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1、(10)申请公布号 CN 102994517 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994517 A *CN102994517A* (21)申请号 201210562428.6 (22)申请日 2012.12.21 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C07K 14/415(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人 鲍永美 张红生 黄骥 储瑞珍 王建飞 王州飞 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 322。
2、18 代理人 徐冬涛 傅婷婷 (54) 发明名称 一种水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1及其 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种水稻 MYB 转录因子蛋白基 因 OsMyb1 及其应用， 属于生物技术领域。该基因 的cDNA序列及其编码氨基酸序列见SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2。本发明基因 OsMyb1 为水稻中抗 稻瘟病相关的 Myb 类转录因子蛋白基因， 基因芯 片结果和 mRNA 表达分析表明该基因受稻瘟病菌 接种诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提 高了水稻对稻瘟病的抗病性。因此， OsMyb1 可作 为目的基因导入植物， 提高植物的抗病性。 (51)In。
3、t.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 1/1 页 2 1.水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1， 其特征在于该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1 所示。 2. 权利要求 1 所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 编码的水稻 MYB 转录因子蛋 白， 其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 3. 含有权利要求 1 所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的表达载体。 4. 根据权利要求 3 所述的表达载体，。
4、 其特征在于所述的表达载体是将所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 插入双元表达载体 pCAMBIA1300S 的 Kpn 酶切位点所得。 5. 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的基因工程应用。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。 7. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于包括如下步骤 ： 1） 总 RNA 的提取 选用水稻抗稻瘟病品种 “黑壳子粳” ， 待水稻幼苗长至 3-4 叶期， 用稻瘟病菌孢子 5104ml-1接种处理， 24 小时后立即取叶。
5、片液氮冷冻， 保存于 -80冰箱。取部分叶片， 用 研钵研碎， 转移入盛有 Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管， 充分振荡后， 抽提总 RNA， 电泳鉴定总 RNA 质量 ； 2） 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的克隆 以拟南芥基因 OsMyb1 序列为探针， 搜索水稻基因组序列和 EST 序列数据库， 拼接得到 858bp 水稻 Myb 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的全长序列， 并设计两端引物 ： P1:SEQ ID NO.3， P2:SEQ ID NO.4， 将步骤 1） 获得的总 RNA 反转录合成 cDNA 第一链， 以此为模板用高保真 Pfu 酶进行 P。
6、CR 扩增， PCR 程序如下 ： 94预变性 5 分钟， 94变性 45s， 56复性 1min， 72 延伸 1.5min， 35 个循环后， 72延伸 5min， 最后 Tag 酶 72保温 10min 末端加 A 后克隆至 pGEM-T 载体， 测序获得水稻 Myb 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的 cDNA 序列 SEQ ID NO.1 ； 3） 植物表达载体的构建 根据水稻 Myb 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的 cDNA 序列 SEQ ID NO.1， 设计扩增出完整 编码阅读框的引物， 并在上游引物 P3 和下游引物 P4 上都引入限制性内切酶位点 Kpn ， P3 和 。
7、P4 引物序列分别为 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 ； 以步骤 2） 中获得的 PCR 扩增产物为模板， 经 PCR 扩增后， 将 OsMyb1 的 cDNA 克隆至中 间载体pGEM-T， 利用引入的限制性内切酶位点Kpn进一步将OsMyb1克隆到双元表达载体 pCAMBIA1300S， 测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确 ； 4） 转基因植株的获得 将步骤 3） 获得的表达载体 pCAMBIA1300S 转入农杆菌， 进一步转入水稻感稻瘟病菌品 种 “苏御糯” ， 转基因植株经 PCR,Southern 杂交以及 RT-PCR 验证为阳性。将生长至 3-4 叶 。
8、期的转基因 T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理， 7 天后调查植株的病级数以及发病叶片 病斑数目和病斑长度， 与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌 转基因植株。 权 利 要 求 书 CN 102994517 A 2 1/5 页 3 一种水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及一种水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 及其应 用。 背景技术 0002 MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。 MYB结构域是一个含有 52个氨基酸的DNA结合域。 植物中的MYB类转录因子以在其N端含有一。
9、段约52个氨基酸组 成的MYB结构域为共同特征。 玉米的Clorless 1(C 1)是植物中第一个被分离鉴定的MYB转 录因子(Paz-Areset et al.,1987Paz-Ares J,Ghosal D,Wienand U(1987)The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators.EMBO J.6(12):355。
10、3-3558)， 随后， 拟南芥 （Romero et al.,1998 Romero I,Fuertes A,Benito MJ,Malpica JM,Leyva A,Paz-Ares J.More than 80 R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,14(3):273-284） 、 金鱼 草 (Waites et a1.,1998 Waites R,Selvadurai HR,Oliver IR(1998)The PHANTASTICA gene enc。
11、odes a MYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateral organs in antirrhinum.Cell,93(5):779-789)、 棉花 (Loguerico et al.,l 999Loguerico LL,Zhang JQ,Wilkins TA(1999)Differential regulation of six novel MYB-domain genes defines two distinct expression patterns in allotetraploi。
12、d cotton(Gossypium hirsutum L.).Mol Gen Genet.261:660-671), 苹果 (Takos et al.,2006 Takos AM,JaffFW,Jacob SR,Bogs J,Robinson SP,Walker AR(2006) Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples.Plant Physiol.142:1216-1232) 等植物中也分离鉴定出功能各异的 MYB 蛋 白。对 MYB 类转录因子的功能研究结。
13、果表明， MYB 蛋白主要作用有 ： 参与植物次级代谢过 程， 调节细胞形态， 参与植物对生物和非生物胁迫的应答， 在植物对激素反应中起作用， 调节植物的生物钟， 在细胞循环和增殖中起作用等 ( 刘蕾， 2008 刘蕾， 杜海， 唐晓凤 , 吴 燕民， 黄玉碧， 唐益雄 (2008)MYB 转录因子在植物抗逆胁迫中的作用及其分子机理 . 遗 传 ,30(10):1265-1271)。Vailleau 等 (2002 Vailleau F,Daniel X,Tronchet M(2002)A R2R3-MYB gene,AtMYB30， acts as a positive regulator 。
14、of the hypersensitive cell death program in plants in response to pathogen attack.PNAS 99(15):10179-10184) 发现在 AtMYB30 过量表达的拟南芥与病原细菌互作过程中表现出抗病反应， 抑制表达 AtMYB30 的拟南芥对几种病原细菌的抗性下降 ； Van 等 (2008 Van SC,Van S(2008)Plant immune responses triggered by beneficial microbesJ.Current Opinion in Plant Biology,11。
15、:443-448) 通过基因敲除的方法构建 MYB72 缺陷型拟南芥， 对假单胞菌、 寄生霜 霉、 链格孢菌、 灰霉菌的抵抗能力降低， 说明拟南芥 MYB72 在植物抗病方面起作用 ； Fekete 等(2009 Fekete C,Fung RW,Szabo Z(2009)Up-regulated transcripts in a compatible 说 明 书 CN 102994517 A 3 2/5 页 4 powdery mildew-grapevine interaction.Plant Physiol Biochem.47:732-738) 通过构 建白粉病菌诱导葡萄藤的SSH文库。
16、， 发现MYB转录因子及一些抗病相关基因的表达， 这说明 MYB可能参与葡萄藤对白粉病的防御过程。 目前， 越来越多的研究结果表明植物中MYB类转 录因子在抗病性方面的功能。 发明内容 0003 本发明的目的在于公开水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的抗病性基因工程应 用， 该基因来自水稻， 可作为目的基因导入植物， 提高植物抗病性， 进行植物品种改良。 0004 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： 0005 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1， 该基因的 cDNA 序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0006 本发明所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMy。
17、b1 编码的水稻 MYB 转录因子蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0007 含有本发明所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的表达载体。 0008 所述的表达载体优选将所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 插入双元表达 载体 pCAMBIA1300S 的 Kpn 酶切位点所得。 0009 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的基因工程应用。 0010 优选本发明所述的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 在通过基因工程手段培育 稻瘟病抗性品种中的应用。 0011 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的基因工程应用，。
18、 优选包括如下步骤 ： 0012 1） 总 RNA 的提取选用水稻抗稻瘟病菌品种 “黑壳子粳” （太湖流域粳稻地方品种） ， 待水稻幼苗长至 3-4 叶期， 用稻瘟病菌孢子 （5104ml-1） 接种处理， 24 小时后立即取叶片液 氮冷冻， 保存于 -80冰箱。取部分叶片， 用研钵研碎， 转移入盛有 Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管， 充分振荡后， 抽提总 RNA， 电泳鉴定总 RNA 质量 ； 0013 2） 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的克隆分析黑壳子粳接种稻瘟病前后的基 因芯片表达数据发现芯片探针OsAffx.21972.1.S1_at受到稻瘟病的诱导 （。
19、未发表的数据） 。 以该探针序列搜索水稻基因组序列和 EST 序列数据库， 拼接得到 858bp 水稻 MYB 转录因子 蛋白基因 OsMyb1 的全长序列， 并设计两端引物 ： 0014 P1:5-ATGGAGATGGTGCTG-3（SEQ ID NO.3） ， 0015 P2:5-TTATTGCATCTTCCATATG-3（SEQ ID NO.4） 。 0016 将步骤 1） 获得的总 RNA 反转录合成 cDNA 第一链， 以此为模板用高保真 Pfu 酶进 行 PCR 扩增， PCR 程序如下 ： 94预变性 5 分钟， 94变性 45s,56复性 1min， 72延伸 1.5min， 。
20、35个循环后， 72延伸5min， 最后Tag酶72保温10min末端加A后克隆至pGEM-T 载体， 委托上海英骏公司测序获得水稻 Myb 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的 cDNA 序列 SEQ ID NO.1 ； 0017 3） 植物表达载体的构建根据水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的 cDNA 序列 SEQ ID NO.1， 设计扩增出完整编码阅读框的引物， 并在上游引物 P3 和下游引物 P4 上均引入限 制性内切酶位点 Kpn ， P3 和 P4 引物序列为 ： 0018 P3 ： 5-GGTACCATGGAGATGGTGCTG-3（SEQ ID NO.5） ， 0。
21、019 P4 ： 5-GGTACCTTATTGCATCTTCCATATG-3（SEQ ID NO.6） ， 说 明 书 CN 102994517 A 4 3/5 页 5 0020 以步骤 2） 中获得的 PCR 扩增产物为模板， 经 PCR 扩增后， 将 OsMyb1 的 cDNA 克隆 至中间载体pGEM-T， 利用引入的限制性内切酶位点Kpn进一步将OsMyb1克隆到双元表达 载体 pCAMBIA1300S 上， 测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确 ； 0021 4） 转基因植株的获得将步骤 3） 获得的表达载体 pCAMBIA1300S 转入农杆菌， 进一 步转入水稻感稻瘟病菌品种。
22、 “苏御糯” ， 对获得的转基因植株进行 PCR,Southern 杂交以及 RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价， 将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌 孢子接种处理， 7 天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度， 与对照相比具 有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。 0022 有益效果 0023 1、 本发明公开了水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 及其所编码的蛋白质。水稻 MYB转录因子蛋白基因OsMyb1为水稻中首次报道， 基因芯片和mRNA表达分析表明该基因受 稻瘟病菌接种诱导， 转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病。
23、菌的抗性。因 此有望可作为目的基因导入植物， 提高植物抗病性， 以进行植物品种改良。 0024 2、 本发明的 OsMyb1 基因来自水稻， 具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密 码子， 其基因工程受体植物除了双子叶植物， 如大豆、 棉花、 烟草等之外更加适合于水稻、 玉 米、 小麦等单子叶植物。 0025 3、 对获得的转基因植株进行PCR， Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗 病性评价。将生长至 3-4 叶期的转基因 T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理， 7 天后调查 植株的平均病级数为2.8级， 发病叶片平均病斑数目为6.2个， 而对照植株的平均病级数为 7 级以及。
24、发病叶片平均病斑数目为 21.4 个， 结果表明， 转基因植株与对照相比表现出对稻 瘟病菌的明显抗性。 0026 4、 利用本发明 OsMyb1 基因作为目的基因构建植物表达载体， 其中可用任何一种 启动子例如花椰菜花叶病毒 (CAMV)35S 启动子、 Ubiquitin 启动子或其它启动子， 该表达载 体中必要时可包括增强子， 不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可 使用选择性标记包括具有抗生素抗性的酶， 也可利用颜色变化 （例如 - 葡糖醛酸糖苷酶 GUS） 或发光 （例如荧光素酶） 来识别的化合物的酶类， 也可用无标记选择。所用的表达载体 可使用 Ti 质粒， Ri 质。
25、粒， 植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、 基因枪法、 花粉管 通道法或其它方法转化植物。 具体实施方式 0027 实施例 1 0028 选用水稻品种 “黑壳子粳” （为太湖流域粳稻地方品种， 为抗稻瘟病菌品种） ， 待水 稻幼苗长至 3-4 叶期后， 用稻瘟病菌孢子进行接种处理， 24 小时后立即取叶片液氮冷冻， 保存于 -80冰箱。取部分叶片， 用研钵研碎， 转移入盛有 Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管 (TRIzol Reagents,购自Invitrogen,USA)， 充分振荡后， 抽提总RNA， 电泳鉴定总RNA质量。 0029 分 析 “黑 壳 子 粳”接 种 。
26、稻 瘟 病 前 后 的 基 因 芯 片 表 达 数 据 发 现 芯 片 探 针 OsAffx.21972.1.S1_at 受到稻瘟病的诱导。以该探针序列搜索水稻基因组序列和 EST 序 列数据库， 拼接得到 858bp 水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的全长序列， 并设计两端引 物 ： 说 明 书 CN 102994517 A 5 4/5 页 6 0030 P1:5 -ATGGAGATGGTGCTG-3 （SEQ ID NO.3） ， 0031 P2:5 -TTATTGCATCTTCCATATG-3 （SEQ ID NO.4） 。 0032 以总 RNA 反转录合成的 cDNA 。
27、第一链为模板用高保真 Pfu 酶 （购自 Roche） 进行 PCR 扩增， PCR 程序如下 ： 94预变性 5 分钟， 94变性 45s， 56复性 1min， 72延伸 1.5min， 35 个循环后， 72延伸 5min， 最后 Tag 酶 （购自天根公司， 北京） 72保温 10min 末端加 A 后克隆至 pGEM-T 载体 （购自 Promega） ， 委托上海英骏公司测序获得水稻转录因子蛋白基因 OsMyb1 的 cDNA 序列。 0033 分析上述获得的水稻 MYB 转录因子蛋白基因 OsMyb1 的 cDNA 序列 SEQ ID NO.1 及 其编码蛋白 SEQ ID NO。
28、.2， 存在保守结构域 Myb 结构域。 0034 实施例 2 0035 用实施例 1 中设计的引物 P1、 P2 进行半定量 RT-PCR 分析接种处理后水稻 3-4 叶 期地上部幼苗的表达， 结果表明， 接种稻瘟病菌孢子4小时后OsMyb1的表达增强， 经灰度扫 描分析， 其 mRNA 表达量为接种处理前的 30 倍， 表明 OsMyb1 基因的表达与稻瘟病菌处理有 关。 0036 实验例 3 0037 根据实施例 1 得到的 OsMyb1 的 cDNA 全长序列 ( 见 SEQ ID NO.1), 设计扩增出完 整编码阅读框的引物， 并在上游引物 P3 和下游引物 P4 上均引入限制性内。
29、切酶位点 Kpn ， P3 和 P4 引物序列为 ： 0038 P3 ： 5 -GGTACCATGGAGATGGTGCTG-3 （SEQ ID NO.5） ， 0039 P4 ： 5 -GGTACCTTATTGCATCTTCCATATG-3 （SEQ ID NO.6） , 0040 以实施例1中获得的扩增产物为模板， 以P3和P4为引物， 经PCR扩增后， 将OsMyb1 的 cDNA 克隆至中间载体 pGEM-T， 利用引入的限制性内切酶位点 Kpn 进一步将 OsMyb1 克 隆到双元表达载体 pCAMBIA1300S 上， 测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确， 再将 其转入农杆菌，。
30、 进一步转入水稻感稻瘟病菌品种 “苏御糯” （太湖流域粳稻地方品种） ， 转基 因植株经 PCR,Southern 杂交以及 RT-PCR 验证为阳性。 0041 将生长至 3-4 叶期的转基因 T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理， 按照 Mackill and Bonman （1992Mackill D and Bonman J(1992)Inheritance of blast resistance in near-isogenic lines of rice.Phytopathology 82:746-749） 的方法进行病害级别鉴定， 7 天后调查植株的平均病级数为 2.8 级， 发病。
31、叶片平均病斑数目为 6.2 个， 而对照植株的平 均病级数为 7 级以及发病叶片平均病斑数目为 21.4 个， 结果表明， 转基因植株与对照相比 表现出对稻瘟病菌的明显抗性。 0042 综上所述， 本发明人提供的 OsMyb1 基因是在水稻中分离的新基因， 其功能与水稻 抗病性相关， 可作为目的基因导入植物， 提高植物抗病性， 以进行植物品种改良。可利用本 发明 OsMyb1 基因作为目的基因构建植物表达载体， 其中可用任何一种启动子例如花椰菜 花叶病毒 (CAMV)35S 启动子、 Ubiquitin 启动子或其它启动子， 该表达载体中必要时可包括 增强子， 不论是转录增强子或翻译增强子。为。
32、了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包 括对抗生素抗性的酶， 也可利用颜色变化 （例如 B- 葡糖醛酸糖苷酶 GUS） 或发光 （例如荧光 素酶） 来识别的化合物的酶类， 也可用无标记选择。所用的表达载体可使用 Ti 质粒， Ri 质 粒， 植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、 基因枪法、 花粉管通道法或其它方法 说 明 书 CN 102994517 A 6 5/5 页 7 转化植物。 说 明 书 CN 102994517 A 7 1/4 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102994517 A 8 2/4 页 9 0003 序 列 表 CN 102994517 A 9 3/4 页 10 0004 序 列 表 CN 102994517 A 10 4/4 页 11 序 列 表 CN 102994517 A 11 。