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1、(10)申请公布号 CN 102993307 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102993307 A *CN102993307A* (21)申请号 201110266695.4 (22)申请日 2011.09.09 C07K 16/46(2006.01) C07K 16/18(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (71)申请人 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公 司 。
2、地址 215000 江苏省苏州市工业园区钟南街 502 号 申请人 苏州大学 (72)发明人 费敏 阮长耿 杨剑峰 (54) 发明名称 抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体 (57) 摘要 本发明公开了抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌 合抗体， 包括嵌合抗体成熟轻链和嵌合抗体成熟 重链， 所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序 列表中序列 2 的自氨基末端第 453 666 位氨基 酸残基， 所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为 序列表中序列 2 的自氨基末端第 1 452 位氨基 酸残基。本发明还公开了所述嵌合抗体的制备方 法及其浓度效果分析。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 。
3、页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体， 包括嵌合抗体成熟轻链和嵌合抗体成熟重链， 其特征在于所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第453 666 位氨基酸残基， 所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为序列表中序列 2 的自氨基末端 第 1 452 位氨基酸残基。 2.根据权利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Ib嵌合抗体， 其特征在于所述嵌合抗体 为由序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 3. 根据。
4、权利要求 1 或 2 所述抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体的编码基因。 4. 根据权利要求 3 所述的编码基因， 其特征在于所述编码基因的核苷酸序列是序列表 中的序列 1。 5. 含有权利要求 3 所述编码基因的重组表达载体或表达盒。 6. 含有权利要求 3 所述编码基因的转基因细胞系。 7. 含有权利要求 3 所述编码基因的重组菌。 权 利 要 求 书 CN 102993307 A 2 1/4 页 3 抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体 技术领域 0001 本发明涉及生物技术嵌合抗体领域， 具体的说是抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合 抗体。 背景技术 0002 血小板 GPIb 是一种血小板。
5、特异性膜糖蛋白， 以 GPIb-IX-V 复合物的形式存在， 该复合物包含四个亚单位， GPIb， GPIb， GPIX 和 GPV， 以 2 4 2 1 的比例组成。它 们都是 I 型跨膜糖蛋白， 包括胞外区， 跨膜区和胞浆区。GPIb 与 GPIb 之间以二硫键的 形式共价连接组成 GPIb， GPIb 与 GPIX， GPV 以非共价键的形式连接形成 GPIb-IX-V 复合物。 GPIb是该复合物中主要的配体结合亚单位。 当血管受损时， 血小板膜表面受体GPIb在 高剪切力条件下与血浆 VWFA1 结构域结合， 同时 VWF 的 A3 结构域与血管损伤部位暴露的内 皮下基质主要是胶原结。
6、合， 从而在 VWF 的桥联作用下实现血小板的初始黏附。此外， VWF 结 合 GPIb 后引发一系列血小板细胞内信号传递， 最终使血小板整合素受体 GPIIb/IIIa 活 化， 引起血小板聚集， 形成血栓。而动脉血栓引起的中风、 心肌梗死等血栓栓塞性疾病是我 国最常见的死亡病因之一， 且其发病率仍在不断上升。目前临床应用的阿司匹林和氯噼格 雷是第一代抗血小板药物， GPIIb/IIIa 抑制剂为第二代抗血小板药物。虽然这些药物对于 改善动脉血栓引起的血栓栓塞性疾病有着巨大的贡献， 但是， 仍然有相当一部分病人用了 这类药物之后不能改善缺血性症状。 另外， 潜在的出血并发症也限制了这些药物的。
7、应用。 血 小板黏附是动脉血栓形成的早期必经阶段， 阻断 GPIb 与 VWF 的结合， 抑制血小板的初始 黏附， 被认为能够有效抑制血栓形成， 并且能够降低出血倾向。Deckmyn 等报道在狒狒股动 脉狭窄血栓模型的体内实验中应用抗血小板 GPIb 单克隆抗体 6B4-Fab 剂量为 0.6mg/kg 时可以明显减少单位时间内周期性血流减低发生的次数， 还明显抑制血小板在 I 型胶原上 的沉积 (700-1000/s)。2mg/kg 的 6B4-Fab 可以完全抑制周期性血流减低的发生， 而无出血 时间的延长。因此， 抗 GPIb 单克隆抗体具有良好的抗血栓应用前景。 0003 但是目前市面。
8、上的抗血小板 GPIb 单克隆抗体大多还是鼠源性抗体， 由于鼠源 性抗体应用到人体后可能出现人抗鼠抗体反应， 因此逐渐被人源化抗体所取代， 这是单抗 发展的趋势。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种人源化的抗血小板 GPIb 单克隆抗体及其制备方法。 0005 本发明提供的抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体， 包括嵌合抗体成熟轻链和嵌 合抗体成熟重链， 所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序列表中序列 2 的自氨基末端第 453666位氨基酸残基， 所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基 末端第 1 452 位氨基酸残基。 0006 上述抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗。
9、体为如下 1) 或 2) 所示蛋白质 ： 0007 1) 由序列表中序列 2 所示氨基酸序列组成的蛋白质 ； 说 明 书 CN 102993307 A 3 2/4 页 4 0008 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和 / 或添加具有抗人血小板膜糖蛋白 Ib 功能的由 1) 衍生的蛋白质。 0009 上述抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。 0010 所述抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体的编码基因为如下 1) 3) 中任一所述 的基因 ： 0011 1) 其核苷酸序列是序列表中的序列 1 ； 0012 2)在严格条件。
10、下可与序列表中的序列1限定的DNA序列杂交且编码上述任一抗体 的 DNA 分子 ； 0013 3) 与 1) 的基因具有 90以上同源性且编码上述任一抗体的 DNA 分子。 0014 含有上述抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体编码基因的重组表达载体、 试剂盒、 转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。 附图说明 0015 附图是本发明嵌合抗体及其 Fab 片段体外抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集分 析图。其中 (A)(f) 富血小板血浆与 10g/ml chSZ2 ； (g) 富血小板血浆与 10g/ml 鼠源 SZ2 ； (h) 富血小板血浆与 10g/ml 人 IgG(B)chSZ2Fa。
11、b 呈剂量依赖型抑制瑞斯托霉素诱导 的血小板聚集 (a 至 e 代表 0.5， 1， 2， 5， 10g/ml chSZ2Fab 片段 ). 具体实施方式 0016 下面结合附图， 对本发明作进一步说明。 0017 实施例 1 ： 抗人血小板膜糖蛋白 Ib 嵌合抗体的获得 ： 0018 一、 引物设计和合成， 0019 实验中所涉及的引物除了试剂盒提供的以外， 均为 Invitrogen 公司合成。 0020 HGSP1 GTCCACCTTGGTGCTGCTGGCCGGGTG KGSP1 ACTTGACATTGATGTCTTTG HGSP2 GCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC KG。
12、SP2 CACGACTGAGGCACCTCCAG 5 RACE Outer Primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 5 RACE Inner Primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG SZ2HR GCGGCTAGCCACCATGACATTGAACATGCTG SZ2HF GCGGGCCCTTGGTGGAGGCTAAGGAGACGGTGACAG SZ2KR GCGATATCATGAGGGTCCTTGCTGAG 说 明 书 CN 102993307 A 4 3/4 页 5 SZ2KF CACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTG。
13、GTC 0021 二、 mAb SZ2V 区基因的克隆与测定， 0022 以分泌鼠源单克隆抗体 SZ2 的杂交瘤细胞的总 RNA 为模板， 采用大连 Takara 公司 的 5 快速扩增 cDNA 末端试剂盒进行 VH 和 VL 基因的克隆。概括来说， 抽提杂交瘤细胞总 RNA， 对 RNA 5 去帽子反应， 然后 5 加磷酸基团， 之后在 5 端加上接头 RNA， 完成对 RNA 的 加工处理。 0023 VH 基因的克隆 ： 以上述加工过的 RNA 为模板， HGSP1 为逆转录引物， 合成第一链 cDNA， 然后以 HGSP2 和 5 RACE Outer Primer 一对引物 PCR。
14、 扩增 10 个循环， 然后以该 PCR 产物为模板， 以 HGSP2 和 5 RACE Inner Primer 为引物 PCR 扩增 20 个循环， PCR 产物经 1 琼脂糖凝胶电泳后， 切下目的条带， 回收， 与 pMD-18T 载体 ( 大连 Takara) 连接， 转化 TOP10 感受态细菌， 涂布于带有氨苄青霉素抗性的 LB 平板上。37培养过夜， 第二天挑取 5 个单 菌落， 送测序公司测序鉴定。 0024 VL 基因的克隆 ： 以前述加工过的 RNA 为模板， KGSP1 为逆转录引物， 合成第一链 cDNA， 然后以 KGSP2 和 5 RACE Outer Primer。
15、 一对引物 PCR 扩增 10 个循环， 然后以该 PCR 产物为模板， 以 KGSP2 和 5 RACE Inner Primer 为引物 PCR 扩增 20 个循环， PCR 产物经 1 琼脂糖凝胶电泳后， 切下目的条带， 回收， 与 pMD-18T 载体 ( 大连 Takara) 连接， 转化 TOP10 感受态细菌， 涂布于带有氨苄青霉素抗性的 LB 平板上。37培养过夜， 第二天挑取 5 个单 菌落， 送测序公司测序鉴定。 0025 三、 人 - 鼠嵌合抗体表达质粒的构建， 0026 SZ2的VH和VL基因经测序鉴定后， 与NCBI的免疫球蛋白数据库比对序列， 确认为 免疫球蛋白可变。
16、区序列。 然后根据所得的VH序列， 设计合成了扩增VH的SZ2HF和SZ2HR一 对引物， 以克隆有 VH 的 pMD-18T 质粒为模板， 扩增 VH 序列， 经 Nhe I/Apa I 双酶切后克隆 入 pIDH 表达载体中， 成为 pID-SZ2H 表达载体。同样， 以测序所得的 SZ2VL 序列设计合成了 SZ2KF 和 SZ2KR 一对引物， 以克隆有 VL 的 pMD-18T 质粒为模板， PCR 扩增 VL 序列， 经 EcoR V/BsiWI 双酶切后克隆入 pIDL 表达载体中， 成为 pID-SZ2K 表达载体。pIDH 和 pIDL 表达载 体为本单位自己构建保有， 两个。
17、载体都是以pcDNA3为架构， 分别带有人IgG1重链恒定区和 kappa 轻链恒定区编码序列， 同时都带有从中国仓鼠卵巢细胞 CHO 中克隆的二氢叶酸还原 酶基因 (DHFR) 编码序列。 0027 四、 CHO 细胞的转染和筛选， 0028 CHO-dhfr- 细胞培养在 IMDM+7胎牛血清 +HT 的培养基中， 转染前一天接种 2106细胞于 10cm 细胞培养平皿， 第二天换 10ml 新鲜的完全培养基， 3h 后转染。 0029 A 管 ： pIDH-SZ2 和 pIDL-SZ2 各 10g 于 300l IMDM ； 0030 B 管 ： lipofectamine2000 50。
18、l 于 300l IMDM， 0031 室 温 放 置 5min 后 将 A 和 B 两 管 溶 液 充 分 混 匀， 静 置 30min 后， 逐 滴 加 入 CHO-dhfr-细胞培养上清中。转然 36h 后， 收集培养上清备检测， 细胞用 PBS 洗涤 2 次后加 入 1ml 胰酶， 37孵育 1min 后弃去胰酶， 加入 IMDM+7透析的胎牛血清 +10nM MTX， 吹打细 胞使细胞悬浮， 细胞计数， 调整细胞浓度， 按 4000 个细胞 / 孔加入 96 孔细胞培养板， 37， 5 CO2培养箱中培养， 每 5 天换液， 直至细胞克隆形成。为了筛选到高表达细胞克隆， 细胞 说 明。
19、 书 CN 102993307 A 5 4/4 页 6 从 10nM MTX 压力开始下， 20nM， 50nM 逐步加压至 100nM。 0032 五、 表达产物的 ELISA 检测， 0033 羊抗人 IgG1 多克隆抗体 10g/ml 包被 96 孔板， 4过夜， 第二天弃包被液， 用 PBST 洗涤 2 次， 加入 200l 2 PBST-BSA 溶液， 37， 2h 封闭。弃封闭液， 拍干 ELISA 板。 加入细胞培养上清， 以已知浓度的商品化人 IgG1 标准品做对照， 37反应 1h， PBST 洗涤 5 次， 加入 100l 辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgG 抗体， 37反。
20、应 1h， PBST 洗涤 5 次， 加入 100l TMB， 37反应 10min 后加入 50l 2N 的 H2SO4终止反应。测 OD450 读数。以标准 品的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标拟合标准曲线， 根据标准曲线计算细胞培养上清中嵌合 抗体的浓度。 0034 六、 嵌合抗体的纯化， 0035 收集细胞无血清培养上清， 12,000rpm， 离心 30min 去除细胞碎片。HiTrap rProtein A FF 柱先用 20mM 的磷酸钠缓冲液 (pH 7.0) 平衡， 然后细胞培养上清用恒流泵 以 0.5ml/min 的速度过柱。上清全部上柱后再用 5 倍柱体积的磷酸钠缓冲液洗。
21、涤出去未 结合的蛋白质。Protein A 结合的嵌合抗体用 0.1M 的柠檬酸钠洗脱液 (pH 3.0) 洗脱， 每 0.5ml 洗脱液加入至预先放有 100l 1M Tris-Hcl(pH9.0) 中， 使抗体溶液的 pH 在 7.0 左 右。分光光度计测定每管中溶液的 OD280 值， 选取 OD280 值大于 0.2 的溶液， 合并。转移至 透析袋中， 在 PBS 缓冲液中 4透析 3 小时后换新鲜的 PBS， 继续透析过夜。测定 OD280 值， 以 OD280/1.35 计算抗体浓度 (mg/ml)。 0036 七、 嵌合抗体 Fab 片段的制备， 0037 100l 纯 化 的 。
22、SZ2 嵌 合 抗 体 2mg/ml，加 入 100l 0.02mg/ml papain suspension(0.02M EDTA， 0.02M cysteine 在 PBS 中 )， 37孵育 2h。加入 20l 的 0.3M 碘 乙酰胺终止反应。在 PBS 缓冲液中透析过夜， 然后再过 protein A 柱， 收集穿透液， 结合在 Protein A 柱上的蛋白样品用 0.1M 的柠檬酸钠洗脱液洗脱。OD280 分别测定穿透液和洗脱 液中的蛋白含量。 0038 八、 嵌合抗体及其 Fab 片段体外抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集分析， 0039 正常人全血以 0.38 ( 终浓度 ) 枸。
23、橼酸钠抗凝， 以 1000rpm 离心 10min， 吸取富含 血小板的血浆 (platelet-rich plasma， PRP)， 下层液继续以 3,000rpm 离心 10min， 吸取上 层血浆为(platelet-poor plasma， PPP)。 计数PRP中血小板的浓度， 用PPP调整血小板浓度 至3108/ml。 取235l PRP加入10l抗体(0.25mg/ml)预孵育5min， 然后加入6.25l 的 50mg/ml 瑞斯托霉素， 在 1,000rpm 转子搅拌下， 记录血小板的聚集。分析数据见附图。 说 明 书 CN 102993307 A 6 1/5 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102993307 A 7 2/5 页 8 0003 序 列 表 CN 102993307 A 8 3/5 页 9 0004 序 列 表 CN 102993307 A 9 4/5 页 10 0005 序 列 表 CN 102993307 A 10 5/5 页 11 序 列 表 CN 102993307 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102993307 A 12 。