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1、(10)申请公布号 CN 102994555 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994555 A *CN102994555A* (21)申请号 201110289008.0 (22)申请日 2011.09.15 C12P 1/02(2006.01) A61K 8/99(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) C12R 1/78(2006.01) (71)申请人 花王株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 孔凡旗 (74)专利代理机构 北京尚诚知识产权代理有限 公司 11322 代理人 龙淳 (54) 发明名称 神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促。
2、进剂 的制造方法 (57) 摘要 本发明提供一种神经酰胺和 / 或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 在含有豆渣和 糖类的培养基中培养汉逊酵母属 (Hansenula) 的 微生物， 从其上清液中获得神经酰胺和 / 或葡萄 糖神经酰胺产生促进剂。根据本发明的制造方 法， 能够利用特定微生物， 以食品加工业等的副产 物豆渣作为培养基的主原料， 从而低成本且高效 地获得神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 1/1 页 2 。
3、1. 一种神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 在含有豆渣和糖类的培养基中培养汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物， 从其上清液中 获得神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 2.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 所述汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物是多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha) 或 西弗汉逊酵母 (Hansenula ciferrii)。 3.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 所述糖类是葡萄糖。 4.如权利要求3所述的神经酰。
4、胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 所述培养基由豆渣、 葡萄糖和水构成。 5.如权利要求4所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 所述培养基中所述豆渣的含量为 8 12w/v， 所述糖类的含量为 0.8 1.2w/v。 6.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 所述培养温度为 27 35。 7.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 所述培养时间为 1 7 天。 8.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 将通过所述培养获得的培养液进行。
5、离心， 从而得到所述上清液。 9.如权利要求8所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 在离心后获得的所述上清液中加入乙醇后， 进一步经超声波处理、 离心分离、 过滤、 真 空干燥处理进行精制后， 得到神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 10. 豆渣发酵提取物用于促进神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的产生的非治疗目的的 用途， 所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生 物得到的。 11. 豆渣发酵提取物作为神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的非治疗目的的 用途， 所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养。
6、汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生 物得到的。 12. 豆渣发酵提取物在制造神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途， 所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生 物得到的。 13. 如权利要求 10 12 中任意一项所述的用途， 其中， 所述汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物是多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha) 或 西弗汉逊酵母 (Hansenula ciferrii)。 权 利 要 求 书 CN 102994555 A 2 1/8 页 3 神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法 技。
7、术领域 0001 本发明涉及利用特定微生物， 以食品加工业等的副产物豆渣作为培养基的主原 料， 制造能够促进皮肤产生神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂的方法。 背景技术 0002 神经鞘脂类之一的神经酰胺 (Ceramide) 存在于皮肤角质层中， 占角质层中 细胞间脂质的 50左右。神经鞘脂类 (Sphingolipid) 是具有鞘氨醇骨架的复合脂质 的总称。葡萄糖神经酰胺 (Glucosylceramide) 是在神经酰胺上结合了葡萄糖而成的 一种神经鞘脂类。由表皮细胞合成得到的神经酰胺暂时以葡萄糖神经酰胺或者神经 鞘磷脂 (Sphingomye。
8、lin) 的形式被储存起来 ； 之后被排出至细胞外， 在葡糖脑苷酯酶 (Glucocerebrosidase) 和神经磷脂酶 (Sphingomyelinase) 的作用下， 再次成为神经酰胺， 从而发挥作为细胞间脂质的功能。 0003 一直以来， 已知神经酰胺、 葡萄糖神经酰胺、 半乳糖神经酰胺等神经鞘脂类具有促 进角质层的保持水分能力、 改善皮肤粗糙等效果 ( 专利文献 1 2)。虽然皮肤具有产生神 经酰胺和葡萄糖神经酰胺的能力， 但是这种能力并不充分， 因而人们也尝试了从外部补充 神经酰胺的方法。但是该方法的长期效果得不到认可， 且存在稳定性低等问题。例如， 报道 了利用热带假丝酵母 (。
9、Candida tropicalis)JPCCY0004 株 (NITE P-570) 来制造葡萄糖神 经酰胺的方法 ( 专利文献 3)。但是， 该方法并不是关于神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产 生促进剂的方法， 而只不过是将培养后的菌体中大量存在的葡萄糖神经酰胺直接提取的方 法 ； 而且， 通过该方法合成得到的葡萄糖神经酰胺的神经酰胺骨架与人体中存在的神经酰 胺类的神经酰胺骨架不同， 其在两处具有碳碳双键且具有支链。 因而， 将这种葡萄糖神经酰 胺涂布在人体皮肤上的话， 有可能不能与人体皮肤相适应而产生使用安全性方面的问题。 0004 而另一方面， 如果能够增强或促进皮肤本身的神经酰胺或葡。
10、萄糖神经酰胺的产生 能力， 则无需从外部补充神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 而能够通过促进皮肤自身产生神经 酰胺或葡萄糖神经酰胺来提高皮肤的屏障功能和保湿功能。这样， 由于是由皮肤自身产生 神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 因而其不存在与皮肤的适应性不好等安全性方面的问题。 0005 因此， 近年来， 关于在皮肤角质层中以促进表皮神经酰胺产生为目的的物质的 生产研究相当热门。作为促进神经酰胺产生的物质， 已报道的有以灵芝、 蜂花粉 (Bee Pollen)、 川芎等的提取物为有效成分的神经酰胺产生促进剂 ( 专利文献 4 6)。然而， 由 于这些神经酰胺产生促进剂全都是从植物原料提取得到， 该提取操作耗。
11、费时间长， 且由于 天然资源的利用可能性有限等原因， 其制造成本高。 0006 另外， 也报道了以含有烟酸和 / 或烟酰胺的乳酸菌培养物或者酵母菌培养物为有 效成分的神经酰胺合成促进剂(专利文献7)。 然而， 从专利文献7的实施例可以看出， 不含 有烟酸和 / 或烟酰胺的乳酸菌培养物或者酵母菌培养物 ( 比较例 1 4) 的神经酰胺产生 量较之对照组并无明显变化， 因而该神经酰胺合成促进剂实质上含有烟酸和 / 或烟酰胺作 说 明 书 CN 102994555 A 3 2/8 页 4 为有效成分， 其神经酰胺合成促进效果还不够充分， 尚有改善的余地。并且， 由于使用烟酸 或烟酰胺， 因而其制造成。
12、本较高。 0007 另外， 已知汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物大多能产生乙酸乙酯， 从而增加产 品香味， 因此通常用于酿酒和食品工业。 0008 但是， 目前还没有利用汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物来制造神经酰胺和 / 或 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的报道。 0009 专利文献 1 ： 日本特开昭 61-260008 号公报 0010 专利文献 2 ： 日本特开昭 61-271205 号公报 0011 专利文献 3 ： 日本特开 2005-194240 号公报 0012 专利文献 4 ： 日本特开 2010-70499 号公报 0013 专利文献 5 ： 日本特开 2。
13、010-150237 号公报 0014 专利文献 6 ： 日本特开平 9-194383 号公报 0015 专利文献 7 ： 日本特开 2010-22217 号公报 发明内容 0016 针对上述现有技术中存在的技术问题， 本发明人进行了悉心研究， 结果发现 ： 在含 有豆渣和糖类的培养基中培养汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物， 特别是培养多形汉逊酵 母(Hansenula polymorpha)或西弗汉逊酵母(Hansenula ciferrii)， 能够低成本且高效地 获得神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 从而完成本发明。 0017 本发明涉及， 提供一种神经酰胺和 /。
14、 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中， 在含有豆渣和糖类的培养基中培养汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物， 从其上清液 中获得神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 0018 本发明还涉及， 提供豆渣的汉逊酵母属 (Hansenula) 的发酵提取物用于促进神经 酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的产生的非治疗目的的用途。 0019 本发明还涉及， 提供豆渣的汉逊酵母属 (Hansenula) 的发酵提取物作为神经酰胺 和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的非治疗目的的用途。 0020 本发明还涉及， 提供豆渣的汉逊酵母属 (Hansenula) 的发酵提取物在制造神经酰 胺。
15、和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途。 0021 发明效果 0022 根据本发明的制造方法， 能够利用特定微生物， 以食品加工业等的副产物豆渣作 为培养基的主原料， 低成本且高效地获得神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 该 促进剂能够有效提高皮肤所具有的产生神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的能力， 从而有效 提高皮肤的保湿能力。 具体实施方式 0023 ( 可以用于神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造的微生物 ) 0024 作为在本发明中使用的汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物， 可以列举出从食品领 域使用的多形汉逊酵母 (Hansenula polymor。
16、pha)、 西弗汉逊酵母 (Hansenula ciferrii)、 亚膜汉逊酵母 (Hansenula subpelliculosa)、 土星汉逊酵母 (Hansenula saturnus)、 异常 说 明 书 CN 102994555 A 4 3/8 页 5 汉逊酵母 (Hansenula anomala) 等中选出的至少 1 种微生物 ； 还包括根据通常方法得到 的这些微生物的变异株。这些微生物如下所述发挥作用， 通过在含有豆渣和糖类的培养基 中培养， 从而从其上清液中可以得到提高表皮细胞的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生 能力的物质。其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促。
17、进效果和葡萄糖神经酰胺 产生促进效果的观点出发， 优选多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha) 或西弗汉逊酵母 (Hansenula ciferrii)， 其中， 多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha) 的同物异名 / 曾用 名有 ： 安格斯毕赤酵母 (Pichia angusta)、 安格斯汉逊酵母 (Hansenula angusta)、 多形欧 加铁菌 (Ogataea polymorpha)。 0025 本发明所涉及的汉逊酵母属 (Hansenula) 的微生物都可以从中国普通微生物保 藏管理中心 (CGMCC)、 中国典型培养物保藏中心 (CCT。
18、CC)、 江南大学工业微生物资源和信息 中心 (CICIM) 等商业渠道购买得到。 0026 ( 神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法 ) 0027 本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法通过在含有豆 渣和糖类的培养基中， 培养上述微生物， 并从其上清液中获得神经酰胺和 / 或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂。该方法的具体步骤如下所示。 0028 0029 在本发明中， 优选在液体培养基中培养上述微生物中的 1 种或 2 种以上。 0030 在本发明中， 液体培养基的主要成分是豆渣和糖类。 也可以适当添加蛋白胨、 酵母 粉。 0031 由于豆渣和糖类都是容易获得。
19、的物质， 因而， 本发明的培养基具有成本低的优点。 0032 其中， 豆渣是指， 将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后， 再经粉碎、 过滤除去水 而得到的物质 ； 如上所述， 尤其可以使用食品产业中压榨豆浆后剩下的豆渣。 0033 作为糖类， 可以单独使用葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖等中的任意一种， 或者混合使用。 从 提高发酵生产性和利用性的观点出发， 其中优选葡萄糖。 0034 在本发明中， 为了提高神经酰胺产生促进效果和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进效 果， 本发明的培养基优选由豆渣、 葡萄糖和水构成， 进一步优选培养基中的豆渣的含量为 520w/v、 更优选为812w/v， 葡萄糖的含量为0。
20、.22w/v、 更优选为0.81.2w/ v。 0035 下面， 将上述这种用于制造神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的培养基 称为 “神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造培养基” 。 0036 0037 将上述微生物的菌体直接接种到神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造培 养基中。作为用于制造神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的培养条件， 从最优化 汉逊酵母属 (Hansenula) 微生物的成长所必需的温度、 时间， 以及提高神经酰胺产生促进 效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点出发， 优选在 20 40、 更优选在 27 35 的培养温度下， 培养 1 7 天。
21、， 优选培养 48 96 小时， 更优选培养 68 76 小时。 0038 0039 从上述培养获得的培养液中回收、 精制神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂， 可以根据需要， 适当地组合过滤、 离心分离、 离子交换或吸附色谱、 溶剂提取、 结晶化等 说 明 书 CN 102994555 A 5 4/8 页 6 通常的操作。具体而言， 例如， 可以通过离心分离从培养液中除去菌体， 再在超声波处理装 置中粉碎， 回收离心后的上清液。接着， 再将回收后的上清液过滤除去杂质等， 真空下干燥 处理后得到豆渣发酵提取物作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 0040 如下述实施。
22、例所示， 通过培养本发明的汉逊酵母属 (Hansenula) 微生物， 并从培 养上清液中得到的豆渣发酵提取物， 在正常人体的角化细胞中具有使神经酰胺和 / 或葡萄 糖神经酰胺的量增加的作用。 0041 因此， 通过培养本发明的汉逊酵母属 (Hansenula) 微生物并从培养上清液中得到 的豆渣发酵提取物， 可以用于促进神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生的治疗目的或非治 疗目的的使用， 也可以作为治疗目的或非治疗目的的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生 促进剂使用。非治疗目的的使用是以美容为目的的使用， 或为维持健康状态的使用等。并 且， 所述治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区。
23、分地进行的。 0042 另外， 通过培养本发明的汉逊酵母属 (Hansenula) 微生物并从培养上清液中得到 的豆渣发酵提取物， 还可以用于制造神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 0043 本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂可以作为使角质层中的神 经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺增加， 并恢复或维持皮肤的屏障功能和保湿功能的医药品、 准医药品、 化妆品等使用。 另外， 本发明的神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂也可以作为以神经酰胺产生促进或葡萄糖神经酰胺产生促进为概念的、 并根据需要标明 该概念的准医药品、 化妆品使用。 0044 作为本发明的神经酰胺和 。
24、/ 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的使用形态， 可以作为 添加到培养细胞中的添加剂， 或者制成洗净剂、 化妆品等皮肤外用剂， 根据使用方法可以以 化妆水、 乳液、 凝胶、 霜、 软膏、 粉末、 颗粒等形态提供。在配制各种皮肤外用剂时， 可以单独 地使用本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 或适当组合在洗净剂和化妆 品等皮肤外用剂中通常配合的油性成分、 保湿剂、 粉体、 色素、 乳化剂、 增溶剂、 紫外线吸收 剂、 增稠剂、 药效成分、 香料、 防菌防霉剂、 植物提取物、 醇类等使用。 0045 在将本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂添加到培养的表皮细 胞中来促进神经。
25、酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的情况下， 作为本发明的豆渣发酵提取物 ( 换 算为干燥固体成分 )， 其添加量优选为 0.0001 10w/v， 更优选为 0.001 5w/v。当添 加量大于 0.0001w/v时， 能得到充分的促进效果 ； 而当添加量小于 10w/v时， 对表皮细 胞的刺激性更小。 0046 在将本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂配合在皮肤外用剂使 用时， 从有效促进神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺的产生、 从而有效提高皮肤的保湿能力、 而且不易显示出培养物的颜色和气味的观点出发， 作为豆渣发酵提取物的干燥固体成分， 其配合量优选为皮肤外用剂总量的 0.01 。
26、20w/v， 更优选为 0.1 10w/v。 0047 实施例 0048 下面， 基于实施例对本发明进行更详细的说明， 但本发明并不限定于此。 0049 实施例 1 0050 ( 神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造 ) 0051 作为从豆渣制造神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形 汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)( 从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源 说 明 书 CN 102994555 A 6 5/8 页 7 和信息中心 CICIM， 保藏编号 CICIM Y0234)。 0052 将在 YPD(Yeast Extr。
27、act Peptone Dextrose Medium) 培养基中 30下培养后得 到的上述菌株接种到含有神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造培养基100ml的三角 烧瓶 ( 容量 300ml) 中， 在 30下培养 72 小时。该培养基含有 10w/v豆渣和 1w/v葡萄 糖。其中， 豆渣的制备通过将大豆放入水中浸泡 12 小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将吸收 了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥干来得到。 0053 然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 以 3000rpm 离心分离 10 分钟除去菌体， 回收离心分离后的。
28、上清液， 在回收后的培养上清 液中加入 2.5 倍的无水乙醇， 再用超声波处理装置 (Branson 公司制造 ) 粉碎 10 分钟， 以 3000rpm 离心分离 30 分钟， 回收上清液。用滤纸过滤该上清液约 70ml， 再在 40以下真空 干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄 糖神经酰胺产生促进剂。 0054 进而， 用 50v/v乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取物浓度为 0.1w/ v ( 本发明品 A-1) 后， 保存在 4下， 用于之后的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试 验。 0055 实施例 2 0056 作为从。
29、豆渣制造神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊 酵母 (Hansenula polymorpha)( 从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信 息中心 CICIM， 保藏编号 CICIM Y0205)。采用与实施例 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 ( 本发明品 B-1) 后， 保存在 4 下， 用于之后的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 0057 实施例 3 0058 作为从豆渣制造神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊 酵母 (Hansenula polymorp。
30、ha)( 从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信 息中心 CICIM， 保藏编号 CICIMY0257)。采用与实施例 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 进而， 用 50v/v乙醇溶解该豆 渣发酵提取物， 调整其浓度为 0.1w/v ( 本发明品 C-1) 后， 保存在 4下， 用于之后的神经 酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 0059 实施例 4 0060 作为从豆渣制造神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊 酵母 (Hansenula polymorpha)( 从江南大学购入， 并保藏于。
31、中国高校工业微生物资源和信 息中心 CICIM， 保藏编号 CICIMY0122)。采用与实施例 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 ( 本发明品 D-1)， 进而， 用 50v/ v乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 1w/v ( 本发明品 D-2)、 0.1w/v ( 本 发明品 D-3) 后， 保存在 4下， 用于之后的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 0061 实施例 5 0062 作为从豆渣制造神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊 酵母 (Hansenula polymorpha)(。
32、 从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信 息中心 CICIM， 保藏编号 CICIMY0135)。采用与实施例 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 说 明 书 CN 102994555 A 7 6/8 页 8 作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 ( 本发明品 E-1) 后， 保存在 4 下， 用于之后的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 0063 实施例 6 0064 作为从豆渣制造神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用西弗汉逊 酵母 (Hansenula ciferrii)( 从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信息 中。
33、心 CICIM， 保藏编号 CICIM Y0150)。采用与实施例 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作 为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 进而， 用 50v/v乙醇溶解该豆渣 发酵提取物， 调整其浓度为 1w/v ( 本发明品 F-1) 后， 保存在 4下， 用于之后的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 0065 实施例 7 0066 作为从豆渣制造神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊 酵母 (Hansenula polymorpha)( 从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信 息中心 CICIM， 保藏编号 CICIM。
34、Y0197)。采用与实施例 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 ( 本发明品 G-1)， 进而， 用 50v/ v乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 1w/v ( 本发明品 G-2)、 0.1w/v ( 本 发明品 G-3) 后， 保存在 4下， 用于之后的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 0067 ( 神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进试验 ) 0068 0069 首先， 活化角质化细胞 (Cascade Co.， Ltd) 作为原代细胞， 于 75cm2培养瓶中 ( 含 有生长因子的培养基 2ml)， 在 37、。
35、 CO2浓度为 5的条件下进行细胞培养， 直至培养到细 胞聚集密度(confluence)为8090。 再传代细胞至175cm2方瓶中继续培养细胞至80 90浓度。然后以 1105个细胞 /ml 传代至 12 孔板 ( 每孔容积为 2ml) 中， 继续培养细胞 至 80 90浓度。 0070 然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12 孔板中 (n 2) 分别以 20l/ 孔 的量添加上述实施例17中得到的豆渣发酵提取物的乙醇水溶液。 另外， 只添加50v/v 乙醇 ( 没有添加神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 ) 作为对照品， 相同培养条件 下培养 72 小时。培养 72 。
36、小时后， 弃去上清培养液， 用 2ml PBS( 磷酸盐缓冲液 ) 清洗细胞 两次(2ml/孔)， 再加入1ml PBS至板孔中， 以细胞收集器(细胞铲)收集细胞至试管中， 以 备后续神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。 0071 0072 脂质提取采用 Bligh&Dyer 法进行。具体而言， 首先， 在上述回收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇氯仿2.5ml1.25ml的溶剂， 振荡20分钟， 进行离心分离(3000rpm， 5 分钟 )， 从而得到上清液和沉淀。将上清液 A 转移至另外试管中用于神经酰胺 / 葡萄糖神 经酰胺量的分析， 将沉淀 B 用于蛋白质含量的分析。 0073 。
37、0074 为了表征细胞中的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量分析。在上述 回收的沉淀 B 中加入 900l 的 SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 溶液并进行混合， 在 60水浴下加 热 2 小时使蛋白质变性降解， 冷却后在其中添加 100l 的 2N HCl 溶液， 按照 BCAKit(BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ) 法测定其中蛋白质的量 ( 记为 Pro， 单位为 g/ml)。 说 明 书 CN 102994555 A 8 7/8 页 9 0075 0076 在残留的上清液 A 中加入 PBS 氯仿 1.25ml 1.25ml 的溶剂， 振动 20 分钟， 3000rpm进行离心分。
38、离5分钟， 分离、 回收作为下相的氯仿层， 并在30、 氮气保护下干燥氯 仿层40分钟得到干燥品， 加入100l的氯仿甲醇2.5ml1.25ml的溶剂， 并用下述薄 板层析 (TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 ( 分别记为 Cer 和 GlyCer， 单位为 g/ ml) 进行定量。 0077 采用干燥 TLC 板， 以氯仿甲醇醋酸 (190 9 1v/v/v) 为展层剂进行薄板 层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂 ； 重复以上步骤一次。然后以氯仿甲 醇丙酮(76204v/v/v)为展层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。。
39、 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于180烘烤板上烘烤 7 分钟显色。扫描显色 TLC 板并进行神经酰胺 ( 或葡萄糖神经酰胺 ) 分析。 0078 然后， 根据下述公式 (1)， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro。以对照品的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro 为 1， 求出本发明的 Cer/Pro 和 GlyCer/ Pro 的相对值。并且， 以对照品每孔中的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄 糖神经酰胺的量 ( 分别记为 Cer/Well 和 GlyCer/Well， 相对于对照品的相对量 )。一并在 表 。
40、1 中表示。 0079 公式 (1) 0080 Cer/Pro 神经酰胺量 (g/ml)/ 蛋白质含量 (g/ml) 0081 GlyCer/Pro 葡萄糖神经酰胺量 (g/ml)/ 蛋白质含量 (g/ml) 0082 表 1 0083 0084 如表1所示， 实施例2中得到的本发明品既具有神经酰胺产生促进效果， 又具有葡 萄糖神经酰胺产生促进效果 ； 另外， 实施例 1、 实施例 3 以及实施例 6 中得到的本发明品的 神经酰胺产生促进效果显著， 而实施例 4 以及实施例 7 中得到的本发明品的葡萄糖神经酰 胺产生促进效果显著。因此， 确认了本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
41、 说 明 书 CN 102994555 A 9 8/8 页 10 具有神经酰胺产生促进效果和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 0085 ( 本发明的神经酰胺和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神经酰胺和葡萄 糖神经酰胺的试验 ) 0086 不经过细胞培养， 直接采用 TLC 法对上述实施例 1 7 中得到的神经酰胺和 / 或 葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明品中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰 胺存在。 0087 由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 但具有神经 酰胺产生促进效果和 / 或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 / 或葡萄糖 神经酰胺产生促进剂使用。 说 明 书 CN 102994555 A 10 。