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1、(10)申请公布号 CN 103045608 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103045608 A *CN103045608A* (21)申请号 201210549926.7 (22)申请日 2012.12.17 C12N 15/16(2006.01) C07K 14/575(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院东海水产研究 所 地址 200090 上海市杨浦区军工路 300 号 (72)发明人 房娅博 蒋科技 张凤英 马凌波 宋炜 马春艳 胡敬环 (74)专利代理机构 上海泰能。
2、知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 (54) 发明名称 一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 及其用途 (57) 摘要 本发明涉及一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制 因子基因 MIF 及其用途， 该基因 cDNA 长 734bp， 有 一个 363bp 的开放阅读框， 编码 120 个氨基酸 ； 可 用于制备拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品 ； 本 发明基因的获得不仅为研究拟穴青蟹免疫系统奠 定基础， 而且通过基因序列可以获得具有生物活 性的蛋白产物， 为进一步从蛋白层面对 MIF 进行 研究提供理论基础。该基因在拟穴青蟹抵抗病原 微生物入侵中具有重要功能。 (51)Int.Cl。
3、. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF， 其特征在于 ： 所述基因 MIF 的 cDNA 长 734bp， 自 99bp 到 461bp 区段为其开放阅读框， 编码 120 个氨基酸， 具有如 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF， 其特征在于 ： 所述基因 MIF 编码的蛋白质具有如 SEQ ID 。
4、No.2 所示的氨基酸序列。 3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF， 其特征在于 ： 所述基因 MIF 开放阅读框 ORF 的克隆方法所涉及的引物序列如下 ： 上游引物 ： 5 -CCGAAGAACCTCACTCCA-3 ， 下游引物 ： 5 -CAGCCGACAATCGAAATAT-3 。 4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF， 其特征在于 ： 所述基因 MIF 转录水平的检测方法为使用一对荧光定量 PCR 引物进行 PCR 检测， 所涉及的 引物序列如下 ： 上游引物 ： 5 -CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3 ， 下游。
5、引物 ： 5 -ACTGGTGCCGCCGAAAG-3 。 5. 根据权利要求 1 所述的一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 的应用， 其特 征在于 ： 用于制备拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品。 6. 如权利要求 5 所述一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 的应用， 其特征在 于 ： 所述的病原微生物为副溶血性弧菌。 权 利 要 求 书 CN 103045608 A 2 1/4 页 3 一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 及其用途 技术领域 0001 本发明涉及甲壳类免疫器官中表达的基因序列， 具体涉及一种拟穴青蟹巨噬细胞 移动抑制因子的基因序列及其用途。 背景技。
6、术 0002 甲壳类动物免疫包括细胞免疫和体液免疫两种方式。细胞免疫包括吞噬作用、 包 围化及结节的形成 ； 体液免疫系统包括粉氧化酶原激活系统、 各种凝集素及抗菌肽等。 0003 巨噬细胞移动抑制因子最早是在 1966 年研究迟发型超敏反应的时候发现的一种 分子， 它具有多种生物活性， 既是一种细胞因子， 又是一种源于垂体的激素， 还可以作为糖 皮质激素生理活动的负反馈调节剂。在脊椎动物体免疫体统方面， 巨噬细胞移动抑制因子 参与迟发型超敏反应、 刺激 T 细胞增殖， 并在自身免疫系统疾病中参与作用。另外， 巨噬细 胞移动抑制因子还能促进肿瘤细胞生长。 0004 拟穴青蟹是四种青蟹之一， 属。
7、节肢动物门， 甲壳纲， 十足目， 爬行亚纲， 短尾派， 梭 子蟹科。具有很高的营养价值、 药用价值和工业价值， 是我国三大经济蟹类之一。近年来， 随着养殖规模的不断扩大， 在养殖过程中， 由于水质、 苗种质量以及细菌感染等原因容易导 致青蟹的大量死亡。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子的基因 序列及其用途。 该基因的获得不仅为研究甲壳类巨噬细胞移动抑制因子在免疫反应中的作 用机理奠定基础， 而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物， 为进一步研究 MIF 的免疫功能提供理论基础 ； 该基因还可以用于拟穴青蟹的抗病相关研究。 0006 本发。
8、明提供了从拟穴青蟹肝胰腺 SMART cDNA 文库中筛选出的一个巨噬细胞移动 抑制因子的核苷酸序列、 氨基酸序列及其时空表达图谱以及在拟穴青蟹抵抗病原微生物入 侵产品中的应用。 0007 为实现本发明的发明目的， 发明人提供如下技术方案 ： 0008 一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF， 具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸 序列。 0009 一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF， 它所编码的蛋白质具有如 SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。 0010 本发明所述的拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 是从拟穴青蟹肝胰腺的 SMARTcDNA 质粒文库中筛选到的。
9、一个基因。该基因 cDNA 长 734bp， 自 99bp 到 461bp 区段为 其开放阅读框， 编码 120 个氨基酸。 0011 拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 的 cDNA 序列如 SEQ ID No.1 所示。 0012 拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 编码的蛋白质序列如 SEQ ID No.2 所 示。 说 明 书 CN 103045608 A 3 2/4 页 4 0013 本发明还提供一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF ORF的核苷酸克隆方 法， 其中， 所涉及的引物序列如下 ： 0014 上游引物 ： 5 -CCGAAGAACCTCACTCCA-3 。
10、， 0015 下游引物 ： 5 -CAGCCGACAATCGAAATAT-3 。 0016 本发明还提供一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 转录水平的检测方 法， 其中， 所述的检测方法为使用一对荧光定量 PCR 引物进行 PCR 检测， 所述的一对荧光定 量 PCR 引物由上游引物和下游引物组成， 其中， 所述的引物如下 ： 0017 上游引物 ： 5 -CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3 ， 0018 下游引物 ： 5 -ACTGGTGCCGCCGAAAG-3 。 0019 本发明还提供了上述的一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因 MIF 在制备拟 穴青蟹抵抗病原微生物入。
11、侵产品中的应用， 其中， 所述的病原微生物为副溶血性弧菌。 0020 本发明利用荧光定量 PCR 技术检测了 MIF 在拟穴青蟹的血细胞、 肝胰腺、 心脏、 精 巢、 心脏、 鳃中的转录水平， 结果表明 ： 该基因在所检测的六个组织中均有 mRNA 存在， 其中 在肝胰腺中的丰度最高， 其次在血细胞和鳃中。另外还检测到经副溶血性弧菌刺激后的血 细胞中的 MIF 基因表达量呈上升趋势， 明显较正常水平高， 这显示该基因在拟穴青蟹抵抗 病原微生物入侵中具有重要功能。 0021 有益效果 0022 本发明的基因的获得不仅为研究甲壳类巨噬细胞移动抑制因子在免疫反应中的 作用机理奠定了基础， 而且通过基。
12、因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物， 为进一步研 究 MIF 的免疫功能提供理论基础。此外， 本发明的基因还可以用于拟穴青蟹的抗病相关研 究。 附图说明 0023 图 1 是采用 TaKaRa rTaq 扩增 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图 ； 0024 图 2 是荧光定量检测 MIF 在拟穴青蟹六个组织中的表达情况 ； 0025 图 3 是拟穴青蟹经副溶血性弧菌感染后血细胞中 MIF 的时空表达谱。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 。
13、员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0027 实施例 1 0028 RNA 的提取和 SMART cDNA 文库的构建。 0029 肝胰腺总 RNA 使用 Unizol Reagents(Biostar,Shanghai,China) 提取， 具体步 骤如下 ： 取新鲜肝胰腺组织进行液氮研磨， 加入 1mL Unizol Reagents， 充分匀浆后， 加入 0.2mL 氯仿剧烈震荡 15s， 室温静置 5min 后 12000r/min 离心 15min。取上清， 加入等体积 的异戊醇， 混匀， 冰上静置 10min 后 12000r。
14、/min 离心 10min， 弃上清。使用 1mL75% 乙醇洗 涤沉淀， 7500r/min 离心 3min 后弃上清。室温放置晾干后加入 30L RNase free dH2O， 溶 说 明 书 CN 103045608 A 4 3/4 页 5 解。取 3L 电泳检测总 RNA 浓度和质量。 0030 SMART cDNA 的合成用 SMARTTM cDNA Library Construction Kit(Clontech,Palo Alto,CA,USA)试剂盒。 具体步骤如下 ： 取2g RNA， 加入1L SMART IV Oligonucleotide 和 1LCDS III/3。
15、 PCR Primer， 加水补足 5L， 混匀离心后 72温浴 2min 后冰浴。离心 后加入 2L5X First-Strand Buffer， 1L DTT（20mM） ， 1L dNTP Mix（10mM） 和 1L PowerScriptReverse Transcriptase， 42温浴 1h 合成第一链 cDNA。取 2L 第一链 cDNA 和 80L 去离子水， 10L 10X Advantage 2PCR Buffer， 2L 50X dNTP Mix， 2L 5PCR Primer， 2L CDSIII/3PCR Primer 和 2L 50X Advantage 2Po。
16、lymerase Mix 进行如下 PCR 循环 ： 95 1min 后， 以 95 15sec、 68 6min 反应 26 个循环。取 5L 进行电泳检测。 合成的SMART cDNA和pBluescript II SK （+） 载体连接， 并转化入DH5感受态细胞中。 摇 菌后取 250L 菌液涂布于 15cm 培养皿上 （Apr-IPTG/x-gal LB 固体培养基） ， 37过夜。通 过蓝白斑鉴定后筛选 cDNA 插入片段的阳性重组子， 分别接种到 1mL 含氨苄浓度为 100g/ mL的LB液体培养基中扩大培养后进行菌液测序。 对得到的序列进行BLAST比对后， 共检测 到该基因。
17、的一个克隆。该基因 cDNA 全长 734bp， 自 99bp 到 461bp 区段为其开放阅读框， 编 码 120 个氨基酸。 0031 实施例 2 0032 拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子 MIF 基因 ORF 序列的高保真克隆。 0033 本发明人设计了一对特异性引物， 以拟穴青蟹血液总 cDNA 为模板， 可快速、 准确 地克隆出编码拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子 MIF 的 ORF 序列， 用于后续基因工程。 0034 1、 用于扩增编码拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子 MIF 的 ORF 序列的特异性引物 ： 0035 上游引物 ： 5 -CCGAAGAACCTCACTCCA-3 ， 00。
18、36 下游引物 ： 5 -CAGCCGACAATCGAAATAT-3 。 0037 2、 PCR 反应体系 ：（TakaRa） 0038 0039 0040 反应条件为 ： 953min， 然后是35个循环 ： 9530s， 5245s， 721min。 结果见 图 1 琼脂糖凝胶电泳图谱， 将 PCR 产物回收与纯化， 可直接用于后续基因工程。 0041 实施例 3 0042 六个组织和经副溶血性弧菌后不同时期的血细胞总RNA的提取和荧光定量PCR反 应。 0043 利用上述 RNA 提取方法提取拟穴青蟹血细胞、 肝胰腺、 精巢、 心脏、 肌肉、 鳃及 说 明 书 CN 103045608 。
19、A 5 4/4 页 6 经副溶血性弧菌刺激后不同时间点血细胞的总 RNA。利用 Rever TraAce qPCR RT Kit （TOYOBO CO.,LTD.OSAKA JAPAN）试剂盒反转录合成 cDNA 第一链为模板， 使用该基因 的 特 异 性 引 物 （Sense Primer ： 5 -CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3 ； Anti-sense Primer ： 5 -ACTGGTGCCGCCGAAAG-3 ） 进行实时荧光定量 PCR 反应， 试剂盒为 TaKaRa SYBRPremix Ex Taq（Perfect Real Time） 。反应体系为总体积 20L。
20、， 10L 2X SYBR Mix， 正反向引物 （10M） 和ROX各0.4L， ddH2O 6.8L。 PCR反应在ABI StepOnePlus Detection system上 进行， 反应程序为 ： 在 95变性 10min， 进行 45 个循环， 每个循环包括 95 15s， 60 1min， 72延伸1min。 最后72延伸10min。 使用拟穴青蟹18S rRNA （GenBank accessionnumber FJ646616.1， Sense Primer:5 -GGGGTTTGCAATTGTCTCCC-3 ， Anti-sense Primer:5 -GGTG TGT。
21、ACAAAGGGCAGGG-3 ） 作为对照。利用标准曲线法计算相对表达量。结果显示 ： 该基因在 拟穴青蟹六个组织中都有表达 （图 2） ， 其中在肝胰腺中的表达量最高， 其次是在血细胞和鳃 中。 经副溶血性弧菌刺激后血液中的表达量出现了明显的上升， 较正常水平高， 这显示该基 因在拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵中具有重要功能 （图 3） 。 说 明 书 CN 103045608 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103045608 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 103045608 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 103045608 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103045608 A 10 。