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1、(10)申请公布号 CN 102993298 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102993298 A *CN102993298A* (21)申请号 201210544015.5 (22)申请日 2012.12.14 C07K 14/81(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (71)申请人 成都蓉生药业有限责任公司 地址 610041 四川省成都市高新区起步园科 园南路 7 号 (72)发明人 蔡骏 李泽林 刘波 初毅波 邓红 吴强 (74)专。
2、利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 全学荣 (54) 发明名称 一种制备 1- 抗胰蛋白酶的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种制备 1- 抗胰蛋白酶的 方法， 它包括如下步骤 ： a. 沉淀溶解 b.PEG 沉淀 ； c、 病毒灭活 ； d、 纯化 ； e. 超滤 ； f、 纯化 ； g. 超滤 透析 ； i. 除菌分装 , 冻干。本发明方法采用改良 Kistler 和 Nitschmann 法工艺的废弃组分沉淀 FIV 来制备 1- 抗胰蛋白酶， 既解决了长期困扰 的K-N工艺或其改良工艺制备1-抗胰蛋白酶的 难题， 实现了血浆资源的综。
3、合利用， 又对血浆蛋白 主体分离工艺无干扰影响， PEG4000 用量少， 操作 体积小， 不使用离心设备， 简化工艺， 节省设备投 入具备了很好的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种制备 1- 抗胰蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 它包括如下步骤 ： a. 沉淀溶解 ： 采用低温乙醇法中的改良 K-N 法组份沉淀溶解于 8-12 倍体积的 pH8.1-9.0 的缓冲液中， 常温分散搅拌 1 小时， 30-40加热搅拌 1 小时， 常温搅拌。
4、 4-14 小 时， 得溶解液 ； b.PEG 沉淀 ： 将 a 步骤溶解液冷至 5， 加入 PEG3000-6000， PEG 浓度为 6-10%（g/ml） ， 搅拌 1 小时， 用酸调整 pH 值至 5.05-5.35， 加入 1.0-2.0% 助滤剂， 搅拌过滤得到滤液， 滤液 用碱调到 pH7.0 ； c. 病毒灭活 ： 用 S/D 法灭活 ； d. 纯化 ： 采用阴离子交换层析纯化 ； e. 超滤 ； f. 纯化 ： 采用阳离子交换层析纯化 ； g. 超滤透析 ； h.15nm 纳米过滤 ； i. 除菌分装 , 冻干。 2. 一种制备 1- 抗胰蛋白酶的方法， 其特征在于 ： 它包。
5、括如下步骤 ： a. 沉淀溶解 ： 采用低温乙醇法中的改良 K-N 法组份沉淀溶解于 8-12 倍体积的 pH8.1-9.0 的缓冲液中， 常温分散搅拌 1 小时， 30-40加热搅拌 1 小时， 常温搅拌 4-14 小 时， 得溶解液， 弃去沉淀， 在上清液中加入 2-3% 助滤剂， 边搅拌边进行压滤得滤液， 超滤浓 缩至约滤液体积的 1/6-1/7， 浓缩后蛋白浓度控制在 5.1-6.0% 得超滤浓缩液 ； b.PEG 沉淀 ： 将 a 步骤的超滤浓缩液冷至 5， 加入 PEG3000-6000， PEG 浓度为 6-10% （g/ml） ， 搅拌 1 小时， 用酸调整 pH 值至 5.0。
6、5-5.35， 加入 1.0-2.0% 助滤剂， 搅拌过滤得到滤 液， 滤液用碱调到 pH7.0 ； c. 病毒灭活 ： 用 S/D 法灭活 ； d. 纯化 ： 采用阴离子交换层析纯化 ； e. 超滤 ； f. 纯化 ： 采用阳离子交换层析纯化 ； g. 超滤透析 ； h.15nm 纳米过滤 ； i. 除菌分装 , 冻干。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： c 步骤所述 S/D 病毒灭活为采 用1Tween80/0.3%TNBP， 在241， 6小时， 灭活后用等体积缓冲液进行稀释终止来保存 1- 抗胰蛋白酶的生物活性。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的制。
7、备方法， 其特征在于 ： d 步骤所述的纯化 ： 阴离子交换 层析采用的树脂为DEAE-Sepharose Fast Flow、 DEAE-Sepharose CL-6B， DEAE-Sephacel或 者Q-Sepharose Fast Flow ； 平衡层析柱缓冲液， 采用0.02-0.03M PBS溶液， pH6.45-6.65， 洗脱缓冲液 0.075-0.085M PBS 溶液， pH6.45-6.65。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： f 步骤所述的纯化 ： 阳离子交换 采用的树脂为 ： CM-Sepharose Fast Flow 层析、 CM-。
8、SepharoseCL-6B， SP-Sepharose Fast Flow 层析 ； 平衡层析柱缓冲液采用 0.003M 磷酸氢二钠 +0.003M 枸橼酸钠， pH5.36-5.44。 权 利 要 求 书 CN 102993298 A 2 2/2 页 3 6. 根据权利要求 1 或 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 b 所述的助滤剂为硅藻土。 7. 根据权利要求 1 或 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 b 所述的 PEG 为 PEG4000。 权 利 要 求 书 CN 102993298 A 3 1/6 页 4 一种制备 1- 抗胰蛋白酶的方法 技术领域 0001 本。
9、发明涉及运用改良K-N法组份沉淀制备人1-抗胰蛋白酶的方法， 属血浆蛋 白领域。 背景技术 0002 1-抗胰蛋白酶(Alpha-1antitrypsin AAT)。 分子由394个氨基酸组成,分子量 为 52000 的糖蛋白 , 以天然有活性及变性无活性两种形式存在 , 由肝脏产生 , 主要功能为 抑制胰蛋白酶和中性白细胞的弹性蛋白酶的活性 , 还可抑制糜蛋白酶 , 纤维蛋白溶酶等， 为人体内功能最强大的酶抑制剂之一。AAT 先天性缺乏如基因突变或后天因素如长期吸烟 或细菌感染会造成 AAT 活性中心失活， 都会导致 AAT 功能性不足进而造成机体蛋白酶与抗 蛋白酶系统失衡,肺组织抵抗弹性蛋。
10、白酶的能力下降,引起肺泡变形及末端小支气管以及 下肺空间扩张等肺组织的慢性损害 , 会发生泡性肺气肿， 慢性阻塞性肺病 （COPD） ， 成人呼 吸道窘迫症 （ARDS） ， 现阶段美国FDA批准的临床适应症为1-抗胰蛋白酶遗传性缺乏引起 的肺气肿， 临床上一直就存在着采用 AAT 制剂进行增补治疗的需求。由于 1- 抗胰蛋白酶 自身具备抗炎， 抗感染以及抗自身免疫反应等多功能特性， 故在炎症性肠病 （Inflammatory bowel disease IBD） ， 脂膜炎， 脉管炎， 鼻窦炎， 风湿性关节炎， 糖尿病1型， 糖尿病所引起足 病， 囊性纤维化 （粘滞症） ， 支气管扩张， 肌。
11、纤维痛， 某些皮肤病像牛皮癣等常见慢性疾病具 备潜在治疗价值。 0003 国外公司在进行扩大适应症方面的尝试并取得了进展， 扩大的适应症为支气管扩 张 （Bronchiectasis） 和囊性纤维化疾病 (Cystic fibrosis)， 糖尿病 1 型。另有国外公司 采用基因重组技术基于酿酒酵母系统表达的重组 1 抗胰蛋白酶 rAAT, 剂型为胶体， 进 行了特应性皮肤病的临床试验。rAAT 也在进行针对其它皮肤炎症， 例如银屑病以及中耳炎 的临床前研究。至今国内没有商品供应临床治疗需要。开发 AAT 能有利于宝贵的血浆资源 的综合利用， 极大地提升血浆蛋白生产的附加利润。因此开展 AAT。
12、 的研发不仅有很好的经 济效益而且会有极佳的社会效益。 0004 国内外文献及专利报道 1- 抗胰蛋白酶剂提纯原料常为 Cohn 法组分 -1。 科恩等 Coan et al ： Preparation and Properties of Alpha 1-ProteinaseInhibitor Concentrate from Human Plasma Vox Sang.48:333-342(1985) 发 表 的 采 用 Cohn 法 组分 -1 为原料， 两步 PEG 沉淀， 第一步为 11.5% 为去除杂蛋白， 第二步 28% 为富集沉 淀 1- 抗胰蛋白酶， 再经一步 DEAE-Sep。
13、harose CL-6B 层析， 巴氏法病毒灭活， 该制剂含 有 12% 白蛋白， 2.5%IgA, 具备生物活性即抑制猪弹性蛋白酶 （PPE 活性） 的 AAT 仅占总蛋 白含量的 60%， 基于此工艺， 美国 Bayer 公司开发出全世界第一个 1- 抗胰蛋白酶产品 海因等 Hein et al ： Production of Alpha 1-Proteinase inhibitor(Human) Eur.RespirJ.9:16s-20s(1990) 发表的工艺采用 Cohn 法组分 -1 为原料， 采用 PEG 沉淀 和阴离子交换层析， 最终产品的纯度为60%。 朱威等 ： 1-抗胰蛋。
14、白酶制剂的制备及其病毒 灭活， 中国生物制品杂志， 2001， 14（2） ： 97-101 发表了 Cohn 法组分抽提液经两次沉淀， 说 明 书 CN 102993298 A 4 2/6 页 5 第一次去杂， 第二次富集 1- 抗胰蛋白酶及离子交换批量吸附及凝胶过滤纯化 1- 抗胰 蛋白酶， 工艺中仅采用一次病毒灭活， 采用的是巴氏法。有改为两步病毒灭活措施的必要， 并且工艺中有 PEG4000 用量大的缺陷。莱宾等 Lebing et al ： 美国专利 No.6,462,180: 采用 Coan -1 为原料， 经 PEG 沉淀， 再经两步离子交换层析。病毒灭活方法采用去污剂 （Twe。
15、en20） , 纳米过滤， 冻干后干热病毒灭活， 此发明中病毒灭活工艺较为繁复， 可以进一步 优化。 卜凤荣等 ： 专利申请号 ： 200610103642.X， 发明名称 ： 1-抗胰蛋白酶的制备方法， 公 开了采用组分 -1 为原料， 提取 1- 抗胰蛋白酶， 病毒灭活方法为 S/D 病毒灭活和巴氏消 毒法的组合， 但制备采用 PEG 沉淀加一步阴离子交换层析， 纯度还达不到高纯的标准。 0005 随着国内血浆蛋白分离技术的发展， Kistler 与 Nitschmann 法及其改良法也广泛 地为国内厂家所采用。改良 Kistler 和 Nitschmann 法 （简称改良 K-N 法） 。
16、确实提升了主要 血浆蛋白制品白蛋白的收率。但也造成了一些问题， 一些重要的血浆蛋白制品如 1- 抗胰 蛋白酶等制备困难。采用 Cohn 法离心工艺处理 1 吨血浆可得 17-20kg FIV-1 蛋白沉淀， 而 改良 Kistler 与 Nitschmann 法处理 1 吨血浆可得 100kg FIV 沉淀 （其中 50kg 蛋白沉淀和 50kg助滤剂） ， 由此可见， 采用改良Kistler与Nitschmann法的FIV沉淀中的杂蛋白含量远 高于 Cohn 法 FIV-1 沉淀， 故纯化难度也高出许多。 0006 国际上有一些厂家及研究者， 如法国伯尔诺夫等 Burnouf et al ：。
17、“Biochemical and Biological Properties of an1-antitrypsin Concentrate”VoxSang 52:291-297(1987)应用Kistler与Nitschmann法的组份A或组份A+上清经层析柱进行 分离纯化 1- 抗胰蛋白酶， 该方法存在对设备要求较高， 需要大规模的层析系统及配套设 施， 操作时间较长， 病毒灭活不充分等缺陷。 发明内容 0007 为了解决上述问题， 本发明运用改良 Kistler 和 Nitschmann 法工艺的废弃沉淀 FIV 来纯化制备 1- 抗胰蛋白酶， 提供了一种制备 1- 抗胰蛋白酶的方法。 0。
18、008 本发明提供了一种制备 1- 抗胰蛋白酶的方法， 它包括如下步骤 ： 0009 a. 沉 淀 溶 解 ： 采 用 低 温 乙 醇 法 中 的 改 良 K-N 法 组 份 沉 淀 （按 专 利 号 ZL03135795.4， 名称 ：“一种血浆蛋白分离方法” 所述的方法制备） 溶解于 8-12 倍体积的 pH8.1-9.0 的缓冲液中， 常温分散搅拌 1 小时， 30-40加热搅拌 1 小时， 常温搅拌 4-14 小 时， 整个溶解过程 6-16 小时， 得溶解液 ； 0010 b.PEG 沉淀 ： 将 a 步骤溶解液冷至 5， 加入 PEG3000-6000 浓度为 6-10%（g/ml。
19、） ， 搅拌， 用酸调整 pH 值至 5.05-5.35， 加入 1.0-2.0% 助滤剂， 搅拌过滤得到 PEG 上清液， 滤液 用碱调到 pH7.0 ； 0011 c、 病毒灭活 ： S/D 法 ； S/D 病毒灭活完成后用等体积缓冲液进行稀释终止来保存 1- 抗胰蛋白酶的生物活性 ； 0012 d、 纯化 ： 采用阴离子交换层析纯化 ； 0013 e. 超滤 ； 0014 f、 纯化 ： 采用阳离子交换层析纯化 ； 0015 g. 超滤透析 ； 0016 h.15nm 纳米过滤 ； 说 明 书 CN 102993298 A 5 3/6 页 6 0017 i. 除菌分装 , 冻干。 001。
20、8 其中， 所述的步骤 a 还包括将搅拌后溶解液弃去沉淀， 在上清液中加入 2-3% 助滤 剂， 边搅拌边进行压滤得滤液， 超滤浓缩至约滤液体积的 1/6-1/7， 浓缩后蛋白浓度控制在 5.1-6.0% 得超滤浓缩液， 再进行 b 步骤 PEG 沉淀。 0019 其中， S/D 病毒灭活为采用 1 Tween80/0.3%TNBP， 在 241， 6 小时， S/D 病毒灭 活完成后用等体积缓冲液进行稀释终止。 0020 其中， d 步骤所述的纯化 ： 平衡层析柱缓冲液采用 0.02-0.03M PBS( 磷酸氢二钠与 磷酸二氢钠 )pH6.45-6.65， 洗脱缓冲液 0.075-0.08。
21、5M PBS（磷酸氢二钠与磷酸二氢钠 )， pH6.45-6.65 ； 所述的阴离子交换层析为 ： DEAE-SepharoseFast Flow层析、 DEAE-Sepharose CL-6B， DEAE-Sephacel,Q-Sepharose FastFlow 0021 其中， f 步骤所述的纯化 ： 平衡层析柱缓冲液采用 0.003M 磷酸氢二钠 +0.003M 枸橼酸钠 pH5.36-5.44。所述的阳离子交换树脂为 ： CM-SepharoseFast Flow 层析、 CM-Sepharose CL-6B， SP-Sepharose Fast Flow 层析。 0022 其中， 。
22、所述的助滤剂为硅藻土。 0023 其中， 所述的 PEG 为 PEG4000。 0024 本发明方法采用改良 Kistler 和 Nitschmann 法工艺的废弃组分沉淀 FIV 来制备 1- 抗胰蛋白酶， 既解决了长期困扰的 K-N 工艺制备 1- 抗胰蛋白酶的难题， 实现了血浆 资源的综合利用， 又对血浆蛋白主体分离工艺无干扰影响， PEG4000 用量少， 操作体积小， 不 使用离心设备， 简化工艺， 节省设备投入， 具备了很好的应用前景。 具体实施方式 0025 仪器及材料 ： 0026 强力电动搅拌机 JB90-D 型上海标本仪器厂 0027 低温循环仪 ： HC2050 重庆恒达。
23、仪器厂 0028 HC2030 重庆恒达仪器厂 0029 超滤器 :Millipore 0.5M2, 截留值 10KD 0030 Millipore Pellicon 0.11M2, 截留值 10KD 0031 压滤机 ： Seitzschenk Niro 490 板式压滤器德国 0032 滤器 ： Millipore 293 0033 pH 仪 ： Metler Toledo Delta 320 0034 电导仪 Metler Toledo 326 0035 层析柱 ： XK50Pharmacia Biotech 0036 紫外监测仪 ： UV-1Pharmacia 0037 记录仪 ： R。
24、EC112amershampharmacia Biotech 0038 蠕动泵 ： Masterflex L/S Cole-Parmer Instrument CompanyImage 双光径免疫 浊度分析仪美国 Beckman Coulter 公司 Versamax Microplate reader 美国 Molecular Devices 公司 0039 助滤剂 ： Celite 503 吉林临江塞力特公司 0040 滤板 ： 50P 美国 Pall 公司 说 明 书 CN 102993298 A 6 4/6 页 7 0041 实施例 1 本发明抗 1- 抗胰蛋白酶的制备方法 0042 。
25、a. 沉淀溶解 ： 3kg Kistler 和 Nitschmann 法组份沉淀溶解于 24L 0.02MPBS pH 8.1 的缓冲液， 搅拌 1 小时后， 40加温搅拌 1 小时后， 再进行常温搅拌 14 小时。整个溶解 过程16小时， 弃去沉淀， 添加2%Celite到上清液中。 压滤后超滤浓缩到4L， 蛋白浓度5.1%。 0043 b.PEG沉淀 ： FIV沉淀溶解液冷至5加入PEG4000至6% （g/ml） ， 搅拌1小时后,pH 用1N HCl调整到5.05,2%Celite添加量为1.5%,采取压滤方式,进行过滤， 滤液pH用0.5N NaOH 调整到 pH7.05。 0044。
26、 c.S/D 病毒灭活 ： 采用 1 Tween80/6%TNBP， 241， 6 小时 241， 6 小时。S/D 病毒灭活后用等体积的 PBS 缓冲液进行稀释终止， 在此实施例中用约 4L 0.01M PBS pH6.5 终止。 0045 d.用酸碱调整pH,2M NaCl调整电导调整pH,电导与平衡后的DEAE-Sepharose FF 流出液一致。 0046 e.DEAE-Sepharose FF 层析 ： 层析柱直径 5cm, 柱高 15cm, 柱体积 300ml, 用 0.02M PBS pH6.45 平衡 DEAE-Sepharose FF, 大概需 20 柱床体积 CV （Co。
27、lumn Volume） ， 平衡后上 样流速 30ml/min,（线流速 90cm/h） 结束上样后 , 用 0.02M pH6.45, 平衡层析柱缓冲液 （即 上样缓冲液， ） 洗流穿峰至基线左右。用 0.075M pH6.45PBS, 洗脱 AAT, 流速 40ml/min（线 流速 120cm/h） ， 收集洗脱峰， 此后换 2M NaCl 2CV， 流速 40ml/min, 换 0.5M NaOH 2CV， 流速 40ml/min, 换 pH 4.0 醋酸盐缓冲液 2CV， 流速 40ml/min, 检测流出液 pH 为 4.0。 0047 f. 超滤浓缩及调制 ： 取步骤 e 得到。
28、的含有 AAT 的洗脱峰， 超滤后将 pH 及电导调整 至尽量与 CM-Sepharose FF 层析平衡后流出液保持一致。 0048 g.CM-Sepharose FF层析 ： 层析柱直径5cm,柱高30cm,柱体积600ml， 平衡层析柱 缓冲液采用 0.003M 磷酸氢二钠 +0.003M 枸橼酸钠 pH5.36。平衡 CM-Sepharose FF 柱 , 大 约 20CV， 平衡后上样 , 上样流速 8ml/min（线流速 24cm/h） , 收集含有 1- 抗胰蛋白酶流 穿峰， 流穿峰后峰不予收集 , 此后换 2MNaCl 2CV， 流速 40ml/min（线流速 120cm/h）。
29、 洗脱 , 换 0.5M NaOH 2CV， 流速 40ml/min, 换 pH 4.0 醋酸盐缓冲液 2CV， 流速 40ml/min, 检测流出 液 pH 为 4.0。 0049 h. 超滤透析 0050 i.15nm 纳米膜过滤 0051 j. 除菌分装， 冻干 0052 AAT 制剂检测 ： 醋纤膜电泳纯度 100%， HPLC 主峰 94.3%， AAT 含量 15mg/ml,AAT 活 性 ： 抑制猪弹性蛋白酶 （PPE 活性） 14.18mg/ml， 蛋白浓度 1.487%， 白蛋白与 APA 载脂蛋白均 在检测限下， IgA 0.133mg/ml ( 占总蛋白的 1% 以下 )。
30、， 渗透压 274mOsmol/kg， 处于等渗水 平。 0053 实施例 2 本发明抗 1- 抗胰蛋白酶的制备方法 0054 a. 沉淀溶解 ： 3kg Kistler 和 Nitschmann 法组份沉淀溶解于 36L 0.03MPBS pH 9.0 的缓冲液， 搅拌 1 小时后， 40加温 1 小时后， 再进行常温搅拌 4 小时。整个溶解过程 6 小时。弃去沉淀， 添加 3%Celite 到上清液中。压滤后超滤浓缩到 5L， 蛋白浓度 6.0%。 0055 b.PEG 沉淀 ： FIV 沉淀溶解液冷至 5加入 PEG4000 至 10%（g/ml） ， 搅拌 1 小时 后 ,pH 用 1。
31、N HCl 调整到 5.35, 助滤剂添加量为 1.5-2%, 采取压滤方式 , 进行过滤， 滤液 pH 说 明 书 CN 102993298 A 7 5/6 页 8 用 0.5N NaOH 调整到 pH7.01。 0056 c.S/D 病毒灭活 ： 采用 1 Tween80/0.3%TNBP， 在 241， 6 小时。S/D 病毒灭活 后用等体积的 PBS 缓冲液进行稀释终止， 在此实施例中用约 5L0.015M PBS pH6.5 终止。 0057 d. 调整 pH, 电导与平衡后的 DEAE-Sepharose FF 流出液一致。 0058 e.DEAE-Sepharose FF 层析 。
32、： 层析柱直径 5cm, 柱高 15cm, 柱体积 300ml, 用 0.03M PBS pH6.65 平衡 DEAE-Sepharose FF, 大概需 20CV， 平衡后上样流速 30ml/min,（线流速 90cm/h） 结束上样后,用0.03M pH6.65平衡液洗流穿峰至基线左右， 用0.085M pH6.65PBS, 洗脱 , 流速 40ml/min（线流速 120cm/h） ， 收集峰此后换 2M NaCl 2CV， 流速 40ml/min, 换 0.5M NaOH 2CV， 流速 40ml/min, 换 pH 4.0 醋酸盐缓冲液 2CV， 流速 40ml/min, 检测流出液。
33、 pH 为 4.0。 0059 f. 超滤浓缩及调制 ： 超滤浓缩后调至 CM-Sepharose FF 平衡后的电导水平。将 pH 及电导调整至尽量与 CM-Sepharose FF 层析平衡后流出液保持一致。 0060 g.CM-Sepharose FF 层析 ： 层析柱直径 5cm, 柱高 30cm, 柱体积 600ml 用平衡层析 柱缓冲液采用 0.003M 磷酸氢二钠 +0.003M 枸橼酸钠 pH5.44。平衡 CM-Sepharose FF 柱 , 大约 20CV， 平衡后上样 , 上样流速 8ml/min（线流速 24cm/h） , 收集流穿峰， 流穿峰后峰不 予收集 , 此后。
34、换 2M NaCl 2CV， 流速 40ml/min（线流速 120cm/h） 洗脱 , 换 0.5M NaOH 2CV， 流速 40ml/min, 换 pH 4.0 醋酸盐缓冲液 2CV， 流速 40ml/min, 检测流出液 pH 为 4.0。 0061 h. 超滤透析 0062 i.15nm 纳米膜过滤 0063 j. 除菌分装， 冻干 0064 AAT 制剂检测 ： 醋纤膜电泳纯度 100%， HPLC 主峰 96.1%， AAT 含量 23.4mg/ml,AAT 活性 ： 抑制猪弹性蛋白酶 （PPE 活性） 20.67mg/ml， 蛋白浓度 2.387%， 白蛋白与 APA 载脂蛋白。
35、 均在检测限下， IgA 0.194mg/ml ( 占总蛋白的 1% 以下 )， 渗透压 261mOsmol/kg， 处于等渗 水平。 0065 实施例 3 本发明 1- 抗胰蛋白酶的制备方法 0066 a. 沉淀溶解 ： 3kg Kistler 和 Nitschmann 法组份沉淀溶解于 30L 0.03MPBS pH 8.5的缓冲液， 现搅拌分散混悬1小时后， 再进行40加温1小时后， 尔后继续常温16-25 搅拌 4 小时。 0067 b.PEG沉淀 ： FIV沉淀溶解液冷至5加入PEG4000至9% （g/ml） ， 搅拌1小时后,pH 用 1N HCl 调整到 5.10, 助滤剂添加。
36、量为 2%, 采取压滤方式 , 进行过滤， 滤液 pH 用 0.5N NaOH 调整到 pH7.00。 0068 c.S/D 病毒灭活 ： 采用 1 Tween80/0.3%TNBP， 在 241， 6 小时。S/D 病毒灭活 后用等体积的 PBS 缓冲液进行稀释终止， 在此实施例中用约 30L0.015M PBS pH6.5 终止。 0069 d. 调整 pH, 电导与平衡后的 DEAE-Sepharose FF 流出液一致。 0070 e.DEAE-Sepharose FF 层析 ： 层析柱直径 5cm, 柱高 15cm, 柱体积 300ml, 用 0.03M PBS pH6.6 平衡 D。
37、EAE-Sepharose FF, 大概需 20CV， 平衡后上样流速 60ml/min,（线流速 180cm/h） 结束上样后 , 用 0.03M pH6.6 平衡液洗流穿峰至基线左右。用 0.085M pH6.6PBS 洗脱 AAT, 流速 40ml/min（线流速 120cm/h） ， 收集峰此后换 2M NaCl 2CV， 流速 40ml/min, 换 0.5M NaOH 2CV， 流速 40ml/min, 换 pH 4.0 醋酸盐缓冲液 2C V， 流速 40ml/min, 检测流 说 明 书 CN 102993298 A 8 6/6 页 9 出液 pH 为 4.0。 0071 f.。
38、 超滤浓缩及调制 ： 超滤浓缩后调至 CM-Sepharose FF 平衡后的电导水平。将 pH 及电导调整至尽量与 CM-Sepharose FF 层析平衡后流出液保持一致。 0072 g.CM-Sepharose FF 层析 ： 层析柱直径 5cm, 柱高 30cm, 柱体积 600ml 用平衡层析 柱缓冲液采用 0.003M 磷酸氢二钠 +0.003M 枸橼酸钠 pH5.42。平衡 CM-Sepharose FF 柱 , 大约 20C V， 平衡后上样 , 上样流速 8ml/min（线流速 24cm/h） , 收集流穿峰， 流穿峰后峰不 予收集 , 此后换 2M NaCl 2CV， 流速。
39、 40ml/min（线流速 120cm/h） 洗脱 , 换 0.5M NaOH 2CV， 流速 40ml/min, 换 pH 4.0 醋酸盐缓冲液 2CV， 流速 40ml/min, 检测流出液 pH 为 4.0。 0073 h. 超滤透析 ； 0074 i.15nm 纳米膜过滤 ； 0075 j. 除菌分装， 冻干 ； 0076 AAT 制剂检测 ： 醋纤膜电泳纯度 99%， HPLC 主峰 92.3%， AAT 含量 15.6mg/ml,AAT 活 性 ： 抑制猪弹性蛋白酶 （PPE活性） 15.18mg/ml， 蛋白浓度1.58%， 白蛋白与APA载脂蛋白均在 检测限下， IgA 0.1。
40、5mg/ml ( 占总蛋白的 1% 以下 )， 渗透压 273mOsmol/kg， 处于等渗水平。 0077 本发明制备的 AAT 是高纯制剂， 且生物活性保存完好， S/D 及 PEG 残留均远在允许 限下， 且工艺反复实施 8 次以上， 有很好的稳定性。证明本发明对比现有其他工艺具备以下 显著优点 ： 0078 a.采用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃组分沉淀FIV来制备1-抗胰 蛋白酶， 既解决了长期困扰的 K-N 工艺或其改良工艺制备 1- 抗胰蛋白酶的难题， 实现了 血浆资源的综合利用， 又对血浆蛋白主体分离工艺无干扰影响。 0079 b.PEG4000 用量少 。
41、： 采用沉淀溶解压滤后进行超滤浓缩的方式处理 3kgF 沉淀仅 用 400g, 而其他工艺如 Coan 工艺处理 3kgF -1 则需用 8400g， PEG4000 试剂价格昂贵， 仅 PEG400 用量成本一项就占到总生产成本的很高比例， 故此一项改进的发明就极大降低了生 产成本。 0080 c. 操作体积小 ： 经超滤浓缩后， 体积缩小， 不仅所用 PEG4000 及 S/D 试剂大为减 少， 且操作时间也同时降低。 0081 d. 不使用离心设备， 简化工艺， 节省设备投入。 0082 e. 在第一步病毒灭活后采用阴离子交换层析， 既纯化了 AAT， 又去除了 S/D 及 PEG400。
42、0， 做到一举三得， 工艺组合流畅合理。 0083 f. 病毒灭活技术采用双重机制的灭活方法， 有机溶剂 / 清洗剂 （Solvent/ Detergent,S/D） 法为国际公认的灭活脂包膜病毒的有效方法， 而纳米膜过滤除则为去除非 脂包膜病毒， 特别是指示病毒猪细小病毒 PPV 的公认有效措施， 去除效果可达 4 个 log 以 上， 这两种方法均较为温和安全， 对 1- 抗胰蛋白酶生物活性影响较小。而其他方法例如 加热法存在着较为剧烈及灭活 PPV 效果不确切等因素。故发明人采用 S/D 病毒灭活法和纳 米膜病毒去除的组合可达到国家病毒灭活技术指南的标准的要求。 0084 g. 制剂纯度及比活在所有国内外报道文献处于最好水平之列。 0085 综上所述， 本发明制备方法具备了很好的应用前景。 说 明 书 CN 102993298 A 9 。