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1、(10)申请公布号 CN 102994388 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994388 A *CN102994388A* (21)申请号 201210509349.9 (22)申请日 2012.11.23 C12N 1/04(2006.01) (71)申请人 常州市肿瘤医院 地址 213002 江苏省常州市钟楼区怀德北路 1 号 (72)发明人 朱长太 凌扬 董春雷 孔颖泽 张长松 万美珍 刘永萍 吴婷婷 (74)专利代理机构 常州市江海阳光知识产权代 理有限公司 32214 代理人 孙晓晖 (54) 发明名称 菌种保藏液和菌种保藏方法 (57) 摘要 本发明公开。
2、了一种菌种保藏液和菌种保藏 方法。该菌种保藏液以 100mL 溶液计含有酵母 粉 0.2g 0.6g、 氯化钠 0.4g 1.0g、 二甲亚砜 2mL 10mL、 甘油 10mL 30mL、 其余为水。该菌 种保藏方法是将待保藏菌种加入上述菌种保藏液 中， 混合均匀， 得到待保藏菌液。用无菌滤纸吸取 待保藏菌液， 得到含菌滤纸 ； 用无菌透明胶带将 含菌滤纸固定在无菌蜡纸上， 然后置于冰箱中保 藏。 本发明菌种保藏液可长时间维持微生物活力、 保藏期较长。本发明的菌种保藏方法生物安全性 和保存效能均较高， 操作方便且转运方便， 特别是 当菌种数量时具有储存空间小且便于查找。 (51)Int.Cl。
3、. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种菌种保藏液， 其特征在于 ： 以 100mL 溶液计含有酵母粉 0.2g 0.6g、 氯化钠 0.4g 1.0g、 二甲亚砜 2mL 10mL、 甘油 10mL 30mL、 其余为水。 2.根据权利要求1所述的菌种保藏液， 其特征在于 ： 以100mL溶液计含有酵母粉0.5g、 氯化钠 0.6g、 二甲亚砜 5mL、 甘油 20mL、 其余为水。 3. 根据权利要求 1 所述的菌种保藏液， 其特征在于 ： 。
4、以 100mL 溶液计还含有胰蛋白 0.8g 1.2g 和葡萄糖 0.2g 0.6g。 4.根据权利要求3所述的菌种保藏液， 其特征在于 ： 以100mL溶液计含有胰蛋白1.0g、 酵母粉 0.5g、 氯化钠 0.6g、 葡萄糖 0.5g、 二甲亚砜 5mL、 甘油 20mL、 其余为水。 5. 一种菌种保藏方法， 其特征在于具有以下步骤 ： 将待保藏菌种加入菌种保藏液中， 混合均匀， 得到待保藏菌液 ； 所述菌种保藏液以 100mL 溶液计含有酵母粉 0.2g 0.6g、 氯化钠 0.4g 1.0g、 二甲亚砜 2mL 10mL、 甘油 10mL 30mL、 其余为水 ； 用无菌滤纸吸取步骤。
5、得到的待保藏菌液， 得到含菌滤纸 ； 用无菌透明胶带将步骤得到的含菌滤纸固定在无菌蜡纸上， 然后置于冰箱中保 藏。 6. 根据权利要求 5 所述的菌种保藏方法， 其特征在于 ： 所述无菌滤纸根据待保藏菌种 数量至少设有一张 ； 每张无菌滤纸吸取待保藏菌液后得到的含菌滤纸一侧相应设有一张作 为标识的贴纸。 7. 根据权利要求 6 所述的菌种保藏方法， 其特征在于 ： 所述无菌蜡纸根据待保藏菌种 数量至少设有一张 ； 所述无菌蜡纸多于一张时， 则由文件夹夹装， 并将该文件夹置于冰箱中 保藏。 8. 根据权利要求 5 至 7 之一所述的菌种保藏方法， 其特征在于 ： 所述菌种保藏液以 100mL 溶。
6、液计含有酵母粉 0.5g、 氯化钠 0.6g、 二甲亚砜 5mL、 甘油 20mL、 其余为水。 9. 根据权利要求 5 至 7 之一所述的菌种保藏方法， 其特征在于 ： 所述菌种保藏液以 100mL 溶液计还含有胰蛋白 0.8g 1.2g 和葡萄糖 0.2g 0.6g。 10. 根据权利要求 9 所述的菌种保藏方法， 其特征在于 ： 所述菌种保藏液以 100mL 溶液 计含有胰蛋白 1.0g、 酵母粉 0.5g、 氯化钠 0.6g、 葡萄糖 0.5g、 二甲亚砜 5mL、 甘油 20mL、 其余 为水。 权 利 要 求 书 CN 102994388 A 2 1/4 页 3 菌种保藏液和菌种保。
7、藏方法 技术领域 0001 本发明属于微生物工程技术领域， 具体涉及一种菌种保藏液和菌种保藏方法。 背景技术 0002 菌种保藏在微生物研究及实际应用中必不可少。由于微生物具有容易变异的特 性， 因此， 在保藏过程中， 必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态， 才能在长 时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 0003 目前菌种保藏方法主要有以下几种 ： （1） 传代培养保藏法。该方法又包括斜面培养、 穿刺培养、 疱肉培养基培养作保藏厌氧 细菌用） 等几种。 0004 （2） 液体石蜡覆盖保藏法。该方法是传代培养的变相方法， 能够适当延长保藏时 间。 0005 （3） 载体保藏法。该方。
8、法是将微生物吸附在适当的载体 （如土壤、 沙子、 硅胶等） 上， 然后进行干燥的保藏法。 0006 （4） 寄主保藏法。用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物， 如病毒、 立克次 氏体、 螺旋体等， 它们必须在生活的动物、 昆虫、 鸡胚内感染并传代， 此法相当于一般微生物 的传代培养保藏法。 0007 （5） 冷冻保藏法。可分为低温冰箱法 （-20 -30或者 -50 -80） 、 干冰酒 精快速冻结法 （约 -70 ） 和液氮法 （-196） 等。 0008 上述几种方法各有优缺点， 但总的来说仍然存在以下缺点 ：（1） 不能长时间维持 微生物活力， 保藏期较短。 （2） 生物安全性较低，。
9、 保存效能较低。 （3） 操作繁琐， 保存不便， 难以转运。 （4） 当菌种数量较多时， 储存空间较大， 而且不便查找。 发明内容 0009 本发明的目的之一在于针对现有技术的不足， 提供一种可长时间维持微生物活 力、 保藏期较长的菌种保藏液。 0010 本发明的另一目的在于针对现有技术的不足， 提供一种生物安全性和保存效能均 较高、 操作方便且转运方便、 特别是当菌种数量时具有储存空间小且便于查找的菌种保藏 方法。 0011 实现本发明目的之一的技术方案是 ： 一种菌种保藏液， 以 100mL 溶液计含有酵母 粉 0.2g 0.6g、 氯化钠 0.4g 1.0g、 二甲亚砜 2mL 10mL。
10、、 甘油 10mL 30mL、 其余为水。 优选以 100mL 溶液计含有酵母粉 0.5g、 氯化钠 0.6g、 二甲亚砜 5mL、 甘油 20mL、 其余为水。 0012 该菌种保藏液以100mL溶液计还含有胰蛋白0.8g1.2g和葡萄糖0.2g0.6g。 优选以 100mL 溶液计含有胰蛋白 1.0g、 酵母粉 0.5g、 氯化钠 0.6g、 葡萄糖 0.5g、 二甲亚砜 5mL、 甘油 20mL、 其余为水。 0013 本发明的另一目的的技术方案是 ： 一种菌种保藏方法， 具有以下步骤 ： 将待保 说 明 书 CN 102994388 A 3 2/4 页 4 藏菌种加入上述菌种保藏液中，。
11、 混合均匀， 得到待保藏菌液。 用无菌滤纸吸取步骤得到 的待保藏菌液， 得到含菌滤纸 ； 用无菌透明胶带将步骤得到的含菌滤纸固定在无菌蜡 纸上， 然后置于冰箱中保藏。 0014 当待保藏菌种数量较多而使得无菌滤纸 （或含菌滤纸） 较多的情况下， 则可以将多 张含菌滤纸呈阵列固定在无菌蜡纸的一面， 并且每张含菌滤纸一侧相应设有一张作为标识 的贴纸， 用于记载菌种名称、 保藏日期以及鉴定号等， 从而起到清楚地标识作用， 便于查找。 0015 当待保藏菌种数量较多而使得一张无菌蜡纸的一面不够使用的情况下， 则可以将 含菌滤纸及贴纸设置在同一张无菌蜡纸的另一面。 0016 而当待保藏菌种数量较多而使得。
12、一张无菌蜡纸的两面都不够使用的情况下， 可以 采用多张无菌蜡纸， 并由文件夹夹装， 并将该文件夹置于冰箱中保藏。 文件夹扉页设有生物 安全标识， 首页则标有目录和索引， 从而进一步起到清楚标识作用， 便于查找。 0017 本发明具有的积极效果 ：（1） 本发明的菌种保藏液中的二甲亚砜和甘油可通过氢 和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型， 以防止因冷冻或水分不断升 华对细胞的损害。而酵母粉和氯化钠则可为细菌提供能量， 防止其死亡。从而使得该菌种 保藏液可长时间维持微生物活力， 大大延长了保藏期。 （2） 本发明的菌种保藏液中的胰蛋白 和葡萄糖可进一步为细菌提供能量， 从而进一步维。
13、持微生物活力。使用本发明的方法在使 菌种在 -18保藏两年以及在 25复苏一个月均存活。 （3） 本发明的菌种保藏方法采用具 有良好的吸水性及粘附性的无菌滤纸作为粘附介质， 并且采用具有良好的隔绝空气作用的 蜡纸以及透明胶带， 这样能够保证所保藏菌种的无氧状态， 生物安全性和保存效能均较高。 （4） 本发明的菌种保藏方法操作简便， 转运方便， 细菌生存期长， 可储存于普通冰箱冻藏室， 非常适合临床微生物菌种实验室分离的细菌、 酵母菌及丝状真菌的日常保藏及转运。 （5） 本 发明一方面在待保藏菌种较多而使得含菌滤纸较多的情况下， 可将多张含菌滤纸呈阵列设 置在无菌蜡纸上， 并且采用贴纸记载菌种名。
14、称、 保藏日期以及鉴定号等， 从而起到清楚地标 识作用， 便于查找。 另一方面在待保藏菌种更多而使无菌蜡纸较多的情况下， 以文件夹方式 存储菌种， 其扉页设有生物安全标识， 首页则标有目录和索引， 从而进一步起到清楚标识作 用， 便于查找。特别是还大大减小了储存空间。 附图说明 0018 图 1 为多张含菌滤纸呈阵列设置在无菌蜡纸一面的示意图。 具体实施方式 0019 （实施例 1） 本实施例为菌种保藏液的配制。 0020 将 1.0g 的胰蛋白、 0.5g 的酵母粉、 0.6g 的氯化钠、 0.5g 葡萄糖、 5.0mL 的二甲亚 砜、 20mL 的甘油加入到 150mL 的烧瓶中， 然后加。
15、水至 100mL， 充分混匀溶解后， 在 0.1MPa 的 压力以及 121的温度下进行 20min 的灭菌， 得到菌种保藏液。 0021 （实施例 2 实施例 5） 各实施例的菌种保藏液的配制与实施例 1 基本相同， 不同之处见表 1。 0022 表 1 说 明 书 CN 102994388 A 4 3/4 页 5 实施例 1实施例 2实施例 3实施例 4实施例 5 胰蛋白1.0g0.8g1.2g- 酵母粉0.5g0.2g0.6g0.5g0.4g 氯化钠0.6g1.0g0.4g0.6g0.7g 葡萄糖0.5g0.6g0.2g- 二甲亚砜5mL10mL2mL5mL8mL 甘油20mL12mL3。
16、0mL20mL10mL 水补足 100mL 补足 100mL 补足 100mL 补足 100mL 补足 100mL 0023 （准备例） 首先准备无菌滤纸、 无菌透明胶带、 无菌蜡纸以及无菌镊子。 0024 将滤纸剪成若干个 0.31.4cm 的小条， 装入安瓿管中， 塞以棉塞， 在 0.1MPa 的压 力下以及 121的温度下进行 20min 的灭菌， 得到若干个无菌滤纸， 备用。 0025 透明胶带和蜡纸 （15cm10cm） 在使用前用环氧乙烷灭菌， 即得无菌透明胶带和无 菌蜡纸， 备用。 0026 镊子使用酒精灯火焰灼烧即得无菌镊子， 备用。 0027 （实施例 6） 本实施例为单个菌。
17、种的保藏方法， 具有以下步骤 ： 将鲍曼不动杆菌于血平板37培养18h， 得到待保藏菌种。 挑取3个菌落滴入0.5mL 实施例 1 制得的菌种保藏液中， 混合均匀， 得到待保藏菌液。 0028 用无菌镊子夹取一张无菌滤纸吸取步骤得到的待保藏菌液， 得到含菌滤纸 2。 0029 用无菌透明胶带将步骤得到的含菌滤纸 2 固定在无菌蜡纸 1 上， 然后立即将 该无菌蜡纸 1 置于 -18的冰箱中保藏即可。 0030 复苏时， 只需要先将无菌蜡纸 1 放置在环境温度 （0 40） 下 20min， 即可将无菌 透明胶带连同含菌滤纸 2 一起取下， 将含菌滤纸 2 接触无菌蜡纸 1 的一面涂于血平板一区。
18、， 划线分区， 于 37培养 18h， 即可得到鲍曼不动杆菌单个菌落。 0031 另外， 出于实验或研究目的， 如需转运， 只需将无菌蜡纸 1 置于厚透明塑料袋中， 密封后即可转运 （新鲜菌种一个月内可抵达目的地而无需低温转运） 。 0032 （实施例 7） 本实施例为多个菌种的保藏方法 ： 见图 1， 将金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、 肺炎克雷伯菌、 阴沟肠杆菌、 产气肠杆菌、 铜绿 假单胞菌、 白色假丝酵母菌、 曲霉菌、 毛霉菌等临床分离的常见微生物按照实施例 6 的菌种 保藏方法分别固定在无菌蜡纸 1 的一面， 且呈阵列放置。每张含菌滤纸 2 一侧均设有一张 贴纸 3， 用于记载菌种名称。
19、、 保藏日期、 鉴定号等标识， 从而起到清楚地标识作用， 便于查找。 0033 若待保藏菌种的数量较多而使得一张无菌蜡纸 1 的一面不够使用的情况下， 则可 以将含菌滤纸 2 及贴纸 3 设置在同一种无菌蜡纸 1 的另一面。 0034 若待保藏菌种的数量较多而使得一张无菌蜡纸 1 的两面均不够使用的情况下， 则 可以采用多张无菌蜡纸 1， 并由文件夹夹装， 并将该文件夹置于 -18的冰箱中保藏。文件 夹的扉页设有生物安全标识， 文件夹的首页设有目录和索引， 从而进一步起到清楚标识作 用， 便于查找。 0035 （实验例） 对部分菌种在使用本发明的方法保藏两年内以及复苏一个月内的存活性进行检测，。
20、 结 说 明 书 CN 102994388 A 5 4/4 页 6 果见表 2。 0036 表 2 不同保藏时期菌种活力检测 菌种鲍曼不动杆菌金黄色葡萄球菌产气肠杆菌曲霉菌 毛霉菌 保藏三个月 （-18）存活存活存活存活存活 保藏六个月 （-18）存活存活存活存活存活 保藏一年 （-18）存活存活存活存活存活 保藏两年 （-18）存活存活存活存活存活 复苏半个月 （25）存活存活存活存活存活 复苏一个月 （25）存活存活存活存活存活 0037 由表2可知， 使用本发明的保藏方法在-18保藏两年以及在25复苏一个月， 所 有菌种均存活。 说 明 书 CN 102994388 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102994388 A 7 。