骤的另一种候选物是3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶(或HMG‑CoA还原酶)。该酶天然地将3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A中的CoA基团还原为形成醇的甲羟戊酸。已经克隆、测序和在大肠杆菌中表达了得自硫矿硫化叶菌的hmgA基因，该基因编码3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶(Bochar等人,JBacteriol.179:3632‑3638(1997))。酿酒酵母中也具有2种HMG‑CoA还原酶(Basson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A83:5563‑5567(1986))。该基因也已经从拟南芥中分离出，且已经被证实会补充酿酒酵母中的HMG‑COA还原酶活性(Learned等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:2779‑2783(1989))。
蛋白GenBank IDGI号生物HMG1CAA86503.1587536酿酒酵母HMG2NP_0135556323483酿酒酵母HMG1CAA70691.11694976拟南芥hmgAAAC45370.12130564硫矿硫化叶菌
在1.2.1家族中的酰基‑CoA还原酶会将酰基‑CoA还原成它的对应醛。在图21的步骤C和H中，需要这样的转化。已经在公开文献中描述了几种酰基‑CoA脱氢酶，它们代表适用于这些步骤的候选物。这些描述在下文中。
示例性的酰基‑CoA还原酶包括脂肪酰酰辅酶A还原酶、琥珀酰辅酶A还原酶(EC1.2.1.76)、乙酰辅酶A还原酶和丁酰辅酶A还原酶。示例性的脂肪酰酰辅酶A还原酶是由醋酸钙不动杆菌(Reiser,Journal of Bacteriology 179:2969‑2975(1997))和不动杆菌属M‑1 (Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192‑1195(2002))的acr1编码。具有琥珀酰辅酶A还原酶活性的酶是由克鲁氏梭状芽孢杆菌的sucD(Sohling,J.Bacteriol.178:871‑880(1996))和龈紫单胞菌的sucD(Takahashi,J.Bacteriol182:4704‑4710(2000))编码。其它琥珀酰辅酶A还原酶参与嗜热古细菌的3‑羟基丙酸/4‑羟基丁酸循环，所述嗜热古细菌包括勤奋生金球菌(Berg等人,Science318:1782‑1786(2007))和嗜中性热变形菌(Ramos‑Vera等人,J Bacteriol.,191:4286‑4297(2009))。所述勤奋生金球菌酶（由Msed_0709编码）是严格NADPH依赖性的，并且具有丙二酰辅酶A还原酶活性。所述嗜中性热变形菌酶在有NADPH和NADH时是有活性的。在假单胞菌属中的酶酰化乙醛脱氢酶（由bphG编码）是另一种候选物，因为已经证实，它会氧化和酰化乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛(Powlowski,J.Bacteriol.175:377‑385(1993))。除了将乙酰辅酶A还原为乙醇以外，已经证实，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶会将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰辅酶A(Kazahaya,J. Gen.Appl. Microbiol.18:43‑55(1972)；和Koo等人,Biotechnol Lett.27:505‑510(2005))。在产溶剂性生物诸如Clostridium saccharoperbutylacetonicum中，丁醛脱氢酶催化类似的反应，将丁酰辅酶A转化为丁醛(Kosaka等人,Biosci Biotechnol Biochem.,71:58‑68(2007))。

将酰基‑CoA转化成它的对应醛的其它酶类型是丙二酰辅酶A还原酶，该酶将丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛。丙二酰辅酶A还原酶是在嗜热嗜酸古细菌中通过3‑羟基丙酸循环进行自养碳固定的一种关键酶(Berg,Science318:1782‑1786(2007)；和Thauer，Science318:1732‑1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子，且已经在生金球形菌属和硫化叶菌属中表征(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551‑8559(2006)；和Hugler,J.Bacteriol.184:2404‑2410(2002))。该酶是由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551‑8559(2006)；和Berg,Science318:1782‑1786(2007))。在大肠杆菌中克隆和异源地表达了得自Sulfolobus to kodaii的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因(Alber等人,J.Bacteriol 188:8551‑8559(2006))。还已经证实，该酶催化甲基丙二酰辅酶A转化成它的对应醛(WO2007141208(2007))。尽管这些酶的醛脱氢酶功能性与得自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶类似，但是基本上没有序列相似性。两种丙二酰辅酶A还原酶候选物与天冬氨酸‑半醛脱氢酶具有高序列相似性，所述天冬氨酸‑半醛脱氢酶是催化天冬氨酰基‑4‑磷酸至天冬氨酸半醛的还原和同时去磷酸化的酶。通过与蛋白的序列同源性，可以在其它生物（包括硫矿硫化叶菌和酸热硫化叶菌）中发现其它基因候选物，且已经列出在下面。酰化辅酶A的醛脱氢酶的另一种候选物是，得自拜氏梭菌的ald基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973‑4980(1999)。已经报道，该酶会将乙酰辅酶A和丁酰辅酶A还原为它们的对应醛。该基因非常类似于eutE，后者编码鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973‑4980(1999)。
蛋白GenBank IDGI号生物Msed_0709YP_001190808.1146303492勤奋生金球菌McrNP_378167.115922498Sulfolobus tokodaiiasd‑2NP_343563.115898958硫矿硫化叶菌Saci_2370YP_256941.170608071酸热硫化叶菌AldAAT6643649473535拜氏梭菌eutEAAA80209687645鼠伤寒沙门菌eutEP774452498347大肠杆菌
已知2‑烯酸还原酶（它们中的一些是可逆的）会催化多种α、β‑不饱和的羧酸和醛的NAD(P)H依赖性的还原(Rohdich等人,276:5779‑5787(2001))。这些酶代表适用于进行图20的步骤I和C所示的转化的候选物。下面提供了几个实例。
在新近公开的克鲁氏梭状芽孢杆菌的基因组序列中，报道了9个编码烯酸还原酶的序列，其中之一已被表征(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 105:2128‑2133(2008))。得自酪丁酸梭菌和热乙酸梭菌的enr基因已被克隆和测序，并且彼此呈现59％同一性。还发现前一个基因与克鲁氏梭状芽孢杆菌中已表征的基因具有大约75％相似性(Giesel等人,135:51‑57(1983))。基于这些测序结果，已经报道，enr非常类似于大肠杆菌中的二烯酰基CoA还原酶(fadH)(Rohdich等人,JBiol.Chem.276:5779‑5787(2001))。热乙酸梭菌enr基因还已经以催化活性形式在大肠杆菌中表达(Rohdich等人,JBiol.Chem.276:5779‑5787(2001))。该酶表现出对宽范围的α、β‑不饱和的羰基化合物的活性。
蛋白GenBank IDGI号生物enrACA54153.1169405742肉毒梭菌A3菌株enrCAA71086.12765041酪丁酸梭菌enrCAA76083.13402834克鲁氏梭状芽孢杆菌enrYP_430895.183590886热醋穆尔氏菌fadHNP_417552.116130976大肠杆菌
另一种候选物2‑烯酸还原酶是马来酰乙酸还原酶(MAR,EC1.3.1.32)，该酶催化2‑马来酰乙酸(4‑氧代己‑2‑烯二酸)还原为3‑氧代己二酸。MAR酶天然地参与芳族化合物降解途径(Kaschabek等人,JBacteriol.175:6075‑6081(1993);Kaschabek等人,J Bacteriol.177:320‑325(1995);Camara等人,J Bacteriol.(2009);Huang等人,Appl Environ.Microbiol72:7238‑7245(2006))。在假单胞菌菌株B13中鉴别和表征了该酶活性(Kaschabek等人,175:6075‑6081(1993);Kaschabek等人,177:320‑325(1995))，并对编码基因进行了克隆和测序(Kasberg等人,J Bacteriol.179:3801‑3803(1997))。其它MAR基因候选物包括：得自假单胞菌菌株B13的clcE基因(Kasberg等人,J Bacteriol.179:3801‑3803(1997))，得自混浊红球菌的macA基因(Seibert等人,180:3503‑3508(1998))，得自富养产碱菌(也称作台湾贪铜菌)的macA基因(Seibert等人,Microbiology 150:463‑472(2004))，得自富养产碱菌的tfdFII(Seibert等人,J Bacteriol.175:6745‑6754(1993))，和在谷氨酸棒杆菌中的NCgl1112(Huang等人,Appl Environ.Microbiol 72:7238‑7245(2006))。最近鉴别出了在Pseudomonas reinekei MT1中的MAR，其由ccaD编码(Camara等人,JBacteriol.(2009))。
蛋白GenBank IDGI号生物
clcE3913241O30847.1假单胞菌菌株B13macA7387876O84992.1Rhodococcus opacusmacA5916089AAD55886台湾贪铜菌tfdFII1747424AAC44727.1富养产碱菌JMP134NCgl111219552383NP_600385谷氨酸棒杆菌ccaD134133940ABO61029.1Pseudomonas reinekei MT1
图19‑21的步骤A和图19的步骤M需要将3‑羟基丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A、琥珀酰辅酶A或丙二酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合。已经在公开文献中描述了几种β‑酮硫解酶，它们代表适用于这些步骤的候选物。这些描述在下文中。
例如，3‑氧代己二酰辅酶A硫解酶代表适用于前述步骤的一类β‑酮硫解酶。3‑氧代己二酰辅酶A硫解酶(EC2.3.1.174)天然地将β‑酮己二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，且是芳族化合物降解的β‑酮己二酸途径的关键酶。该酶广泛地分布于土壤细菌和真菌中，包括恶臭假单胞菌(Harwood等人,J Bacteriol.176:6479‑6488(1994))和醋酸钙不动杆菌(Doten等人,J Bacteriol.169:3168‑3174(1987))。由假单胞菌菌株B13中的pcaF(Kaschabek等人,J Bacteriol.184:207‑215(2002))、恶臭假单胞菌U中的phaD(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A95:6419‑6424(1998))、荧光假单胞菌ST中的paaE(Di等人,Arch.Microbiol188:117‑125(2007))和得自大肠杆菌的paaJ(Nogales等人,Microbiology153:357‑365(2007))编码的基因产物也会催化该转化。几种β‑酮硫解酶在氧代己二酰辅酶A形成方向表现出显著的且选择性的活性，包括得自恶臭假单胞菌的bkt、得自铜绿假单孢菌PAO1的pcaF和bkt、得自Burkholderia ambifaria AMMD的bkt、得自大肠杆菌的paaJ和得自恶臭假单胞菌的phaD。
蛋白GI号GenBank登记号生物paaJ16129358NP_415915.1大肠杆菌pcaF17736947AAL02407Pseudomonas knackmussii(B13)phaD3253200AAC24332.1恶臭假单胞菌pcaF506695AAA85138.1恶臭假单胞菌pcaF141777AAC37148.1醋酸钙不动杆菌paaE106636097ABF82237.1荧光假单胞菌bkt115360515YP_777652.1Burkholderia ambifaria AMMDbkt9949744AAG06977.1铜绿假单孢菌PAO1pcaF9946065AAG03617.1铜绿假单孢菌PAO1
氧代庚二酰辅酶A:戊二酰辅酶A酰基转移酶（一种β‑酮硫解酶）（EC2.3.1.16）会缩合戊二酰辅酶A和乙酰辅酶A，以形成3‑氧代庚二酰辅酶A。催化该转化的酶存在于富养产碱菌(以前称作真养产碱菌)中，由基因bktB和bktC编码(Slater等人,J.Bacteriol.180:1979‑1987(1998);Haywood等人,52:91‑96(1988))。已知BktB蛋白的序列，但是尚未报道BktC蛋白的序列。沼泽红假单胞菌的pim操纵子也编码β‑酮硫解酶，该酶由pimB编码，预测会在苯甲酰辅酶A降解过程中在降解方向催化该转化(Harrison等人,151:727‑736(2005))。通过与bktB的序列同源性(43%同一性,e值=1e‑93)，鉴别出在S.aciditrohicus中的β‑酮硫解酶候选物。
蛋白GenBank IDGI号生物bktBYP_72594811386745富养产碱菌pimBCAE2915639650633沼泽红假单胞菌syn 02642YP_462685.185860483Syntrophus aciditrophicus
催化从乙酰辅酶A和丙酰辅酶A形成β‑酮戊酸的β‑酮硫解酶也可以能够催化乙酰辅酶A与3‑羟基丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A、琥珀酰辅酶A或丙二酰辅酶A的缩合。生枝动胶菌具有2种可以从丙酰辅酶A和乙酰辅酶A形成β‑酮戊酰辅酶A的酮硫解酶，且富养产碱菌具有也能够催化该转化的β‑氧化酮硫解酶(Gruys等人,美国专利5,958,745(1999))。尚未报道这些基因或它们翻译的蛋白的序列，但是基于与得自富养产碱菌的bktB的序列同源性，可以鉴别出在富养产碱菌、生枝动胶菌或其它生物中的几种候选物。这些包括:
蛋白GenBank IDGI号生物phaAYP_725941.1113867452富养产碱菌h16_A1713YP_726205.1113867716富养产碱菌pcaFYP_728366.1116694155富养产碱菌h16_B1369YP_840888.1116695312富养产碱菌h16_A0170YP_724690.1113866201富养产碱菌h16_A0462YP_724980.1113866491富养产碱菌h16_A1528YP_726028.1113867539富养产碱菌h16_B0381YP_728545.1116694334富养产碱菌h16_B0662YP_728824.1116694613富养产碱菌h16_B0759YP_728921.1116694710富养产碱菌h16_B0668YP_728830.1116694619富养产碱菌h16_A1720YP_726212.1113867723富养产碱菌h16_A1887YP_726356.1113867867富养产碱菌
phbAP07097.4135759生枝动胶菌bktBYP_002005382.1194289475台湾贪铜菌Rmet_1362YP_583514.194310304Ralstonia metalliduransBphy_0975YP_001857210.1186475740Burkholderia phymatum
其它候选物包括已知会将2个乙酰辅酶A分子转化成乙酰乙酰辅酶A的β‑酮硫解酶(EC2.1.3.9)。示例性的乙酰乙酰辅酶A硫解酶包括：得自大肠杆菌的atoB(Martin等人,Nat.Biotechnol21:796‑802(2003))、得自丙酮丁醇梭杆菌的thlA和thlB(Hanai等人,Appl Environ Microbiol73:7814‑7818(2007);Winzer等人,J.Mol.Microbiol Biotechnol2:531‑541(2000))和得自酿酒酵母的ERG10(Hiser等人,J.Biol.Chem.269:31383‑31389(1994))的基因产物。
蛋白GenBank IDGI号生物atoBNP_41672816130161大肠杆菌thlANP_349476.115896127丙酮丁醇梭杆菌thlBNP_149242.115004782丙酮丁醇梭杆菌ERG10NP_0152976325229酿酒酵母
在2.8.3家族中的酶会催化CoA部分部分从一个分子向另一个分子的可逆转移。图19的步骤F、O、G、T、H和E和图20的步骤B和H需要这样的转化。已经在公开文献中描述了几种CoA转移酶，它们代表适用于这些步骤的候选物。这些描述在下面。
许多转移酶具有宽特异性，因而可以多种CoA受体，诸如乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、2‑甲基乙酰乙酸、3‑酮己酸、3‑酮戊酸、戊酸、巴豆酸、3‑巯基丙酸、丙酸、乙烯基乙酸、丁酸，以及其它。例如，经证实，得自罗斯氏菌属A2‑183的酶具有丁酰辅酶A:乙酸:CoA转移酶和丙酰辅酶A:乙酸:CoA转移酶活性(Charrier等人,Microbiology 152,179‑185(2006))。接近的同系物可以存在于，例如，肠道罗斯氏菌L1‑82、Roseburia inulinivorans DSM16841、直肠真杆菌ATCC 33656中。具有丙酰辅酶A转移酶活性的另一种酶可以存在于丙酸梭菌中(Selmer等人,Eur J Biochem269,372‑380(2002))。该酶可以使用乙酸、(R)‑乳酸、(S)‑乳酸、丙烯酸和丁酸作为CoA受体(Selmer等人,Eur J Biochem269,372‑380(2002);Schweiger和Buckel,FEBS Letters,171(1)79‑84(1984))。接近的同系物可以存在于，例如，诺维梭菌NT、拜氏梭菌NCIMB8052和肉毒梭菌C的Eklund菌株中。YgfH编码大肠杆菌中的丙酰基CoA:琥珀酸CoA转移酶(Haller等人,Biochemistry,39(16)4622‑4629)。接近的同系物可以存在于，例如，杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种血清变型和中间耶尔森菌ATCC29909中。下面鉴别出了这些蛋白。

其它的候选酶是由假单胞菌属中的pcaI和pcaJ编码的双单位酶，其已经被证实具有3‑氧代己二酰辅酶A/琥珀酸转移酶活性(Kaschabek等人,出处同上)。基于同源性的类似酶存在于不动杆菌属ADP1(Kowalchuk等人,Gene146:23‑30(1994))和天蓝色链霉菌中。其它示例性的琥珀酰辅酶A:3:酮酸‑CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy‑Theulaz等人,J.Biol.Chem.272:25659‑25667(1997))和枯草芽孢杆菌(Stols等人,Proteins.Expr.Purif.53:396‑403(2007))中。下面鉴别出了这些蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物pcaIAAN69545.124985644恶臭假单胞菌pcaJNP_746082.126990657恶臭假单胞菌pcaIYP_046368.150084858不动杆菌属ADP1pcaJAAC37147.1141776不动杆菌属ADP1pcaINP_630776.121224997天蓝色链霉菌pcaJNP_630775.121224996天蓝色链霉菌HPAG1_0676YP_627417108563101幽门螺杆菌HPAG1_0677YP_627418108563102幽门螺杆菌ScoANP_39177816080950枯草芽孢杆菌ScoBNP_39177716080949枯草芽孢杆菌
可以利用乙酸作为CoA受体的CoA转移酶是乙酰乙酰辅酶A转移酶，其由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res Commun.33:902‑908(1968);Korolev等人,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58:2116‑2121(2002))。还已经证实，该酶会将CoA部分从多种支链和直链酰基‑CoA底物转移至乙酸，所述底物包括异丁酸(Matthies等人,Appl Environ Microbiol58:1435‑1439(1992))。戊酸(Vanderwinkel等人,出处同上)和丁酸(Vanderwinkel等人,出处同上)。类似酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,Appl Environ Microbiol68:5186‑5190(2002))、丙酮丁醇梭杆菌(Cary等人,Appl Environ Microbiol56:1576‑1583(1990))和Clostridium saccharoperbutylacetonicum(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58‑68(2007))中。下面鉴别出了这些蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物atoAP76459.12492994大肠杆菌K12atoDP76458.12492990大肠杆菌K12actAYP_226809.162391407谷氨酸棒杆菌ATCC13032cg0592YP_224801.162389399谷氨酸棒杆菌ATCC13032ctfANP_149326.115004866丙酮丁醇梭杆菌ctfBNP_149327.115004867丙酮丁醇梭杆菌ctfAAAP42564.131075384Clostridium saccharoperbutylacetonicumctfBAAP42565.131075385Clostridium saccharoperbutylacetonicum
其它示例性的转移酶候选物是克鲁氏梭状芽孢杆菌的cat1、cat2和cat3的基因产物，已经证实，它们分别表现出琥珀酰辅酶A、4‑羟基丁酰辅酶A和丁酰辅酶A转移酶活性(Seedorf等人,出处同上;Sohling等人,Eur.J Biochem.212:121‑127(1993);Sohling等人,J Bacteriol.178:871‑880(1996))。类似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411‑1418(2008))和布鲁斯锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337‑45346(2004))中。下面鉴别出了这些蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物cat1P38946.1729048克鲁氏梭状芽孢杆菌cat2P38942.2172046066克鲁氏梭状芽孢杆菌cat3EDK35586.1146349050克鲁氏梭状芽孢杆菌TVAG_395550XP_001330176123975034阴道毛滴虫G3Tb11.02.0290XP_82835271754875布鲁斯锥虫
得自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酸‑CoA‑转移酶(EC2.8.3.12)酶会与二酸戊烯二酰辅酶A和3‑丁烯酰辅酶A反应(Mack等人,FEBS Lett.405:209‑212(1997))。编码该酶的基因是gctA和gctB。该酶对其它CoA衍生物具有降低的、但是可检测的活性，所述CoA衍生物包括戊二酰辅酶A、2‑羟基戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A和丙烯酰辅酶A(Buckel等人,Eur.J.Biochem.118:315‑321(1981))。已经在大肠杆菌中克隆和表达了该酶(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41‑51(1994))。下面鉴别出了这些蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物gctACAA57199.1559392发酵氨基酸球菌gctBCAA57200.1559393发酵氨基酸球菌
在3.1.2家族中的酶会将酰基‑CoA分子水解成它们的对应酸。图19的步骤F、O、G、T、H和E和图20的步骤B和H需要这样的转化。在文献中已经描述了几种这样的酶，它们代表适用于这些步骤的候选物。
例如，由得自褐家鼠脑的acot12编码的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959‑965(1976))可以与丁酰辅酶A、己酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应。由acot8编码的人二羧酸硫酯酶会表现出对戊二酰辅酶A、己二酰辅酶A、环庚基‑CoA、癸二酰辅酶A和十二烷二酰基‑CoA的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125‑38132(2005))。与该酶最接近的大肠杆菌同系物tesB还可以水解许多CoA硫羟酸酯(Naggert等人,J Biol Chem266:11044‑11050(1991))。还已经在大鼠肝中表征了类似的酶(Deana R.,Biochem Int26:767‑773(1992))。在大肠杆菌中的具有水解酶活性的其它酶包括：ybgC、paaI和ybdB(Kuznetsova,等人,FEMS Microbiol Rev,2005,29(2):263‑279;Song等人,J Biol Chem,2006,281(16):11028‑38)。尽管尚未报道它的序列，得自豌豆叶的线粒体的该酶具有宽底物特异性，且表现出对乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丁酰辅酶A、棕榈酰辅酶A、油酰辅酶A、琥珀酰辅酶A和巴豆酰辅酶A的活性(Zeiher等人,Plant.Physiol.94:20‑27(1990))得自酿酒酵母的乙酰辅酶A水解酶ACHI代表另一种候选水解酶(Buu等人,J.Biol.Chem.278:17203‑17209(2003))。
蛋白GenBank登记号GI号生物acot12NP_570103.118543355褐家鼠tesBNP_41498616128437大肠杆菌acot8CAA155023191970智人acot8NP_57011251036669褐家鼠tesANP_41502716128478大肠杆菌ybgCNP_41526416128711大肠杆菌paaINP_41591416129357大肠杆菌ybdBNP_41512916128580大肠杆菌ACH1NP_0095386319456酿酒酵母
另一种候选水解酶是得自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸辅酶A‑转移酶。通过定位诱变，将该酶转化成对戊二酰辅酶A、乙酰辅酶A和3‑丁烯酰辅酶A的具有活性的酰基‑CoA水解酶(Mack等人,FEBS.Lett.405:209‑212(1997))。这提示，编码琥珀酰辅酶A:3‑酮酸‑CoA转移酶s和乙酰乙酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶的酶也可以用作该反应步骤的候选物，但是需要某些突变来改变它们的功能。
蛋白GenBank登记号GI号生物gctACAA57199559392发酵氨基酸球菌gctBCAA57200559393发酵氨基酸球菌
其它水解酶包括3‑羟基异丁酰辅酶A水解酶，其已经被描述为，可有效地催化在缬氨酸降解过程中3‑羟基异丁酰辅酶A至3‑羟基异丁酸的转化(Shimomura等人,J Biol Chem.269:14248‑14253(1994))。编码该酶的基因包括：褐家鼠(Shimomura等人,Methods Enzymol.324:229‑240(2000))和智人(Shimomura等人,出处同上)的hibch。通过序列同源性，也可以鉴别出类似的基因候选物，包括酿酒酵母的hibch和蜡状芽孢杆菌的BC_2292。
蛋白GenBank登记号GI号生物hibchQ5XIE6.2146324906褐家鼠hibchQ6NVY1.2146324905智人hibchP28817.22506374酿酒酵母BC_2292AP0925629895975蜡状芽孢杆菌
催化图19的步骤U、Y、V和X、图20的步骤D、J、M和N和图21的步骤M、N和P，需要在EC类别4.1.1中的脱羧酶。在本申请的前文中已经描述了候选脱羧酶。
双键的水合，可以由4.2.1酶家族中的水合酶催化。除去水以形成双键，是由4.2.1酶家族中的脱水酶催化。水合酶有时是可逆的，并且催化脱水。脱水酶有时是可逆的，并且催化水合。图19的步骤S、K、L、R、D、C、J、Q和W、图20的步骤F和图21的步骤E、F和O，需要向/从给定的底物添加或除去水。在文献中已经描述了几种水合酶和脱水酶，它们代表适用于这些步骤的候选物。
例如，许多脱水酶会催化水的α、β‑消除，这包括：取走电子的羰基、羧酸酯或CoA‑硫醇酯基团对α‑氢的活化，和羟基从β‑位的除去(Buckel等人,J Bacteriol,117:1248‑60(1974);Martins等人,PNAS101:15645‑9(2004))。示例性的酶包括：2‑(羟甲基)戊二酸脱水酶(EC4.2.1.‑)、延胡索酸酶(EC4.2.1.2)、3‑脱氢奎尼酸脱水酶(EC4.2.1.10)、环己酮水合酶(EC4.2.1.‑)和2‑酮‑4‑戊烯酸脱水酶(EC4.2.1.80)、柠苹酸水解酶和二甲基马来酸水合酶。
2‑(羟甲基)戊二酸脱水酶是一种含有[4Fe‑4S]的酶，其将2‑(羟甲基)戊二酸脱水为2‑亚甲基‑戊二酸酶，研究了它在巴氏真杆菌(以前的巴克梭菌)的烟酸分解代谢中的作用(Alhapel等人,Proc Natl Acad Sci103:12341‑6(2006))。具有高序列同源性的类似酶存在于多毛拟杆菌、Anaerotruncus colihominis和Natranaerobius thermophilius中。这些酶与含有[4Fe‑4S]的细菌丝氨酸脱水酶(例如，由tadcG、sdhB和sdaA编码的大肠杆菌酶)的α和β亚基具有同源性。在巴氏真杆菌中具有类似功能性的酶是二甲基马来酸水合酶，即在顺乌头酸酶家族中的可逆的Fe2+依赖性的和氧敏感的酶，其水合二甲基马来酸以形成(2R,3S)‑2,3‑二甲基苹果酸。该酶是由dmdAB编码(Alhapel等人,Proc Natl Acad SciUSA 103:12341‑6(2006);Kollmann‑Koch等人,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847‑857(1984))。
蛋白GenBank IDGI号生物hmdABC88407.186278275巴氏真杆菌BACCAP_02294ZP_02036683.1154498305多毛拟杆菌ANACOL_02527ZP_02443222.1167771169Anaerotruncus colihominisNtherDRAFT_2368ZP_02852366.1169192667Natranaerobius thermophilusdmdAABC8840886278276巴氏真杆菌dmdBABC8840986278277巴氏真杆菌
延胡索酸水合酶(EC4.2.1.2)酶天然地催化延胡索酸至苹果酸的可逆水合。尽管尚未在文献中描延胡索酸水合酶与3‑氧代丁醇底物反应的能力，关于该酶的结构信息资源是得到的，研究人员已经成功地工程改造该酶以改变活性、抑制和定位(Weaver,61:1395‑1401(2005))。大肠杆菌具有3种延胡索酸酶：FumA、FumB和FumC，它们受生长条件调节。FumB是氧敏感的，仅在厌氧条件下有活性。FumA在微厌氧条件下有活性，FumC是在需氧生长中唯一有活性的酶(Tseng等人,JBacteriol,183:461‑467(2001);Woods等人,954:14‑26(1988);Guest等人,J Gen Microbiol131:2971‑2984(1985))。其它酶候选物存在于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.J Biochem.Cell Biol31:961‑975(1999))、嗜热栖热菌(Mizobata等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49‑55(1998))和褐家鼠(Kobayashi等人,J.Biochem,89:1923‑1931(1981))中。具有高序列同源性的类似酶包括：得自拟南芥的fum1和得自谷氨酸棒杆菌的fumC。得自Pelotomaculum thermopropionicum的MmcBC延胡索酸酶是另一类延胡索酸酶，其具有2个亚基(Shimoyama等人,FEMS Microbiol Lett,270:207‑213(2007))。
蛋白GenBank IDGI号生物fumANP_416129.116129570大肠杆菌fumBNP_418546.116131948大肠杆菌fumCNP_416128.116129569大肠杆菌fumCO692949789756空肠弯曲杆菌fumCP8412775427690嗜热栖热菌fumHP14408120605褐家鼠fum1P9303339931311拟南芥fumCQ8NRN839931596谷氨酸棒杆菌MmcBYP_001211906147677691Pelotomaculum thermopropionicumMmcCYP_001211907147677692Pelotomaculum thermopropionicum
4‑羟基‑2‑氧代戊酸脱水为2‑氧代戊烯酸，是由4‑羟基‑2‑氧代戊酸水合酶(EC4.2.1.80)催化。该酶参与芳族化合物降解途径，且通常与编码具有4‑羟基‑2‑氧代戊酸醛缩酶活性的酶的基因共转录。示例性的基因产物是由下述基因编码：大肠杆菌的mhpD(Ferrandez等人,J Bacteriol.179:2573‑2581(1997);Pollard等人,Eur J Biochem.251:98‑106(1998))，恶臭假单胞菌的todG和cmtF(Lau等人,Gene146:7‑13(1994);Eaton,J Bacteriol.178:1351‑1362(1996))，丛毛平胞菌属各种的cnbE CNB‑1(Ma等人,Appl Environ Microbiol73:4477‑4483(2007))和Burkholderia xenovorans的mhpD(Wang等人,FEBS J272:966‑974(2005))。一种密切相关的酶2‑氧代庚‑4‑烯‑1,7‑二酸水合酶参与4‑羟基苯乙酸降解，其中它使用镁作为辅因子，将2‑氧代‑庚‑4‑烯‑1,7‑二酸(OHED转化成2‑氧代‑4‑羟基‑庚‑1,7‑二酸(Burks等人,J.Am.Chem.Soc.120:(1998))。已经在大肠杆菌C(Roper等人,Gene156:47‑51(1995);Izumi等人,J Mol.Biol.370:899‑911(2007))和大肠杆菌W(Prieto等人,JBacteriol.178:111‑120(1996))中鉴别和表征了OHED水合酶候选物。序列对比揭示了宽范围的细菌、植物和动物中的同系物。在肺炎克雷伯菌(91%同一性,eval=2e‑138)和肠道沙门氏菌(91%同一性,eval=4e‑138)以及其它物种中含有具有高度相似的序列的酶。
蛋白GenBank登记号GI号生物mhpDAAC73453.287081722大肠杆菌cmtFAAB62293.11263188恶臭假单胞菌todGAAA61942.1485738恶臭假单胞菌cnbEYP_001967714.1190572008丛毛平胞菌属各种CNB‑1mhpDQ13VU0123358582Burkholderia xenovoranshpcGCAA57202.1556840大肠杆菌ChpaHCAA86044.1757830大肠杆菌WhpaHABR80130.1150958100肺炎克雷伯菌Sari_01896ABX21779.1160865156肠道沙门氏菌
另一种酶候选物是柠苹酸水解酶(EC4.2.1.34)，该酶天然地将2‑甲基苹果酸脱水为中康酸。已经在通向2‑氧代丁酸的丙酮酸途径的背景下在詹氏甲烷球菌中研究了该酶，其中已经证实它具有宽底物特异性(Drevland等人,J Bacteriol.189:4391‑4400(2007))。也在破伤风形梭菌、摩氏摩根菌、丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌中检测到该酶活性，其中认为它参与谷氨酸降解(Kato等人,Arch.Microbiol 168:457‑463(1997))。詹氏甲烷球菌蛋白序列与这些生物中的基因没有显著的同源性。
蛋白GenBank IDGI号生物leuDQ58673.13122345詹氏甲烷球菌
二甲基马来酸水合酶(EC4.2.1.85)是顺乌头酸酶家族中的一种可逆的Fe2+依赖性的和氧敏感的酶，其水合二甲基马来酸盐以形成(2R,3S)‑2,3‑二甲基苹果酸盐。该酶是由巴氏真杆菌中的dmdAB编码(Alhapel等人,出处同上;Kollmann‑Koch等人,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847‑857(1984))。
蛋白GenBank IDGI号生物dmdAABC8840886278276巴氏真杆菌dmdBABC88409.186278277巴氏真杆菌
油酸水合酶代表其它合适的候选物，如在WO2011076691中所提示的。这些特别适用于图19的步骤W和图21的步骤O。实例包括下述蛋白。
蛋白GenBank IDGI号生物OhyAACT54545.1254031735Elizabethkingia meningosepticaHMPREF0841_1446ZP_07461147.1306827879酿脓链球菌ATCC 10782P700755_13397ZP_01252267.191215295Psychroflexus torquis ATCC 700755RPB_2430YP_486046.186749550沼泽红假单胞菌
烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.17)催化多种3‑羟酰辅酶A底物的脱水(Roberts等人,Arch.Microbiol 117:99‑108(1978);Agnihotri等人,Bioorg.Med.Chem.11:9‑20(2003);Conrad等人,JBacteriol.118:103‑111(1974))。恶臭假单胞菌的烯酰辅酶A水合酶（由ech编码）催化3‑羟基丁酰辅酶A转化为巴豆酰辅酶A(Roberts等人,Arch.Microbiol117:99‑108(1978))。该转化也由下述酶催化：丙酮丁醇梭杆菌的crt基因产物，克鲁氏梭状芽孢杆菌和其它梭菌生物的crt1基因产物(Atsumi等人,MetabEng10:305‑311(2008);Boynton等人,JBacteriol.178:3015‑3024(1996);Hillmer等人,FEBSLett.21:351‑354(1972))。其它烯酰辅酶A水合酶候选物是：恶臭假单胞菌的phaA和phaB，和得自荧光假单胞菌的paaA和paaB(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A95:6419‑6424(1998))。预测沼泽红假单胞菌中的pimF的基因产物会编码参与庚二酰辅酶A降解的烯酰辅酶A水合酶(Harrison等人,Microbiology 151:727‑736(2005))。最后，已经证实，许多大肠杆菌基因会表现出烯酰辅酶A水合酶功能性，所述基因包括maoC(Park等人,J Bacteriol.185:5391‑5397(2003))、paaF(Ismail等人,Eur.JBiochem.270:3047‑3054(2003);Park等人,Appl.Biochem.Biotechnol113‑116:335‑346(2004);Park等人,Biotechnol Bioeng86:681‑686(2004))和paaG(Ismail等人,Eur.J Biochem.270:3047‑3054(2003);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol 113‑116:335‑346(2004);Park和Yup,Biotechnol Bioeng86:681‑686(2004))。
蛋白GenBank登记号GI号生物echNP_745498.126990073恶臭假单胞菌crtNP_349318.115895969丙酮丁醇梭杆菌crt1YP_001393856153953091克鲁氏梭状芽孢杆菌phaAABF82233.126990002恶臭假单胞菌phaBABF82234.126990001恶臭假单胞菌paaANP_745427.1106636093荧光假单胞菌paaBNP_745426.1106636094荧光假单胞菌maoCNP_415905.116129348大肠杆菌paaFNP_415911.116129354大肠杆菌paaGNP_415912.116129355大肠杆菌
可替换地，fadA和fadB的大肠杆菌基因产物编码参与脂肪酸氧化的多酶复合物，所述复合物表现出烯酰辅酶A水合酶活性(Yang等人,Biochemistry 30:6788‑6795(1991);Yang,J Bacteriol.173:7405‑7406(1991);Nakahigashi等人,Nucleic Acids Res.18:4937(1990))。敲除由fadR 编码的负调节物，可以用于活化fadB 基因产物(Sato等人,J Biosci.Bioeng103:38‑44(2007))。fadI和fadJ基因编码类似的功能，且天然地在厌氧条件下表达(Campbell等人,Mol.Microbiol47:793‑805(2003))。
蛋白GenBank IDGI号生物fadAYP_026272.149176430大肠杆菌fadBNP_418288.116131692大肠杆菌fadINP_416844.116130275大肠杆菌fadJNP_416843.116130274大肠杆菌fadRNP_415705.116129150大肠杆菌
酰基‑CoA底物向它们的酸产物的转化，可以由在6.2.1酶家族中的CoA酸‑硫醇连接酶或CoA合成酶催化，所述家族中的几种是可逆的。在图19‑20中显示的几种反应是由酸‑硫醇连接酶催化。这些反应包括：图19的步骤F、O、G、T、H和E，和图20的步骤B和H。在文献中已经描述了几种催化CoA酸‑硫醇连接酶或CoA合成酶活性的酶，它们代表适用于这些步骤的候选物。
例如，形成DP的乙酰辅酶A合成酶(ACD,EC6.2.1.13)是这样的一种酶：其将酰基‑CoA酯向它们的对应酸的转化与伴随的ATP合成相偶联。经证实，得自闪烁古球菌的ACD I（由AF1211编码）作用于多种直链和支链底物，包括异丁酸、异戊酸和延胡索酸(Musfeldt等人,J Bacteriol.184:636‑644(2002))。也经证实，在闪烁古球菌中的第二种可逆ACD（由AF1983编码）具有宽底物范围，对环状化合物苯乙酸和吲哚乙酸具有高活性(Musfeldt和Schonheit,JBacteriol.184:636‑644(2002))。得自死海嗜盐古细菌的酶（注解为琥珀酰辅酶A合成酶）接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物，并经证实会在正向和反向工作(Brasen等人,Arch Microbiol 182:277‑287(2004))。由得自超嗜热的crenarchaeon Pyroaculum aerophilum的PAE3250编码的ACD表现出所有表征的ACD的最宽底物范围，其与乙酰辅酶A、异丁酰辅酶A(优选的底物)和苯基乙酰辅酶A反应(Brasen等人,出处同上)。定向进化或工程改造可以用于修饰该酶，以在宿主生物的生理温度工作。得自闪烁古生菌、死海嗜盐古细菌和P.aerophilum的酶都已经在大肠杆菌中克隆、功能性地表达和表征(Brasen和Schonheit,出处同上;Musfeldt和Schonheit,JBacteriol.184:636‑644(2002))。其它的候选物是琥珀酰辅酶A合成酶，其由大肠杆菌的sucCD和酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码。这些酶催化从琥珀酸形成琥珀酰辅酶A，伴随地消耗1摩尔ATP，该反应在体内是可逆的(Buck等人,Biochemistry24:6245‑6252(1985))。已经证实，得自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶会作用于几种脂族底物（包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸）和芳族化合物（诸如苯乙酸和苯氧乙酸）(Fernandez‑Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149‑1154(1993))。得自豌豆根瘤菌的相关酶丙二酰基CoA合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸（即乙基‑、丙基‑、烯丙基‑、异丙基‑、二甲基‑、环丙基‑、环丙基亚甲基‑、环丁基‑和苄基‑丙二酸）转化成它们的对应的单硫代酸酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822‑5823(2001))。
蛋白GenBank IDGI号生物AF1211NP_070039.111498810闪烁古球菌AF1983NP_070807.111499565闪烁古球菌ScsYP_135572.155377722死海嗜盐古细菌PAE3250NP_560604.118313937Pyrobaculum aerophilum菌株IM2
蛋白GenBank IDGI号生物sucCNP_415256.116128703大肠杆菌sucDAAC73823.11786949大肠杆菌LSC1NP_0147856324716酿酒酵母LSC2NP_0117606321683酿酒酵母paaFAAC24333.222711873恶臭假单胞菌matBAAC83455.13982573豌豆根瘤菌
这些步骤的另一种候选酶是6‑羧基己酸‑CoA连接酶，也称作庚二酰辅酶A连接酶(EC6.2.1.14)，它在革兰氏阳性细菌的生物素生物合成过程中天然地将庚二酸活化为庚二酰辅酶A。经证实，得自门多萨假单胞菌的酶（被克隆进大肠杆菌中）会接受替代底物己烷二酸和壬烷二酸(Binieda等人,Biochem.J340(Pt3):793‑801(1999))。其它候选物存在于枯草芽孢杆菌(Bower等人,J Bacteriol.178:4122‑4130(1996))和球形赖氨酸杆菌(以前的球形芽孢杆菌)(Ploux等人,Biochem.J287(Pt3):685‑690(1992))中。
蛋白GenBank IDGI号生物bioWNP_390902.250812281枯草芽孢杆菌bioWCAA10043.13850837门多萨假单胞菌bioWP22822.1115012球形芽孢杆菌
其它CoA‑连接酶包括：大鼠二羧酸‑CoA连接酶，其序列仍未表征(Vamecq等人,Biochem.J230:683‑693(1985))，得自产黄青霉的2种表征过的苯乙酸‑CoA连接酶中的任一种(Lamas‑Maceiras等人,Biochem.J395:147‑155(2006);Wang等人,360:453‑458(2007))，得自恶臭假单胞菌的苯乙酸‑CoA连接酶(Martinez‑Blanco等人,J Biol Chem265:7084‑7090(1990))，和得自枯草芽孢杆菌的6‑羧基己酸‑CoA连接酶(Bower等人J Bacteriol178(14):4122‑4130(1996))。得自小家鼠(Hasegawa等人,Biochim Biophys Acta1779:414‑419(2008))和智人(Ohgami等人,Biochem.Pharmacol.65:989‑994(2003))的乙酰乙酰辅酶A合成酶天然地催化乙酰乙酸向乙酰乙酰辅酶A的ATP依赖性的转化。
蛋白登记号GI号生物phlCAJ15517.177019264产黄青霉phlBABS19624.1152002983产黄青霉paaFAAC24333.222711873恶臭假单胞菌
bioWNP_390902.250812281枯草芽孢杆菌AACSNP_084486.121313520小家鼠AACSNP_076417.231982927智人
象在其它类别中的酶一样，已经确定在EC类别6.2.1中的某些酶具有宽底物特异性。已经证实，得自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶会作用于几种脂族底物（包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸）和芳族化合物（诸如苯乙酸和苯氧乙酸）(Fernandez‑Valverde等人,Applied和环境al微生物学59:1149‑1154(1993))。得自三叶草根瘤菌的相关酶丙二酰基CoA合成酶(6.3.4.9)可以将几种二酸（即乙基‑、丙基‑、烯丙基‑、异丙基‑、二甲基‑、环丙基‑、环丙基亚甲基‑、环丁基‑和苄基‑丙二酸）转化成它们的对应的单硫代酸酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822‑5823(2001))。
贯穿本申请，已经参考了各种出版物。这些出版物的公开内容（包括GenBank和GI号公开）据此通过引用整体并入本申请中，以便更充分地描述本发明所属领域的技术水平。尽管已经参考以上提供的实施例描述了本发明，应当理解，可以做出各种改变而不背离本发明精神。