靶向纳米递释系统及其制备方法和应用.pdf

《靶向纳米递释系统及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《靶向纳米递释系统及其制备方法和应用.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN102335428A43申请公布日20120201CN102335428ACN102335428A21申请号201110296612622申请日20111008201110124612820110513CNA61K39/44200601A61K47/48200601A61P35/00200601A61K31/416420060171申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433上海市杨浦区翔殷路800号72发明人高申丁宝月丁雪鹰武鑫范伟高静朱全刚刘继勇张玮吴兆勇王翔寇有利马露露王学贤74专利代理机构上海大邦律师事务所31252代理人周东萍54发明名称靶向纳米递释系统及其制备。

2、方法和应用57摘要本发明公开了一种靶向纳米递释系统，该系统主要由靶头DR5MAB和载药纳米粒连接组成。本发明还公开了靶向纳米递释系统的制备方法和应用。本发明靶向纳米递释系统，是一种有效的药物缓释及靶向治疗系统，靶头DR5MAB与纳米递释系统中的药物可分别从外源性和内源性两条途径促使肿瘤细胞凋亡，使药物在体内具有主动靶向性的同时，还可将化疗和免疫治疗有效结合，起到协同和增敏作用，大大提高药效，又降低了药物毒副作用。66本国优先权数据51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图3页CN102335437A1/1页21一种靶向纳米递释系统，其特征在于，所。

3、述靶向纳米递释系统主要由靶头DR5MAB和载药纳米粒连接组成。2根据权利要求1所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述载药纳米粒的载体材料为聚乙二醇修饰的聚乳酸。3根据权利要求1所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述载药纳米粒装载的药物为治疗肿瘤的药物。4根据权利要求3所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述肿瘤包括恶性黑素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、甲状腺癌、咽喉癌、或前列腺癌。5根据权利要求4所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述治疗恶性黑素瘤的药物为达卡巴嗪。6根据权利要求1所述的靶向纳米递释系统，其特征在于，所述靶向纳米递释系统的粒径为1。

4、00200纳米。7权利要求1所述靶向纳米递释系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤将适量药物溶于水，制成内水相；将适量聚乙二醇修饰的聚乳酸溶于有机溶剂，制成油相；将适量人血清白蛋白溶于水，制成外水相；把内水相加入到油相经超声形成初乳，并将该初乳加入到外水相中超声形成复乳，待有机溶剂挥发后，得到载药纳米粒；将靶头DR5MAB以化学键偶联的方式连接到载药纳米粒表面，得到靶向纳米递释系统。8根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述内水相与油相的体积比为110，初乳与外水相的体积比为14。9根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂是二氯甲烷和丙酮组成的二元混合溶剂，二氯甲烷和丙酮。

5、的体积比为32。10权利要求1所述靶向纳米递释系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。权利要求书CN102335428ACN102335437A1/8页3靶向纳米递释系统及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种DR5MABMONOCLONALANTIBODYAGAINSTDR5，抗DR5单克隆抗体介导的靶向纳米递释系统及其制备方法和应用。背景技术0002目前，全世界每年约600万人死于恶性肿瘤。中国现有癌症患者约450万人，死亡率逾30，造成了严重的社会问题。临床上治疗恶性肿瘤的主要手段仍然是在术后予以全身辅助的化学治疗，但因传统化疗药物普通剂型缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细。

6、胞的同时也对正常细胞产生毒性，常使患者不能耐受。0003以治疗难度大、死亡率高的恶性黑素瘤MALIGNANTMELANOMA，MM为例，达卡巴嗪DTIC是一种治疗恶性黑色素瘤最有效的药物，化学名称为53，3二甲基1三氮烯基4酰胺基咪唑枸橼酸盐，在体内分解能放出甲基正离子CH3，为嘌呤生物合成的前体，能干扰嘌呤的生物合成，具有直接细胞毒作用，但是剂型单一，只有普通注射粉针剂，存在毒副作用大、靶向性差、用药顺应性差、稳定性差等缺点，临床用于恶性黑色素瘤的有效率也仅为20。0004死亡受体DR5与目前已知的其他死亡受体CD95、TNFR1、DR3、DR4一样，都属于肿瘤坏死因子受体TNRF超家族，都。

7、是I型跨膜蛋白，然而死亡受体DR5的独特之处就在于当外来的配体与之结合时，它仅选择性的杀伤肿瘤细胞或者转化细胞，而对机体的正常细胞不具有明显的毒性，极大地降低了其副作用。研究表明，DR5受体高水平地广泛表达于许多肿瘤组织，如肝癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、恶性黑素瘤、甲状腺癌、咽喉癌、前列腺癌等；而不表达或较少表达于正常的组织细胞中。DR5的激动型抗体比如DR5MAB，能特异性地结合DR5，通过细胞内凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织细胞毒性很小。因此，可以利用抗DR5单克隆抗体DR5MAB对肿瘤进行免疫治疗。目前，这些抗体在临床前期研究已显示出较TRA。

8、IL更有效的诱导多种肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞凋亡的活性，并能使部分小鼠移植瘤模型的肿瘤消退，部分临床试验研究已取得了可喜的成果。但是，单独使用DR5MAB，容易在体内被清除，影响治疗效果。0005经检索国内外数据库和专利数据库，以与DR5具有高亲和性、高特异性、可高效诱导瘤细胞凋亡且对正常细胞无毒副作用的DR5单抗为靶头，偶联载药纳米粒制备具有主动靶向性且可将化疗和免疫治疗有效结合的多功能靶向纳米给药系统尚未见相关文献报道。发明内容0006本发明要解决的技术问题是提供一种以本身具有促肿瘤细胞凋亡活性的单抗为靶头的靶向纳米递释系统，该系统是将靶头DR5MAB与载药纳米粒连接而制成的靶向纳米递释系。

9、统，是一种有效的药物缓释及靶向治疗系统，其将化疗和免疫治疗有效结合，既提高了药效和特异性，又降低了药物的毒副作用。0007此外，还需要提供一种靶向纳米递释系统的制备方法和应用。说明书CN102335428ACN102335437A2/8页40008为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现0009在本发明的一个方面，提供了一种靶向纳米递释系统，该系统主要由靶头DR5MAB和载药纳米粒连接组成。0010优选的，所述载药纳米粒的载体材料为聚乙二醇修饰的聚乳酸。聚乳酸是具有优良生物相容性和生物降解性的聚合物，在人体内代谢的最终产物是水和二氧化碳，中间产物乳酸是体内糖代谢的产物，所以不会在体内积。

10、聚，无毒副作用。本发明采用聚乙二醇修饰的聚乳酸，不仅具有前述聚乳酸的优点，还具有长循环的特性，能更有效地将药物输送至肿瘤细胞。0011优选的，所述载药纳米粒装载的药物为治疗肿瘤的药物。所述肿瘤包括恶性黑素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、甲状腺癌、咽喉癌、或前列腺癌。在本发明的优选实施例中，载药纳米粒以治疗恶性黑素瘤的达卡巴嗪DTIC为模型药物。0012所述靶向纳米递释系统的粒径为100200纳米。0013在本发明的另一方面，提供了一种上述靶向纳米递释系统的制备方法，包括以下步骤0014将适量药物溶于水，制成内水相；将适量聚乙二醇修饰的聚乳酸溶于有机溶剂，。

11、制成油相；将适量人血清白蛋白溶于水，制成外水相；0015把内水相加入到油相经超声形成初乳，并将该初乳加入到外水相中超声形成复乳，待有机溶剂挥发后，得到载药纳米粒；0016将靶头DR5MAB以化学键偶联的方式连接到载药纳米粒表面，得到靶向纳米递释系统。0017优选的，所述内水相与油相的体积比为110，初乳与外水相的体积比为14。0018优选的，所述有机溶剂是二氯甲烷和丙酮组成的二元混合溶剂，二氯甲烷和丙酮的体积比为32，可使载药纳米粒平均粒径控制在100200纳米之间。0019在本发明的另一方面，还提供了上述靶向纳米递释系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。0020本发明靶向纳米递释系统，其靶头抗D。

12、R5单克隆抗体DR5MAB本身具有抗肿瘤活性，该DR5MAB与纳米递释系统中的药物可分别从外源性和内源性两条途径促使肿瘤细胞凋亡，使药物在体内具有主动靶向性的同时，还可将化疗和免疫治疗有效结合，起到协同和增敏作用，从而大大提高药效，又可降低药物毒副作用。本发明靶向纳米递释系统，既将药物靶向输送至肿瘤细胞，延长药物在体内的作用时间，又增加DR5MAB的稳定性，使其不易被清除。经实验验证，本发明靶向纳米递释系统，能明显抑制肿瘤生长，效果显著优于原药和DR5MAB联合用药组。附图说明0021下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0022图1是本发明实施例3的DTICNPS及DTICN。

13、PSDR5MAB体外释药曲线图；0023图2是本发明实施例4双荧光标记的DTICNPSDR5MAB对表面高表达DR5的A375细胞的特异性识别和结合功能的流式细胞仪检测图；说明书CN102335428ACN102335437A3/8页50024图3是本发明实施例5双荧光标记的PENPSDR5MABFITC与靶细胞A375结合和内吞过程的激光共聚焦显微镜图；0025图4是本发明实施例6各治疗组荷瘤裸鼠最终肿瘤平均体积的柱状图；0026图5是本发明实施例6的DTICNPSDR5MAB体内靶抗肿瘤曲线图。具体实施方式0027本发明靶向纳米递释系统，以具有长循环特性的聚乙二醇修饰的聚乳酸MPEGPLA。

14、为载体材料，以治疗肿瘤的药物为模型药物，以自身具有抗肿瘤活性并具有高特异性的DR5MAB为靶头，先采用超声复乳法制备载药纳米粒，然后将DR5MAB以化学键偶联的方式连接到载药纳米粒表面，得到具有多重功能的靶向纳米递释系统。本发明采用的靶头DR5MAB具有双重功能，一方面，可选择性地与表面高表达DR5的肿瘤细胞结合，将载药纳米粒装载的药物特异性地导向肿瘤细胞，使该缓释药物以内源性途径促使肿瘤细胞凋亡；另一方面，DR5MAB本身具有抗肿瘤活性，以主动免疫治疗的方式从外源性途径诱导肿瘤细胞凋亡。因此，本发明的靶向纳米递释系统，将化疗和免疫治疗有效结合，起到协同和增敏作用，大大提高药效，又降低了药物毒。

15、副作用。0028在下面优选实施例中，以治疗恶性黑色素瘤的有效药物达卡巴嗪DTIC为模型药物制备靶向纳米递释系统。0029实施例1DR5MAB介导的靶向纳米递释系统的制备0030以具有长循环特性的聚乙二醇修饰的聚乳酸MPEGPLA为载体材料，DTIC为模型药物，以自身具有抗肿瘤活性并具有高特异性的DR5MAB为靶头，先采用超声复乳法制备DTICNPS缓释递药系统，然后将DR5MAB以化学键偶联的方式连接到DTICNPS表面，得到具有多重功能的靶向纳米递释系统DTICNPSDR5MAB，具体步骤如下。00311载达卡巴嗪的DTICNPS递释系统的制备0032电子天平精密称取适量DTIC，以去离子水。

16、作溶剂，配制成浓度为3MG/ML的水溶液，所得溶液作为内水相备用。0033用电子天平精密称取MPEGPLA适量溶于有机溶剂V二氯甲烷V丙酮32中，配制成浓度为10MG/ML的溶液，所得溶液作为油相备用，精密称取适量人血清白蛋白HSA，以去离子水作溶剂，配制成浓度为1W/V的水溶液，所得溶液作为外水相兼乳化剂备用，该外水相兼乳化剂使下面步骤制得的载药纳米粒表面包裹着生物相容性良好的可降解材料HSA。0034将100L去离子水或药物溶液内水相加入1ML浓度为10MG/ML的MPEGPLA溶液油相，100W、60S连续超声制备W/O初乳。然后，将初乳滴加入4ML的1HSA水溶液外水相中，100W、3。

17、0S间断超声2次制备W/O/W复乳，再加入30ML去离子水使复乳分散。磁力搅拌4H，挥去有机溶剂，纳米粒固化。14000R/MIN离心30MIN后弃去上清液即得，洗涤3次，冷冻干燥，保存备用。00352靶向纳米递释系统DTICNPSDR5MAB的制备0036采用碳二亚胺法制备靶向纳米递释系统，即将抗DR5单克隆抗体与DTICNPS表面包裹的HSA以化学键偶联的方式连接，得到具有靶向功能的DTICNPSDR5MAB。0037简易反应式如下说明书CN102335428ACN102335437A4/8页600380039即取冷冻干燥后的载药纳米粒适量以PH74的PBS重悬约5MG/ML，取1ML重悬。

18、液，在电磁搅拌下分别加入50L001M/L碳二亚胺EDC以及500L的DR5MAB原液100G/ML，于4下搅拌2H，将所得混悬溶液经离心分离16000R/MIN，5MIN。超声分散后用去离子水洗涤三遍，冷冻干燥，所得白色粉状固体即为靶向载药纳米粒，即DTICNPS与抗DR5单克隆抗体的偶联物靶向纳米递释系统DTICNPSDR5MAB。冷藏备用。0040实施例2纳米粒粒径与ZETA电位测定0041分别取定量冷冻干燥后的空白纳米粒DRUGFREENPS、载药纳米粒DTICNPS及靶向载药纳米粒DTICNPSDR5MAB，以去离子水超声重悬分散后，用激光粒度仪测定纳米粒的粒径分布与ZETA电位。结。

19、果如下表1所示。0042表1纳米粒的粒径和电位N600430044由MPEGPLA及DR5MAB制备的载DTIC靶向纳米粒粒径在166NM左右，在100NM200NM之间，可减少巨噬细胞的吞噬作用，ZETA电位30MV，静电稳定性良好。0045实施例3DTICNPS及DTICNPSDR5MAB体外释药行为的测定0046精密称取DTICNPS或DTICNPSDR5MAB50MG，置于离心管中，加入50ML01MPH74磷酸盐缓冲液，超声分散均匀后，置于37恒温水浴摇床中，振荡速度120RPM/MIN。分别在第1、4、8、16、24、48、72小时以及第5、7、10天取出同时间点的3份样品，置于冷。

20、冻离心机中，14000RPM离心30MIN，将全部的释放介质小心吸出并更换新的磷酸盐释放介质，取上清液过滤后进样20L，记录峰面积，代入标准曲线方程，计算得到上清液中的DTIC浓度，求得各个时间点释放的DTIC的药量CT。同时，测定释放前纳米粒中DTIC的含量，C0计算累计释放百分率FT，FTCT/C0100以FT对时间T作图，获得药物释放曲线见图1。由图1可知，DTICNPSDR5MAB在接上靶头后仍保持原载药纳米粒的缓释特性。0047实施例4流式细胞仪验证DTICNPSDR5MAB的特异性识别和结合功能0048恶性黑素瘤细胞A375细胞表面高度表达DR5受体分子，抗DR5的单克隆抗体可以与。

21、之特异性结合。利用流式细胞仪可检测荧光素标记的抗DR5单克隆抗体与该细胞的结合，细胞荧光强度与A375细胞所结合的抗体量呈正相关。在已经确定DR5连接到纳米粒表面的基础上，通过流式实验测定细胞的荧光强度，考察连接DR5抗体的靶向纳米粒对靶细胞的识别功能，进而评价DR5的生物活性。说明书CN102335428ACN102335437A5/8页70049具体方法0050以FITC标记的DR5MAB制备双荧光标记的靶向纳米粒PENPSDR5MABFITC。0051将得到的纳米粒重悬液分别加入到装有1ML的A375细胞与NIH细胞悬液的EP管中细胞数量为5105，混匀，37孵育60MIN后，离心150。

22、0RPM，5MIN，用PH74的PBS溶液洗三次，重悬液样品用流式细胞仪检测荧光强度。以未加靶向纳米粒的细胞作为相应的空白对照，同时以极少抗原DR5表达的NIH细胞作为阴性对照。0052为了证明对DTICNPSDR5MAB的单克隆抗体与A375细胞相互作用的特异性，使用DR5MAB进行竞争抑制考察。即A375细胞在用PENPSDR5MABFITC作用前，预先加入适量DR5MAB孵育30MIN，具体操作方法同。0053结果见图20054如图2A所示，从细胞表面高表达DR5受体的靶细胞A375的荧光柱状图可以看到与空白对照比较，荧光靶向纳米粒产生明显的荧光峰偏移。说明靶向纳米粒识别并结合到靶细胞表。

23、面的DR5抗原上，使细胞表面带有荧光，出现了荧光峰偏移。而从图2B可看出，阴性NIH细胞表面DR5抗原数量极少，靶向纳米粒无法特异性识别连接，因而观察到的峰几乎与对照组重合，靶向纳米粒作用组荧光强度明显强于非靶向作用组。通过流式实验证实靶向纳米粒上的DR5MAB在纳米粒制备前后生物活性保持稳定；另一方面，靶向纳米粒在体外条件下对靶细胞具有良好的特异性识别功能。为了证明对DTICNPSDR5MAB的单克隆抗体与A375细胞相互作用的特异性，使用DR5MAB进行竞争抑制考察，结果如图2C所示，未用DR5MAB预处理的作用组的荧光强度显著强于预处理组，即荧光标记的PENPSDR5MABFITC跟A3。

24、75的结合受到了DR5MAB的抑制，证明DTICNPSDR5MAB的内吞主要是通过配体受体结合途径。0055实施例5激光共聚焦观察PENPSDR5MABFITC与靶细胞A375结合和内吞过程0056在验证了靶向纳米粒在体外条件下对靶细胞具有特异性识别功能后，又通过共聚焦显微镜观察靶向纳米粒与靶细胞之间的作用过程。0057具体方法0058以FITC标记的DR5MAB制备双荧光标记的靶向纳米粒PENPSDR5MABFITC。0059A375细胞和NIH细胞于含10胎牛血清的DMEM培养基中，37，5CO2中常规培养。0060取对数生长期细胞制成浓度为1105个/ML的细胞悬液，以500L/孔接种于。

25、24孔培养板的盖玻片上盖玻片预先进行无菌处理，并用PBS及培养液冲洗后置于培养孔中培养24小时，在给药前细胞用PH74的PBS洗三次。0061将制得的纳米粒重悬液分别加入到A375与NIH细胞培养孔中未加药物的细胞作为对照组，37分别继续培养1MIN，5MIN，10MIN，30MIN和60MIN，然后用PH74PBS溶液洗涤三次，用4的多聚甲醛PFA溶液固定细胞15MIN，PBS溶液洗涤三次，然后以HOECHST33342试剂复染色细胞核5MIN，PBS溶液洗涤三次，取出盖玻片置于滴加有甘油保湿剂的载玻片上，盖玻片周围用指甲油固定，制得共聚焦观测样品，置于湿盒中冷藏保存，备测。用LEICATC。

26、SSP2共聚焦显微镜观察，LEICACONFOCALSOFTWARE分析样品图片。0062结果0063图3所示为用激光共聚焦测得的双荧光标记的PENPSDR5MABFITC与靶细胞说明书CN102335428ACN102335437A6/8页8A375结合和内吞过程。由图3可知，纳米粒在体外条件下5MIN可以识别并与细胞表面抗原结合，附着于细胞膜表面，进一步证明了纳米粒的靶向性良好。30MIN后纳米粒已进入细胞内，入胞效果良好。1H时靶向纳米粒穿过细胞膜，进入细胞内部，布满整个细胞浆。而对于正常细胞NIH，则1H后在细胞内也只能看到少量纳米粒。0064实施例6DTICNPSDR5MAB体内抗肿。

27、瘤效果、安全性评价0065利用A375黑素瘤细胞株诱导黑素瘤，构建相应的动物模型选取对数生长期A375黑素瘤细胞进行造模，取该期A375细胞，吸去培养液、清洗、用胰酶消化、再清洗、进行细胞计数，然后用无菌生理盐水制备癌细胞悬液，调整细胞浓度至1107/ML，再加等体积基质胶BDMATRIGEL，混匀，接种前置冰盒中；选取BALB/C裸鼠，取细胞悬液接种至裸鼠背部皮下02ML/只；小鼠精心饲养一段时间后，选择肿瘤生长良好，至一定体积的裸鼠，作为实验模型。0066将48只裸鼠人恶性黑素瘤移植模型随机分为8组AH组，每组6只。具体给药方法为将所有制剂分别溶于PBS01ML中，纳米制剂经超声分散水浴，。

28、经尾静脉注射。于治疗的第1，3，5天和7天以同样剂量药物治疗1次。分组为0067A组DTICNPSDR5MAB组；0068B组DTIC原药组十DR5MAB组即DTIC原药和DR5MAB联合用药组；0069C组DTICNPS组；0070D组DTIC原药组；0071E组DR5MAB组；0072F组DR5MAB未载药NPS组；0073G组未载药NPS组；0074H组空白对照组PBS组。0075治疗当天开始隔日用游标卡尺测量裸鼠肿瘤最长径及其垂直径，用公式体积最长径垂直径2/2，计算肿瘤体积。至第16天，颈椎脱臼处死小鼠，同时取裸鼠血清检测谷丙转氨酶、肌酐、血白细胞计数。剥离瘤体称重，计算瘤重抑制率。。

29、瘤重抑制率对照组平均瘤重一实验组平均瘤重/对照组平均瘤重100。0076数据处理和统计方法0077统计学处理荷瘤裸鼠瘤重、MVD、AI等数据，结果以MEANSD表示，组间比较采用ANOVA，P005即认为存在显著性差异。所有的统计学分析采用SPSS130软件完成。0078结果如表2、3和图4、5所示。从表2和图4、5可知，DTICNPSDR5MAB治疗组和DTIC原药组DR5MAB联合用药组抑制肿瘤生长效果明显，其中，DTICNPSDR5MAB治疗组的肿瘤生长明显受到抑制。0079表2治疗实验中的平均瘤重及肿瘤生长抑制率N6说明书CN102335428ACN102335437A7/8页9008。

30、00081P005VS空白对照H组；P005VSA组。0082表3荷瘤裸鼠用药后的血白细胞总数WBC、谷丙转氨酶ALT和肌酐CR清除率测定结果008300840085P005VS空白对照H组；P005VSDTIC原药D组。0086表3为不同治疗药物的不良反应测定结果，DTICNPSDR5MAB组与G组和H组BALB/C裸鼠血白细胞总数、谷丙转氨酶水平相近P值均005，提示DTICNPSDR5MAB说明书CN102335428ACN102335437A8/8页10对血白细胞和肝功能无影响。DTIC原药组及DTIC原药DR5MAB组的血白细胞总数明显低于DTICNPSDR5MAB组和对照H组，而D。

31、TIC原药组及DTIC原药DR5MAB组的谷丙转氨酶明显高于对照H组P005，对肝功能有影响。反映肾功能的肌酐CR清除率在各组中相差无显著性，说明本发明靶向纳米制剂对肾功能无影响。0087以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。说明书CN102335428ACN102335437A1/3页11图1图2说明书附图CN102335428ACN102335437A2/3页12图3说明书附图CN102335428ACN102335437A3/3页13图4图5说明书附图CN102335428A。