猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用.pdf

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组的猪霍乱沙门氏菌菌株C501-COE和C501-SD的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一种不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011296；CCTCC NO：M2011297，这两株重组菌株缺失了猪霍乱沙门氏菌生长所必需的asd基因，并含有能够在该菌株中表达asd基因和猪流行性腹泻病毒COE基因片段、SD基因片段的质粒。还公开了利用该重组菌制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻疫苗的方法及应用。本发明的疫苗可以刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒的保护性免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒的感染。

权利要求书一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD，其特征在于，所述的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C501‑COE和C501‑SD保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297，所述的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD分别含有表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE和SD，它们的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2和4所示。
一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD的制备方法，它包括下列步骤：
1)分别构建重组质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD，用如下所示的两个引物对从患猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea)的病猪粪便病料中分别扩增猪流行性腹泻病毒COE基因和SD基因，所述的COE基因和SD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示：
所用引物对的DNA序列分别如下所示：
COE正向引物：GATGAATTCATGCATGAACAGCCAATTTC(5′→3′)，
COE反向引物：GGGAAGCTTGATAGTATACTTGGTACACACATCC(5′→3′)；
SD正向引物：GACGAATTCATGACAGACGTTTCTTTTATGACTC(5′→3′)，
SD反向引物：GGGGTCGACAATACTCATACTAAAGTTGGTGGG(5′→3′)；
分别将其亚克隆至原核表达载体pET‑32a上，构建重组质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD，其中重组质粒pET‑32a‑COE包含如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的重组质粒pET‑32a‑SD包含如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
2)分别构建重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD，将构建正确的原核表达质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD分别进行双酶切，并与经过相同双酶切的穿梭质粒pYA3493进行连接，转化asd基因缺失的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)分别构建重组猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD，将重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，分别得到保藏编号为CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD。
一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE，该片段的核苷酸序列如下所示：
CATGAACAGC CAATTTCTTT TGTTACTTTG CCATCATTCA ATGATCATTC
TTTTGTTAAT ATTACTGTCT CTGCGGCTTT TGGTGGTCAT AGTGGTGCCA
ACCTCATTGC ATCTGACACT ACTATCAATG GGTTTAGTTC TTTCTGTGTT
GACACTAGAC AATTTACCAT TACACTGTTT TATAACGTTA CAAACAGTTA
TGGTTATGTG TCTAAGTCAC AGGATAGTAA TTGCCCTTTC ACCTTGCAAT
CTGTTAATGA TTACCTGTCT TTTAGCAAAT TTTGTGTTTC AACCAGCCTT
TTGGCTGGTG CTTGTACCAT AGATCTTTTT GGTTACCCTG AGTTCGGTAG 
TGGTGTTAAG TTTACGTCCC TTTATTTTCA ATTCACAAAG GGTGAGTTGA
TTACTGGCAC GCCTAAACCA CTTCAAGGTG TCACGGACGT TTCTTTTATG
ACTCTGGATG TGTGTACCA AGTATACTATC
一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段SD，该片段的核苷酸序列如下所示：
ACAGACGTTT CTTTTATGAC TCTGGATGTG TGTACCAAGT ATACTATCTAT
GGCTTTAAAG GTGAGGGTAT TATTACCCTT ACAAATTCTA GCTTTTTGGC
AGGTGTTTAT TATACATCTG ATTCTGGACA GTTGTTAGCC TTTAAGAATG
TCACTAGTGG TGCTGTTTAT TCTGTTACGC CATGTTCTTT TTCAGAGCAG
GCTGCATATG TTGATGATGA TATAGTGGGT GTTATTTCTA GTTTGTCTAA
CTCCACTTTT AACAATACCA GGGAGTTGCC TGGTTTCTTC TACCATTCTA
ATGATGGCTC CAATTGTACA GAGCCTGTGT TGGTGTATAG TAACATAGGT
GTCTGTAAAT CTGGCAGTAT TGGCTATGTC CCACTTCAGG ATGGCCAAG
TCAAGATTGC ACCCATGGTT ACTGGGAATA TTAGTATTCC CACCAACTTT
AGTATGAGTA TT。
一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二价基因工程疫苗，其特征包括，该疫苗含有权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD，按照体积比，猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD的菌液与明胶保护剂比例为2∶1。
权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二价基因工程疫苗中的应用。

说明书猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用
技术领域
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及两种不含抗性标记的分别表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因‑COE基因和SD基因的重组的猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的构建及应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonellu)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性，最常见的沙门氏菌属有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。沙门氏菌对人和动物均有较强的致病力，可引起人体和动物的胃肠道疾病，沙门氏菌在外界环境中的生存能力较强，在利用基因工程的方法致弱以后，仍具有较强的侵袭力。
最初预防沙门氏菌的疫苗是全菌灭活苗，但该疫苗只能激发机体的体液免疫，且易引起副作用，另外，还存在着需免疫多次和无交叉保护的缺点，因而不能广泛应用。此后，研究学者模拟沙门氏菌肠道自然感染的方式，给动物口服减毒的沙门氏菌(如肠炎沙门氏菌Ty21a的口服弱毒苗)，结果发现，可诱导机体产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此受到很多研究学者的普遍重视(Gernianier R et al.，1975)。
由于肠炎伤寒沙门氏菌Ty21a致弱的遗传背景不清晰，各国研究学者，尝试运用基因工程的方法，研究遗传背景清晰的伤寒弱毒基因缺失疫苗株，用于口服免疫研究，例如，aro基因缺失株(Dougan G et al.，1988)、cya/crp缺失株(Alper M D et al.，1978)、Dam和phoP/phoQ缺失株(Galan J E et al.，1989)、asd基因缺失株(徐引弟等，2006)等。
弱毒沙门氏菌除本身可以作为疫苗以外，也可被用作载体来表达外源抗原基因，近年来，以弱毒沙门氏菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌和寄生虫等的外源抗原，研制多价基因工程疫苗成为该领域的研究热点，从而为研制新型基因工程疫苗开辟了新的途径(Zhao Z et al.，2008)。
近年来，弱毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗成为研究的热点，其优越性主要表现在(徐引弟博士论文，2006)：
(1)抗原递呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫时，效果更佳(Dietrich et al.，1998)；
(2)可产生特异性细胞毒性T细胞杀伤反应(CTL效应)；
(3)可以激发黏膜和系统免疫反应。以弱毒沙门氏菌为载体的疫苗经口服或滴鼻的方式免疫后，可以直接将外源抗原运载至机体的黏膜相关淋巴组织(MALT)，从而激发机体的黏膜和系统免疫反应(Spreng et al.，2006)；
(4)具有免疫佐剂作用。沙门氏菌的LPS是一种内在佐剂，此外，有研究表明，沙门氏菌内部有一个非甲基化的CpG DNA序列，具有较强的免疫刺激活性，可以促进机体内部Th型为主的免疫应答，因而，被认为是具有应用潜力的免疫增强剂和免疫佐剂(Paglia et al.，1998)；
(5)免疫具有持续性。减毒沙门氏菌载体所携带的质粒不易丢失，且可长期稳定地存在于机体淋巴组织内，从而不需反复多次地加强免疫也可长期地激发机体的免疫应答反应；
(6)联合免疫作用。减毒沙门氏菌本身所携带的抗原与质粒表达的外源抗原起到了联合免疫的作用，同时，还可以将2个或2个以上的外源抗原基因插入到表达质粒中，免疫宿主后可针对不同的外源抗原产生相应的免疫反应，从而达到一次免疫防治多种疾病的疗效；
(7)所表达的抗原蛋白不需提纯。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗，只需过夜培养即可直接免疫，从而省去了诱导剂诱导与纯化蛋白的步骤，制备过程简单、省时，且易于储存运输，因此，可显著降低疫苗制作成本；
(8)接种方式简便，易于操作，适于群体免疫，且安全性好。
猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是在含醋酸铊的培养基中，连续传代500次致弱的菌株，其具有良好免疫原性，实践也证明了C500株具有良好的免疫原性，且能激活全身、局部和粘膜免疫系统，具有副作用低、安全性好的特点。其中，最常用的是沙门氏菌Asd‑平衡致死系统(Galan J E，et al.1990)。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟博士构建了C500株的asd基因缺失株Δasd C500，经实验证实Δasd C500缺失株的免疫原性，与C500菌株相比，毒力更低，安全性更好(徐引弟等，2006)，且已应用于重组活疫苗的制备，如申请人所在农业微生物国家重点实验室构建了猪传染性胃肠炎的重组沙门氏菌活疫苗，经临床验证，该疫苗具有较好的免疫预防效果，且已申请了中国发明专利(专利申请号为2009100639279)。
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，一种高度接触性的急性传染病，猪感染PEDV以后，常引起仔猪的急性肠炎及致命性水泻直至脱水死亡，其临床特征主要表现在仔猪呕吐、严重腹泻和脱水；PEDV感染猪，剖检病理变化主要表现为猪的空肠和回肠部分的肠绒毛的萎缩和脱落(Pensaert and Yeo，2006)。PED对猪的危害很大，各种年龄的猪均可发病，但对哺乳仔猪的危害最为严重，20日龄以内仔猪死亡率达95％以上(Timoney J F et al.，1988)，给养猪业带来重大经济损失。
目前，PED在世界范围内广泛流行。在欧洲各国，PED较以前的流行程度已明显降低，但是在亚洲猪场中PEDV的感染率非常高，尤其是在韩国、日本和中国等，从致病机理和临床症状上来看，PEDV与TGEV极为相似，且由于其感染率明显高于TGEV和猪轮状病毒(PoRV)，给养猪业造成了巨大的损失(Cavanagh D et al.，1997)。
PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属。PED首次发现并报道是在1971年的英国(Oldham，1972)。自此以后，该病在欧洲和亚洲大规模发生报道(Puranaveja et al.，2009)，自1976年开始，我国相继报道了PED的发生，现在PED已成为世界范围内流行的重要的猪病毒性腹泻病之一。1978年，引起该病的病原体‑PEDV，在英国和比利时首次得到鉴定(Chasey et al.，1978)，且在1991年国际病毒分类委员会(ICTV)的第五次报告被列为冠状病毒属的可能成员，直到1995年的第六次报告才被列为冠状病毒属的正式成员。
PEDV粒子形态特征与冠状病毒科其它成员的很相似(Chasey et al.，1978)，纤突糖蛋白(S蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和包膜糖蛋白(E蛋白)分布于病毒粒子的表面；核衣壳蛋白(N蛋白)位于病毒粒子内部，PEDV的核衣壳结构是由N蛋白与基因组RNA相互作用而形成的，这使得PEDV与传染性胃肠炎病毒在形态学上很难区别(Pensaert et al.，1986)。目前为止，研究发现PEDV只存在一个血清型(Witte et al.，1981)。
PEDV S蛋白在介导感染宿主产生中和抗体的过程中发挥重要作用，近年来，国内外研究人员先后对PEDV S基因进行了的研究。2002年Chang等据TGEV S基因的中和表位序列，推测出了PEDV S基因的一个抗原表位区(499～638aa)，并命名为COE，经试验证实，该基因具有较好的免疫原性，且也已作为靶基因，应用到转基因植物疫苗和基因工程疫苗的制备之中(Nguyen et al.，2009；葛俊伟等，2010)。PEDV是以体液免疫为主的病毒，因而，B细胞抗原表位在抗PEDV感染中具有重要的意义，Sun等人(2008)通过实验鉴定得知S1亚基的S1D(636‑789aa)区中所包含的S1D5(744‑759aa)和S1D6(756‑771aa)，可能为PEDV的两个B细胞表位(Sun D B et al.，2008)，另外S1D区还包括了一个免疫原性较好的高亲和力表位序列S1P3(697‑742aa)。
国内外常用的预防PED发生的方法是，将PEDV感染猪的粪便或发病仔猪的肠内容物，人工感染妊娠母猪，刺激产生母源抗体，仔猪吮乳后，获得保护，降低死亡率和缩短PED流行时间。
与大多数病毒性疾病相同，对PED的防控，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，PED商业化的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗两种，两种疫苗在使用后，虽然在一定程度上可以预防PED的发生，但效果不理想。推测其原因为PEDV主要经肠道感染猪，局部肠黏膜免疫系统在抗PEDV感染的免疫过程中发挥了重要的作用(Pospischil A et al.，2002)，因而刺激肠道黏膜产生的特异性sIgA，成为防制本病发生和研制PED疫苗关键的问题。然而，现有的商业化灭活苗和弱毒苗在免疫后，只能诱导体液免疫应答，不能激活黏膜免疫系统，即使有较高的血清抗体滴度，仍不能阻止病原经黏膜入侵体内，因而免疫效果不佳。目前，虽已有PED转基因植物疫苗和基因工程活疫苗的相关研究，但只是处于实验研究阶段，还未实现商业化，因此，开发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。
鉴于减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果较好，能同时激发全身免疫和局部粘膜免疫等优点，有着良好的应用前景。重组沙门氏菌疫苗的传统构建方法存在很多缺陷，如以前所采用的携带抗性基因的表达质粒，因其所存在的生物安全问题，而不被人们所接受。本研究所使用的猪霍乱沙门氏菌C500asd质粒‑载体平衡致死系统具有无抗性标记的优点，此外，还具有免疫原性好、表达量高、外源基因表达稳定和不需纯化等优点，因而，将其开发为表达猪流行性腹泻病毒主要抗原基因的重组活疫苗具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原蛋白基因‑COE基因和SD蛋白基因的重组猪霍乱沙门氏菌株。
本发明的第二个目的是利用上述的重组菌获得一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒二价基因工程疫苗。
本发明的第三个目的是上述重组菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒二价基因工程疫苗中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过基因工程的方法，获得了表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因‑COE基因和SD基因的重组的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)‑C501‑COE和C501‑SD，该两菌株已于2011年8月22日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号分别为CCTCCNO：M2011296；CCTCC NO：M2011297。
两个重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD的制备方法，主要包括下列步骤：
1)原核表达质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD的构建：从患猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病猪粪便病料中，扩增猪流行性腹泻病毒COE基因和SD基因，并分别将其亚克隆至原核表达载体pET‑32a，构建原核表达质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD；
2)重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD的构建：将构建正确的原核表达质粒进行双酶切，并与经过相同双酶切的穿梭质粒pYA3493进行连接，转化Asd‑的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD的构建：将重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，得到保藏编号分别为CCTCC NO：M2011296；CCTCC NO：M2011297的重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD。
申请人获得两种猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE基因、SD基因，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示(其制备方法见实施例所示)。
申请人利用所述的重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑COE菌液、重组的猪霍乱沙门氏菌C501‑SD菌液与明胶保护剂按照适当体积比(见实施例)成功制备一种防治猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻的二价基因工程疫苗。
上述的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株缺失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能正常生长、繁殖)，同时这两株重组菌株分别含有外源质粒pYA‑COE和pYA‑SD(均含有asd基因)，这两株重组菌株均保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA‑COE和pYA‑SD均能在该菌株中表达asd基因，且两者能分别表达猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗原位点和SD抗原位点基因。其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成相关成份。COE抗原位点和SD抗原位点基因表达产物提供良好的针对猪流行性腹泻病毒的免疫原性。
本发明的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株C501‑COE和C501‑SD，这两株基因工程菌株均衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500。所述的本发明的重组猪霍乱沙门氏菌株C501‑COE和C501‑SD，缺失了C500菌株基因组中的asd基因，同时添加了含有猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗原位点和SD抗原位点基因的质粒pYA‑COE和pYA‑SD。由于需要pYA‑COE和pYA‑SD的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA‑COE和pYA‑SD(也就是COE抗原位点和SD抗原位点基因)在重组菌株中的稳定性。COE抗原位点和SD抗原位点基因在重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪传染性胃肠炎病毒很好的免疫保护力。
本发明的基本构建方法是：利用本申请人所在的农业微生物国家重点实验室构建好的asd基因缺失的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500ΔcrpΔasd缺失株(徐引弟等，2006)构建含有能够原核表达猪流行性腹泻病毒COE和SD基因的质粒pYA‑COE和pYA‑SD。将重组质粒分别电转入C500asd基因缺失株中，这样重组质粒与C500asd基因缺失株形成互补，而满足生长需要，进而稳定共存，形成了我们发明的不含抗性标记的能表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原的重组菌株C501‑COE和C501‑SD。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻的二价基因工程疫苗。
本发明的主要优点是：
1、本发明的重组菌株表达的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点是猪传染性胃肠炎病毒重要的免疫原性基因片段，本发明的重组菌株表达的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因‑COE基因和SD基因是猪流行性腹泻病毒重要的免疫原性基因片段，均具有良好的免疫保护性。由于猪传染性胃肠炎病毒和猪、流行性腹泻病毒危害日益严重，而目前市场上各种商品化猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻疫苗(主要是佐剂灭活苗和弱毒苗)免疫效果普遍较差。因此，用该基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。
2、本发明的重组菌株衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，该重组菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物安全性。
3、本发明的重组菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌、传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻三种病原的保护力。
4、本发明所研制的疫苗，与现有的灭活苗和弱毒苗相比，具有制备过程简单、省时，且易于储存运输的特点，显著降低了疫苗的制作成本。
5、本发明的重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。
更详细的技术方案见实施例所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE的核苷酸片段。
序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因SD的核苷酸片段。
图1：本发明制备的能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原基因片段构建流程图。
图2：本发明制备的能够原核表达的COE基因和SD基因的序列比对图。其中，图2A：能够原核表达的COE基因与其它毒株相应序列的比对；图2B：能够原核表达的SD基因与其它毒株相应序列的比对。
图3：本发明制备重组沙门氏菌所用穿梭质粒pYA3493的图谱。
图4：本发明制备重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD的PCR鉴定图片。其中：
图4A：pYA‑COE PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1‑2：pYA‑COE；3：阳性对照；4：阴性对照；
图4B：pYA‑SD PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1‑2：pYA‑SD；3：阳性对照；4：阴性对照。
图5：本发明制备重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD的酶切鉴定结果电泳图。其中，M1：DNA Marker(DL2000)；M2：DNA marker(DL15000)；1：pYA3493/EcoR I；2：pYA‑COE/EcoRI+HindIII；3：pYA‑SD/EcoRI+Sal I。
图6：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD的构建流程图。
图7：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD的PCR鉴定图。其中，
图7A：重组菌C501‑COE PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1‑2：C501‑COE；3：阳性对照；
4：阴性对照；
图7B：重组菌C501‑SD PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1‑2：C501‑SD；3：阳性对照；
4：阴性对照。
图8：本发明制备的重组菌株C501‑COE和C501‑SD中沙门氏菌invA基因的扩增图片。其中，
M：DNA Marker(DL2000)；1：阳性对照；2：C501‑COE中invA基因扩增；3：501‑SD中invA基因扩增。
图9：利用Western blotting方法检测本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD中蛋白的分泌表达。其中：
图9A：含有COE蛋白在重组菌C501‑COE中的分泌表达。其中，M：Prestained Protein Ladder；
图9B：含有SD蛋白在重组菌C501‑SD中的分泌表达。其中，M：Prestained Protein Ladder。
图10：利用间接免疫荧光实验检测本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD中表达蛋白在细菌中的定位。其中，图10A：C501‑COE；图10B：C501‑SD；图10C：C501‑pYA。
图11：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD的生长曲线图。
图12：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD的遗传稳定性实验结果。其中：
图12A：重组菌C501‑COE的遗传稳定性鉴定结果。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1‑6：分别为重组菌C501‑COE传代50次、40次、30次、20次、10次和第1代的PCR鉴定结果；
图12B：重组菌C501‑SD的遗传稳定性鉴定结果。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1‑6：分别为重组菌C501‑SD第1代及传代20次、30次、40次和50次后的PCR鉴定结果。
图13：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源抗原的的黏膜sIgA抗体水平。其中：
图13A：重组菌C501‑COE免疫小鼠后的抗COE蛋白的黏膜sIgA抗体水平；
图13B：重组菌C501‑SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的黏膜sIgA抗体水平。
图14：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源抗原的血清IgG抗体水平。其中：
图14A：重组菌C501‑COE免疫小鼠后的抗COE蛋白的血清IgG抗体水平；
图14B：重组菌C501‑SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的血清IgG抗体水平。
图15：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD在免疫BalB/C小鼠后针沙门氏菌的抗体水平。其中：
图15A：重组菌C501‑COE和C501‑SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的血清IgG抗体水平；
图15B：重组菌C501‑COE和C501‑SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的黏膜sIgA抗体水平。
图16：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD在小鼠体内诱导的IFN‑γmRNA上的差异水平比较。其中；
图16A：重组菌C501‑COE诱导的IFN‑γmRNA水平与空质粒对照菌的对照结果；
图16B：重组菌C501‑SD诱导的IFN‑γmRNA水平与空质粒对照菌的对照结果。
图17：本发明制备的重组菌C501‑COE和C501‑SD在小鼠体内诱导的IFN‑γ蛋白表达水平的差异比较。其中：
图17A：重组菌C501‑COE诱导的IFN‑γ蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果；
图17B：重组菌C501‑SD诱导的IFN‑γ蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：制备能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原COE和SD蛋白的基因片段
(1)制备原核表达质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD所需的引物设计，其序列如表1所述。
表1制备原核表达质粒pET‑32a‑COE和pET‑32a‑SD所需的引物序列


表1中引物的下划线部分为酶切位点。
(2)制备能够原核表达的COE和SD片段
利用张坤报道的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT‑PCR检测方法(张坤，2010)，检测送检的临床病料。从猪流行性腹泻病毒感染的阳性粪便病料中，提取基因组RNA(采用BioFlux公司的总RNA提取试剂盒，按照该公司提供的试剂盒说明书操作)，然后进行反转录。以反转录所得到的cDNA为模板，分别以表1所示的EP1/HP2和SDE1/SDS2为引物，PCR扩增带有EcoR I、HindIII酶切位点的PEDV COE基因和带有ECOR I、Sal I酶切位点的SD基因片段，扩增体系如下所述：

COE基因片断和SD基因片段的PCR扩增条件：95℃预变性4min后，进行如下循环：94℃变性40s，58.1℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环，最后72℃10min。
扩增完成后，取PCR产物8μL，加入1μL10×Loading Buffer，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，观察电泳结果。电泳后用BioFlux公司胶回收试剂盒进行目的基因的纯化(按照该试剂盒的说明书操作)。将纯化后的COE基因片段与原核表达载体pET‑32a分别进行EcoR I和HindIII双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)；将纯化后的SD基因片段与原核表达载体pET‑32a分别进行EcoR I和Sal I双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)。经PCR、双酶切和测序鉴定，最终得到能够原核表达的猪流行性腹泻COE和SD基因片段。能够原核表达的基因片段的制备流程如图1所示。测序结果与其它毒株序列的比对结果如图2所示。
实施例2：重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD的构建与鉴定
将带有EcoR I、HindIII酶切位点的重组质粒pET‑32a‑COE和带有ECOR I、Sal I酶切位点的pET‑32a‑SD进行双酶切回收，然后与同样经过双酶切回收的穿梭质粒pYA3493(质粒构建图谱见图3)连接，连接产物转化asd基因缺失的大肠杆菌x6097(来源：美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠)，筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定，得到构建正确的重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD(如图4和图5所示)。其中，PCR扩增体系及扩增条件如实施例1，(2)所述。
实施例3：表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株C501‑COE和C501‑SD的构建与鉴定
(1)鉴定重组的沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD所需的引物的设计，其DNA序列如表2所示：
表2鉴定重组的沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD所需的引物的DNA序列

(2)重组的沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD的构建与鉴定方法
将鉴定正确的重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD(来源见实施例2)分别电转化至asd缺失的C500‑感受态细胞中，电转仪(Bio‑Rad GenePulserII)参数设置为：电压2.2Kv，电容25μF，脉冲电阻200Ω和时间4ms，构建流程图见图6。在DAP阴性平板上，挑取单菌落于TSB液体培养基中培养8‑10h，吸取1mL菌液制备模板，分别以表1所示的EP1/HP2和SDE1/SDS2为引物，进行目的片段的扩增(如图7所示)；再使用沙门氏菌特异基因invA基因(GenBank：M90846.1)的特异性引物pi1/pi2(见表2)对重组菌进行沙门氏菌特异性鉴定(如图8所示)；最后以表2所示的引物pY1为上游测序引物进行测序鉴定。结果表明含有pYA‑COE和pYA‑SD质粒的重组的猪霍乱沙门氏菌构建正确，申请人分别将其命名为猪霍乱沙门氏菌菌株(Salmonella choleraesuis)C501‑COE和C501‑SD，并送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)用于专利程序的保藏。
实施例4：表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株C501‑COE和C501‑SD的生物学特性
(1)重组菌C501‑COE和C501‑SD的表达特性分析
分别挑取重组菌C501‑COE和C501‑SD的单菌落于TSB液体培养基中，37℃，200r/min培养12h，4℃放置12h，按1∶100的体积比接种于TSB液体培养基(配方：3％TSB粉末(30g)溶于ddH2O中，15磅高压灭菌15min后于室温保存。)中，37℃，200r/min，培养6‑8h，8000rpm离心10min，分别收集菌体和上清，上清液经0.22μm滤膜过滤，取900μl上清，并加入100％的三氯乙酸100μl，使上述重组菌的终浓度均达到10％，冰浴30min后，12000r/min，离心30min，弃上清；加入1mL预冷的无水乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心10min，如此重复洗涤2次。将所得到的蛋白用猪源抗猪流行性腹泻病毒阳性血清(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，见遗传资源表所述)作一抗，进行Western blotting鉴定(如图9所示)，结果显示本发明的重组菌能够分泌表达融合蛋白，且融合蛋白能够与猪的猪流行性腹泻病毒阳性血清抗体发生特异性反应。
此外，经间接免疫荧光实验对融合蛋白在细菌中的定位进行了鉴定，鉴定方法参考汪淼的硕士论文(汪淼.2006。)，实验结果显示，重组菌所表达的融合蛋白定位于细菌的表面(如图10所示)。
(2)重组菌C501‑COE和C501‑SD的生长特性分析
将重组菌C501‑COE、C501‑SD在TSB中37℃培养过夜后，进行连续10倍稀释，选取3个合适的稀释梯度，每个稀释度取100μL均匀涂布在TSA平板上，每个梯度各做3个重复，37℃，培养过夜，计数，取平均值，并计算出原液的CFU(菌落形成单位)。转接使其终浓度为106CFU/mL，37℃，200r/min振荡培养，每间隔1h取样，测OD600值，绘制生长曲线。相同的方法绘制亲本株猪沙门氏菌C500及空载体质粒对照菌株C501‑pYA的生长曲线，然后比较其生长特性的差异。从重组菌的生长曲线(如图11所示)可以看出，重组菌C501‑COE、重组菌C501‑SD、空载体质粒对照菌株C501‑pYA在培养过程中，生长状态与亲本菌株猪沙门氏菌C500基本相似，只是生长速度稍慢于亲本猪沙门氏菌。
(3)重组菌C501‑COE和C501‑SD的表型鉴定
分别将重组菌C501‑COE、C501‑SD、空质粒对照菌株C501‑pYA和亲本菌株C500划线接种于TSA平板，然后挑取单菌落，分别转接阿拉伯糖、甘露糖、硫化氢、乳糖、木糖、尿素、葡萄糖、鼠李糖、卫茅醇、蔗糖等碳源生化鉴定管，37℃，温育24h，进行重组菌的表型判定。生化鉴定结果表明，重组菌C501‑COE、C501‑SD和C501‑pYA与亲本菌C500生化特性相同，都不能利用蔗糖、阿拉伯糖、尿素、乳糖、卫茅醇和蔗糖，但是能利用甘露糖、木糖、葡萄糖、和鼠李糖作为唯一碳源。
(4)重组菌C501‑COE和C501‑SD的遗传稳定性
将重组菌C501‑COE和C501‑SD在用TSA固体培养基(配方：4％TSA粉末(40g)溶于ddH2O中，15磅高压灭菌15min后于室温保存。)制备的平板上划线培养，挑取单菌落至液体培养基中，37℃，200r/min，振荡培养12h，然后按1∶100的体积比转接到新鲜的TSB液体培养基中，培养12h，如此连续重复转接培养50次，以第1、10、20、30、40和50代的培养物为模板，分别用表1所述的引物EP1/HP2和SDE1/SDS2进行PCR扩增，PCR扩增体系及扩增条件如实施例1，(2)所述，检测重组质粒pYA‑COE和pYA‑SD在Δasd C500中的遗传稳定性。鉴定结果证明，均可以从各代重组菌培养物中扩增出480bp和462bp的特异性DNA条带(如图12所示)。
实施例5：以Balb/C小鼠为动物模型分析重组菌的免疫原性
1.小鼠免疫实验设计
70只BALB/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心，见遗传资源表所述)随机分为7小组，每组10只，分别为口服重组菌C501‑COE、肌注重组菌C501‑COE、口服重组菌C501‑SD、肌注重组菌C501‑SD、口服重组菌C501‑pYA、肌注重组菌C501‑pYA和TSB对照组，于首免后两周和二免后两周(首免后4周)断尾采血和收集肠内容物，间接ELISA方法检测抗体水平(IgA和IgG抗体)，具体操作步骤如下所述：
1.1免疫小鼠血清IgG抗体水平ELISA检测：
按照文献《疫苗关键技术详解》原著第二版(A.罗宾逊等，2006)，将原核表达蛋白(COE蛋白和SD蛋白)按0.5μg/孔的浓度包被酶标板，100μl/孔，4℃，包被过夜，洗涤液洗涤3次，3min/次；
(2)加入封闭液进行封闭，150μl/孔，37℃，封闭2h，取出洗涤3次，3min/次；
(3)将待检血清从1∶2或1∶10开始进行倍比稀释，加入酶标板，100μl/孔，37℃，反应1h，取出洗涤3次，3min/次；
(4)加入1∶6000倍稀释的羊抗鼠HRP‑IgG，100μl/孔，37℃，反应1h，洗涤5‑6次，3min/次；
(5)加入四甲基联苯胺底物(A+B)100μl，室温避光反应10‑15min，再加入50μl 0.25％HF终止反应，用酶标仪测定OD630nm；
(6)选择OD630nm≥0.2的反应孔，作为阳性，取待检血清的最高稀释倍数的倒数，换算成抗体的滴度。
1.2免疫小鼠肠分泌性IgA抗体水平检测：
分别于免疫后21d，28d随机取2‑3只小鼠，颈椎脱臼处死，刮取肠道表面粘液于1.5ml离心管中，用pH 7.4PBS作10倍稀释，混匀后‑20℃保存备用。
肠道sIgA抗体ELISA检测方法同实施例5，1.1所述。其中，间接ELISA检测方法所用的核心试剂的成分及制备步骤如下所示：
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液(25mmol/L)；Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，ddH2O定容至至1L；
PBS缓冲液：140mmol NaCl(8.18g)，2.7mmol KCl(0.20g)，10mmol Na2HPO4(3.58g)，1.8mmol KH2PO4(0.245g)，溶于800mL ddH2O中，用5mol/L的NaOH调至pH7.4后，ddH2O定容至至1L；
洗涤液：在PBS缓冲液中加入0.05％的Tween‑20；
封闭液：1L洗涤液中加入0.50g牛血清蛋白(BSA)；
底物缓冲液：pH5.0的磷酸盐‑柠檬酸盐缓冲液25.7mL，0.1mol/L的柠檬酸液24.3mL，0.2mol/L的Na2HPO4 25.7mL，ddH2O 50mL；
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL的无水乙醇中；
底物液(TMB)：将TMB母液与底物缓冲液按按1∶20的比例混合均匀后，每毫升底物液中加入30％的H2O2 0.2μL；
终止液：0.25％HF。
免疫前，需对重组菌进行活菌计数。口服组免疫前4h，BALB/c小鼠需停水停料，在免疫前20min口服50μl 10％NaHCO3中和胃酸，然后用12号BALB/c小鼠灌胃针口服免疫200μl，使每只BALB/c小鼠免疫剂量约为1.5×108个活菌量(剂量参照：中华人民共和国兽用生物制品质量标准，2001版)；肌肉注射组每只BALB/c小鼠免疫剂量与口服免疫组下相同；TSB空白对照组免疫接种200μl。
免疫后2周，每组随机选取5只进行加强免疫。分别于首次免疫前、首次免疫后2周、加强免疫后2周进行小鼠尾静脉负压采血，收集血清，将5只BALB/c小鼠血清等量混合，采用间接ELISA法检测各组平均抗体水平。
2.免疫BALB/c小鼠的抗猪流行性腹泻病毒保护性抗原蛋白抗体水平的检测
分别采集免疫前、首免后2周和二免后2周的BALB/c小鼠血清利用间接ELISA方法检测血清IgG抗体；分别于免疫后21d，28d随机取2‑3只BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死，刮取肠道表面粘液于1.5ml离心管中，用pH 7.4PBS稀释，利用间接ELISA方法检测黏膜sIgA抗体。按照文献《疫苗关键技术详解》原著第二版(A.罗宾逊等，2006)，将原核表达蛋白(COE蛋白和SD蛋白)按0.5μg/孔的浓度包被酶标板，将待检血清或肠黏膜内容物从1∶2或1∶10开始进行倍比稀释，分别加入到相应反应孔内进行检测。
检测结果如下：①sIgA产生情况，重组菌C501‑COE和C501‑SD口服免疫组sIgA抗体滴度分别为1∶1280和1∶2048，而肌肉注射组的sIgA抗体滴度分别为1∶640和1∶1024(如图13所示)；②血清IgG抗体产生情况，重组菌C501‑COE和C501‑SD肌肉注射组中的IgG抗体滴度分别为1∶4096和1∶2560，而口服免疫组所产生的IgG抗体滴度分别为1∶2048和1∶1280(如图14所示)
(3)免疫BALB/c小鼠沙门氏菌抗体水平ELISA检测
沙门氏菌ELISA抗原的制备：挑取沙门氏菌单菌落于5mL TSB液体培养基中，37℃，活化过夜，用体积比为1∶100转接至100mL TSB液体培养基，37℃，200r/min，培养8h，8000r/min，离心10min，收集菌体，用pH 7.4的PBS洗涤2次，然后，用pH 7.4的PBS以体积比为1∶10倍浓缩重悬，冰上超声破碎至清亮(UP 200S超声波处理器‑德国Dr.Hielscher公司制造，功率：200W、振幅：60％、操作频率：24KHz，超声波破碎时间：30s/次，间隔时间：1min/次)，12000r/min，离心20min，弃沉淀。用分光光度计测定上清蛋白浓度，分装500μl/管，于‑20℃保存备用。按照文献《疫苗关键技术详解》原著第二版(A.罗宾逊等，2006)，将制备的沙门氏菌蛋白按0.5μg/孔的浓度包被酶联板，间接ELISA方法检测免疫BALB/c小鼠血清中的IgG抗体和肠黏膜中的特异性IgA抗体水平。
检测结果显示，重组菌株C501‑COE和C501‑SD免疫组BALB/c小鼠均诱导产生了与空载体对照菌株C501‑pYA免疫组BALB/c小鼠相似水平的沙门氏菌血清IgG抗体和肠道sIgA抗体(如图15所示)
(4)细胞免疫检测
具体方法按文献(肖少波，2004)进行：
制备小鼠脾淋巴细胞，并调整细胞浓度为2×106/mL，加入到24孔细胞培养板中，1mL/孔，以纯化的目的蛋白作体外刺激原，并使蛋白终浓度为10μg/mL。将24孔细胞培养板放于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，20h后，各选择一个细胞孔，提取细胞总RNA，通过相对荧光定量的方法测定IFN‑γmRNA表达水平上的差异。剩余细胞孔，在72h后，收集细胞上清，利用双夹心ELISA方法(采用R&D公司小鼠IFN‑γ检测试剂盒进行检测，具体操作步骤参照该试剂盒的说明书)，检测IFN‑γ蛋白表达水平上的差异。
利用SYBR Green Real‑time PCR的方法，检测BALB/c小鼠免疫脾细胞中IFN‑γ的mRNA相对于β‑actin的mRNA的表达量，并进行了相对定量分析，结果显示，重组菌C501‑COE和C501‑SD免疫组BALB/c小鼠脾细胞中IFN‑γmRNA的相对表达量高于空载体质粒C501‑pYA免疫组，且肌肉注射组的IFN‑γmRNA的相对表达量要高于口服免疫组(如图16所示)。
采用双夹心ELISA方法(采用R&D公司小鼠IFN‑γ检测试剂盒进行检测，具体操作步骤参照该试剂盒的说明书)检测各免疫组脾细胞分泌的IFN‑γ水平，结果表明，本发明的重组菌C501‑COE和C501‑SD免疫组BALB/c小鼠脾细胞中IFN‑γ蛋白表达水平明显高于高于空载体质粒C501‑pYA免疫组，且重组菌肌肉注射组IFN‑γ抗体水平要略高于口服免疫组。(如图17所示)
此外，沙门氏菌空质粒对照组C501‑pYA所诱导的IFN‑γ无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上都比TSB对照组的要高一些，这可能与沙门氏菌本身可充当佐剂有关，因而可刺激机体产生比较强的细胞免疫反应。
实施例6：利用重组的沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD制备二价基因工程疫苗
将重组菌C501‑COE和C501‑SD在TSA固体培养基上划线培养，挑取单菌落于TSB液体培养基中培养，培养至活菌浓度达到2.5×1010CFU/mL。将菌液低速离心集菌，按沙门氏菌C501‑COE和C501‑SD的菌液：明胶保护剂(体积：体积)为2∶1的比例加入明胶保护剂(保护剂配制方法：每100mL ddH2O中加入蔗糖40g，明胶8g；充分溶解后于121℃高压灭菌30min，保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置‑50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36‑40h后压盖，用生理盐水或PBS(pH7.4)溶解并进行活菌计数(CFU)，并且确保没有杂菌污染，置于‑20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。
实施例7：重组疫苗菌株的初步临床保护效果观察
(1)重组疫苗菌株对新生仔猪的安全性试验
从一规模化养猪场随机抽取2窝健康1日龄仔猪(品种为长白猪)，以3×109CFU的免疫剂量，口服免疫本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗，跟踪观察7天，发现免疫前后仔猪体温无变化，且仔猪能够正常吸吮母乳，由此说明本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗是安全的。
(2)本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗对仔猪的免疫保护试验
选择两个PEDV感染的规模化猪场，以3×109CFU的免疫剂量，口服免疫本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗，跟踪观察1周，记录各猪场免疫后的仔猪(品种为长白猪)发病率和成活率，评价免疫效果(见表3和表4)。
表3猪场A应用本发明制备的猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗的免疫效果


表4猪场B应用本发明制备的猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗的免疫效果

由表3和表4的临床试验统计数据可知，本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗不仅安全性较好，且具有较好的预防效果。新生仔猪免疫重组疫苗后，A场腹泻率由100％下降到18％～30％，B场死亡率则由80％下降到8％～20％，结果显示了该重组疫苗具有较好的免疫预防效果。
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