一种导管细菌生物被膜感染动物模型的构建方法 【技术领域】
本发明涉及一种导管细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，特别是一种气管导管细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，属于医学模型领域。
背景技术
近年来，经气管插管机械通气的治疗已成为抢救危重病人的重要治疗手段。呼吸机相关性肺炎是机械通气治疗带来的严重并发症，发生率和死亡率较高，病情反复，抗生素疗效差，是临床面临的棘手问题。机械通气患者气管导管细菌生物被膜的存在已被大量研究证实，近年来在呼吸机相关性肺炎的发病机制研究中，发现气管导管细菌生物被膜与呼吸机相关性肺炎之间存在密切相关性。细菌生物被膜是细菌黏附于活性或惰性材料表面形成的与浮游细胞相对应的生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质组成，使细菌耐药性增加，感染难以清除，从而成为一个持续存在的感染源，是导致慢性感染的一个重要原因。细菌生物被膜相关性的感染已成为临床上非常棘手的问题，所以，建立一种新型的更符合临床实际情况的、简单、可靠的气管导管相关性细菌生物被膜感染模型，用以进行气管导管相关性细菌生物被膜感染的体内研究，从而进一步开发抗气管导管相关性细菌生物被膜药物及药物筛选、疗效评价是临床上需要迫切解决的问题。
近年来，针对细菌生物被膜的形成和发展以及干预进行了大量的体外研究，但针对气管导管相关性生物被膜的体内研究相对较少。而进行体内研究的第一步就是建立气管导管相关性细菌生物被膜感染的动物模型。目前，气管导管相关性生物被膜感染的动物模型主要有以下两种：一是将灭菌的导管插入气管后，将一定量菌液通过导管注入肺内；另一种是将带菌的导管在导管内针管的引导下经口插入气管，将针管拔出后留置导管于气管内。前者与临床上气管导管相关性生物被膜感染的实际形成过程不相符合，且主要反映的不是气管内而是肺内细菌生物被膜形成情况；后者操作复杂、技术要求高，同时在操作的过程中易破坏导管上的生物膜，影响实验准确性，且导管在气管内不固定，易造成导管脱落、丢失，使实验失败。因此，基于以上模型的体内研究所得出的结果对于临床治疗的应用价值也受到影响。
【发明内容】
本发明的目的是建立一种简单易行、对研究者技术要求低，模型制作成功率高，能有效模拟体内气道微环境的导管相关性细菌生物被膜感染动物模型的构建方法。
为达到上述目的，本发明采取如下的技术方案：一种导管细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，包括：体外构建附着细菌生物被膜的导管，将导管固定在实验动物气管内，对动物模型相关指标进行鉴定。
所述实验动物是SD大鼠。
具体地说，所述附着细菌生物被膜导管的体外构建方法是挑取细菌接种于培养液中培养，接种菌液于无菌盖玻片上培养，得到成熟细菌生物被膜。
更具体地说，附着细菌生物被膜导管的体外构建中，所述用于接种的细菌是铜绿假单胞菌临床分离株单菌落；培养液为L-Broth培养液；培养条件是37℃，200rpm，过夜培养；接种于无菌盖玻片的菌液是分光光度计测定OD600值为0.5的菌液；所述无菌盖玻片是作为细菌生物被膜生长的载体，带有24孔细胞培养板，尺寸是8mm×8mm，其细胞培养板是容纳菌液的；生物被膜培养方式是隔日换液，培养周期为7天。
上述导管在实验动物气管内的固定方法是：切开实验动物的气管，将附着细菌生物被膜的导管插入并缝在气管内。
本发明分别经术后第4天和第7天处死SD大鼠，对SD大鼠相关指标进行常规鉴定，包括：导管上铜绿假单胞菌生物被膜形态的SEM检测、导管菌落计数、肺部病理改变和/或肺部菌落计数进行鉴定。
本发明通过将体外培养的附着细菌生物被膜的导管固定在实验动物如大鼠的气管内，有效地模拟了体内气道微环境，使得导管上的细菌生物被膜能够在气管微环境中稳定地形成和发展，获得的细菌生物被膜的生理形态与实际相似、且稳定性好，从而为进一步开发研究抗气管导管相关性细菌生物被膜的药物及其药物的筛选提供了可靠的细菌生物被膜来源。同时，该构建方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。
【附图说明】
图1为实施例中各组导管上铜绿假单胞菌生物被膜形态扫描电镜图。
图2为各组大鼠肺部病理改变扫描电镜图(x 200)。
具体实施方式：
1.附着细菌生物被膜导管的体外构建
挑取铜绿假单胞菌临床分离株单菌落接种于L-Broth培养液中，37℃，200rpm振荡培养过夜，分光光度计测定菌液OD600值，调整OD600值至0.5，接种菌液于预先放置无菌盖玻片(8mm×8mm，作为生物被膜生长的载体)的24孔细胞培养板中，每孔1ml，隔日换液，7天后得到有成熟生物被膜附着的盖玻片，每次随机取两只培养管采用平板稀释法进行菌落计数。
2.动物模型地制备
(1)动物分组
将40只SD大鼠(体重130-160g/只)随机分为2组，每组20只；
第一组为细菌生物被膜感染组，将体外培养7天后得到的附有成熟生物被膜的导管通过气管切开插入并固定于气管内，每天给予生理盐水1ml/只；
第二组为空白导管对照组，将无菌导管通过气管切开插入并固定于气管内，每天给予生理盐水1ml/只；
(2)动物模型建立过程
①取10％水合氯醛0.3ml/100g麻醉大鼠；
②固定大鼠四肢和头，将颌下至两前腿之间的皮毛剪掉，用碘酒从中间向外周消毒，再用酒精脱碘；
③用镊子提起皮肤，用小剪刀剪开一个小口，再在消毒范围的正中，从颌下至胸部剪一个长约1.5cm的小口；
④用剪刀剪开浅筋膜，直至暴露肌肉，用弯钳从中央钝性分离肌肉直至暴露气管；
⑤分离气管周围组织，将小管垫放到气管下；
⑥用小剪刀垂直剪开气管一个长约0.5cm的小口；
⑦将空白导管或长有生物被膜的导管放入气管内，再用小缝线针穿过气管切口远端最近的软骨间肌肉，并穿过导管，从切口近段最远的软骨间肌肉穿出，先拉紧缝线，观察大鼠呼吸情况，如平稳即可结扎。
⑧将皮下组织理顺盖好，将皮肤缝合后用酒精消毒伤口。
各组均于第4天和第7天处死10只大鼠。
3.模型建立评价方法
(1)导管上铜绿假单胞菌生物被膜形态的SEM检测
在各时间段，处死大鼠后，每组随机取出2只大鼠的导管，纵切分开取一半立即用2.5％戊二醛PBS溶液中固定2h后，再经0.1molPBS冲洗2次(pH＝7.2)，30％～100％系列浓度乙醇脱水后，经50％～100％叔丁醇置换，干燥、离子溅射仪喷金，经过SEM观察铜绿假单胞菌生物被膜微观形态；
(2)导管菌落计数
在各时间段，处死大鼠后，每组取出8只大鼠的导管，纵切分开取一半置于1ml无菌生理盐水中，振荡30分钟后取100ml平铺于LB琼脂平板上，37℃孵育过夜后计数平板上菌落数；
(3)肺部病理改变
于各时间点处死大鼠后取出肺，取一块置4％多聚甲醛固定，石蜡切片，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察肺病理变化，肺部病理改变用肺部大体病理改变指数(Lung indexof macroscopic pathology，LIMP)来表示，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比；
(4)肺部菌落计数
于各时间点处死大鼠后无菌取出肺，取下一块肺组织进行匀浆(每10mg肺组织加入6μl无菌生理盐水)。取匀浆液100ml平铺于LB琼脂平板上，37℃孵育过夜后计数平板上菌落数。
4.模型建立的评价结果
(1)导管上铜绿假单胞菌生物被膜形态
如图1所示，
A代表术后4天生物被膜感染组；B代表术后空白导管对照组；
C代表术后7天生物被膜感染组；D代表术后7天空白导管对照组。
手术后第4天，可见细菌生物被膜感染组大鼠的气管导管上生物被膜成片状，周围有厚薄不均的黏液状物质连接成一大片，细菌包裹其内；空白导管对照组可见管内壁有少量形状不一的细菌聚集。而在手术后第7天，可见细菌生物被膜感染组大鼠的气管导管上生物被膜与大量粘液性物质混合，细菌深埋其内；在空白导管对照组，可见聚集的细菌外有团簇样物质包绕。
(2)导管菌落计数
表1各组大鼠气管导管菌落计数(lgCFU，x±s)
Table1 Bacterial count in biofilm on the tube(lgCFU，x±s)
生物被膜感染组 空白导管对照组 第4天 8.5669±0.11★ 6.2425±0.023 第7天 8.5009±0.013★ 6.3933±0.065
注：★表示与同时间段生物被膜感染组相比，F＝87.6和507.58，p＜0.05。
结果显示，在各个时间段，空白导管对照组检出的细菌明显少于细菌生物被膜感染组。
(3)肺部病理改变
如图2所示，
A为术后4天生物被膜未干预组；B为术后7天生物被膜未干预组；
C为术后4天空白导管对照组；D为术后7天空白导管对照组。
表2各组大鼠肺部LIMP积分，x±s
Table2 LIMP score of lungs，x±s
生物被膜感染组 空白导管对照组 第4天 0.1929±0.025★ 0.0286±0.005 第7天 0.2357±0.031★ 0.04±0.009
注：★表示与同时间段生物被膜感染组相比，F＝4.9，p＜0.05。
在各时间段，空白导管组均低于同时间的细菌生物被膜感染组LIMP积分(p＜0.05)。
(4)肺部菌落计数
表3各组大鼠肺部菌落计数(lgCFU，x±s)
Table3 Bacterial count in lungs(lgCFU，x±s)
生物被膜感染组 空白导管对照组 第4天 6.3216±0.11★ 5.2483±0.061 第7天 6.1729±0.013★ 5.1283±0.075
注：★表示与同时间段生物被膜感染组相比，F＝52.3，p＜0.05。
结果显示，空白导管对照组检出的细菌明显少于细菌生物被膜感染组