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1、(10)申请公布号 CN 103013994 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013994 A *CN103013994A* (21)申请号 201210575819.1 (22)申请日 2012.12.26 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 武汉康圣达医学检验所有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新 大道 666 号武汉国家生物产业基地项 目 B、 C、 D 区研发楼 B3-1 栋 (72)发明人 李小青 孙黎 李金欢 叶贵 陈然 郝玮 梁超 韩韬 涂赞兵 方国伟 陈忠 黄士昂 (74)专。
2、利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11411 代理人 郑自群 (54) 发明名称 引物及该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基 因方法 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域, 具体来说是一种 引物及该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因 方法, 是一种临床检验用途的基因融合检测试剂 盒, 采用 PCR 技术, 能够对人类慢性粒细胞白血 病 (CML) 、 急性淋巴细胞白血病 (ALL) 、 以及少数 急性粒细胞白血病 (AML) 患者体内各种融合型的 BCR/ABL 融合基因进行检测, 一次性确定具体的 BCR/ABL 融合型, 利于后期的定量。
3、检测和疗效监 测。可有效的节约检测时间, 节约检测成本, 提高 检测效率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种引物, 其特征在于 : 所述引物序列如下 : BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG BCR-19:GCACTGAAGGCAG。
4、CCTTCGACG BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。 2. 根据权利要求 1 所述该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因方法, 其特征在于 : 包 括如下步骤 : (1) 、 RNA 的提取 ; (2) 、 将 RNA 反转录成 cDNA ; (3) 、 以 cDNA 为模板进行 PCR 反应 ; (4) 、 PCR 反应产物检测 ; (5) 、 结果判断。 3. 根据权利要求 2 所述该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因方法, 其特征在于 : 所 述步骤 (3) 中 PC。
5、R 反应的反应液包括 cDNA 模板, GoTaq Green MasterMix(2) , 检测已知 融合型的 BCR/ABL 融合基因用上下游公共引物 BCR-1、 BCR-6、 BCR-12、 BCR-19 和 ABL-3, 检 测内参基因 BCR 用引物为 BCR-12、 BCR-R 和 ddH2O ; 其中 : BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG BCR-R:GGAT。
6、GTCCGTGGCCACACCGGAC ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。 4. 根据权利要求 2、 3 所述该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因方法, 其特征在于 : 所述的 PCR 反应条件为 94 10min 循环数 1 次 ; 94 30s、 58 30s、 72 45s 循环 35 次 ; 72 5min 循环 1 次。 权 利 要 求 书 CN 103013994 A 2 1/5 页 3 引物及该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域, 具体来说是一种引物及该引物筛选 9 种已。
7、知 BCR/ABL 融合基因方法。 背景技术 0002 白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。 其克隆中的白血病细胞失去进 一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。 根据白血病细胞的成熟程度和自然病 程, 白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速 , 自然病程仅有数周至数 月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系细胞白血病 (AML) 和急性淋巴细胞白血 病 (ALL) 两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟的细胞过度增生, 因此 慢性白血病应是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患, 而非成熟障碍所至。 慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病 (CM。
8、L) 、 慢性淋巴细胞性白血病 (CLL) 。由于白血病 类型不同, 治疗方案及预后亦不尽相同, 因此确诊后, 应进一步分型。关于人类白血病的病 因与发病机理, 至今仍未完全明了。 已知病因有感染因素、 电离辐射、 化学物质, 遗传因素及 免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。 0003 白血病的诊断和治疗, 一直是国际性的重大难题。 近年来, 随着各种诊断技术的不 断发展, 特别是分子生物学研究手段的不断更新, 其在血液病诊断中所起的作用越来越重 要。尤其是对有明显检测靶标的白血病的诊断, 分子生物学的检测结果已经不可或缺。 0004 Ph 染色体是在血液病中最早确。
9、定的染色体异常, 主要出现在慢性粒细胞白血病和 部分急性淋巴细胞白血病中, 它是由 9 号和 22 号染色体易位造成的。这种易位也造成了位 于22号染色体上的BCR基因和位于9号染色体上的ABL基因的融合, 产生了一个新的BCR/ ABL 融合基因 (图、 1) 。应用分子生物学方法 (RT-PCR) 检测该融合基因的存在, 已经成了确 诊 CML 或 ALL 的重要参考依据之一。近年来慢性粒细胞白血病 (CML) 的分子生物学研究不 断有新的进展, 其中之一就是陆续报道了多种不同融合位点的 BCR/ABL 融合基因。而且不 同的融合型的 BCR/ABL 融合基因对病程的影响和治疗的反应是不尽。
10、相同的。例如 P190 比 P2l0 的致癌能力更高 , 表达更倾向于导致 AL 表型。因此, 从 CML 和 ALL 病人中检测出存在 BCR/ABL 融合基因与否, 以及确定具体的融合型, 对于 CML 和 ALL 病人的诊断和治疗方案的 选择均有重大意义。 0005 在实际应用中, 用于检测 BCR/ABL 融合基因的方法主要为荧光原位杂交和 RT-PCR 法。但目前使用这两种方法来对 BCR/ABL 融合基因进行检测的, 均是只针对某种特定的融 合型进行检测。如要对目前已知的所有融合型的 BCR/ABL 融合基因进行检测, 则只能一个 一个单独进行检测, 费时费力, 且检测成本非常昂贵。
11、。 因而急需一种能同时对所有已知的融 合型的 BCR/ABL 融合基因进行筛查的方法, 省时省力, 更有利于患者的及时诊治。多重 PCR 技术则能够解决这种需求。 0006 多重 PCR 技术是在传统 PCR 原理上进行改进, 即在同一体系中加入多对特异性引 物, 对多个 DNA 模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的 DNA 片段。应用多重 PCR 技术, 说 明 书 CN 103013994 A 3 2/5 页 4 设计出针对9种已知融合型BCR/ABL融合基因 (e1a2,e1a3,e6a2,e8a2,e13a2,e13a3,e14a2 ,e14a3,e19a2) (图、 2) 的公共特。
12、异性引物, 并避免各对特异性引物之间的相互干扰, 即可实 现在同一检测体系中, 对这些不同型的 BCR/ABL 融合基因进行一次性检测。节约了大量的 检测时间和检测成本。因此本研究采用多重 PCR 技术应用于 9 种已知融合型的 BCR/ABL 融 合基因的筛查检测。 发明内容 0007 本发明设计了检测内参 / 目的基因用引物序列, 采用多重 PCR 技术, 一次性检测 9 种已知融合型 BCR/ABL 融合基因的存在与否, 试剂盒通过调整公共检测引物的比例, 以及 PCR 反应条件, 使扩增效率和速率均达到最佳。 0008 为实现上述目的, 本发明采用的技术方案是 : 一种引物, 所述引物。
13、序列如下 : 0009 BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC 0010 BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG 0011 BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG 0012 BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG 0013 BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC 0014 ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。 0015 本发明的另一个目的是利用该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因方法, 包括如 下步骤 : 0016 (1) 、 RN。
14、A 的提取 ; 0017 (2) 、 将 RNA 反转录成 cDNA ; 0018 (3) 、 PCR 反应 ; 0019 (4) 、 PCR 反应产物检测 ; 0020 (5) 、 结果判断。 0021 进一步的 : 所述步骤 (3) 中 PCR 反应的反应液包括 cDNA 模板, GoTaq GreenMaster Mix(2) , 检测已知融合型的 BCR/ABL 融合基因用上下游公共引物 BCR-1、 BCR-6、 BCR-12、 BCR-19 和 ABL-3, 检测内参基因 BCR 用引物为 BCR-12、 BCR-R 和 ddH2O ; 其中 : 0022 BCR-1:ACCTCC。
15、AGCGAGGAGGACTTCTC 0023 BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG 0024 BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG 0025 BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG 0026 BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC 0027 ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。 0028 进一步的 : 所述的 PCR 反应条件为 94 10min 循环数 1 次 ; 94 30s、 58 30s、 72 45s 循环 35 次 ; 72 5min 循环 1 次。
16、。 0029 本发明的有益技术效果是 : 本发明利用多重 PCR 技术, 设计检测 9 种已知融合型 BCR/ABL 融合基因的公共特异性引物, 对这些 BCR/ABL 融合基因进行一次性筛查检测, 使初 诊和复查的CML和ALL患者能一次性得到更全面更及时的检测, 节约检测时间和检测成本 ; 尽早确定存在的BCR/ABL融合型有助于临床上CML和ALL的早期预防、 早期诊断 ; 还可对于 说 明 书 CN 103013994 A 4 3/5 页 5 疑似进入慢性粒细胞白血病 (CML) 加速期、 急变期的高危人群进行较为准确的筛查。 附图说明 0030 图 1.BCR 和 ABL 基因的转录。
17、本 ; 0031 图 2. 各型 BCR-ABL 融合基因的转录本 ; 0032 图 3. 各型 BCR-ABL 融合基因检测结果电泳图。 具体实施方式 0033 下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、 完整地描述, 显然, 所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例, 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例, 本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例, 都属于本发明保护的范 围。 0034 引物及该引物筛选 9 种已知 BCR/ABL 融合基因方法 ; 0035 包括如下步骤 : 0036 1、 RNA 的提取 : 0037 (1)向经高压灭菌处理过的15m。
18、l离心管中加入采集的新鲜血液及7ml的红细胞裂 解液, 漩涡振荡混匀。 0038 (2) 冰浴 15 分钟后, 低速离心 3 分钟 (1500r/min) 。 0039 (3) 离心完后, 倒掉上层液体, 再向沉淀中加入 4ml 的红细胞裂解液, 漩涡振荡混 匀后, 低速离心 3 分钟 (1500r/min) 。 0040 (4) 离心后去掉上清, 再加入 8mlPBS, 漩涡振荡混匀, 低速离心 3 分钟 (1500r/ min) 。 0041 (5) 离心完后去掉上清。 0042 (6) 向沉淀中加入 1.5ml 的 PBS, 将沉淀吹打混匀后, 分别取 1ml 和 0.5ml 至两个 经。
19、过灭菌的干净离心管中。1ml 的为实验用, 0.5ml 的留作备份。 0043 (7) 将上述离心管进行低速离心 3 分钟 (1500r/min) 。 0044 (8) 离心完后去掉上清, 分别向两个管子中加入 1ml 的 Trizol 和 300ul 的白细胞 裂解液, 并吹打混匀。加 Trizol 为实验用的, 加白细胞裂解液的为备份, 放入 -20保存。 0045 (9) 给每一个 1ml Trizol 管写一个干净的灭菌的备份管, 并向加入了 1mlTrizol 的离心管中加入 200ul 的三氯甲烷, 剧烈振荡后, 4, 12000r/min 离心 10min。 0046 (10)在。
20、离心的过程中, 向备份管中加入500ul的异丙醇。 等离心完后, 将上清取至 对应的干净离心管中, 上下混匀后, -20冷藏 20min。 0047 (11)20 分钟后, 将离心管取出, 4, 15000r/min 离心 12min。 0048 (12) 离心完后, 去掉上清, 再加 1ml75% 的乙醇, 上下混匀后, -4, 12000r/min 离 心 8min。 0049 (13) 离心后, 倒掉上清, 在通风橱中将乙醇风干, 再向沉底中加入适量的超纯水, 得到总 RNA。 0050 2、 参考 Promega 公司的 M-MLV PCR RT Kit 试剂盒说明书, 将 RNA 反。
21、转为 cDNA。 0051 逆转录体系 : 说 明 书 CN 103013994 A 5 4/5 页 6 0052 试剂体积 (uL) RNA6 随机引物1 M-MLV0.25 dNTP0.5 RNA 抑制剂0.25 10M-MLV buffer2 总体积10 0053 逆转录反应条件 : 0054 RNA 和随机引物共 7uL 的体系70 5min 再加入逆转录反应混合液 3uL 共 10uL 体系37 60min 0055 3、 PCR 反应 0056 取逆转录产物 2ul, 作为 PCR 反应模板, 以 BCR(p210)-F 和 ABL(p210)-R 为上下游 引物, BCR(p19。
22、0)-F 和 ABL(p190)-R 为上下游引物进行 PCR 扩增, PCR 反应体系为 20ul。具 体配方如下 : 0057 成分加入量 (l) GoTaq Green Master Mix10 ddH2O6.5 Primers(5M each)2 cDNA1.5 总体积20 0058 PCR 的扩增条件如下 : 说 明 书 CN 103013994 A 6 5/5 页 7 0059 0060 4、 检测 : 取 5ul PCR 产物, 用 2% 琼脂糖凝胶进行凝胶电泳, 结果如图 3 所示。 0061 5、 结果判断 : BCR/ABL 9 种剪切型的扩增片段大小如下 : 0062 剪。
23、切型片段大小 (bp) e1a2474 e1a3300 e6a2270 e8a2465 e13a2345 e13a3170 e14a2420 e14a3245 e19a2236 0063 0064 若在凝胶图像中观察到上述任一种片段大小的条带出现, 则对应样本为阳性 ; 若 观察不到条带出现, 则对应样本为阴性。 0065 以上所述仅是本发明的优选实施方式, 应当指出, 对于本技术领域的普通技术人 员来说, 在不脱离本发明原理的前提下, 还可以做出若干改进和润饰, 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103013994 A 7 1/2 页 8 0001 序 列 表 CN 103013994 A 8 2/2 页 9 0002 序 列 表 CN 103013994 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103013994 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103013994 A 11 。