《一种枇杷细胞悬浮培养液及悬浮培养方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种枇杷细胞悬浮培养液及悬浮培养方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102994443 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994443 A *CN102994443A* (21)申请号 201210457733.9 (22)申请日 2012.11.14 C12N 5/02(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (71)申请人 福建省亚热带植物研究所 地址 361012 福建省厦门市嘉禾路 780 号 (72)发明人 李惠华 刘小英 苏明华 王伟 常强 陈淳 徐剑 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 张松亭 (54) 发明名称 一种枇杷细胞悬浮培养液及悬。
2、浮培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种枇杷细胞悬浮培养液 及悬浮培养方法。其中， 培养液包括 ： MS 基本 培 养 基， 2,4-D0.5-6.0mg/L ； NAA0.5-6.0mg/L ； IBA0.5-6.0mg/L ； KT 0-4.0mg/L ； BA0-4.0mg/L ； 蔗糖1-3.5% ； pH4.0-6.5。 培养方法为愈伤组织在 该培养液中培养。本发明建立了枇杷细胞液体培 养体系， 采用本发明最佳方式培养， 枇杷细胞培养 物中熊果酸的得率为 36.49mg/gDW。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家。
3、知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种用于枇杷细胞悬浮培养的培养液， 包括 ： MS 基本培养基 ； 2,4-D 0.5-6.0mg/L ； NAA 0.5-6.0mg/L ； IBA 0.5-6.0mg/L ； 6-BA 0-4.0mg/L ； KT 0-4.0mg/L ； 蔗糖 1-3.5% ； pH 4.0-6.5。 2. 一种用于枇杷细胞悬浮培养的培养液， 其特征在于， MS 基本培养基 +0.5mg/L NAA+3% 蔗糖 +PH 6.0。 3. 一种枇杷细胞悬浮培养方法， 包括如下步骤 ： （1） 培养获取枇杷。
4、愈伤组织 ； （2） 提供权利要求 1 或 2 的枇杷细胞悬浮培养液 ； （3） 愈伤组织在悬浮培养液中进行悬浮培养 ； （4） 收获细胞， 提取熊果酸。 4. 一种枇杷细胞悬浮培养方法， 细胞悬浮培养基配方为 ： MS 基本培养基 +0.5mg/L NAA+3% 蔗糖 ,pH 值为 6.0 ； 外界调控条件为 ： 光照条件为 400Lux， 12h/d， 采用 250ml 的三角 瓶装液 100ml， 接种量为 40-60g/LFW， 摇床转速为 130r/min， 采用透气膜封口， 培养 18 天 收获。 权 利 要 求 书 CN 102994443 A 2 1/7 页 3 一种枇杷细胞悬。
5、浮培养液及悬浮培养方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地涉及枇杷细胞悬浮培养方法。 背景技术 0002 熊果酸是枇杷叶中最重要的次生代谢物质， 被中国医药科学院肿瘤医院实验证明 有望成为低毒、 有效的新型天然抗癌药物 , 市场十分紧缺。目前产品多从枇杷叶片进行有 机提取， 成本高。提取方法可见 CN200710008809.9、 200910154645.X、 201210057030.7 等。 0003 现有技术中主要集中在 ： 对枇杷的愈伤组织培养和无性快繁体系的建立 ； 对枇杷 叶活性成份的提取及其药理研究。 植物细胞悬浮培养途径生产次生代谢产物是目前中药生 产中的重。
6、要技术路线， 但目前在枇杷研究中， 尚无建立悬浮培养体系以提取熊果酸等三萜 类化合物的报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种枇杷细胞悬浮培养方法， 来生产天然熊果酸， 以解决 现有技术中存在的上述问题。 0005 本发明提供的技术方案如下 ： 0006 技术方案一 ： 0007 一种用于枇杷细胞悬浮培养的培养液， 包括 ： 0008 MS 基本培养基 0009 2,4-D（2,4- 二氯苯氧基乙酸） 0.5-6.0mg/L ； 0010 NAA（a- 萘乙酸） 0.5-6.0mg/L ； 0011 IBA（吲哚丁酸） 0.5-6.0mg/L ； 0012 6-BA（6- 苄氨基嘌。
7、呤） 0-4.0mg/L ； 0013 KT（kinetin， 激动素） 0-4.0mg/L ； 0014 蔗 1-3.5%（重量比） ； 0015 pH 4.0-6.5。 0016 本发明中最佳的培养液方案为 ： MS 基本培养基 +0.5mg/L NAA+3% 蔗糖 +PH 6.0 0017 技术方案二 ： 0018 一种枇杷细胞悬浮培养方法， 包括如下步骤 ： 0019 （1） 培养获取枇杷愈伤组织 ； 0020 （2） 提供前述的枇杷细胞悬浮培养液 ； 0021 （3） 愈伤组织在悬浮培养液中进行悬浮培养 ； 0022 （4） 收获细胞， 提取熊果酸。 0023 在本发明的较佳实施例中。
8、， 用于悬浮培养的愈伤组织为淡黄色、 生长状态良好、 质 地疏松的枇杷幼胚诱导而来的愈伤组织。获得愈伤组织可以采用现有技术。继代 5 次后， 转入悬浮培养。 说 明 书 CN 102994443 A 3 2/7 页 4 0024 一种枇杷细胞悬浮培养方法， 细胞悬浮培养基配方为 ： MS 基本培养基 +0.5mg/L NAA+3% 蔗糖 ,pH 值为 6.0 ； 外界调控条件为 ： 光照条件为 400Lux （12h/d） ， 采用 250ml 的三 角瓶装液 100ml， 接种量为 40-60g/LFW， 摇床转速为 130r/min， 采用透气膜封口， 培养 18 天收获。 0025 由于。
9、传统的枇杷叶熊果酸提取方法存在多种局限性， 本发明提供了用于枇杷细胞 悬浮培养的培养液以及培养方法。 本发明以枇杷幼胚为材料， 进行优良愈伤组织的诱导， 优 良愈伤组织经过多次继代培养转入液体培养基， 继而进行悬浮培养条件的筛选同时检测目 标产物熊果酸的含量， 从而建立了枇杷愈伤组织悬浮培养体系， 为通过枇杷细胞悬浮培养 提取熊果酸的产业化生产奠定基础。 其中， 采用最佳方式培养， 枇杷细胞培养物中熊果酸的 得率为 36.49mg/gDW。比目前洪燕萍文献报道中枇杷叶 （南亚枇杷） 中最高熊果酸的含量 （14.01mg/gDW） 提高了约 160.46%。 附图说明 0026 图 1 为本发明。
10、实施例中枇杷细胞悬浮培养生长曲线及熊果酸含量图。 具体实施方式 0027 试验材料 ： 枇杷幼果， 采自福建省莆田市果树研究所。 0028 枇杷细胞有效成分熊果酸的提取方法为现有技术超声波萃取法， 具体为 ： 溶剂为 95% 乙醇， 料液比 1 ： 30（g/ml） ， 超声波萃取， 萃取温度 40， 萃取频率为 25KHZ， 萃取功率 260W， 提取次数 1 次， 超声时间 40min。用液相色谱 （HPLC） 测定。 0029 实施例 1 枇杷愈伤组织的获得 0030 采用现有技术， 从枇杷幼果诱导获得， 诱导培养基为 MS 基本培养基 +1mg/ L2,4-D+0.5mg/L KT+ 。
11、蔗糖 2%+6.8g/L 琼脂粉， PH 5.8， 25， 黑暗培养， 同一培养基及培养 条件继代培养 5 次后， 转入悬浮培养。 0031 枇杷细胞悬浮培养体系的建立及培养方法 0032 材料 ： 选取固体培养基上淡黄色、 生长状态良好、 质地疏松、 枇杷幼胚诱导而来的 胚性愈伤组织。以原有固体培养基配方及培养条件 （实施例 1 中， 诱导培养基为 MS 基本培 养基 +1mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+ 蔗糖 2%， PH 5.8， 25， 黑暗培养， 摇床转速 110r/min） 连 续继代 5 代以上， 获得均一的悬浮液， 以进行后续的调控研究 （实施例 2-9） 。调控研。
12、究中所 采用的培养液配方及培养条件为 :MS 基本培养基 +1mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+ 蔗糖 2%， PH 5.8， 25， 黑暗培养 , 摇床转速 110r/min, 考察某个因素时 , 固定其它因素来研究。 0033 主要考察指标 ： 悬浮培养物鲜重比生长速率、 熊果酸含量。 0034 0035 熊果酸以超声波萃取， 含量用液相色谱 （HPLC） 测定 0036 实施例 2 激素对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0037 表 12,4D 对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0038 说 明 书 CN 102994443 A 4 3/7 页 5 处理号2,4-D（m。
13、g/L）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 10.5162.1111.68 21.0147.588.37 32.0148.756.84 44.0111.085.34 56.092.407.83 0039 结论 ： 2,4-D 0.5 较适宜枇杷细胞悬浮培养 0040 表 2NAA 对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0041 处理号NAA（mg/L）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 10.5257.6136.49 21.0272.8030.52 32.0286.2128.00 44.0280.9629.02 56.0271.0428.63 0042 结论 ： NAA。
14、0.5 适合用于枇杷细胞悬浮培养 0043 表 3IBA 对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0044 处理号IBA（mg/L）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 10.529.0610.53 21.024.2810.84 32.044.2610.39 44.056.859.75 56.059.1310.56 0045 结论 ： 生长素 IBA 各范围都不适宜枇杷细胞悬浮培养， 试验范围内， IBA6.0 相对适 宜。 0046 表 4BA 对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0047 说 明 书 CN 102994443 A 5 4/7 页 6 处理号BA（mg/L）鲜重比生。
15、长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 10-4.5922.10 20.25-5.7322.14 30.53.3220.93 41.013.0624.75 52.025.3223.21 64.051.4724.88 0048 结论 ： BA2.0 可用于枇杷细胞悬浮培养 0049 表 5KT 对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0050 处理号KT（mg/L）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 1028.7017.00 20.2528.4721.03 30.544.2120.50 0051 41.051.55 21.05 52.071.16 22.95 64.082.96 24.。
16、98 0052 结论 ： KT4.0 适宜枇杷细胞悬浮培养 0053 小结 ： 单因子激素调控综合比生长速率以及熊果酸含量， 以 NAA0.5mg/L 为宜。 0054 实施例 3PH 值对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0055 选定基本培养基和适宜激素配比后， 观测液体培养基中不同的 pH 值对悬浮培养 细胞生长和熊果酸含量的影响。 0056 表 6pH 值对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0057 处理号PH鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 14218.7812.24 24.5192.4311.83 说 明 书 CN 102994443 A 6 5/7 页 7 35。
17、239.8811.57 45.5228.8212.09 56261.7213.23 66.5217.4711.67 0058 结论 ： 枇杷细胞悬浮培养在PH4.0-6.5范围内均可生长， 但以PH6.0为最佳PH值。 实施例 4 光照对悬浮培养细胞生长和右旋龙脑含量的影响 0059 光照对细胞悬浮培养可能有较大的影响， 因此对悬浮培养系的光照条件进行研 究。 0060 选取 0、 400、 1000、 2000 和 4000Lux 的光强对培养物 12h/d 照射 （模拟自然） ， 以筛 选出有利最佳光照条件。 0061 表 7 光照条件对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0062 处理号。
18、光照强度 （lux）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 10301.4211.85 2400336.1117.18 31000265.2812.14 42000203.6413.33 54000180.3114.03 0063 结论 ： 400lux 光照条件较为适宜。 0064 实施例 5 接种量对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0065 对任何悬浮培养的细胞系， 都有它生长适合的密度。在 250ml 三角瓶中， 每瓶装入 100ml 培养液， 观测不同接种量对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响。 0066 表 8 接种量对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0067 处理号。
19、接种量 （g/100ml）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 12108.138.38 24243.2511.85 36242.6715.62 48239.0016.90 说 明 书 CN 102994443 A 7 6/7 页 8 510182.8015.91 612147.9216.94 0068 结论 ： 接种量 8g/L 最适宜枇杷细胞悬浮培养 0069 实施例 6 摇床转速对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0070 将培养物分别置于 50、 70、 90、 110、 130、 150、 170r/min 的旋转式摇床上进行悬浮 培养， 观测摇床转速对悬浮培养细胞生长和。
20、熊果酸含量的影响。 0071 表 9 摇床转速对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0072 0073 结论 ： 摇床转速 130rpm/min 最适合枇杷细胞悬浮培养。 0074 实施例 7 收获时间对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0075 分别于培养后的第 18 天收获， 观测收获时间对悬浮培养愈伤组织、 细胞生长和熊 果酸含量的影响。结果见图 1。 0076 由图 1 可见， 培养物的生长曲线基本呈现 S 型， 7-15d 为生长对数期， 15d 后进入 生长平台期， 生长周期内， 熊果酸的含量先下降后上升， 熊果酸的含量也是在 15d 后大量积 累。 0077 实施例 8 装液量。
21、对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0078 材料以 250ml 的培养瓶培养， 新旧培养基的比例固定为 1:1。 0079 表 10 装液量对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0080 处理号装液量 （ml）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 140255.4211.21 270287.399.22 3100308.998.26 说 明 书 CN 102994443 A 8 7/7 页 9 4130227.909.62 516078.849.13 0081 结论 ： 250ml 的培养瓶以 100ml 的装液量为佳。 0082 实施例 9 蔗糖含量对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0083 表 11 蔗糖含量对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响 0084 处理号蔗糖含量 （%）鲜重比生长速率 (%)熊果酸含量 (mg/g) 11.0191.616.34 21.5167.516.88 32.0210.926.90 42.5200.806.63 53.0230.897.57 63.5190.417.22 0085 结论 ： 蔗糖含量以 3% 为最适合。 说 明 书 CN 102994443 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102994443 A 10 。