一种用于癌症检测的标志物及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103045737 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103045737 A *CN103045737A* (21)申请号 201210555743.6 (22)申请日 2012.12.19 C12Q 1/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 周荣家 程汉华 陈恒玲 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 薛玲 (54) 发明名称 一种用于癌症检测的标志物及应用 (57) 。

2、摘要 本发明公开了一种用于癌症检测的标志物及 应用， 所述标志物为Nurim基因的 mRNA 或其表达 产物， 所述试剂包括特异性检测Nurim基因 mRNA 的试剂或特异性检测Nurim基因表达产物的试 剂。通过 RT-PCR 检测Nurim的不同转录本或者 免疫印迹或免疫荧光检测Nurim的蛋白表达可以 诊断病人是否患有癌症。本发明标志物具有通用 性， 可以检测多种不同的类型的恶性肿瘤， 同时根 据 mRNA 或表达产物的量能够反映肿瘤恶化程度， 利用本发明分子标志物或检测试剂可以方便快速 地诊断癌症， 准确率高， 对临床诊断有较高的参考 价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页。

3、 说明书 6 页 序列表 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 7 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种用于癌症检测的标志物， 其为Nurim基因的 mRNA 或其表达产物。 2. 根据权利要求 1 所述的标志物， 其特征在于， 所述Nurim基因的 mRNA 为 Nurim a， Nurim b 或 Nurim c， 其核苷酸序列分别为 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6 和 SEQ ID No.7 所示 的序列。 3.根据权利要求1所述的标志物， 其特征在于， 所述Nurim基因的。

4、表达产物为Nurim a， Nurim b 或 Nurim c 其氨基酸序列分别为 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9 和 SEQ ID No.10。 4. 权利要求 1 或 2 所述的标志物在制备癌症诊断试剂中的应用。 5. 用于癌症检测的试剂， 其包括特异性检测Nurim基因 mRNA 的试剂或特异性检测 Nurim基因表达产物的试剂。 6. 根据权利要求 5 所述的试剂， 其特征在于， 所述特异性检测Nurim基因 mRNA 的试剂 至少包括Nurim不同转录本 mRNA 之一的 RT-PCR 引物。 7. 根据权利要求 6 所述的试剂， 其特征在于， 其还包括 RT-PC。

5、R 试剂。 8.根据权利要求5所述的试剂， 其特征在于， 所述特异性检测Nurim基因表达产物的试 剂包括至少一种与Nurim基因表达产物特异性结合的抗体。 9. 根据权利要求 8 所述的试剂， 其特征在于， 其还包括与所述特异性抗体结合的酶标 二抗。 10. 根据权利要求 8 所述的试剂， 其特征在于， 其还包括与所述特异性抗体结合的荧光 标记二抗。 权 利 要 求 书 CN 103045737 A 2 1/6 页 3 一种用于癌症检测的标志物及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种癌症检测的分子标识和技术方法， 在医学遗传学以及临床诊断领 域具有广泛的应用前景。 背景技术 0002 1.。

6、 癌症分子标记 人体正常细胞经过一系列基因突变， 最终摆脱细胞正常生长调控而癌变。这些突变涉 及到染色体易位、 基因扩增、 基因缺失、 点突变等。 癌症组织遗传学改变， 最终会导致癌症个 体中某些基因 mRNA 和蛋白的差异表达。因此尽管对于这些遗传学改变功能不明确， 我们仍 可通过基因的 mRNA 和蛋白表达水平的差异来获得癌症组织的生物学信息。 0003 癌症分子标记物是在癌症患者的血液， 尿液， 淋巴液， 唾液， 肿瘤实体或者其他组 织中特异表达的基因产物(McShane and Altman 2005)。 癌症标记物可能由癌细胞产生， 也 可能由正常细胞产生。虽然大多数的癌症分子标记物。

7、的最终产物是蛋白质， 但是 DNA， mRNA 和蛋白分子的变化都可以用作癌症分子标记的检测。在临床上癌症分子标记物常常用于 癌症的早期诊断， 中期分期以及辅助治疗。到目前为止， 有超过 20 种的癌症标记物用于临 床。常见的有， Alpha-fetoprotein (AFP) 检测肝癌和精原细胞瘤， BRAF mutation V600E 检测结肠癌， CA15-3/CA27.29 检测乳腺癌， CA-125 检测卵巢癌， Calcitonin 检测前列腺癌， Cytokeratin fragments 21-1 检测肺癌， Fibrin/fibrinogen 检测膀胱癌， CD20 检测淋。

8、巴 癌等。 0004 现阶段， 癌症分子标记的局限在于 1) 有的时候非癌症的内环境也可能产生癌症分子标记物， 对诊断结果造成影响。 0005 2) 并不是每一个患同种类型癌症的个体都伴随该类型癌症分子标记物的高水平 表达。 0006 3) 某些类型的癌症缺少相应的分子标记物。 0007 4) 至今没有一种癌症分子标记物可以检测所有类型的癌症。 0008 2. RT-PCR 检测 mRNA 表达 RT-PCR 可以精确地反映受检基因在癌症组织中的 mRNA 表达水平， 从而能精确地评 估癌症的相关信息。RT-PCR 目前已广泛应用于临床实践。相对于蛋白水平的免疫印迹 （Western blot。

9、） 而言， RT-PCR 体现出的是体内相关基因的 mRNA 表达量的信息， 检测灵敏度 和准确性都比较高， 并且所需时间和成本较低。 0009 3. 免疫印迹 （ Western blot） 测定蛋白表达 免疫印迹 （Western Blot） 中， 经过 PAGE 分离的蛋白质样品， 转移到固相载体上， 固相 载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。随 后固相载体上的蛋白质作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶标记的第二抗体起反 应， 经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广 泛应用于检测癌症中特定蛋白水平的表达。

10、。 说 明 书 CN 103045737 A 3 2/6 页 4 0010 4. 免疫荧光 （Immunofluorescence） 检测蛋白表达 为了检测癌症组织中蛋白表达水平和表达部位， 目前临床上可以采用免疫荧光的技 术。免疫荧光是利用抗原与抗体特异性结合的原理， 通过荧光标记的二抗显色来确定组织 细胞内抗原 （多肽和蛋白质） ， 对其进行定位、 定性及定量分析。 发明内容 0011 本发明的目的是提供一种新型的用于癌症检测的标志物 ； 本发明的另一个目的是提供一种用于癌症检测的试剂组合。 0012 本发明首次发现Nurim是一种新型的内层核膜蛋白 （见图 1） ， 在多数正常组织中 不。

11、表达， 在早期肿瘤中低表达， 随着肿瘤的恶化Nurim一直保持高水平的表达。而在肿瘤晚 期，Nurim不仅存在于细胞核膜， 在细胞质和细胞核中也可以观察到Nurim的表达。Nurim 对维持细胞内层核膜的完整性起着非常重要的作用。同时， 干涉Nurim可以大大提高 UV 诱 导的细胞凋亡， 提示Nurim可能具有抑制凋亡的功能 （见图 2） 。 0013 据此， 为实现上述目的， 本发明提供一种用于癌症检测的标志物， 其为Nurim基因 的 mRNA 或其表达产物。 0014 Nurim基因有三个转录本， 包括 Nurim a， Nurim b 和 Nurim c， 其核酸序列如 SEQ ID。

12、 No.57 所示。 0015 相应的也存在三个蛋白表达产物， 包括 Nurim a， Nurim b 和 Nurim c， 其氨基酸序 列如 SEQ ID No.810 所示。 0016 根据上述的标志物可以开发出癌症的检测相关试剂， 包括 mRNA 检测试剂、 免疫印 迹试剂以及组织免疫荧光试剂等等。 0017 进一步本发明提供用于癌症检测的试剂组合， 其包括特异性检测Nurim基因 mRNA 的试剂或特异性检测Nurim基因表达产物的试剂。 0018 所述特异性检测Nurim基因 mRNA 的试剂至少包括Nurim不同转录本 mRNA 之一的 RT-PCR 引物。进一步还可包括 RT-P。

13、CR 相关试剂， 例如 RNA 提取试剂、 反转录试剂、 PCR 试剂 等等。 0019 所述特异性检测Nurim基因表达产物的试剂包括至少一种与Nurim基因表达产物 特异性结合的抗体。 此外还包括与所述特异性抗体结合的酶标二抗或者与所述特异性抗体 结合的荧光标记二抗。 0020 具体地， RT-PCR 检测、 免疫印迹检测以及免疫荧光检测的方法如下 ： 一、 RT-PCR 检测Nurim的不同转录本 提取病例肿瘤组织总 RNA， 然后逆转录为 cDNA， 以 cDNA 为模板扩增Nurim的不同转录 本片段。同时扩增人类的Hprt基因作为阳性对照， 并取适量正常组织或者癌旁组织作为阴 性对。

14、照。扩增结束后， 可以取 5L 样品用于电泳检测。该方法用以检测Nurim不同转录本 的转录情况。 0021 二、 免疫印迹检测Nurim的蛋白表达 提取待检测病例的总蛋白质， 蛋白变性准备上样。因Nurim的三个蛋白都比较小， 所以 我们采用浓度是 15% 的 SDS-PAGE 凝胶电泳。半干转移法将蛋白质转移到 PVDF 膜上。5 脱脂奶粉封闭 1 小时， 一抗 4孵育过夜， 再与 HRP 标记二抗结合。最后用 ECL 系统显色观 说 明 书 CN 103045737 A 4 3/6 页 5 察。同时检测人类的 Actin 蛋白作为阳性对照， 并取适量正常组织或者癌旁组织作为阴性 对照。该。

15、方法用以检测Nurim的蛋白表达情况。 0022 三、 免疫荧光检测Nurim的蛋白表达和细胞定位 制备冰冻切片， 并置于甲醇中 4固定 20 分钟。正常羊血清室温封闭 1 小时。按照 1 比 100 的比例加入Nurim一抗， 4孵育过夜。阴性对照中， 加入正常的兔血清。第二天， 按 照 1 比 100 的比例加入 Cy3 标记的二抗。Hoechest 33258 室温下染核 3 分钟。封片以后 用激光扫描共聚焦显微镜观察并照相。 取适量正常组织或者癌旁组织平行实验作为阴性对 照。该方法用以检测Nurim在癌症病例中的蛋白表达和细胞定位。 0023 本发明与已有的方法相比优点 ： 1) Nu。

16、rim是一种新型的的癌症诊断分子标记， 可以检测多种不同的类型的恶性肿瘤， 具体涉及到皮肤癌， 肝癌， 肺癌， 肾透明细胞癌， 食道癌， 胃癌， 肠癌， 膀胱癌， 睾丸癌， 宫颈 癌， 卵巢癌， 甲状腺癌， 前列腺癌， 胰腺癌， 乳腺癌。而大多数传统的癌症分子标记只能检测 其中的一种或者几种肿瘤。 0024 2) Nurim的表达和肿瘤的恶化密切相关， 随着肿瘤恶化，Nurim的表达量增加。该 方法检测结果可以反映肿瘤恶化程度。 0025 3) 该方法快速方便， 准确率高， 对临床诊断有较高的参考价值。 附图说明 0026 图 1 Nurim的三个转录本在 HeLa 细胞中的亚细胞定位，Nur。

17、im a 和Nurim b 定位 在细胞核膜，Nurim c 核质均一表达。 0027 图 2 在 UV 处理下， 干涉Nurim以后细胞凋亡增加。 0028 图 3 RT-PCR 检测到在精原细胞瘤中Nurim表达， 在正常睾丸中无表达， 其中 1 为 正常睾丸， 2 为睾丸精原细胞瘤。 0029 图 4 免疫印迹检测到在肺癌， 肝癌， 甲状腺癌， 食道癌， 结肠癌， 膀胱癌， 睾丸癌和 卵巢癌中Nurim有表达， 在胃癌癌旁组织中无表达。 0030 图 5 免疫荧光检测到三期肺癌组织中Nurim有较高表达， 正常肺组织中无表达。 具体实施方式 0031 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发。

18、明， 但本发明并不限于本实施例。 0032 下述实施例中， 如果无特殊说明， 均为常规方法。 0033 实施例 1 RT-PCR 检测睾丸精原细胞瘤 一、 总 RNA 提取 1) 立即取 50mg 新鲜肿瘤组织， 置于研砵中， 小心倒入适量液氮， 迅速研磨， 直至组织成 白色粉末状为止。 0034 2) 加入 1mL 的 Trizol ( 购于 Invitrogen 公司 )， 混合均匀， 室温裂解 5 分钟。 0035 3) 加入 0.2mL 氯仿， 混合均匀， 12000rpm 离心 15 分钟， 取上层水相于一个新的离 心管。 0036 4)加入0.5mL异丙醇， 混合均匀， 12000。

19、rpm离心15分钟， 丢弃上清， 沉淀物为RNA。 0037 5) 用新鲜配置的 75的乙醇洗涤， 12000rpm 离心 15 分钟， 弃上清。 说 明 书 CN 103045737 A 5 4/6 页 6 0038 6) 加入 20-25L 的去离子水， 沉淀溶解后测 OD 计算 RNA 浓度。 0039 二、 cDNA 模板的制备。逆转录加样体系见表 1。 37， 反应 2 小时。 0040 表 1. 逆转录加样体系 组分体积 （L） RNA（约 3g）5.50 dNTP（各 10mol/L）1.25 5 逆转录缓冲液4.00 逆转录酶 （200u/L， 购于 Promega 公司）1.。

20、00 水8.25 （注， 可以根据 RNA 的浓度调整加入 RNA 的体积和水的体积， 确保加入 RNA 的含量约 3g， 反应总体积 20L） 三、 PCR 扩增人类Nurim不同转录本。引物 NS-NA 扩增Nurim， 引物 HS-HA 扩增Hprt作 为对照。引物序列如表 2 所示。PCR 反应体系如表 3 所示。扩增条件如下 ： 第一步 94， 5 分钟。 0041 第二步 94， 30 秒。 0042 第三步 66， 30 秒。 0043 第四步 72， 1 分钟。 0044 第二步到第四步循环 35 次。 0045 最后 72， 5 分钟。 0046 扩增结束后， 可以取 5L 。

21、样品用于电泳检测， 琼脂糖胶浓度 2。 0047 表 2. PCR 引物序列 引物名称 引物序列 NS5ATGGCCCCTGCACTGCTCCTG3 NA5TGCTCTGCCTCCCCATCCTGGGG3 HS5CCTGCTGGATTACATCAAAGCACT3 HA5GTCAAGGGCATATCCTACAACAAA3 表 3. PCR 反应体系 组分体积 （L） 10PCR 缓冲液2.0 NS（2.5mol/L）1.0 NA（2.5mol/L）1.0 dNTP（各 2.5mol/L）1.0 cDNA( 原液稀释 10 倍后使用 )0.5 Taq 酶 （2u/L， 购于 Takara 公司 )。

22、）0.5 水14.0 检测结果如图3所示， 在睾丸精原细胞瘤中检测到Nurim的三个转录本表达， 使用这些 引物扩增的片段大小分别是786bp， 609bp， 443bp， 而在正常睾丸组织中Nurim不表达。 这些 转录本的全长序列见序列表。 0048 实施例 2 免疫印迹 （Western blot） 检测多种类型的肿瘤 一、 蛋白质的提取 将整套匀浆器泡酸4小时以上， 洗净烘干， 用锡纸包装， 置于180高温烘烤2小时。 取 100mg 新鲜组织， 加入 PBS， 匀浆器磨碎组织， 超声仪破碎细胞， 加入裂解液， 煮沸 3 分钟后 置于冰上 5 分钟， 5000rpm 离心 5 分钟， 。

23、取上清待上样。裂解液配置， 50mmol/L Tris Base， 100mmol/L 二硫苏糖醇， 2%(m/v)SDS， 0.1% 溴酚蓝， 10%(v/v) 甘油。 说 明 书 CN 103045737 A 6 5/6 页 7 0049 二、 免疫印迹 （Western blot） 1) 实验中我们采用浓度 15% 的 SDS-PAGE 凝胶分离系统， 配制方法如表 4 和表 5。电 泳缓冲液配置， 25mmol/L Tris Base， 250mmol/L 谷氨酸 （pH8.3） ， 0.1%（m/v） SDS。 0050 表 4. 上层胶配置 （浓度 5%， 体积 3mL） 组分体积。

24、 (mL) 水2.10 30% 丙烯酰胺0.50 1.0mol/LTris-Cl（pH6.8）0.38 10%SDS0.03 10% 过硫酸铵0.03 TEMED0.003 表 5. 下层胶配置 （浓度 15%， 体积 5mL） 组分体积 （mL） 水1.10 30% 丙烯酰胺2.50 1.5mol/LTri-Cl（pH8.8）1.30 10%SDS0.05 10% 过硫酸铵0.05 TEMED0.002 2) PVDF 膜 （购于 Millipore 公司） 提前甲醇变性。半干转移法将蛋白质转移到 PVDF 膜上。电转电压 （伏） 为 PVDF 膜的大小 （平方厘米） 乘以 0.8， 时间 。

25、1 小时。转移完毕， TBST 洗膜三次， 每次 10 分钟。转移缓冲液配置， 24 mmol/L Tris Base， 192 mmol/L 谷氨酸， 20% 甲醇 （Towbin et al， 1979） 。TBST 配置， 10 mmol/L Tris Base， 150 mmol/L NaCl， 0.05% （v/v） Tween-20, HCl 调节 pH 至 7.6。 0051 3)5脱脂奶粉溶于 TBST 中， 配制封闭液。封闭 1 小时。 0052 4) 一般情况下Nurim一抗 （货号 sc-133262， 购于 Santa Cruz 公司） 浓度为 1 ： 500 溶于 5。

26、 BSA， 4孵育过夜， 抗体和靶蛋白的结合。同时， 另外一张含 43KD 蛋白的膜孵育 Actin 抗体 （货号 sc-47778， 购于 Santa Cruz 公司） 作为阳性对照。孵育完毕， TBST 洗膜三 次， 每次 10 分钟。 0053 5) 与 HRP 标记二抗 （购于 Pierce 公司） 结合， 室温孵育 1 小时。由于 HRP 标记法 的灵敏度很高， 所以实验中， 所用的二抗浓度为1 ： 50000至1 ： 20000。 二抗孵育完毕， TBST 洗膜至少六次， 每次 10 分钟。 0054 6)ECL 系统 （购于 Thermo 公司）显色观察。将 stable der。

27、oxide solution 和 luminol/enhance solution按照1比1的比例混合均匀， 完全覆盖膜， 暗室反应10分钟， 立 即压片。 0055 如图 4 所示， 发明人在肺癌， 肝癌， 甲状腺， 食道癌， 肠癌， 膀胱癌， 睾丸癌和卵巢癌 中检测到Nurim的表达， 并且在三期的甲状腺癌和膀胱癌中表达量比较高， 在二期的肺癌， 肝癌， 食道癌， 肠癌， 睾丸癌和卵巢癌中表达量较低， 而在对照组的胃癌癌旁组织中Nurim 不表达。 0056 实施例 3 免疫荧光检测肺鳞片细胞癌 一、 冰冻切片 将冰冻切片机预冷至 -20到 -18。根据不同组织的性质选择最适合的温度。连续。

28、 切片， 切片厚度为 7 微米。 说 明 书 CN 103045737 A 7 6/6 页 8 0057 二、 免疫荧光 1) 将冰冻切片置于预冷的甲醇中， 4固定 20 分钟。固定完毕， 室温 PBS 洗涤三次， 每 次 10 分钟。PBS 配置， 8 克 NaCl， 0.2 克 KCl， 1.44 克 Na2HPO4， 0.24 克 KH2PO4， HCl 调节 pH 至 7.4， 加水至 1 升， 高压蒸汽灭菌 20 分钟。 0058 2) 置于 0.5%v/v TX-100， 室温穿透 20 分钟。PBS 洗涤三次， 每次 10 分钟。 0059 3) 加入正常羊血清封闭液， 室温封闭。

29、 1 小时。 0060 4) 加入Nurim一抗 （一般情况下浓度为 1 ： 100 溶于 5%BSA） ， 4孵育过夜。阴性对 照中， 加入正常的兔血清。孵育完毕， PBS 洗涤三次， 每次 10 分钟。 0061 5) 加入 Cy3 标记的二抗 （一般情况下浓度为 1 ： 100 溶于 5%BSA， 购于 Sigma 公司） 。 室温孵育 1 小时。孵育完毕， PBS 避光洗涤三次， 每次 10 分钟。 0062 6) Hoechest 33258（购于 Sigma 公司） 工作液染核 3 分钟。PBS 避光洗涤三次， 每次 10 分钟。 0063 7) 甘油封片， 用激光扫描共聚焦显微镜。

30、观察并照相。 0064 如图5所示， 我们在三期的肺鳞片细胞癌中检测到Nurim的高表达， 在正常肺组织 中无表达。 0065 实施例 4 用于癌症检测的试剂盒 1、 RT-PCR 试剂盒 引物 NS（5 ATGGCCCCTGCACTGCTCCTG 3） 引物 NA （5 TGCTCTGCCTCCCCATCCTGGGG 3） 引物 HS （5 CCTGCTGGATTACATCAAAGCACT 3） 引物 HA （5 GTCAAGGGCATATCCTACAACAAA 3） PCR 试剂包括， 10PCR 缓冲液， dNTP（各 2.5mol/L） ， Taq 酶 （2u/L， 购于 Takara。

31、 公司 ), 蒸馏水 （已灭菌） 。 0066 2、 免疫印迹试剂 Nurim一抗 （货号 sc-133262， 购于 Santa Cruz 公司） HRP 标记抗兔二抗 （购于 Pierce 公司） 3、 免疫荧光试剂盒 抗体 荧光二抗 Nurim一抗 （货号 sc-133262， 购于 Santa Cruz 公司） Cy3 标记的二抗 （购于 Sigma 公司） 。 说 明 书 CN 103045737 A 8 1/7 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103045737 A 9 2/7 页 10 0003 序 列 表 CN 103045737 A 10 3/7 页 11 00。

32、04 序 列 表 CN 103045737 A 11 4/7 页 12 0005 序 列 表 CN 103045737 A 12 5/7 页 13 0006 序 列 表 CN 103045737 A 13 6/7 页 14 0007 序 列 表 CN 103045737 A 14 7/7 页 15 序 列 表 CN 103045737 A 15 1/3 页 16 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103045737 A 16 2/3 页 17 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103045737 A 17 3/3 页 18 图 5 说 明 书 附 图 CN 103045737 A 18 。