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1、(10)申请公布号 CN 102977202 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102977202 A *CN102977202A* (21)申请号 201210480534.X (22)申请日 2012.11.23 C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (71)申请人 绍兴文理学院 地址 312000 浙江省绍兴市越城区环城西路 508 号 (72)发明人 杨受保 (74)专利代理机构 绍兴市越兴专利事务所 33220 代理人 蒋卫东 (54) 发明名。
2、称 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子 蛋白的全序列、 引物序列及其蛋白的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种三角帆蚌的脂多糖诱导 的肿瘤坏死因子蛋白的全序列， 具有序列表中 SEQIDNO.1 所示的来自于三角帆蚌体内的 LITAF 蛋白的核酸全序列和具有序列表中 SEQIDNO.2 所 示的来自于三角帆蚌体内的 LITAF 蛋白的氨基酸 序列 ； 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因 子蛋白的引物序列， 具有序列表中 SEQIDNO.3 所 示的用于扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物 序列， 及其蛋白的制备方法。通过本发明得到的 LITAF 重组蛋白可以用于制备新型基因工。
3、程抗癌 药物， 防治人类癌症， 具有广阔的市场前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的全序列， 其特征在于 ： 具有序列 表中SEQ ID NO.1所示的来自于三角帆蚌体内的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中 SEQ ID NO.2 所示的来自于三角帆蚌体内的 LITAF 蛋白的氨基酸序列。 2. 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的引物序列， 其特征在于 ： 具有序 列表中 SEQ ID N。
4、O.3 所示的用于扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列。 3. 一种如权利要求 1 所述的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的制备方法， 其特征在于 包括如下步骤 ： 以三角帆蚌的 cDNA 为模板， 将设计好扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作 为目的片段， 进行嵌套聚合酶链式 PCR 反应， 得到编码 LITAF 蛋白的基因全序列 ； 再通过构 建重组表达载体 pET-28a(+)-LITAF， 体外诱导 LITAF 蛋白表达 ； 最后分离纯化目的蛋白， 获 得重组的 LITAF 蛋白， 所制备得到的蛋白具有序列表中 SEQ ID NO.1 所示的来自于三角帆 蚌体内特有的。
5、LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO.2所示的来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的氨基酸序列。 4. 如权利要求 3 所述的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的制备方法， 其特征在于所述 步骤具体为 ： 1） 以三角帆蚌的 cDNA 为模板， 设计扩增 LITAF 蛋白基因的引物， 将设计好扩 增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作为目的片段， 进行嵌套聚合酶链式 PCR 反应， 得到编码 LITAF 蛋白的基因全序列 ； 2） 利用基因重组技术将 LITAF 基因片段克隆到合适 的pMD19-T载体中， 再经限制性内切酶酶切， 与经同样酶切的pET-28(a)原核表达载体。
6、相连 接， 获得表达重组载体 pET-28a(+)-LITAF ； 利用 PCR 法筛选阳性克隆， 经测序鉴定获得编码 框正确的重组表达载体 pET-28a(+)-LITAF ； 3） 取阳性重组质粒 pET-28a(+)-LITAF， 体外诱 导LITAF蛋白表达， 利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定目的蛋白 ； 4） 用亲和层析柱分离纯化目的蛋白， 获得重组的 LITAF 蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102977202 A 2 1/4 页 3 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的全序 列、 引物序列及其蛋白的制备方法 0001 技术领域 0002。
7、 本 发 明 涉 及 一 种 三 角 帆 蚌 的 脂 多 糖 诱 导 的 肿 瘤 坏 死 因 子 (Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF) 蛋白的全序列、 引物序列、 及 其蛋白的制备方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0003 脂多糖诱导的肿瘤坏死因子 因子 (Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF) 一种能调控肿瘤坏死因子 TNF-a 转录表达的转录因子， 可引起多种肿瘤细 胞发生凋亡 （Yang 等， 2012） 。 0004 我国是水产大国， 三角帆蚌等贝类养。
8、殖是我国水产养殖的支柱产业之一。三角帆 蚌不仅肉质细嫩、 营养价值高， 还具有抗癌降血脂等功效。目前国内外通过提取三角帆蚌 等贝类体内的多糖等生物活性物质， 并开发出了保健食品。但以上多为多糖等物质的混合 物， 是免疫调节产品， 并且基础研究资料少， 对肿瘤细胞的毒性作用较低， 对其功效及副作 用等所知不多。而利用基因工程技术开发的三角帆蚌中 LITAF 蛋白产品， 对人类肿瘤细胞 NCI-H446 等肿瘤细胞具有杀伤性强、 特异性高、 安全性好、 能够大量生产、 易于贮存等优点， 并具有广阔的市场前景。 0005 发明内容 0006 本发明的目的在于提供了一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因。
9、子 (Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF) 蛋白的全序列、 引物序列、 及 其蛋白的制备方法， 设计了扩增三角帆蚌中 LITAF 编码序列的寡聚核苷酸引物， 获得了三 角帆蚌中 LITAF 蛋白的全序列。 0007 为了达成上述目的， 本发明的解决方案是 ： 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的全序列， 具有序列表中 SEQ ID NO.1所示的来自于三角帆蚌体内的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO.2 所示的来自于三角帆蚌体内的 LITAF 蛋白的氨基酸序列。 0008 一种三角帆蚌的脂多糖诱导。
10、的肿瘤坏死因子蛋白的引物序列， 具有序列表中 SEQ ID NO.3 所示的用于扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列。 0009 一种脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的制备方法， 包括如下步骤 ： 以三角帆蚌的 cDNA 为模板， 将设计好扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作为目的片段， 进行 嵌套聚合酶链式 PCR 反应， 得到编码 LITAF 蛋白的基因全序列 ； 再通过构建重组表达载体 pET-28a(+)-LITAF， 体外诱导 LITAF 蛋白表达 ； 最后分离纯化目的蛋白， 获得重组的 LITAF 说 明 书 CN 102977202 A 3 2/4 页 4 蛋白。
11、， 所制备得到的蛋白具有序列表中 SEQ ID NO.1 所示的来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的核酸全序列及 SEQ ID NO.2 所示的来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的 氨基酸序列。 0010 所述步骤具体为 ： 1） 以三角帆蚌的 cDNA 为模板， 设计扩增 LITAF 蛋白基因的引 物， 将设计好扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作为目的片段， 进行嵌套聚合酶 链式 PCR 反应， 得到编码 LITAF 蛋白的基因全序列 ； 2） 利用基因重组技术将 LITAF 基因 片段克隆到合适的 pMD19-T 载体中， 再经限制性内切酶酶切， 与经同样酶切。
12、的 pET-28(a) 原核表达载体相连接， 获得表达重组载体 pET-28a(+)-LITAF ； 利用 PCR 法筛选阳性克 隆， 经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体 pET-28a(+)-LITAF ； 3） 取阳性重组质粒 pET-28a(+)-LITAF， 体外诱导 LITAF蛋白表达， 利用 Western-blot 和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 电泳方法鉴定目的蛋白 ； 4） 用亲和层析柱分离纯化目的蛋白， 获得重组的 LITAF 蛋白。 0011 本发明的有益效果为 ： 本发明设计了扩增三角帆蚌中 LITAF 编码序列的寡聚核苷 酸引物， 获得了三角帆蚌中LITAF蛋白的全。
13、序列， 从而得到的LITAF重组蛋白是利用基因工 程技术开发的三角帆蚌中LITAF蛋白产品， 对人类肿瘤细胞NCI-H446等肿瘤细胞具有杀伤 性强、 特异性高、 安全性好、 能够大量生产、 易于贮存等优点， LITAF 重组蛋白可以用于制备 新型基因工程抗癌药物， 防治人类癌症， 具有广阔的市场前景。 0012 具体实施方式 0013 实施例 1 本实施例的一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的全序列， 具有序列表中 SEQ ID NO.1 所示的来自于三角帆蚌体内的 LITAF 蛋白的核酸全序列和具有序列表中 SEQ ID NO.2 所示的来自于三角帆蚌体内的 LITAF 蛋白的氨基。
14、酸序列。 0014 一种三角帆蚌的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的引物序列， 具有序列表中 SEQ ID NO.3 所示的用于扩增 LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列。 0015 一种脂多糖诱导的肿瘤坏死因子蛋白的制备方法， 包括如下步骤 ： 1、 PCR 扩增 ： 剪取三角帆蚌的外套膜组织， 用液氮研磨后， 用 TRIzol( 上海生工， 加拿 大)法提取三角帆蚌的的总RNA， 利用反转录试剂盒(上海生工， 加拿大)进行反转录， 获得 三角帆蚌的cDNA。 以该cDNA为模板， 设计扩增LITAF蛋白基因的引物， 将设计好扩增LITAF 蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列， 所述的引物具有序列。
15、表中 SEQ ID NO.3 所示的序列作为 目的片段进行扩增 ； 进行嵌套聚合酶链式 PCR 反应， PCR 扩增反应的参数为 ： 95预变性 4 min ； 35 个循环 ： 94 30 sec, 52 30sec, 72 45 sec ； 72 10 min ； 得到编码 LITAF 蛋白的基因全序列。 0016 2. 重组表达载体 pET-28a(+)-LITAF 的构建 ： 将得到的 PCR 产物与 pMD19-T 载体 （TAKARA， 日本） 相连接， 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞 （天根生物， 德国） ， 涂布含氨苄青霉 素的 LB( 上海生工， 加拿大） 筛选平板， 挑若。
16、干个菌落进行 PCR 鉴定 ； 取一经鉴定过的阳性 克隆扩大培养， 以碱裂解法抽提质粒， 将纯化后的质粒以EcoRI 和XhoI 限制性内切酶 ( 上 海生工， 加拿大） 双酶切， 再插入经过同样双酶切的 pET-28a(+) 载体 （Novagen， 美国） 的相 应位点上， 转化大肠杆菌感受态细胞 BL21(DE3) （Novagen， 美国） 。利用 PCR 法筛选阳性克 说 明 书 CN 102977202 A 4 3/4 页 5 隆， 经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体 pET-28a(+)-LITAF。 0017 3. 重组蛋白的表达与鉴定 ： 将阳性重组质粒 pET-28a(。
17、+)-LITAF 转化表达宿主菌 BL21（DE3） （Novagen， 美国） 感受态， 涂布含卡那霉素的 LB( 上海生 工， 加拿大） 平板， 37倒置培养过夜。挑取一个单克隆菌落， 转入 LB 培养液 ( 上海生工， 加 拿大） ， 37振荡培养过夜。 取适量菌液， 按1:100的比例扩大培养至OD600为 0.4-0.5时， 将 菌液分为若干等份， 不加或分别加入 IPTG( 上海生工， 加拿大） （终浓度在 0-1.0 mmol/L） ， 继续培养8h， 离心收集菌体。 细菌经超声波裂解后， 离心分离上清液和沉淀， 再分别上样， 进 行 SDS-PAGE 电泳 （SDS- 聚丙烯酰。
18、胺凝胶电泳） 鉴定目的蛋白。 0018 4. 重组蛋白的纯化与抗体制备 ： 利用组氨酸亲和层析柱 （Novagen 公司， 美国） 对 表达产物进行分离纯化。用上述方法大量制备超声裂解的菌液， 离心分离上清液， 进行蛋 白的纯化和洗脱操作， 再进行 12% 的 SDS-PAGE 电泳鉴定， 所制备得到的蛋白具有序列表中 SEQ ID NO.1 所示的来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的核酸全序列及 SEQ ID NO.2 所示的来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的氨基酸序列。 。 0019 挑选体重约 1.5 kg 的健康新西兰白雄兔进行免疫。经过一次初始免疫和两次加 强免疫后。
19、， 颈动脉取血， 分离血清， 保存于 -80。 0020 5. 蛋白质定量与抗体效价的检测 ： 按 Brad-ford 法进行蛋白定量 (Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem.1976, 72: 248-254)。 0021 免疫后的兔抗血清用 ELISA 方法检测效价， 具体操作步骤如下 ： (1) 包被与封闭 ： 。
20、用包被缓冲液将蛋白稀释至 1-10 g/ml。在每个 聚苯乙烯酶标板 ( 上海生工， 加拿大） 的反应孔中加 0.1 ml， 4过夜。弃去孔内溶液， 用 5% 的脱脂奶粉封闭 2 h， PBST 洗 3 次， 每次 3 min。 (2) 上样 ： 加指定稀释倍数的 待检样品 ( 待检测的抗血清稀释于 PBST) 0.1 ml 于上述已包被的反应孔中， 置 37孵育 1 h， PBST 洗 3 次， 每次 3 min ( 同时做空白孔， 阴性对照孔及阳性对照孔 )。 0022 (3) 加酶标抗体 ： 于各反应孔中， 加入新鲜稀释的酶标抗体 ( 上海生工， 加拿大） 0.1ml， 37 1 h， 。
21、PBST 洗 3 次， 每次 3 min。 (4) 加底物液显色 ： 于各反应孔中加入新鲜配 制的 OPD 底物溶液 0.1 ml， 37显色10-30分钟。 (5) 终止反应 ： 于各反应孔中加入2 M反应终止液0.05 ml。 (6) 结果分析 ： 用酶标仪 490 nm 测各孔 OD 值， 大于规定的阴性 对照 OD 值的 2.1 倍， 即为阳性。计算抗体效价公式 ： ( 样本 OD 值 - 空白对照 OD 值 )/ ( 阴性对照 OD 值 - 空白对照 OD 值 )。 0023 6. Western 蛋白印迹 ： Western 蛋白印迹操作参照文献 ( Sambrook J, Rus。
22、sell DW 著 . 黄培堂等译 . 分子克隆实验指南， 第 3 版 . 北京 ： 科学出版社， 2002. (Sambrook J,Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 进行， 具体如下 ： (1) 蛋白质样品先进行 SDS-PAGE 电泳。 (2) 转膜 （电转） ： 电泳结束后将胶条割至合 适大小， 浸入转膜 缓冲液平衡 20 min。预先裁好与胶条同样大小的滤纸和 PVDF 膜， 浸入转膜缓冲液中 说 。
23、明 书 CN 102977202 A 5 4/4 页 6 15min。转膜装置的搭建 ： 按从下至上顺序依次为 ： 阴极塑料板、 3 层滤纸、 PVDF 膜、 凝胶、 3 层滤纸和阳极塑料板。滤纸、 凝胶和膜精确对齐， 每一步去除气泡， 吸干多余的液体。恒压 40V， 转移 2.5h。 0024 (3) 免疫杂交反应 ： a. 用 PBST 洗膜 3 次， 每次 10min。 b. 加入封闭液， 室温轻摇 2h。c. 弃封闭液， 用 PBST 洗膜 3 次， 每次 10min。d. 将膜转入一抗杂交液 （抗血清按预定 比例稀释于封闭液） ， 室温2 h。 阴性对照中以免疫前的血清取代一抗， 其。
24、余步骤与实验组相 同。e. 弃杂交液， 用 PBST 洗膜 3 次， 每次 10min。f. 将膜转入二抗杂交液 （辣根过氧化物酶 偶联的二抗按合适稀释比例稀释于 PBST） ， 室温轻摇 2h。g. 弃杂交液， 用 PBS 洗膜 3 次， 每 次 10min。 h. 加入显色液， 避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 0025 LITAF 重组蛋白抗肿瘤活性检测 本实施列中 LITAF 重组蛋白抗肿瘤活性检测 ：（1） NCI-H446 细胞株 （南京凯基， 中国） 悬浮生长于 RPMI1640 培养液中 , 内含 :10% 小牛血清 （四季青， 中国） 、 1mmol/L 谷胺酰胺 。
25、（四季青， 中国） 、 青链霉素 （四季青， 中国） 各 100U/L。于 37， 5%CO2 的饱和湿度孵箱中培 养 , 每 2-3d 传代 1 次， 于对数生长期时做后续实验。 （2） 将纯化的 LITAF 重组蛋白， 加入 NCI-H446 细胞中至 100ng/ml， 分别培养 24h。 （3） 离心收集细胞， 分别用以下两种方法鉴定 NCI-H446 细胞的凋亡 ： 用分别含 1g/ml 的 FITC- Annexin V（联科生物， 中国） 和 PI（联 科生物， 中国） 标记细胞， 流式细胞仪检测凋亡率 ； 用 DNA 提取试剂盒 （碧云天， 中国） 提取 DNA检测DNA la。
26、dder的形成。 三角帆蚌LITAF重组蛋白24h内平均可起近15%的NCI-H446 细胞发生凋亡， 具有很强的抗癌作用。 0026 通过本实施例设计了扩增三角帆蚌中 LITAF 编码序列的寡聚核苷酸引物， 获得了三角 帆蚌中 LITAF 蛋白的全序列， 从而得到的 LITAF 重组蛋白是利用基因工程技术开发的三角 帆蚌中LITAF蛋白产品， 对人类肿瘤细胞NCI-H446等肿瘤细胞具有杀伤性强、 特异性高、 安 全性好、 能够大量生产、 易于贮存等优点， LITAF 重组蛋白可以用于制备新型基因工程抗癌 药物， 防治人类癌症， 具有广阔的市场前景。 0027 序列表 ： SEQ ID NO。
27、.1 来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的核酸全序列 ： ATGGAGAAGTCAGGACCTCCACCAAGCTACAGTGGCCCCCCACCATCCTACCAGGGCCAAACAAGTTCGTCA ACAGTTGTATTTGCACATCAACAACCGACTTTGGTGGCAGTTCAGTTGTTTAGGGAAACACCCGTTCGAGTCACATG CCAATATTGCGGAAGTGACGTTTTCACTTCTACAATGTTTGAAACAGGAACCATCACTTGGTTGGCATGCGCAGTAA CAGCCTTCGTTGGTTGCTGGTTAGGCTGTTGTCTGATC。
28、CCGTTCTGTGTGGACGGCTGTAAGGACGTGGTCCATTCC TGTCCCAACTGTCGACAGGTGCTCAGCCGCTACGACAGAATCTAA SEQ ID NO.2 来自于三角帆蚌体内特有的 LITAF 蛋白的氨基酸序列 ： MEKSGPPPSYSGPPPSYQGQTSSSTVVFAHQQPTLVAVQLFRETPVRVTCQYCGSDVFTS TMFETGTITWLA CAVTAFVGCWLGCCLIPFCVDGCKDVVHSCPNCRQVLSRYDRI SEQ ID NO.3 LITAFf ： 5 -ATGGAGAAGTCAGGACC-3 LITAFr ： 5 -TTAGATTCTGTCGTAGCG-3 说 明 书 CN 102977202 A 6 。