肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110302066.2	申请日：	2011.09.30
公开号：	CN102337289A	公开日：	2012.02.01
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 15/70申请公布日:20120201\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/70申请日:20110930\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/70; A61K39/125; A61P31/14; C12R1/19(2006.01)N	主分类号：	C12N15/70
申请人：	中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
发明人：	李德新; 张福顺; 梁米芳; 张硕; 张全福; 李川
地址：	102206 北京市昌平区昌百路155号
优先权：
专利代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司 11002	代理人：	王朋飞;王加岭
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明提供了一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法，其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载体中，并转化至大肠杆菌中进行诱导表达，然后对表达的VP1蛋白进行纯化和复性。将获得的VP1蛋白与免疫佐剂配伍制备疫苗。本发明首次利用大肠杆菌表达系统表达基因工程重组VP1蛋白，具有操作简单，成本低，易于实现大规模生产等优点。通过将原核表达的基因工程重组VP1蛋白与壳聚糖佐剂配伍后免疫小鼠，并评价其免疫学效果，初步证明了VP1蛋白不仅可以诱导产生体液免疫保护性反应，还可以诱导产生细胞免疫反应，为进一步研制人用基因工程重组VP1蛋白和灭活全病毒口服疫苗奠定了基础。

权利要求书

1.一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法，其特征在于，
其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载体pET30a中，
并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达；
其中，肠道病毒71型VP1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID
No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具
有同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，肠道病毒71型的
VP1基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括对表达的
VP1蛋白进行纯化和复性。
4.采用权利要求1-3任一项所述方法获得的VP1蛋白在制备抗肠
道病毒71型疫苗中的应用。
5.含有由权利要求1-3任一项所述方法获得的VP1蛋白的抗肠道
病毒71型疫苗。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，其为注射型疫苗或
口服型疫苗。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，注射型疫苗中使用
的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝佐剂、MF59佐剂或弗氏佐剂。
8.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，口服型疫苗中使用
的佐剂为壳聚糖、霍乱毒素B亚单位或大肠杆菌不耐热肠毒素。

说明书

肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗

技术领域

本发明涉及基因工程和制药领域，具体地说，涉及肠道病毒71
型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗。

背景技术

肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)近年来在我国的流行呈逐
年上升趋势，EV71所导致的主要疾病手足口病(hand-foot-mouth
disease，HFMD)于2008年被列入我国的法定传染病，近几年来，HFMD
发病数和病死数上升迅速。目前临床治疗中主要采取对症治疗，尚无
疫苗应用于临床治疗手足口病的报道。

目前处于研究阶段的EV71病毒疫苗按照免疫途径可分为注射型
疫苗和口服型疫苗。注射型疫苗包括灭活EV71病毒疫苗、基因工程
重组VP1蛋白疫苗、多肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗。灭活EV71
病毒疫苗可以诱导产生较好的体液免疫反应，但是目前EV71病毒的
纯化还存在一定难度，并且全病毒刺激机体免疫反应的机制还不是很
清楚，而且成本较高；病毒样颗粒疫苗是从SF9细胞中纯化出的，但
由于SF9细胞还不是疫苗生产用细胞，所以还存在安全隐患；多肽疫
苗诱导产生的特异性抗体滴度较低；核酸疫苗不仅诱导产生的特异性
抗体滴度较低，而且由于异源性基因的存在增加了体细胞基因重组的
风险。口服型疫苗主要有沙门氏菌载体疫苗、可食性疫苗、减毒活疫
苗，由于其无痛苦免疫途径所以易为目标人群所接受。但是，从目前
研究阶段来看沙门氏菌载体疫苗和减毒活疫苗均存在致病的危险性；
可食性疫苗是将EV71病毒VP1蛋白表达在果实，如番茄果实中，通过
食用番茄果实达到免疫目的，诱导产生特异性抗体的免疫原性差，并
且转基因食品的安全性还有待评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方
法。

本发明的另一目的是提供利用原核表达系统获得的肠道病毒71
型VP1蛋白在制备抗肠道病毒71型疫苗中的应用。

本发明的进一步目的是提供含有由原核表达系统获得的肠道病
毒71型VP1蛋白的抗肠道病毒71型疫苗。

为了实现本发明目的，本发明的一种肠道病毒71型VP1蛋白的原
核表达方法，其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载
体中，并转化至大肠杆菌中进行诱导表达。优选地，所述原核表达载
体为pET30a，所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

前述的方法，其中肠道病毒71型VP1基因编码蛋白的氨基酸序列
如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基
酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第20位的苯丙氨酸替
换为亮氨酸，或是将第1位的甘氨酸缺失，或是在297位后添加组氨酸
均不会影响VP1蛋白的功能。

前述的方法，其中肠道病毒71型的VP1基因序列如SEQ ID No.1
所示。

前述的方法中还包括对表达的VP1蛋白进行纯化和复性。

本发明还提供采用上述原核表达方法获得的VP1蛋白在制备抗
肠道病毒71型疫苗中的应用。

本发明进一步提供含有由上述原核表达方法获得的VP1蛋白的
抗肠道病毒71型疫苗。所述疫苗为注射型疫苗或口服型疫苗。其中，
注射型疫苗中使用的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝佐剂、MF59佐剂或弗
氏佐剂等。口服型疫苗中使用的佐剂为壳聚糖、霍乱毒素B亚单位、
或大肠杆菌不耐热肠毒素等。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

由于EV71病毒的中和表位主要位于其结构蛋白VP1上面，因此在
本发明中，将EV71病毒的VP1基因序列克隆至原核表达载体pET30a
中，将构建好的表达质粒命名为pET30a-VP1。用pET30a-VP1转化工
程表达菌BL21(DE3)，然后用IPTG对VP1蛋白进行诱导表达。通过
亲和层析柱对带有His标签的VP1蛋白进行纯化(或采用其它蛋白纯化
方法)，最后对纯化出的VP1蛋白进行复性，并将蛋白的缓冲液更换
为高压过滤的磷酸盐缓冲液。

将纯化所得的VP1蛋白与口服疫苗佐剂壳聚糖进行配伍，共分为
两个剂量组：VP1蛋白100μg组和1000μg组。通过灌胃途径，进行0天、
7天、28天三次免疫4-5周龄雌性Balb/C小鼠，于末次免疫后两周处死
小鼠检测血清中中和抗体滴度。本发明还分别于0天、7天、14天、21
天、28天、35天、42天、49天、56天采集小鼠的尾血检测特异性IgM
和IgC，采集小鼠阴道灌洗液和粪便标本检测特异性sIgA抗体。于第42
天处死小鼠后还采集了小鼠肠道和呼吸道粘膜灌洗液检测其表面的
特异性sIgA抗体考察粘膜表面sIgA抗体的保护力。另外，本发明还对
小鼠皮细胞中γ干扰素分泌型T淋巴细胞进行了计数，以反应细胞免
疫水平。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明利用大肠杆菌表达系统表达基因工程重组VP1蛋
白，具有操作简单，成本低，易于实现大规模生产等优点。

(二)本发明首次将原核表达的基因工程重组VP1蛋白与壳聚糖
佐剂进行配伍，并对通过灌胃途径免疫小鼠后的免疫学效果进行了系
统研究，初步证明了VP1蛋白不仅可以诱导产生体液免疫保护性反
应，还可以诱导产生细胞免疫反应，为进一步研制人用基因工程重组
VP1蛋白口服疫苗奠定了基础。

(三)本发明的VP1蛋白口服疫苗安全、无痛苦，易为目标人群，
尤其是易被EV71病毒感染的0-5岁的儿童所接受，可以诱导产生粘膜
和系统免疫反应。

附图说明

图1为质粒pET30a-VP1的构建流程。

图2为质粒pET30a-VP1进行酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
其中，1为DNA Marker：λ-EcoT14 I digest DNA Marker，2为DNA
Marker：DL2000，3和4为质粒pET30a-VP1酶切产物。

图3为SDS-PAGE鉴定VP1蛋白的诱导表达及纯化结果。其中，1
为蛋白Marker，2为阴性对照(大肠杆菌总蛋白)，3为含有质粒
pET30a-VP1的大肠杆菌BL21(DE3)细胞裂解液，4为亲和层析法纯
化获得的VP1蛋白。

图4为捕获法ELISA检测鼠血清中特异性IgM抗体，末次免疫后结
果。其中，EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1
蛋白与壳聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-L：VP1蛋白与壳聚糖配伍
(低剂量)；EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；
VP1-Al：VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖
佐剂配伍；PBS-Al：PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图5为间接法ELISA检测血清中特异性IgG抗体结果。其中，
EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1蛋白与壳
聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-L：VP1蛋白与壳聚糖配伍(低剂量)；
EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1-Al：VP1蛋
白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖佐剂配伍；PBS-Al：
PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图6为间接法ELISA检测血清中特异性sIgA抗体结果。其中，
EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1蛋白与壳
聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-L：VP1蛋白与壳聚糖配伍(低剂量)；
EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1-Al：VP1蛋
白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖佐剂配伍；PBS-Al：
PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图7为间接法ELISA检测粪便中特异性sIgA抗体结果。其中，
EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1蛋白与壳
聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-L：VP1蛋白与壳聚糖配伍(低剂量)；
EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1-Al：VP1蛋
白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖佐剂配伍；PBS-Al：
PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图8为间接法ELISA检测肠道灌洗液中特异性sIgA抗体结果。其
中，EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1蛋白
与壳聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-L：VP1蛋白与壳聚糖配伍(低
剂量)；EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1-Al：
VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖佐剂配伍；
PBS-Al：PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图9为间接法ELISA检测呼吸道灌洗液中特异性sIgA抗体结果。
其中，EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1
蛋白与壳聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-L：VP1蛋白与壳聚糖配伍
(低剂量)；EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；
VP1-Al：VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖
佐剂配伍；PBS-Al：PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图10为各免疫组小鼠血清中特异性IgM抗体的动力学变化结果。
其中，EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1
蛋白与壳聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-H：VP1蛋白与壳聚糖配伍
(低剂量)；EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；
VP1-Al：VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖
佐剂配伍；PBS-Al：PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图11为各免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体的动力学变化结果。
其中，EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1
蛋白与壳聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-H：VP1蛋白与壳聚糖配伍
(低剂量)；EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；
VP1-Al：VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖
佐剂配伍；PBS-Al：PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图12为小鼠阴道粘膜表面特异性sIgA抗体动力学变化结果。其
中，EV71-Chi：灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1-Chi-H：VP1蛋白
与壳聚糖配伍(高剂量)；VP1-Chi-H：VP1蛋白与壳聚糖配伍(低
剂量)；EV71-Al：灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1-Al：
VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBS-Chi：PBS与壳聚糖佐剂配伍；
PBS-Al：PBS与氢氧化铝佐剂配伍。

图13为小鼠粪便中特异性sIgA抗体动力学变化结果。

图14为不同免疫组小鼠分泌特异性IFN-γ的T细胞数。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未
特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规
手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的EV71病毒HN-8分离株购自中国疾病预防控
制中心病毒病预防控制所。

实施例1 EV71病毒VP1蛋白原核表达载体的构建及VP1蛋白的表
达与纯化

1、EV71病毒HN-8分离株核酸的提取及VP1蛋白基因序列的获得

采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Minikit病毒核酸提取试剂
盒，提取EV71病毒的基因组RNA。采用Roche公司的Transcriptor
highfidelity cDNA systhesis sample Kit将EV71病毒的基因组RNA反转
录为cDNA。用一对引物扩增VP1蛋白的基因序列，引物为：
Nde1-VP1-F：5’-CGCCATATGGGAGATAGGGTGGCAGATG-3’和
Xho1-VP1-R：5’-CCGCTCGAGAAGAGTGGTGATCGCTGT-3’。扩增
产物在VP1片段的5’端添加Nde1酶切位点及保护性碱基，在3’端添加
Xho1酶切位点及相应保护性碱基。将PCR产物进行1.2％的琼脂糖凝
胶电泳，将VP1片段所在目的条带切下，用QIAGEN公司QIAquick Gel
Extraction Kit试剂盒回收VP1片段。

2、VP1蛋白原核表达质粒的构建

将纯化所得的VP1基因序列和原核表达载体pET30a经Nde1和
Xho1双酶切，然后用QIAGEN公司QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒
对VP1片段酶切产物进行非过胶回收，对pET30a酶切产物先进行1％
的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，采用QIAGEN公司QIAquick Gel
Extraction Kit试剂盒进行载体纯化。

将纯化好的目的片段和载体按照摩尔比为3∶1的比例配制连接体
系，加入1μl的T4 DNA连接酶，1μl的10×连接缓冲液，总连接体系
为10μl，16℃连接12小时，得质粒pET30a-VP1(图1)。

3、重组载体的筛选与鉴定

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，转化步骤为：将10μl
连接产物混合到100μl感受态细胞中，冰浴30分钟；然后42℃热休克
90秒；加入600μl无抗性2×YT，37℃，180转，培养45分钟；涂于卡
那抗性的LB固体培养基，37℃培养12小时；挑取单克隆用卡那抗性
的2×YT培养基，37℃，200转培养12小时，提取质粒进行酶切鉴定，
结果如图2所示。用Omega公司质粒小提试剂盒提取质粒pET30a-VP1，
然后进行测序，将正确的质粒保留。VP1片段的基因序列如SEQ ID
No.1所示。

4、将VP1蛋白表达质粒pET30a-VP1转化BL21(DE3)大肠杆菌
和VP1蛋白的诱导表达

将0.5μg的质粒pET30a-VP1加入到BL21(DE3)大肠杆菌感受态
细胞中，冰浴30分钟；然后42℃热休克90秒；加入600μl无抗性2×YT，
37℃，180转，培养45分钟；涂于卡那抗性的LB固体培养基，37℃培
养12小时；挑取单克隆用卡那抗性的2×YT培养基，37℃，200转培
养至OD600＝0.6-0.7时，将上述菌液按1∶100比例转接至1000ml卡那
抗性的2×YT培养基中，37℃剧烈震荡培养至OD600值为0.6时加入
IPTG至终浓度1mmol/L，23℃，180rpm，继续震荡培养6h，8000rpm
离心20min，收获细菌沉淀。于沉淀中加入适量PBS重悬，洗涤菌体，
8000rpm离心20min，收获沉淀并称湿重，以20ml/g湿菌重量加入细菌
裂解液(100mM NaCl，10mM EDTA，50mM Tris-HCl，0.5ml
TritonX-100，PH7.5)重悬细菌，反复冻融3次。超声裂解细菌细胞，
300W，25个循环(超声5秒，间隔5秒)，超声菌液温度不可以超过20
℃。油镜检查超声裂解情况，以每个视野中完整细胞不超过2个为裂
解完全。8000rpm离心20min，收获沉淀。加滤好的细菌裂解液(不含
EDTA)，重悬沉淀。8000rpm离心20min，收获沉淀。蛋白变性液(8M
尿素，20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5)重悬沉淀，4℃溶解12
小时，将变性液溶解好的液体用0.45μm滤膜过滤，准备进行亲和层析
纯化蛋白。

5、VP1蛋白的亲和层析纯化及透析复性

使用AKTA Prime蛋白纯化仪纯化VP1蛋白，将经变性液处理的蛋
白溶液使用0.45μm滤膜过滤后上样，流速为1ml/min，上样完毕后，
以变性液冲洗柱子流速为2ml/min，至吸收峰回到基线。用终浓度为
100、200、500mM咪唑的洗脱缓冲液(8M尿素，20mM Tris-HCl，
500mM NaCl，咪唑，pH7.5)洗柱，收集相应洗脱峰。将洗脱下的高
纯度的VP1进行透析，透析的目的是在去除蛋白缓冲液中的尿素的同
时使蛋白复性。透析采用梯度透析的办法：以Tris-Hcl缓冲液(20mM
Tris-HCl，500mM NaCl，咪唑，pH7.5)为基础液，配制尿素浓度分
别为6M、4M、3M、2M、1M、0.5M、0.25M、0M的溶液，每一个梯
度透析液的体积为蛋白液体积的10倍，最后用20倍体积的PBS缓冲液
进行透析。整个透析过程在4℃条件下进行，以防止蛋白的降解。透
析结束后，调整蛋白浓度至2mg/ml，并用0.45μm的滤膜进行过滤，
将蛋白分装冻存于-80℃。采用SDS-PAGE鉴定VP1蛋白的诱导表达及
纯化，结果如图3所示，VP1蛋白大小为34kD，其氨基酸序列如SEQ ID
No.2所示，亲和层析法纯化所得VP1蛋白蛋白纯度可达95％左右。

实施例2 VP1蛋白与佐剂配伍制备疫苗

(一)含有VP1蛋白的口服型疫苗及其免疫学效果评价

1、VP1蛋白与壳聚糖佐剂进行混合配伍

1)量取0.25ml冰醋酸溶解于100ml双蒸水中获得0.25％醋酸溶
液；

2)称取药用级乙酰化壳聚糖(85％乙酰化)0.5g，溶解于0.25％醋
酸溶液100ml中，即获得0.5g/ml壳聚糖溶液；

3)然后加入终浓度为0.05％的多聚磷酸钠，室温混匀得到含壳聚
糖微米颗粒的胶体溶液，此即壳聚糖微米颗粒。

将VP1蛋白同配制好的壳聚糖溶液进行混合，疫苗中壳聚糖的
终浓度为0.2g-0.5g/ml，终体积为1ml。

2、该疫苗的功能分析

VP1蛋白100μg和1000μg分别与壳聚糖混合后制备成的高低剂
量组疫苗通过灌胃途径免疫雌性Balb/C小鼠。第0天、第7天、第
28天，三次全程免疫结束后，可以刺激小鼠产生血清中特异性IgM
和IgG抗体，并且IgM抗体滴度可达2⁶以上，IgG抗体滴度可达2¹⁰
以上

而且在小鼠的阴道灌洗液，粪便中，肠道灌洗液，呼吸道灌洗液
中均检测到了特异性sIgA抗体

体外中和实验中将不同稀释度的小鼠血清进行系列稀释后与等
体积的100TCID₅₀的EV71病毒混合后，200μl混合液加入到传至96
孔板中的Vero细胞中，通过观察细胞病变的途径来判断小鼠血清的
中和效果。结果低剂量组小鼠血清中中和抗体滴度最高可达1∶8，几
何均数GMT为1∶5.04；高剂量组小鼠血清中中和抗体滴度最高可达
1∶16，几何均数GMT为1∶7.13。

VP1蛋白口服疫苗还可以刺激小鼠产生细胞水平免疫反应。IFN-
γ分泌细胞数明显高于阴性对照组。

(二)含有VP1蛋白的注射型疫苗及其免疫学效果评价

1、VP1蛋白与氢氧化铝佐剂进行混合配伍

将VP1蛋白与氢氧化铝佐剂进行混合，并且用无菌PBS调节氢
氧化铝至终浓度为0.1-0.5mg/ml，4℃条件下静置1小时，使用前混
匀。

2、该疫苗的功能分析

VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍采用0天、7天、28天程序免疫小
鼠，并于末次免疫后两周(初次免疫后第42天)眼眶采血处死小鼠，
检测VP1蛋白特异性抗体滴度。

实施例3 VP1蛋白与不同佐剂配伍的粘膜疫苗及其免疫学效果

(一)免疫计划

选取4-5周龄Balb/C雌性小鼠(15±1g)。共分成9组，每组6
只；设对照组3组(E-G)，不同佐剂配伍的粘膜疫苗免疫如表1所示：

表1 VP1蛋白与不同佐剂配伍免疫小鼠

A组：为全病毒对照组，100μg灭活EV71病毒与壳聚糖佐剂配伍，制成总体积
为1ml的疫苗；

B1组：为VP1口服疫苗低剂量组，100μg纯化VP1蛋白与壳聚糖佐剂配伍，制
成总体积为1ml的疫苗；

B2组：为VP1口服疫苗高剂量组，100μg纯化VP1蛋白与壳聚糖佐剂配伍，制
成总体积为1ml的疫苗；

C组：为肌注对照组，100μg灭活EV71病毒与氢氧化铝佐剂配伍，制成总体积
为100μl的疫苗；

D组：为肌注对照组，100μg纯化VP1蛋白与与氢氧化铝佐剂配伍，制成总体积
为100μl的疫苗；

E、F、G组分别为口服和肌注组的空白对照组。

(二)免疫流程

1、灌胃途径：采用圆头注器胃部灌入1ml疫苗；

2、肌注途径：先用1ml注射器器吸取100μl疫苗，然后于小鼠
后腿肌肉内进行两点注射；

3、免疫时间次数为常规免疫，即免疫3次；

4、分别在0、7、28天对小鼠进行免疫，并在0、7、14、21、28、
35、42、49、56天进行尾静脉取血分离血清，检测血清中的特异性
IgM、IgG抗体；阴道灌洗液冲洗阴道；收集老鼠粪便；实验终末对
老鼠进行肠道和肺灌洗，检测粘膜表面的特异性sIgA抗体。

(三)壳聚糖佐剂的制备

1、量取0.25ml冰醋酸溶解于100ml双蒸水中获得0.25％醋酸溶
液；

2、称取药用级乙酰化壳聚糖(85％乙酰化)0.5g，溶解于0.25％
醋酸溶液100ml中，即获得0.5g/ml壳聚糖溶液；

3、然后加入终浓度为0.05％的多聚磷酸钠，室温混匀得到含壳
聚糖微米颗粒的胶体溶液。

(四)免疫学效果的评价

1、末次免疫后两周(初次免疫后第42天)，眼眶采血处死小鼠，
特异性抗体滴度检测

1)血清中特异性IgM抗体的检测

通过捕获法ELISA检测鼠血清中特异性IgM抗体，末次免疫后
结果如下图4所示，VP1-Chi-H和VP1-Chi-L两粘膜免疫组均有效刺
激小鼠产生了特异性IgM抗体，高低剂量组间没有明显差异；和灭
活EV71病毒口服免疫组间也没有明显差异；但口服免疫组的IgM抗
体滴度明显低于肌注组。

2)血清中特异性IgG抗体的检测

间接法ELISA检测血清中特异性IgG抗体，结果如图5所示，
VP1-Chi-H和VP1-Chi-L两粘膜免疫组均有效刺激小鼠产生了特异
性IgG抗体，高低剂量组间没有明显差异；和灭活EV71病毒口服免
疫组间也没有明显差异；但口服免疫组的IgG抗体滴度明显低于肌注
组。

3)阴道灌洗液中特异性sIgA抗体检测

间接法ELISA检测血清中特异性sIgA抗体，结果如图6所示，
VP1-Chi-H和VP1-Chi-L两口服免疫组均有效刺激小鼠产生了粘膜
表面特异性sIgA抗体，但VP1蛋白高剂量组明显高于低剂量组；VP1
蛋白高剂量口服免疫组明显高于灭活EV71病毒口服免疫组和肌注组
各组。

4)粪便中特异性sIgA抗体检测

间接法ELISA检测粪便中特异性sIgA抗体，结果如图7所示，
口服免疫的三组在小鼠的粪便中均检测到特异性sIgA抗体，并且普
遍高于肌注组小鼠粪便中的特异性sIgA抗体。

5)肠粘膜表面特异性sIgA抗体检测

间接法ELISA检测肠道灌洗液中特异性sIgA抗体，结果如图8
所示，在口服免疫组和肌注组小鼠的肠道灌洗液中均检测到了特异性
sIgA抗体。VP1蛋白高、低剂量组间没有明显差异，并且与灭活EV71
病毒口服组和肌注组各组间均无明显差异。

6)呼吸道粘膜表面特异性sIgA抗体检测

间接法ELISA检测呼吸道灌洗液中特异性sIgA抗体，结果如图
9所示，VP1蛋白高、低剂量口服组均刺激小鼠呼吸道粘膜表面产生
了特异性sIgA抗体；VP1蛋白高剂量口服组呼吸道粘膜灌洗液中的
sIgA抗体含量最高；VP1蛋白低剂量口服组和灭活EV71病毒口服组
间无明显差异；VP1蛋白高、低剂量口服组均高于肌注组。

2、血清和粘膜标本中特异性抗体的动力学变化

1)各免疫组小鼠血清中特异性IgM抗体的动力学变化结果如图
10所示，VP1-Chi-H和VP1-Chi-L在初次免疫后第7天开始产生IgM
抗体，第42天时达到最高峰，然后逐渐呈下降趋势。

2)各免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体的动力学变化结果如图
11所示，VP1-Chi-H和VP1-Chi-L在初次免疫后7天内即开始产生
IgG抗体，第42天时达到最高峰，然后进入平台期。

3)小鼠阴道粘膜表面特异性sIgA抗体动力学变化结果如图12
所示，VP1-Chi-H和VP1-Chi-L在初次免疫后7天至14天内即开始
产生sIgA抗体，VP1蛋白高剂量组第42天时达到最高峰，然后呈逐
渐下降趋势。VP1蛋白低剂量组在第35天时达最高峰。

4)小鼠粪便中特异性sIgA抗体动力学变化结果如图13所示，
VP1-Chi-H和VP1-Chi-L两组小鼠免疫后均存在特异性sIgA抗体波
动，并且总体呈上升趋势，但趋势并不是很规则，可能原因有：粪便
中特异性抗体间接反应的是小肠粘膜表面sIgA抗体水平，变异度大；
对粪便标本进行处理过程中会伴随有人为原因导致sIgA抗体降解。

3、口服VP1蛋白疫苗刺激产生细胞免疫反应

Th1型辅助性淋巴细胞分泌干扰素的水平能够直接反映小鼠的
细胞免疫水平，本发明运用IFN-γ-ELISPOT法检测了不同配伍疫苗
末次免疫(28天)后两周小鼠产生的对EV71病毒VP1蛋白特异性
的细胞免疫应答情况，作为细胞免疫指标来反映各免疫组小鼠的细胞
免疫水平。具体操作为摘眼球法处死小鼠，取脾脏，分离脾细胞，体
外经过VP1蛋白刺激后，通过ELISPOT方法检测了IFN-r的分泌水
平，结果如图14所示。其中壳聚糖和灭活EV71病毒配伍组，壳聚
糖和VP1蛋白高剂量配伍组，壳聚糖和VP1蛋白低剂量配伍组，氢
氧化铝佐剂和灭活EV71病毒配伍组，氢氧化铝佐剂和VP1蛋白配伍
组小鼠脾细胞经真核表达VP1蛋白刺激后，斑点形成细胞数(spot
forming cells，SFCs)显著高于相应对照组(p＜0.05)。VP1蛋白高低
剂量组间无显著性差别(p＞0.05)，铝佐剂肌注组斑点形成细胞数明
显高于粘膜免疫组(p＜0.05)。ELISPOT结果显示了以壳聚糖为佐剂
下VP1蛋白能诱发小鼠产生特异性细胞免疫应答。

4、口服疫苗刺激小鼠产生血清中和抗体

中和实验检测血清中和抗体滴度，100TCID₅₀/100μl EV71病毒
与相应稀释度鼠血清4℃中和过夜，后接种于生长良好的Vero(96
孔板)，每个稀释度2孔重复，培养7天后，待阴性对照孔全部病变，
而阳性对照空没有病变时，观察中和实验结果。结果显示：粘膜免疫
各组中：VP1高剂量口服免疫组抗体滴度最高为1∶16，几何均数为
1∶7.13；VP1低剂量口服免疫组抗体滴度为1∶8，几何均数为1∶5.04；

根据以上结果可判定原核表达的基因工程重组VP1蛋白100μg
和1000μg与壳聚糖配伍口服免疫小鼠可以有效刺激小鼠血清中特异
性IgM和IgG抗体的产生，同时在小鼠的阴道粘膜、小肠粘膜、呼
吸道粘膜表面检测到特异性sIgA抗体；该口服疫苗还可以刺激小鼠
产生细胞免疫反应；体外中和实验结果显示，VP1蛋白100μg与壳聚
糖配伍免疫组的中和抗体滴度最高为1∶8，几何均数为1∶5.04，VP1
蛋白1000μg与壳聚糖配伍免疫组的中和抗体滴度最高为1∶16，几何
均数为1∶7.13。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详
尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本
领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础
上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

资源描述

《肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗.pdf（20页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN102337289A43申请公布日20120201CN102337289ACN102337289A21申请号201110302066222申请日20110930C12N15/70200601A61K39/125200601A61P31/14200601C12R1/1920060171申请人中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所地址102206北京市昌平区昌百路155号72发明人李德新张福顺梁米芳张硕张全福李川74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王朋飞王加岭54发明名称肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗57摘要本发明提供了一种肠道病毒71。

2、型VP1蛋白的原核表达方法，其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载体中，并转化至大肠杆菌中进行诱导表达，然后对表达的VP1蛋白进行纯化和复性。将获得的VP1蛋白与免疫佐剂配伍制备疫苗。本发明首次利用大肠杆菌表达系统表达基因工程重组VP1蛋白，具有操作简单，成本低，易于实现大规模生产等优点。通过将原核表达的基因工程重组VP1蛋白与壳聚糖佐剂配伍后免疫小鼠，并评价其免疫学效果，初步证明了VP1蛋白不仅可以诱导产生体液免疫保护性反应，还可以诱导产生细胞免疫反应，为进一步研制人用基因工程重组VP1蛋白和灭活全病毒口服疫苗奠定了基础。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专。

3、利申请权利要求书1页说明书9页序列表3页附图6页CN102337301A1/1页21一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法，其特征在于，其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载体PET30A中，并转化至大肠杆菌BL21DE3中进行诱导表达；其中，肠道病毒71型VP1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，肠道病毒71型的VP1基因序列如SEQIDNO1所示。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括对表达的VP1蛋白进行纯化和复性。4采用权利要求13任一。

4、项所述方法获得的VP1蛋白在制备抗肠道病毒71型疫苗中的应用。5含有由权利要求13任一项所述方法获得的VP1蛋白的抗肠道病毒71型疫苗。6根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，其为注射型疫苗或口服型疫苗。7根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，注射型疫苗中使用的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝佐剂、MF59佐剂或弗氏佐剂。8根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，口服型疫苗中使用的佐剂为壳聚糖、霍乱毒素B亚单位或大肠杆菌不耐热肠毒素。权利要求书CN102337289ACN102337301A1/9页3肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗技术领域0001本发明涉及基因工程和制药领域，具体地说。

5、，涉及肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗。背景技术0002肠道病毒ENTEROVIRUS71型EV71近年来在我国的流行呈逐年上升趋势，EV71所导致的主要疾病手足口病HANDFOOTMOUTHDISEASE，HFMD于2008年被列入我国的法定传染病，近几年来，HFMD发病数和病死数上升迅速。目前临床治疗中主要采取对症治疗，尚无疫苗应用于临床治疗手足口病的报道。0003目前处于研究阶段的EV71病毒疫苗按照免疫途径可分为注射型疫苗和口服型疫苗。注射型疫苗包括灭活EV71病毒疫苗、基因工程重组VP1蛋白疫苗、多肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗。灭活EV71病毒疫苗可以诱导产生。

6、较好的体液免疫反应，但是目前EV71病毒的纯化还存在一定难度，并且全病毒刺激机体免疫反应的机制还不是很清楚，而且成本较高；病毒样颗粒疫苗是从SF9细胞中纯化出的，但由于SF9细胞还不是疫苗生产用细胞，所以还存在安全隐患；多肽疫苗诱导产生的特异性抗体滴度较低；核酸疫苗不仅诱导产生的特异性抗体滴度较低，而且由于异源性基因的存在增加了体细胞基因重组的风险。口服型疫苗主要有沙门氏菌载体疫苗、可食性疫苗、减毒活疫苗，由于其无痛苦免疫途径所以易为目标人群所接受。但是，从目前研究阶段来看沙门氏菌载体疫苗和减毒活疫苗均存在致病的危险性；可食性疫苗是将EV71病毒VP1蛋白表达在果实，如番茄果实中，通过食用番茄。

7、果实达到免疫目的，诱导产生特异性抗体的免疫原性差，并且转基因食品的安全性还有待评估。发明内容0004本发明的目的是提供一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法。0005本发明的另一目的是提供利用原核表达系统获得的肠道病毒71型VP1蛋白在制备抗肠道病毒71型疫苗中的应用。0006本发明的进一步目的是提供含有由原核表达系统获得的肠道病毒71型VP1蛋白的抗肠道病毒71型疫苗。0007为了实现本发明目的，本发明的一种肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达方法，其是将肠道病毒71型的VP1基因序列克隆至原核表达载体中，并转化至大肠杆菌中进行诱导表达。优选地，所述原核表达载体为PET30A，所述大肠杆菌。

8、为BL21DE3大肠杆菌。0008前述的方法，其中肠道病毒71型VP1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第20位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，或是将第1位的甘氨酸缺失，或是在297位后添加组氨酸均不会影响VP1蛋白的功能。0009前述的方法，其中肠道病毒71型的VP1基因序列如SEQIDNO1所示。说明书CN102337289ACN102337301A2/9页40010前述的方法中还包括对表达的VP1蛋白进行纯化和复性。0011本发明还提供采用上述原核表达方法获得的VP1蛋白在制备抗肠道病毒71型疫苗中的。

9、应用。0012本发明进一步提供含有由上述原核表达方法获得的VP1蛋白的抗肠道病毒71型疫苗。所述疫苗为注射型疫苗或口服型疫苗。其中，注射型疫苗中使用的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝佐剂、MF59佐剂或弗氏佐剂等。口服型疫苗中使用的佐剂为壳聚糖、霍乱毒素B亚单位、或大肠杆菌不耐热肠毒素等。0013本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。0014由于EV71病毒的中和表位主要位于其结构蛋白VP1上面，因此在本发明中，将EV71病毒的VP1基因序列克隆至原核表达载体PET30A中，将构建好的表达质粒命名为PET30AVP1。用PET30AVP1转化工程表达菌BL21DE3，然后用IPTG对VP1蛋。

10、白进行诱导表达。通过亲和层析柱对带有HIS标签的VP1蛋白进行纯化或采用其它蛋白纯化方法，最后对纯化出的VP1蛋白进行复性，并将蛋白的缓冲液更换为高压过滤的磷酸盐缓冲液。0015将纯化所得的VP1蛋白与口服疫苗佐剂壳聚糖进行配伍，共分为两个剂量组VP1蛋白100G组和1000G组。通过灌胃途径，进行0天、7天、28天三次免疫45周龄雌性BALB/C小鼠，于末次免疫后两周处死小鼠检测血清中中和抗体滴度。本发明还分别于0天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天采集小鼠的尾血检测特异性IGM和IGC，采集小鼠阴道灌洗液和粪便标本检测特异性SIGA抗体。于第42天处死小鼠后还采。

11、集了小鼠肠道和呼吸道粘膜灌洗液检测其表面的特异性SIGA抗体考察粘膜表面SIGA抗体的保护力。另外，本发明还对小鼠皮细胞中干扰素分泌型T淋巴细胞进行了计数，以反应细胞免疫水平。0016借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果0017一本发明利用大肠杆菌表达系统表达基因工程重组VP1蛋白，具有操作简单，成本低，易于实现大规模生产等优点。0018二本发明首次将原核表达的基因工程重组VP1蛋白与壳聚糖佐剂进行配伍，并对通过灌胃途径免疫小鼠后的免疫学效果进行了系统研究，初步证明了VP1蛋白不仅可以诱导产生体液免疫保护性反应，还可以诱导产生细胞免疫反应，为进一步研制人用基因工程重组VP1蛋白口。

12、服疫苗奠定了基础。0019三本发明的VP1蛋白口服疫苗安全、无痛苦，易为目标人群，尤其是易被EV71病毒感染的05岁的儿童所接受，可以诱导产生粘膜和系统免疫反应。附图说明0020图1为质粒PET30AVP1的构建流程。0021图2为质粒PET30AVP1进行酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，1为DNAMARKERECOT14IDIGESTDNAMARKER，2为DNAMARKERDL2000，3和4为质粒PET30AVP1酶切产物。0022图3为SDSPAGE鉴定VP1蛋白的诱导表达及纯化结果。其中，1为蛋白MARKER，2为阴性对照大肠杆菌总蛋白，3为含有质粒PET30AVP1的大肠杆菌。

13、BL21DE3细胞裂解液，4为亲和层析法纯化获得的VP1蛋白。说明书CN102337289ACN102337301A3/9页50023图4为捕获法ELISA检测鼠血清中特异性IGM抗体，末次免疫后结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHILVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0024图5为间接法ELISA检测血清中特异性IGG抗体结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒。

14、与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHILVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0025图6为间接法ELISA检测血清中特异性SIGA抗体结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHILVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSA。

15、LPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0026图7为间接法ELISA检测粪便中特异性SIGA抗体结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHILVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0027图8为间接法ELISA检测肠道灌洗液中特异性SIGA抗体结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHILVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；。

16、EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0028图9为间接法ELISA检测呼吸道灌洗液中特异性SIGA抗体结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHILVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0029图10为各免疫组小鼠血清中特异性IGM抗体的动力学变化结果。

17、。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0030图11为各免疫组小鼠血清中特异性IGG抗体的动力学变化结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；P。

18、BSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢说明书CN102337289ACN102337301A4/9页6氧化铝佐剂配伍。0031图12为小鼠阴道粘膜表面特异性SIGA抗体动力学变化结果。其中，EV71CHI灭活EV71病毒与壳聚糖配伍；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍高剂量；VP1CHIHVP1蛋白与壳聚糖配伍低剂量；EV71AL灭活EV71病毒与氢氧化铝铝佐剂配伍；VP1ALVP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍；PBSCHIPBS与壳聚糖佐剂配伍；PBSALPBS与氢氧化铝佐剂配伍。0032图13为小鼠粪便中特异性SIGA抗体动力学变化结果。0033图14为不同免疫组小鼠分泌特异性。

19、IFN的T细胞数。具体实施方式0034以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。0035以下实施例中使用的EV71病毒HN8分离株购自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。0036实施例1EV71病毒VP1蛋白原核表达载体的构建及VP1蛋白的表达与纯化00371、EV71病毒HN8分离株核酸的提取及VP1蛋白基因序列的获得0038采用QIAGEN公司QIAAMPVIRALRNAMINIKIT病毒核酸提取试剂盒，提取EV71病毒的基因组RNA。采用ROCHE公司的TRANSCRIPTORHIGH。

20、FIDELITYCDNASYSTHESISSAMPLEKIT将EV71病毒的基因组RNA反转录为CDNA。用一对引物扩增VP1蛋白的基因序列，引物为NDE1VP1F5CGCCATATGGGAGATAGGGTGGCAGATG3和XHO1VP1R5CCGCTCGAGAAGAGTGGTGATCGCTGT3。扩增产物在VP1片段的5端添加NDE1酶切位点及保护性碱基，在3端添加XHO1酶切位点及相应保护性碱基。将PCR产物进行12的琼脂糖凝胶电泳，将VP1片段所在目的条带切下，用QIAGEN公司QIAQUICKGELEXTRACTIONKIT试剂盒回收VP1片段。00392、VP1蛋白原核表达质粒的构。

21、建0040将纯化所得的VP1基因序列和原核表达载体PET30A经NDE1和XHO1双酶切，然后用QIAGEN公司QIAQUICKGELEXTRACTIONKIT试剂盒对VP1片段酶切产物进行非过胶回收，对PET30A酶切产物先进行1的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，采用QIAGEN公司QIAQUICKGELEXTRACTIONKIT试剂盒进行载体纯化。0041将纯化好的目的片段和载体按照摩尔比为31的比例配制连接体系，加入1L的T4DNA连接酶，1L的10连接缓冲液，总连接体系为10L，16连接12小时，得质粒PET30AVP1图1。00423、重组载体的筛选与鉴定0043将连接产物转化大肠杆菌感受。

22、态细胞DH5A，转化步骤为将10L连接产物混合到100L感受态细胞中，冰浴30分钟；然后42热休克90秒；加入600L无抗性2YT，37，180转，培养45分钟；涂于卡那抗性的LB固体培养基，37培养12小时；挑取单克隆用卡那抗性的2YT培养基，37，200转培养12小时，提取质粒进行酶切鉴定，结果如图2所示。用OMEGA公司质粒小提试剂盒提取质粒PET30AVP1，然后进行测序，将正确的质粒保留。VP1片段的基因序列如SEQIDNO1所示。说明书CN102337289ACN102337301A5/9页700444、将VP1蛋白表达质粒PET30AVP1转化BL21DE3大肠杆菌和VP1蛋白的。

23、诱导表达0045将05G的质粒PET30AVP1加入到BL21DE3大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30分钟；然后42热休克90秒；加入600L无抗性2YT，37，180转，培养45分钟；涂于卡那抗性的LB固体培养基，37培养12小时；挑取单克隆用卡那抗性的2YT培养基，37，200转培养至OD6000607时，将上述菌液按1100比例转接至1000ML卡那抗性的2YT培养基中，37剧烈震荡培养至OD600值为06时加入IPTG至终浓度1MMOL/L，23，180RPM，继续震荡培养6H，8000RPM离心20MIN，收获细菌沉淀。于沉淀中加入适量PBS重悬，洗涤菌体，8000RPM离心20MIN，。

24、收获沉淀并称湿重，以20ML/G湿菌重量加入细菌裂解液100MMNACL，10MMEDTA，50MMTRISHCL，05MLTRITONX100，PH75重悬细菌，反复冻融3次。超声裂解细菌细胞，300W，25个循环超声5秒，间隔5秒，超声菌液温度不可以超过20。油镜检查超声裂解情况，以每个视野中完整细胞不超过2个为裂解完全。8000RPM离心20MIN，收获沉淀。加滤好的细菌裂解液不含EDTA，重悬沉淀。8000RPM离心20MIN，收获沉淀。蛋白变性液8M尿素，20MMTRISHCL，500MMNACL，PH75重悬沉淀，4溶解12小时，将变性液溶解好的液体用045M滤膜过滤，准备进行亲和。

25、层析纯化蛋白。00465、VP1蛋白的亲和层析纯化及透析复性0047使用AKTAPRIME蛋白纯化仪纯化VP1蛋白，将经变性液处理的蛋白溶液使用045M滤膜过滤后上样，流速为1ML/MIN，上样完毕后，以变性液冲洗柱子流速为2ML/MIN，至吸收峰回到基线。用终浓度为100、200、500MM咪唑的洗脱缓冲液8M尿素，20MMTRISHCL，500MMNACL，咪唑，PH75洗柱，收集相应洗脱峰。将洗脱下的高纯度的VP1进行透析，透析的目的是在去除蛋白缓冲液中的尿素的同时使蛋白复性。透析采用梯度透析的办法以TRISHCL缓冲液20MMTRISHCL，500MMNACL，咪唑，PH75为基础液，。

26、配制尿素浓度分别为6M、4M、3M、2M、1M、05M、025M、0M的溶液，每一个梯度透析液的体积为蛋白液体积的10倍，最后用20倍体积的PBS缓冲液进行透析。整个透析过程在4条件下进行，以防止蛋白的降解。透析结束后，调整蛋白浓度至2MG/ML，并用045M的滤膜进行过滤，将蛋白分装冻存于80。采用SDSPAGE鉴定VP1蛋白的诱导表达及纯化，结果如图3所示，VP1蛋白大小为34KD，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，亲和层析法纯化所得VP1蛋白蛋白纯度可达95左右。0048实施例2VP1蛋白与佐剂配伍制备疫苗0049一含有VP1蛋白的口服型疫苗及其免疫学效果评价00501、VP1蛋白与壳。

27、聚糖佐剂进行混合配伍00511量取025ML冰醋酸溶解于100ML双蒸水中获得025醋酸溶液；00522称取药用级乙酰化壳聚糖85乙酰化05G，溶解于025醋酸溶液100ML中，即获得05G/ML壳聚糖溶液；00533然后加入终浓度为005的多聚磷酸钠，室温混匀得到含壳聚糖微米颗粒的胶体溶液，此即壳聚糖微米颗粒。0054将VP1蛋白同配制好的壳聚糖溶液进行混合，疫苗中壳聚糖的终浓度为02G05G/ML，终体积为1ML。00552、该疫苗的功能分析说明书CN102337289ACN102337301A6/9页80056VP1蛋白100G和1000G分别与壳聚糖混合后制备成的高低剂量组疫苗通过灌胃。

28、途径免疫雌性BALB/C小鼠。第0天、第7天、第28天，三次全程免疫结束后，可以刺激小鼠产生血清中特异性IGM和IGG抗体，并且IGM抗体滴度可达26以上，IGG抗体滴度可达210以上0057而且在小鼠的阴道灌洗液，粪便中，肠道灌洗液，呼吸道灌洗液中均检测到了特异性SIGA抗体0058体外中和实验中将不同稀释度的小鼠血清进行系列稀释后与等体积的100TCID50的EV71病毒混合后，200L混合液加入到传至96孔板中的VERO细胞中，通过观察细胞病变的途径来判断小鼠血清的中和效果。结果低剂量组小鼠血清中中和抗体滴度最高可达18，几何均数GMT为1504；高剂量组小鼠血清中中和抗体滴度最高可达1。

29、16，几何均数GMT为1713。0059VP1蛋白口服疫苗还可以刺激小鼠产生细胞水平免疫反应。IFN分泌细胞数明显高于阴性对照组。0060二含有VP1蛋白的注射型疫苗及其免疫学效果评价00611、VP1蛋白与氢氧化铝佐剂进行混合配伍0062将VP1蛋白与氢氧化铝佐剂进行混合，并且用无菌PBS调节氢氧化铝至终浓度为0105MG/ML，4条件下静置1小时，使用前混匀。00632、该疫苗的功能分析0064VP1蛋白与氢氧化铝佐剂配伍采用0天、7天、28天程序免疫小鼠，并于末次免疫后两周初次免疫后第42天眼眶采血处死小鼠，检测VP1蛋白特异性抗体滴度。0065实施例3VP1蛋白与不同佐剂配伍的粘膜疫苗。

30、及其免疫学效果0066一免疫计划0067选取45周龄BALB/C雌性小鼠151G。共分成9组，每组6只；设对照组3组EG，不同佐剂配伍的粘膜疫苗免疫如表1所示0068表1VP1蛋白与不同佐剂配伍免疫小鼠00690070A组为全病毒对照组，100G灭活EV71病毒与壳聚糖佐剂配伍，制成总体积为说明书CN102337289ACN102337301A7/9页91ML的疫苗；0071B1组为VP1口服疫苗低剂量组，100G纯化VP1蛋白与壳聚糖佐剂配伍，制成总体积为1ML的疫苗；0072B2组为VP1口服疫苗高剂量组，100G纯化VP1蛋白与壳聚糖佐剂配伍，制成总体积为1ML的疫苗；0073C组为肌注。

31、对照组，100G灭活EV71病毒与氢氧化铝佐剂配伍，制成总体积为100L的疫苗；0074D组为肌注对照组，100G纯化VP1蛋白与与氢氧化铝佐剂配伍，制成总体积为100L的疫苗；0075E、F、G组分别为口服和肌注组的空白对照组。0076二免疫流程00771、灌胃途径采用圆头注器胃部灌入1ML疫苗；00782、肌注途径先用1ML注射器器吸取100L疫苗，然后于小鼠后腿肌肉内进行两点注射；00793、免疫时间次数为常规免疫，即免疫3次；00804、分别在0、7、28天对小鼠进行免疫，并在0、7、14、21、28、35、42、49、56天进行尾静脉取血分离血清，检测血清中的特异性IGM、IGG抗体。

32、；阴道灌洗液冲洗阴道；收集老鼠粪便；实验终末对老鼠进行肠道和肺灌洗，检测粘膜表面的特异性SIGA抗体。0081三壳聚糖佐剂的制备00821、量取025ML冰醋酸溶解于100ML双蒸水中获得025醋酸溶液；00832、称取药用级乙酰化壳聚糖85乙酰化05G，溶解于025醋酸溶液100ML中，即获得05G/ML壳聚糖溶液；00843、然后加入终浓度为005的多聚磷酸钠，室温混匀得到含壳聚糖微米颗粒的胶体溶液。0085四免疫学效果的评价00861、末次免疫后两周初次免疫后第42天，眼眶采血处死小鼠，特异性抗体滴度检测00871血清中特异性IGM抗体的检测0088通过捕获法ELISA检测鼠血清中特异性。

33、IGM抗体，末次免疫后结果如下图4所示，VP1CHIH和VP1CHIL两粘膜免疫组均有效刺激小鼠产生了特异性IGM抗体，高低剂量组间没有明显差异；和灭活EV71病毒口服免疫组间也没有明显差异；但口服免疫组的IGM抗体滴度明显低于肌注组。00892血清中特异性IGG抗体的检测0090间接法ELISA检测血清中特异性IGG抗体，结果如图5所示，VP1CHIH和VP1CHIL两粘膜免疫组均有效刺激小鼠产生了特异性IGG抗体，高低剂量组间没有明显差异；和灭活EV71病毒口服免疫组间也没有明显差异；但口服免疫组的IGG抗体滴度明显低于肌注组。00913阴道灌洗液中特异性SIGA抗体检测0092间接法EL。

34、ISA检测血清中特异性SIGA抗体，结果如图6所示，VP1CHIH和说明书CN102337289ACN102337301A8/9页10VP1CHIL两口服免疫组均有效刺激小鼠产生了粘膜表面特异性SIGA抗体，但VP1蛋白高剂量组明显高于低剂量组；VP1蛋白高剂量口服免疫组明显高于灭活EV71病毒口服免疫组和肌注组各组。00934粪便中特异性SIGA抗体检测0094间接法ELISA检测粪便中特异性SIGA抗体，结果如图7所示，口服免疫的三组在小鼠的粪便中均检测到特异性SIGA抗体，并且普遍高于肌注组小鼠粪便中的特异性SIGA抗体。00955肠粘膜表面特异性SIGA抗体检测0096间接法ELISA。

35、检测肠道灌洗液中特异性SIGA抗体，结果如图8所示，在口服免疫组和肌注组小鼠的肠道灌洗液中均检测到了特异性SIGA抗体。VP1蛋白高、低剂量组间没有明显差异，并且与灭活EV71病毒口服组和肌注组各组间均无明显差异。00976呼吸道粘膜表面特异性SIGA抗体检测0098间接法ELISA检测呼吸道灌洗液中特异性SIGA抗体，结果如图9所示，VP1蛋白高、低剂量口服组均刺激小鼠呼吸道粘膜表面产生了特异性SIGA抗体；VP1蛋白高剂量口服组呼吸道粘膜灌洗液中的SIGA抗体含量最高；VP1蛋白低剂量口服组和灭活EV71病毒口服组间无明显差异；VP1蛋白高、低剂量口服组均高于肌注组。00992、血清和粘膜。

36、标本中特异性抗体的动力学变化01001各免疫组小鼠血清中特异性IGM抗体的动力学变化结果如图10所示，VP1CHIH和VP1CHIL在初次免疫后第7天开始产生IGM抗体，第42天时达到最高峰，然后逐渐呈下降趋势。01012各免疫组小鼠血清中特异性IGG抗体的动力学变化结果如图11所示，VP1CHIH和VP1CHIL在初次免疫后7天内即开始产生IGG抗体，第42天时达到最高峰，然后进入平台期。01023小鼠阴道粘膜表面特异性SIGA抗体动力学变化结果如图12所示，VP1CHIH和VP1CHIL在初次免疫后7天至14天内即开始产生SIGA抗体，VP1蛋白高剂量组第42天时达到最高峰，然后呈逐渐下降。

37、趋势。VP1蛋白低剂量组在第35天时达最高峰。01034小鼠粪便中特异性SIGA抗体动力学变化结果如图13所示，VP1CHIH和VP1CHIL两组小鼠免疫后均存在特异性SIGA抗体波动，并且总体呈上升趋势，但趋势并不是很规则，可能原因有粪便中特异性抗体间接反应的是小肠粘膜表面SIGA抗体水平，变异度大；对粪便标本进行处理过程中会伴随有人为原因导致SIGA抗体降解。01043、口服VP1蛋白疫苗刺激产生细胞免疫反应0105TH1型辅助性淋巴细胞分泌干扰素的水平能够直接反映小鼠的细胞免疫水平，本发明运用IFNELISPOT法检测了不同配伍疫苗末次免疫28天后两周小鼠产生的对EV71病毒VP1蛋白特。

38、异性的细胞免疫应答情况，作为细胞免疫指标来反映各免疫组小鼠的细胞免疫水平。具体操作为摘眼球法处死小鼠，取脾脏，分离脾细胞，体外经过VP1蛋白刺激后，通过ELISPOT方法检测了IFNR的分泌水平，结果如图14所示。其中壳聚糖和灭活EV71病毒配伍组，壳聚糖和VP1蛋白高剂量配伍组，壳聚糖和VP1蛋白低剂量配伍组，氢氧化铝佐剂和灭活EV71病毒配伍组，氢氧化铝佐剂和VP1蛋白配伍组小鼠脾细胞经真核表达VP1蛋白刺激后，斑点形成细胞数SPOTFORMINGCELLS，SFCS显著高于相应对照组P说明书CN102337289ACN102337301A9/9页11005。VP1蛋白高低剂量组间无显著性。

39、差别P005，铝佐剂肌注组斑点形成细胞数明显高于粘膜免疫组P005。ELISPOT结果显示了以壳聚糖为佐剂下VP1蛋白能诱发小鼠产生特异性细胞免疫应答。01064、口服疫苗刺激小鼠产生血清中和抗体0107中和实验检测血清中和抗体滴度，100TCID50/100LEV71病毒与相应稀释度鼠血清4中和过夜，后接种于生长良好的VERO96孔板，每个稀释度2孔重复，培养7天后，待阴性对照孔全部病变，而阳性对照空没有病变时，观察中和实验结果。结果显示粘膜免疫各组中VP1高剂量口服免疫组抗体滴度最高为116，几何均数为1713；VP1低剂量口服免疫组抗体滴度为18，几何均数为1504；0108根据以上结果。

40、可判定原核表达的基因工程重组VP1蛋白100G和1000G与壳聚糖配伍口服免疫小鼠可以有效刺激小鼠血清中特异性IGM和IGG抗体的产生，同时在小鼠的阴道粘膜、小肠粘膜、呼吸道粘膜表面检测到特异性SIGA抗体；该口服疫苗还可以刺激小鼠产生细胞免疫反应；体外中和实验结果显示，VP1蛋白100G与壳聚糖配伍免疫组的中和抗体滴度最高为18，几何均数为1504，VP1蛋白1000G与壳聚糖配伍免疫组的中和抗体滴度最高为116，几何均数为1713。0109虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，。

41、在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN102337289ACN102337301A1/3页1200010002序列表CN102337289ACN102337301A2/3页130003序列表CN102337289ACN102337301A3/3页14序列表CN102337289ACN102337301A1/6页15图1图2图3说明书附图CN102337289ACN102337301A2/6页16图4图5图6说明书附图CN102337289ACN102337301A3/6页17图7图8说明书附图CN102337289ACN102337301A4/6页18图9图10说明书附图CN102337289ACN102337301A5/6页19图11图12说明书附图CN102337289ACN102337301A6/6页20图13图14说明书附图CN102337289A。

展开阅读全文