一种生产转基因克隆猪的激活方法.pdf

本发明公开了一种生产转基因克隆猪的激活方法，采用电激活与化学激活的联合激活，在采用电激活前，先用放线菌酮激活处理3min～25min。作为优选，放线菌酮激活的处理时间为10～20min；进一步优选，放线菌酮激活的处理时间为10min；放线菌酮激活处理的浓度为5～10μg/mL。本发明通过改变通常联合激活方式的顺序，采用先化学激活后电激活的方案，并缩短激活方案中化学辅助激活的时间，可以得到与原来先电激活后化学激活并较长时间的组合激活方案相似的胚胎发育能力，以及较低的囊胚凋亡率和囊胚阶段的DNA甲基化水平，将该方案生产的胚胎移植后成功生产转基因克隆猪。

权利要求书一种生产转基因克隆猪的激活方法，采用电激活与化学激活的联合激活，其特征在于，在采用电激活前用放线菌酮激活处理3min～25min。
根据权利要求1所述的激活方法，其特征在于，所述放线菌酮激活的处理时间为10～20min。
根据权利要求2所述的激活方法，其特征在于，所述放线菌酮激活的处理时间为10min。
根据权利要求1‑3任何一项所述的激活方法，其特征在于，所述放线菌酮激活的浓度为5～10μg/mL。

说明书一种生产转基因克隆猪的激活方法
 
技术领域
本发明涉及转基因克隆猪的生产，尤其涉及一种生产转基因克隆猪的激活方法。
背景技术
克隆的效率低下和发育异常的一个主要原因是克隆胚的表观水平，如全基因组甲基化水平存在异常。
克隆胚的激活是启动克隆胚胎发育的关键，常用克隆胚的激活方案有物理激活（如电脉冲刺激、机械刺激、温度变化等）和化学激活（如钙离子载体，乙醇、蛋白合成抑制剂、蛋白激酶抑制剂等)。方法虽不同，但其激活机理基本是一致的，均是要使停止在 MⅡ阶段的卵母细胞恢复分裂。化学激活对猪孤雌胚/克隆胚的激活能力较差，电激活是克隆猪生产中主要的激活方法，世界首批克隆猪都是用电激活方案获得，而后人对电激活参数进行了优化，通过提高脉冲次数、降低场强、增加激活液中的Ca2+浓度以及激活前孵育2~3h等策略来改善克隆胚的发育。尤其是在电激活的之后，再利用化学辅助激活处理克隆胚胎的研究较多；在常用的化学辅助激活试剂中，6‑DMAP辅助激活因易导致大部分（58%以上）胚胎倍性异常而被谨慎使用。放线菌酮（以下简称为CHX）作为蛋白质合成抑制剂，在单独使用时不能激活猪的克隆胚，但在电激活之后使用，明显改善了克隆胚的发育能力，因此，CHX被广泛应用于克隆猪的生产中，电激活后使用CHX处理4～6h（小时）成为当前较为流行的克隆胚激活方案。
在现有的激活方案中，通常采用的是在电激活后，使用CHX处理4～6h的激活方案，该方案中由于要把转基因克隆胚放在化学辅助激活剂CHX中处理4～6h，在CHX暴露时间长，会造成胚胎凋亡率的上升和产生过高的全基因甲基化水平从而可能影响克隆效率和后代健康，且要耗费大量时间和人力成本。
即使在采用上述电激活后的CHX处理的方案中，将CHX激活时间缩短至2～3h，辅助激活对胚胎发育的提高效果亦将消失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生产转基因克隆猪的激活方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种生产转基因克隆猪的激活方法，系采用电激活与化学激活的联合激活方法，在采用电激活前用放线菌酮激活处理3min～25min。
优选的是，放线菌酮激活的处理时间为10～20min。
进一步优选的是，放线菌酮激活的处理时间为10min。
另外一个优选是，放线菌酮激活处理的浓度为5～10μg/mL。
本发明的有益效果是：
通过改变常规的联合激活方式的顺序，采用先化学激活、再电激活的方案，并缩短激活方案中化学辅助激活的时间，可以得到与常规的先电激活、后化学激活并花费较长时间的组合激活方案相似的胚胎发育能力，以及较低的囊胚凋亡率和囊胚阶段的DNA甲基化水平，将该方案生产的胚胎移植后成功生产转基因克隆猪。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明生产转基因克隆猪的激活方法实施例的操作流程图。
具体实施方式
一种生产转基因克隆猪的联合激活方法，在采用电激活前用放线菌酮处理10min。其中放线菌酮处理的浓度为10μg/mL。
本实施例采用在电激活前CHX处理10min，与通常的先电激活后CHX处理4h相比，发现可以降低克隆胚胎的全基因组甲基化水平，而较高的甲基化水被认为是克隆胚发育能力低下的原因。使用本实施例的激活方案（电激活前使用CHX辅助处理10min），我们成功获得健康的转基因克隆猪。
如图1所示，生产转基因克隆猪的联合激活方法的具体实施步骤如下：
1、猪卵母细胞的体外成熟：将从屠宰场刚摘取的猪卵巢，放入37℃含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，2h 内运回实验室。无菌生理盐水洗涤3遍，配有18号针头的10 mL一次性塑料注射器抽取卵巢上2～6 mm直径的卵泡，在带有热台的体视镜下迅速捡取胞质均匀，有2层以上且包裹完整的卵丘细胞COCs，获得的COCs用成熟液洗3遍后转入在38.5℃，5%CO2，100％湿度的二氧化碳培养箱中平衡4h以上的石蜡油覆盖的成熟培养滴中培养42 ±2 h，每50μL成熟液滴培养 15～20枚COCs或是Nunc四孔皿每孔培养100～120枚。
2、脱除卵丘：将成熟培养42小时后的COCs移入已用37℃预热的含1 mg/ml透明质酸酶的DPBS中，再用移液器装上吸嘴吹打3min，将脱完卵丘的卵母细胞移入T2（TCM199+2%FBS）液滴洗涤3次，移进矿物油覆盖的T2滴中备用。
3、体细胞的准备：供核细胞采用培养第3～9代胎儿成纤维细胞或耳成纤维细胞体细胞，选择汇合度在60%～90%的细胞，于显微操作1 h前，按正常细胞传代后，并保存在4 ℃冰箱中待用。
4、体细胞核移植：脱除卵丘后，在显微镜下挑选排出第一极体且卵胞膜完整的卵母细胞，将卵母细胞和体细胞一起放入显微操作皿的核移植操作液，即为HEPES缓冲的含7.5μg/mL细胞松驰素B（CB）及2%FBS的TCM199中。盲吸法去核，之后用去核针吸取体细胞，从去核切口进入卵母细胞透明带下注核，轻轻点压透明带，使体细胞与胞质膜紧密接触。操作完后将重构卵转移到石蜡油覆盖好的T2液滴中，在38.5℃的恒温箱中恢复30min。
5、重构卵的融合与激活：将T2中已恢复好的重构卵在化学辅助激活液CHX （PZM‑3+10μg /mL CHX+10μg/mL CB）处理10min，进行激活，然后用CF‑150B融合仪（BLS，匈牙利）施加单个156V/mm，100μs的直流电脉冲诱导融合同时电激活，PZM‑3培养液洗涤3遍后，转入盖矿物油的胚胎培养液PZM‑3中，38.5℃，5％CO2，100％湿度培养，1 h后取出，在体视显微镜下判定融合。
6、胚胎培养：将判断融合的重构胚用胚胎培养液洗涤3遍后转入预平衡4h以上的胚胎培养滴内，每个培养滴培养10～15枚胚胎或是Nunc四孔板培养。在38.5℃，5% CO2，100%湿度条件下继续培养.
7、胚胎移植：胚胎培养至24或48小时后，收集卵裂的克隆胚胎，再移植入发情同步的受孕母猪子宫内，体内发育直至出生（申请人所在实验室应用该激活方法已获得健康的转基因克隆猪）。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。