一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210514757.3	申请日：	2012.12.05
公开号：	CN102993293A	公开日：	2013.03.27
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/635申请日:20121205\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/635; C07K1/36; C07K1/34; C07K1/20	主分类号：	C07K14/635
申请人：	深圳翰宇药业股份有限公司
发明人：	赵忠卫; 刘建; 马亚平; 袁建成
地址：	518000 广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层
优先权：
专利代理机构：	深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙) 44248	代理人：	韩英杰;许建
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内容摘要

本发明提供了一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法，包括以下步骤：以体积比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液溶解粗肽；将粗肽溶液进行梯度洗脱纯化，以体积比0.1%—0.4%的硫酸和体积比0.1%—0.4%醋酸的水溶液用氨水调pH值5.0—6.0后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B%：20%—40%洗脱；盐析；用含3%—10%乙腈的醋酸铵溶液冲洗，用十八烷基硅烷键合硅胶高效液相色谱进行转盐，醋酸水溶液乙腈体系洗脱。本发明的目的是提供一种操作简单、高收率、纯度高、有利于实现产业化的特立帕肽的纯化方法。

权利要求书

权利要求书一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1）：以体积比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照浓度20g/L—50g/L溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到10%—30%；
步骤2）：将粗肽溶液以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行梯度洗脱纯化，将体积比0.1%—0.4%的硫酸和体积比0.1%—0.4%醋酸的水溶液用氨水调pH值5.0—6.0后的溶液为A 相，乙腈为B相，梯度：B%：20%—40%；
步骤3）：将步骤2）所得合格溶液中乙腈的比例降至10%以下，再将其pH值用20%的稀氨水调至5.5—7.0后放置到2—8摄氏度2小时以上，使其析出，再将浑浊液进行离心处理，上清液作为废液处理；下层固体用50%—100%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍；
步骤4）：用八烷基硅烷键合硅胶进行高效液相转盐，将步骤3）所得溶液用含3%—10%乙腈的醋酸铵溶液冲洗15—30min，醋酸铵溶液的浓度为0.1%—0.8%，然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，收集特立帕肽溶液，所述醋酸水溶液中的醋酸的体积比浓度为0.1%—0.4%，该洗脱步骤所采用的乙腈浓度为40%以上。
根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤2）中用氨水调pH值5.5后的溶液为A 相。
根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤3）中pH值用20%的稀氨水调至6.5。
根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述步骤3）中pH值用20%的稀氨水调至6.5。
根据权利要求1至4任一权利要求所述方法，其特征在于：所述步骤3）中下层固体用60%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍。
根据权利要求1至4任一权利要求所述方法，其特征在于：所述步骤4）中醋酸铵溶液的浓度为0.3%，醋酸水溶液中的醋酸的体积比浓度为0.2%。
根据权利要求5所述方法，其特征在于：所述步骤4）中醋酸铵溶液的浓度为0.3%，醋酸水溶液中的醋酸的体积比浓度为0.2%。

说明书

说明书一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及特立帕肽醋酸盐的纯化方法。
背景技术
特立帕肽，英文名Teriparatide，分子式为C181H292N55O51S2。特立帕肽（pTH（1‑34））是一个34肽，也称人甲状旁腺激素(1‑34)。特立帕肽是人甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone，human）氨基端的1‑34个氨基酸组成的多肽，由美国Eli Lilly公司研发，以特立帕肽醋酸盐作为药品使用，属于基因重组药物，2002年被美国FDA批准上市。它是第1个被批准用于治疗严重骨质疏松症的骨形成促进剂，有较广泛的市场应用前景。
目前涉及到特立帕肽合成的文献和专利较多，但涉及到纯化的较少，特别是本发明的反相色谱和盐析相结合的规模化纯化制备（一批可得精品200克以上）和高纯度且达到药用级（纯度达99.5%以上，最大单杂0.1%）更是没有涉及。
现有技术CN102731643A公开了一种特立帕肽的纯化方法，采用水作为溶剂，然后以0.2%TFA/乙腈为流动相采用C18柱进行纯化，然后用0.2%醋酸/乙腈C18柱转盐，虽能得到较高纯度的特立帕肽醋酸盐，但总收率只有20%左右，不利于产业生产。
为解决现有技术存在收率低的难题，提高特立帕肽醋酸盐的纯化收率，降低生产成本，还需对纯化方法进一步的研究。
发明内容
本发明提出了一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。
为实现上述目的，综合考虑特立帕肽本身的性质，本发明提供的一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法包括以下步骤：
步骤1）：以体积比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照浓度20g/L—50g/L溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到10%—30%。步骤1）下文也表述为“前处理”。
“粗肽溶液”是指粗肽经过前处理后所得到的溶液，所使用的水为纯净水，并符合注射用水标准，优选超纯水；所使用的醋酸为分析纯的冰醋酸，本发明的“乙腈”的纯度级别优选色谱纯。
选择体积比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液混合溶剂系统是通过对比试验考虑实际生产过程的操作方便得出的，不在该浓度的溶剂溶解的浓度会变低，导致样品溶解体积过大，不利于反相色谱的处理（会导致体积过载，纯化效率低）。
现有技术CN102731643A采用水作为溶剂，其会影响纯化洗脱系统所使用有机溶剂的浓度，需要洗脱系统较长时间来平衡色谱柱，采用其他溶剂溶解粗肽会引入新的溶剂（导致成品引入新的有机溶剂残留，影响成品质量。
将制备的粗肽的浓度控制在20g/L—50g/L有利于纯化效率，高于50g/L会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱，低于20g/L会使纯化效率低下。
用水将粗肽溶液中的醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到10%—30%，当醋酸和乙腈的比例高于30%此范围的溶剂会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱，当醋酸和乙腈的比例低于10%会使样品析出，导致后续的反相色谱纯化无法进行。
步骤2）：将粗肽溶液进行梯度洗脱纯化，以0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%醋酸水溶液（体积比，用氨水调pH值5.0—6.0，优选5.5）为A 相，乙腈为B相，梯度：B%：20%—40%；步骤2）下文也表述为“纯化”。
选择0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%醋酸两种酸用氨水调节后生成两种缓冲盐的A相是优化选择的结果，较现有技术CN102731643A采用0.2%TFA具有更好的分离效果。流动相A中缓冲盐的浓度低于所限定的范围使流动相缓冲能力变弱，导致样品不能完全洗脱且谱图变形达不到分离的要求。大于此范围，流动相A中缓冲盐的浓度过高对色谱系统损伤较大，甚至会部分产生盐析，导致无法纯化。另外，流动相A的pH值也非常重要，不在5.0—6.0范围达不到分离效果。
洗脱系统中A相和B相的比例是通过大量实验筛优选得到的，B%低于20%样品不能冲洗下色谱柱，B%大于40%样品会提前冲出，都不能进行纯化。采用该溶剂系统纯化，分离效果较现有技术会大幅提高，本步的收率90%左右，所得样品的纯度在95%以上，大大提高收率和纯度，降低了生产成本。
所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的特立帕肽粗肽或者纯度不能满足药用的特立帕肽，粗肽中特立帕肽的纯度在20%以上，采用现有技术方法CN102731643A的方法较难实现该浓度产品的纯化。
所述步骤2）中所使用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度优选为： 5 cm × 25 cm，10 cm × 25 cm或30 cm × 25 cm。
步骤3）采用盐析的方法对其进行进一步的纯化，使其纯度达到99%以上。步骤3）下文也表述为“盐析”。
所述“盐析”是指通过控制步骤2）所得合格溶液的乙腈浓度和溶液的pH值，使样品析出的过程(所述合格溶液是指纯度大于95%的样品)。盐析的优选方法为：通过常温旋蒸的方法将步骤2）所得合格溶液中乙腈的比例降至10%以下，再将其pH值用20%的稀氨水调至5.5‑7.0后放置到2‑8摄氏度2小时以上，使其析出。再将浑浊液进行离心处理，上清液作为废液处理；下层固体用体积比浓度50%‑100%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤4）即可。
所述步骤3）中，所得合格溶液中乙腈的比例降至10%以下，再将其pH值用20%的稀氨水优选调至6.5；放置到2‑8摄氏度2小时以上，使其析出；再将浑浊液进行离心处理，上清液作为废液处理；下层固体优选用60%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤4）。采用该pH值及相应浓度的磷酸水溶液具有更好的盐析效果。
该步骤提高样品的纯度，将特立帕肽的纯度从大于95%到大于99.0%。另外，使用盐析方法较CN102731643A具有很大的成本优势，盐析的成本远远低于反相色谱处理的成本，特别是在规模化生产时尤为明显。
步骤4）采用反相高效液相色谱法将特立帕肽的硫酸盐转成醋酸盐。步骤4）下文也表述为“转盐”。
所述“反相高效液相色谱”的固定相为八烷基硅烷键合硅胶，转盐的方法优选为：用含3%—10%乙腈的醋酸铵溶液冲洗15—30min，醋酸铵溶液的浓度为0.1%—0.8%，优选0.3%；然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，所述醋酸水溶液的浓度为0.1%—0.4%，优选为0.2%。该洗脱步骤所采用的乙腈浓度为40%以上，收集特立帕肽溶液，浓缩，冷冻干燥后得特立帕肽醋酸盐。
所述步骤4）中所使用以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度优选为： 5 cm × 25 cm，10 cm × 25 cm或30 cm × 25 cm。
本发明提供的纯化特立帕肽方法操作可行、纯度高（可达99.0%以上且最大单杂小于0.1%）、收率高（纯化收率可达80%以上），达到产业化要求（一批次可获得200克以上的精肽）。
本发明采用反相色谱和盐析结合的办法进行纯化处理，有利于浓度在20%左右的粗肽样品的纯化，较CN102731643A具有很大的成本优势（盐析的成本远远低于反相色谱处理的成本），特别是在规模化生产时尤为明显。另外本发明得到的特立帕肽纯度较高可达99.5%以上，且任一单杂均小于0.1%，完全符合美国和欧盟等规范国家化学药品的申报要求。本发明的纯化方法大幅提高了产品的质量，且较现有技术的纯化成本大大降低，收率也大幅提高。
附图说明
图1：采用实施例1得到特立帕肽醋酸盐的HPLC谱图。
具体实施方式
实施例一：
1. 样品处理：
用体积比以10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照不大于50g/L的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到30%以下备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 5 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.3%硫酸和0.2%醋酸水溶液(v/v)，用氨水溶液调pH值6.0；B相：乙腈，流速：50‑80 ml/min，梯度B%：20%—40%，检测波长：280 nm。进样量为2.5g 。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为2.5g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于95%的部分于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于10%以下后备用。
3.盐析：
盐析过程：将步骤2）得到的样品溶液用20%的氨水将其pH值调至5.5后，再放置到2‑8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用50%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤4）即可。
4. 转盐：
色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 5 cm × 25 cm 。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量2g，用含5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗15‑30min，然后用含50%乙腈的0.2%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特立帕肽醋酸盐。
实施例二：
1. 样品处理：
用体积比以10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照不大于50g/L的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到30%以下备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 10 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.3%硫酸和0.2%醋酸水溶液(v/v)，用氨水溶液调pH值5.5；B相：乙腈，流速：150‑250 ml/min，梯度B%：20%—40%，检测波长：280 nm。进样量为10g 。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为10g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于95%的部分于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于10%以下后备用。
3.盐析：
盐析过程：将步骤2）得到的样品溶液用20%的氨水将其pH值调至6.0后，再放置到2‑8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用80%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤4）即可。
4. 转盐：
色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 10 cm × 25 cm 。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量10g，用含5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗15‑30min，然后用含50%乙腈的0.2%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特立帕肽醋酸盐。
实施例三：
1. 样品处理：
用体积比以10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照不大于50g/L的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到30%以下备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 15 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.3%硫酸和0.2%醋酸水溶液(v/v)，用氨水溶液调pH值5.0；B相：乙腈，流速：350‑600 ml/min，梯度B%：20%—40%，检测波长：280 nm。进样量为25g 。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为25g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于95%的部分于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于10%以下后备用。
3.盐析：
盐析过程：将步骤2）得到的样品溶液用20%的氨水将其pH值调至6.5后，再放置到2‑8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用100%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤4）即可。
4. 转盐：
色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 15 cm × 25 cm 。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量25g，用含5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗15‑30min，然后用含50%乙腈的0.2%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特立帕肽醋酸盐。
实施例四：
1. 样品处理：
用体积比以10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照不大于50g/L的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到30%以下备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 30 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.3%硫酸和0.2%醋酸水溶液(v/v)，用氨水溶液调pH值5.5；B相：乙腈，流速：50‑80 ml/min，梯度B%：20%—40%，检测波长：280 nm。进样量为100g 。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为100g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于95%的部分于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于10%以下后备用。
3.盐析：
盐析过程：将步骤2）得到的样品溶液用20%的氨水将其pH值调至6.5后，再放置到2‑8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用60%的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤4）即可。
4. 转盐：
色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 30 cm × 25 cm 。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量100g，用含5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗15‑30min，然后用含50%乙腈的0.2%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的特立帕肽醋酸盐。

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1、(10)申请公布号 CN 102993293 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102993293 A *CN102993293A* (21)申请号 201210514757.3 (22)申请日 2012.12.05 C07K 14/635(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (71)申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址 518000 广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层 (72)发明人赵忠卫刘建马亚平袁建成 (74)专利代理机构深圳市科吉。

2、华烽知识产权事务所 ( 普通合伙 ) 44248 代理人韩英杰许建 (54) 发明名称一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法 (57) 摘要本发明提供了一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法，包括以下步骤：以体积比 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液溶解粗肽；将粗肽溶液进行梯度洗脱纯化，以体积比 0.1%0.4% 的硫酸和体积比 0.1%0.4% 醋酸的水溶液用氨水调 pH 值 5.06.0后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度： B% ： 20%40% 洗脱；盐析；用含 3%10% 乙腈的醋酸铵溶液冲洗，用十八烷基硅烷键合硅胶高效液相色谱进行转盐，醋酸水。

3、溶液乙腈体系洗脱。本发明的目的是提供一种操作简单、高收率、纯度高、有利于实现产业化的特立帕肽的纯化方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法，包括以下步骤：步骤 1）：以体积比 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液按照浓度 20g/L50g/L 溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到 10%30% ；步骤 2）：将粗肽溶液以十八。

4、烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行梯度洗脱纯化，将体积比 0.1%0.4% 的硫酸和体积比 0.1%0.4% 醋酸的水溶液用氨水调 pH 值 5.06.0 后的溶液为 A 相，乙腈为 B 相，梯度： B% ： 20%40% ；步骤 3）：将步骤 2）所得合格溶液中乙腈的比例降至 10% 以下，再将其 pH 值用 20% 的稀氨水调至5.57.0后放置到28摄氏度2小时以上，使其析出，再将浑浊液进行离心处理，上清液作为废液处理；下层固体用 50%100% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍；步骤 4）：用八烷基硅烷键合硅胶进行高效液相转盐，。

5、将步骤 3）所得溶液用含 3%10% 乙腈的醋酸铵溶液冲洗 1530min，醋酸铵溶液的浓度为 0.1%0.8%，然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，收集特立帕肽溶液，所述醋酸水溶液中的醋酸的体积比浓度为0.1%0.4%，该洗脱步骤所采用的乙腈浓度为 40% 以上。 2. 根据权利要求 1 所述方法，其特征在于：所述步骤 2）中用氨水调 pH 值 5.5 后的溶液为 A 相。 3. 根据权利要求 1 所述方法，其特征在于：所述步骤 3）中 pH 值用 20% 的稀氨水调至 6.5。 4. 根据权利要求 2 所述方法，其特征在于：所述步骤 3）中 pH 值用。

6、20% 的稀氨水调至 6.5。 5. 根据权利要求 1 至 4 任一权利要求所述方法，其特征在于：所述步骤 3）中下层固体用 60% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍。 6. 根据权利要求 1 至 4 任一权利要求所述方法，其特征在于：所述步骤 4）中醋酸铵溶液的浓度为 0.3%，醋酸水溶液中的醋酸的体积比浓度为 0.2%。 7. 根据权利要求 5 所述方法，其特征在于：所述步骤 4）中醋酸铵溶液的浓度为 0.3%，醋酸水溶液中的醋酸的体积比浓度为 0.2%。权利要求书 CN 102993293 A 2 1/5 页 3 一种特立帕肽醋酸盐。

7、的纯化方法技术领域 0001 本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及特立帕肽醋酸盐的纯化方法。背景技术 0002 特立帕肽，英文名 Teriparatide，分子式为 C181H292N55O51S2。特立帕肽（pTH （1-34））是一个 34 肽，也称人甲状旁腺激素 (1-34)。特立帕肽是人甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone， human）氨基端的1-34个氨基酸组成的多肽，由美国Eli Lilly公司研发，以特立帕肽醋酸盐作为药品使用，属于基因重组药物， 2002年被美国FDA批准上市。它是第1个被批准用于治疗严重骨质疏松症的骨形成促。

8、进剂，有较广泛的市场应用前景。 0003 目前涉及到特立帕肽合成的文献和专利较多，但涉及到纯化的较少，特别是本发明的反相色谱和盐析相结合的规模化纯化制备（一批可得精品200克以上）和高纯度且达到药用级（纯度达 99.5% 以上，最大单杂 0.1%）更是没有涉及。 0004 现有技术 CN102731643A 公开了一种特立帕肽的纯化方法，采用水作为溶剂，然后以 0.2%TFA/ 乙腈为流动相采用 C18 柱进行纯化，然后用 0.2% 醋酸 / 乙腈 C18 柱转盐，虽能得到较高纯度的特立帕肽醋酸盐，但总收率只有 20% 左右，不利于产业生产。 0005 为解。

9、决现有技术存在收率低的难题，提高特立帕肽醋酸盐的纯化收率，降低生产成本，还需对纯化方法进一步的研究。发明内容 0006 本发明提出了一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。 0007 为实现上述目的，综合考虑特立帕肽本身的性质，本发明提供的一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法包括以下步骤：步骤 1）：以体积比 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液按照浓度 20g/L50g/ L 溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到 10%30%。步骤 1）下文也表述为 “前处理” 。 0008 “粗肽溶液” 是指粗肽经。

10、过前处理后所得到的溶液，所使用的水为纯净水，并符合注射用水标准，优选超纯水；所使用的醋酸为分析纯的冰醋酸，本发明的 “乙腈” 的纯度级别优选色谱纯。 0009 选择体积比 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液混合溶剂系统是通过对比试验考虑实际生产过程的操作方便得出的，不在该浓度的溶剂溶解的浓度会变低，导致样品溶解体积过大，不利于反相色谱的处理（会导致体积过载，纯化效率低）。 0010 现有技术 CN102731643A 采用水作为溶剂，其会影响纯化洗脱系统所使用有机溶剂的浓度，需要洗脱系统较长时间来平衡色谱柱，采用其他溶剂溶解粗肽会引入新的溶。

11、剂（导致成品引入新的有机溶剂残留，影响成品质量。 0011 将制备的粗肽的浓度控制在20g/L50g/L有利于纯化效率，高于50g/L会导致后说明书 CN 102993293 A 3 2/5 页 4 续的反相色谱纯化时不挂色谱柱，低于 20g/L 会使纯化效率低下。 0012 用水将粗肽溶液中的醋酸与乙腈的体积之和的体积比例稀释到10%30%，当醋酸和乙腈的比例高于 30% 此范围的溶剂会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱，当醋酸和乙腈的比例低于 10% 会使样品析出，导致后续的反相色谱纯化无法进行。 0013 步骤2）：将粗肽溶液进行梯度洗脱纯化，以0.1%0.。

12、4%的硫酸和0.1%0.4%醋酸水溶液（体积比，用氨水调 pH 值 5.06.0，优选 5.5）为 A 相，乙腈为 B 相，梯度： B% ： 20% 40% ；步骤 2）下文也表述为 “纯化” 。 0014 选择0.1%0.4%的硫酸和0.1%0.4%醋酸两种酸用氨水调节后生成两种缓冲盐的 A 相是优化选择的结果，较现有技术 CN102731643A 采用 0.2%TFA 具有更好的分离效果。流动相 A 中缓冲盐的浓度低于所限定的范围使流动相缓冲能力变弱，导致样品不能完全洗脱且谱图变形达不到分离的要求。大于此范围，流动相 A 中缓冲盐的浓度过高对色谱系统损伤较。

13、大，甚至会部分产生盐析，导致无法纯化。另外，流动相 A 的 pH 值也非常重要，不在 5.06.0 范围达不到分离效果。 0015 洗脱系统中 A 相和 B 相的比例是通过大量实验筛优选得到的， B% 低于 20% 样品不能冲洗下色谱柱， B% 大于 40% 样品会提前冲出，都不能进行纯化。采用该溶剂系统纯化，分离效果较现有技术会大幅提高，本步的收率 90% 左右，所得样品的纯度在 95% 以上，大大提高收率和纯度，降低了生产成本。 0016 所述 “粗肽” 是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的特立帕肽粗肽或者纯度不能满足药用的特立帕肽，粗肽。

14、中特立帕肽的纯度在 20% 以上，采用现有技术方法 CN102731643A 的方法较难实现该浓度产品的纯化。 0017 所述步骤 2）中所使用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度优选为： 5 cm 25 cm， 10 cm 25 cm 或 30 cm 25 cm。 0018 步骤 3）采用盐析的方法对其进行进一步的纯化，使其纯度达到 99% 以上。步骤 3）下文也表述为 “盐析” 。 0019 所述 “盐析” 是指通过控制步骤 2）所得合格溶液的乙腈浓度和溶液的 pH 值，使样品析出的过程 ( 所述合格溶液是指纯度大于 95% 的样品 )。盐析的优选。

15、方法为：通过常温旋蒸的方法将步骤 2）所得合格溶液中乙腈的比例降至 10% 以下，再将其 pH 值用 20% 的稀氨水调至 5.5-7.0 后放置到 2-8 摄氏度 2 小时以上，使其析出。再将浑浊液进行离心处理，上清液作为废液处理；下层固体用体积比浓度 50%-100% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤 4）即可。 0020 所述步骤 3）中，所得合格溶液中乙腈的比例降至 10% 以下，再将其 pH 值用 20% 的稀氨水优选调至 6.5 ；放置到 2-8 摄氏度 2 小时以上，使其析出；再将浑浊液进行离心处理，上清液作为废液。

16、处理；下层固体优选用 60% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤 4）。采用该 pH 值及相应浓度的磷酸水溶液具有更好的盐析效果。 0021 该步骤提高样品的纯度，将特立帕肽的纯度从大于 95% 到大于 99.0%。另外，使用盐析方法较 CN102731643A 具有很大的成本优势，盐析的成本远远低于反相色谱处理的成本，特别是在规模化生产时尤为明显。 0022 步骤 4）采用反相高效液相色谱法将特立帕肽的硫酸盐转成醋酸盐。步骤 4）下文也表述为 “转盐” 。说明书 CN 102993293 A 4 3/5 页 5 0023 所述 “反相高效。

17、液相色谱” 的固定相为八烷基硅烷键合硅胶，转盐的方法优选为：用含 3%10% 乙腈的醋酸铵溶液冲洗 1530min，醋酸铵溶液的浓度为 0.1%0.8%，优选 0.3% ；然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，所述醋酸水溶液的浓度为 0.1%0.4%，优选为 0.2%。该洗脱步骤所采用的乙腈浓度为 40% 以上，收集特立帕肽溶液，浓缩，冷冻干燥后得特立帕肽醋酸盐。 0024 所述步骤 4）中所使用以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度优选为： 5 cm 25 cm， 10 cm 25 cm 或 30 cm 25 cm。 0025 本发明提供的纯化特立帕肽。

18、方法操作可行、纯度高（可达 99.0% 以上且最大单杂小于0.1%）、收率高（纯化收率可达80%以上），达到产业化要求（一批次可获得200克以上的精肽）。 0026 本发明采用反相色谱和盐析结合的办法进行纯化处理，有利于浓度在 20% 左右的粗肽样品的纯化，较 CN102731643A 具有很大的成本优势（盐析的成本远远低于反相色谱处理的成本），特别是在规模化生产时尤为明显。另外本发明得到的特立帕肽纯度较高可达 99.5% 以上，且任一单杂均小于 0.1%，完全符合美国和欧盟等规范国家化学药品的申报要求。本发明的纯化方法大幅提高了产品的质量，且较。

19、现有技术的纯化成本大大降低，收率也大幅提高。附图说明 0027 图 1 ：采用实施例 1 得到特立帕肽醋酸盐的 HPLC 谱图。具体实施方式 0028 实施例一： 1. 样品处理：用体积比以 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液按照不大于 50g/L 的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到 30% 以下备用。 0029 2. 纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 5 cm 25 cm 。流动相： A 相： 0.3% 硫酸和 0.2% 醋酸水溶液 (v/v)，用氨水溶液调 pH 值。

20、6.0 ； B 相：乙腈，流速： 50-80 ml/min，梯度 B% ： 20%40%，检测波长： 280 nm。进样量为 2.5g 。 0030 纯化过程：将色谱柱用 50% 以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为 2.5g。线性梯度洗脱 60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于 95% 的部分于水温不超过 35 的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于 10% 以下后备用。 0031 3. 盐析：盐析过程：将步骤 2）得到的样品溶液用 20% 的氨水将其 pH 值调至 5.5 后，再放置到 2-8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/。

21、分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用 50% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤 4）即可。 0032 4. 转盐：说明书 CN 102993293 A 5 4/5 页 6 色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 5 cm 25 cm 。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量2g，用含5%乙腈的0.3% 的醋酸铵水溶液冲洗15-30min，然后用含50%乙腈的0.2%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过35 条件下减压旋蒸浓缩至约100 mg/mL 后。

22、转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于 99.5% 的特立帕肽醋酸盐。 0033 实施例二： 1. 样品处理：用体积比以 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液按照不大于 50g/L 的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到 30% 以下备用。 0034 2. 纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 10 cm 25 cm 。流动相： A 相： 0.3% 硫酸和 0.2% 醋酸水溶液 (v/v)，用氨水溶液调 pH 值 5.5 ； B 相：乙腈，流速： 150-250 ml/mi。

23、n，梯度 B% ： 20%40%，检测波长： 280 nm。进样量为 10g 。 0035 纯化过程：将色谱柱用 50% 以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为 10g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于95%的部分于水温不超过35 的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于 10% 以下后备用。 0036 3. 盐析：盐析过程：将步骤 2）得到的样品溶液用 20% 的氨水将其 pH 值调至 6.0 后，再放置到 2-8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用 80% 的磷酸。

24、水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤 4）即可。 0037 4. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 10 cm 25 cm 。将色谱柱用 50% 以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量 10g，用含 5% 乙腈的 0.3% 的醋酸铵水溶液冲洗 15-30min，然后用含 50% 乙腈的 0.2% 的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过 35 条件下减压旋蒸浓缩至约 100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于 99.5% 的特立帕肽醋酸盐。 0038 实施例三：。

25、1. 样品处理：用体积比以 10%30% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液按照不大于 50g/L 的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到 30% 以下备用。 0039 2. 纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 15 cm 25 cm 。流动相： A 相： 0.3% 硫酸和 0.2% 醋酸水溶液 (v/v)，用氨水溶液调 pH 值 5.0 ； B 相：乙腈，流速： 350-600 ml/min，梯度 B% ： 20%40%，检测波长： 280 nm。进样量为 25g 。 0040 纯化过。

26、程：将色谱柱用 50% 以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为 25g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于95%的部分于水温不超过35 说明书 CN 102993293 A 6 5/5 页 7 的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于 10% 以下后备用。 0041 3. 盐析：盐析过程：将步骤 2）得到的样品溶液用 20% 的氨水将其 pH 值调至 6.5 后，再放置到 2-8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用 100% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后。

27、转入步骤 4）即可。 0042 4. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 15 cm 25 cm 。将色谱柱用 50% 以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量 25g，用含 5% 乙腈的 0.3% 的醋酸铵水溶液冲洗 15-30min，然后用含 50% 乙腈的 0.2% 的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过 35 条件下减压旋蒸浓缩至约 100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于 99.5% 的特立帕肽醋酸盐。 0043 实施例四： 1. 样品处理：用体积比以 10%30。

28、% 的醋酸和 5%20% 的乙腈水溶液按照不大于 50g/L 的浓度溶解粗肽；用水将粗肽溶液中的有机相比例稀释到 30% 以下备用。 0044 2. 纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 30 cm 25 cm 。流动相： A 相： 0.3% 硫酸和 0.2% 醋酸水溶液 (v/v)，用氨水溶液调 pH 值 5.5 ； B 相：乙腈，流速： 50-80 ml/min，梯度 B% ： 20%40%，检测波长： 280 nm。进样量为 100g 。 0045 纯化过程：将色谱柱用 50% 以上的乙腈冲洗干净。

29、后平衡上样，上样量为 100g。线性梯度洗脱 60min，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液纯度大于 95% 的部分于水温不超过 35 的条件下减压旋蒸浓缩至乙腈浓度小于 10% 以下后备用。 0046 3. 盐析：盐析过程：将步骤 2）得到的样品溶液用 20% 的氨水将其 pH 值调至 6.5 后，再放置到 2-8摄氏度冰箱中3小时后取出，用3分钟3000转/分的方法进行离心处理，上清液作为废液处理，下层固体用 60% 的磷酸水溶液将其溶解后，再用注射用水稀释一倍后转入步骤 4）即可。 0047 4. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 30 cm 25 cm 。将色谱柱用 50% 以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量 100g，用含 5% 乙腈的 0.3% 的醋酸铵水溶液冲洗 15-30min，然后用含 50% 乙腈的 0.2% 的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的特立帕肽溶液于水温不超过 35 条件下减压旋蒸浓缩至约 100 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于 99.5% 的特立帕肽醋酸盐。说明书 CN 102993293 A 7 1/1 页 8 图 1 说明书附图 CN 102993293 A 8 。

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