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1、(10)申请公布号 CN 103074372 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074372 A *CN103074372A* (21)申请号 201110329199.9 (22)申请日 2011.10.26 C12N 15/85(2006.01) (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 戴一凡 陈凌懿 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 (54) 发明名称 提高猪的瘦肉率、 肌间脂肪含量和生殖能力 的转基因载体 (57) 摘要 本发明公开了一种提高猪的瘦肉率、。
2、 肌间脂 肪含量和生殖能力的转基因载体， 该转基因载体 含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase， MCK)增强子、 2kb猪的-骨骼肌肌动蛋白基因的 启动子、 猪的 PEPCK-C 的 cDNA 和牛生长激素基因 的 3 端不翻译区域， 且带有哺乳动物细胞中筛选 用的抗性基因 - 嘌呤霉素基因和原核细胞中筛 选用的抗性基因 - 博莱霉素基因。本发明的转基 因载体可应用于体细胞克隆， 以构建高瘦肉率、 高 肌间脂肪含量和高生殖能力的 PEPCK-Cmus转基因 猪。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 11 页 附图 2 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表11页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103074372 A CN 103074372 A *CN103074372A* 1/1 页 2 1. 一种提高猪的瘦肉率、 肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体， 其特征在于， 该转 基因载体含有小鼠的肌酸激酶增强子、 2kb 猪的 - 骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、 猪的 PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因的3 端不翻译区域， 且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗 性基因 - 嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因 - 博莱霉素基因。 权 利 要 求 书 CN 10。
4、3074372 A 2 1/4 页 3 提高猪的瘦肉率、 肌间脂肪含量和生殖能力的转基因载体 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种提高猪的瘦肉率、 肌间脂肪含量和 生殖能力的转基因载体。 背景技术 0002 猪肉作为中国人民的主要肉类食品， 保证全国人民有充足的、 优质的猪肉供应是 关系到人民日常生活的重要事件。而随着人口的增长和人民生活水平的提高， 除了对猪肉 的需求量增加以外， 对猪肉的质量和口感的要求也提高了。上海浦东国际机场就曾发现从 日本走私运入价值一百万余元、 八百多公斤的顶级和牛肉 ( 又称雪花牛肉 )， 由此可见中国 对高档肉类产品的消费需求。 因此，。
5、 有必要建立和改良中国自己的猪的品种， 改善猪肉口感 和质量， 以满足人民群众的生活需求。 0003 前面提到的顶级和牛肉的特点是肉色艳丽， 脂肪有如大理石花纹般分布在肌肉 内， 可比秋季降霜时的美丽， 而且由于肌肉中富含脂肪， 入口柔融欲化， 风味鲜美。因此， 可 通过降低猪全身的脂肪含量来提高瘦肉率， 同时， 增加肌肉中的脂肪含量来改善猪肉的口 感和品质。 0004 在肌肉中过表达 PEPCK-C 的 (PEPCK-Cmus) 转基因小鼠有着令人吃惊和兴奋的表 型。首先， PEPCK-Cmus转基因小鼠的运动能力远远高于对照小鼠， 可以以 20 米 / 分钟的速 度跑上 5 公里 ( 对照。
6、小鼠在同样的速度下只能跑 0.2 公里 )。其次， PEPCK-Cmus转基因小 鼠的寿命远远长于对照小鼠， 而且在 30-35 月时还能够产下正常的小鼠后代 ( 大多数小鼠 在 12-18 月时就失去生殖能力了 )。PEPCK-Cmus转基因小鼠的高运动能力可能与骨骼肌里 的甘油三酯的增加有关。尽管 PEPCK-Cmus转基因小鼠全身的脂肪含量下降， 不到对照小鼠 脂肪含量的一半， 但是 PEPCK-Cmus转基因小鼠比对照小鼠却有更多的脂肪分布于骨骼肌中 (Hakimi， P.et al.“Overexpression of the cytosolic form of phosphoeno。
7、lpyruvate carboxykinase(GTP)in skeletal muscle repatterns energy metabolism in the mouse.” J Biol Chem， 2007.282(45) ： 32844-32855)。PEPCK-Cmus转基因小鼠中低脂肪含量 和高肌间脂肪含量的特点和顶级和牛肉的特性是类似的。基于 PEPCK-Cmus转基因小鼠的神 奇表型， 我们预期在猪的骨骼肌中过表达 PEPCK-C 可降低猪的脂肪含量， 并在肉质和口感 上得到大幅度的提高， 这样的猪肉有着巨大的经济价值。大规模的生产 PEPCK-Cmus转基因 猪有望填补国。
8、内在高品质猪肉的空白， 丰富人民群众的菜篮子， 对提高人民群众的生活质 量有重要的意义。而且 PEPCK-C 转基因可提高小鼠的生殖能力， 因此， PEPCK-Cmus转基因猪 很可能在繁殖能力上有所提高， 在优良品种的繁殖上有着广泛的应用前景。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于提供一种能提高猪的瘦肉率、 肌间脂肪含量和生 殖能力的转基因载体。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ： 说 明 书 CN 103074372 A 3 2/4 页 4 0007 转基因载体含有小鼠的肌酸激酶 (muscle creatine kinase， MCK) 增强子、 2。
9、kb 猪 的 - 骨骼肌肌动蛋白 (-skeletal actin) 基因的启动子、 猪的 PEPCK-C 的 cDNA 和牛生 长激素基因 (bGH) 的 3 端不翻译区域， 且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因 - 嘌呤 霉素 (Puromycin) 基因和原核细胞中筛选用的抗性基因 - 博莱霉素 (Zeocin) 基因 ( 见图 2)。 0008 2kb 的 - 骨骼肌肌动蛋白 (-skeletal actin) 的启动子可保证下游的基因在 骨骼肌中特异表达， 而且 MCK 增强子也具有肌肉组织特异性的增强子活性， 可特异地促进 下游基因的高表达。在此转基因载体中表达的是猪自身的 PEP。
10、CK-C 基因， 所以从食品安全 的角度讲， 对消费者的健康没有任何影响。 此外， 本发明在嘌呤霉素和博莱霉素抗性基因的 两端还加入 LoxP 序列， 这样， 在 PEPCK-C 基因整合到基因组 DNA 后， 如有需要， 本发明可通 过表达Cre蛋白， 诱导LoxP序列的重组， 以除去抗性基因， 进一步保障转基因动物的食品安 全性。 0009 本发明构建的在肌肉组织特异表达猪 PEPCK-C 的转基因载体 pZT52 的全序列如 SEQ ID No ： 1 所示， 其中， 第 29-1897 碱基为猪 PEPCK-C 编码区， 第 2278-2491 碱基为 bGH 3端不翻译区， 第 22。
11、67-2300 碱基为 LoxP， 第 3056-3727 碱基为嘌呤霉素抗性基因， 第 3785-4156 碱基为博莱霉素 (Zeocin) 抗性基因， 第 4166-4199 碱基为 LoxP， 第 5673-6023 碱基为 MCK 增强子， 第 6119-8052 碱基为猪 - 骨骼肌肌动蛋白基因的启动子。 0010 本发明的转基因载体可应用于体细胞克隆， 以构建高瘦肉率、 高肌间脂肪含量和 高生殖能力的 PEPCK-Cmus转基因猪。 附图说明 0011 图 1 是本发明的技术流程图。 0012 图 2 是本发明构建的 pZT52 转基因载体的示意图。 具体实施方式 0013 根据下。
12、述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。 0014 实施例 1 ： 插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段， 构建 pZT1。 0015 将 pCDNA3.1(myc-His)a 载体 (Invitrogen) 用 PvuII 酶切， 酶切体系为 2g 质粒 DNA， 3l 10buffer， 2l PvuII 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 30l， 37温浴 3 小时。然 后将酶切体系在 1的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出 3.3kb 大小的 DNA 条。
13、带， 用胶回收 纯化试剂盒纯化 DNA。具体步骤为， 将紫外光下切下目的 DNA 条带装入 1.5ml 离心管中， 称 重后加入3倍体积的溶胶液， 55保温10分钟， 使琼脂糖凝胶完全融化 ； 融化的凝胶待温度 降至室温后， 将混合液转入附柱中， 10,000g 离心 1 分钟， 倒掉流出液 ； 加入 650l 漂洗缓 冲液， 10,000g 离心 1 分钟， 倒掉流出液 ； 吸附柱再次离心， 10,000g 离心， 1 分钟， 倒掉流出 液 ； 将吸附柱转移到一个新的 1.5ml 离心管中， 加入 50l ddH2O， 放置 1 分钟， 10,000g 离 心 1 分钟收集纯化产物。 001。
14、6 从 pSNAP 载体用 EcoRV 酶切出 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段， 酶切体系为 3g 质粒 说 明 书 CN 103074372 A 4 3/4 页 5 DNA， 3l 10buffer， 2l EcoRV 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 30l， 37温浴 3 小时。然 后将酶切体系在 1的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出 1.7kb 大小的 DNA 条带， 用胶回收 纯化试剂盒纯化 DNA。具体步骤同上。 0017 将 pCDNA3.1(myc-His)a(PvuII) 和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP(EcoRV) 连接， 连接反应 中加入2l载体，。
15、 6l插入片段， 1l 10buffer， 1l T4DNA连接酶， 16温浴16小时。 0018 将连接产物转化到 E.coli 的感受态细胞中。取一管 50l 的 Trans5 感受态细 胞置于冰上， 待其融化后， 向其中加入 4l 上述连接产物， 轻弹混匀， 后于冰上孵育 30 分 钟 ； 42热击30秒， 后冰上静置10分钟 ； 加入500l无抗性的LB液体培养基， 37震荡培 养 1 小时 ； 4,000rpm 离心 5 分钟， 吸走， 保留 100l 左右的培养基， 用移液器将细菌沉淀吹 打均匀后涂布在含氨苄和博莱双抗性的 LB 培养基平板上。然后将平板置于 37温箱培养 16 小。
16、时。 0019 克隆生长出来后， 挑单克隆菌落至 3ml 含氨苄青霉素的 LB 培养液中， 37震荡培 养12小时， 提取质粒DNA， 用EcoRI酶切鉴定， 阳性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的两条DNA 条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性， 得到的克隆即为 pZT1。 0020 实施例 2 ： 插入猪 - 骨骼肌肌动蛋白基因的启动子 DNA 片段， 构建 pZT20。 0021 将 pZT1 用 PvuI 和 NdeI 双酶切， 酶切体系为 2g 质粒 DNA， 3l 10buffer， 1.5l PvuI 酶， 1.5l NdeI 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 30l，。
17、 37温浴 3 小时。然后将 酶切体系在 1的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出 4.0kb 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化 试剂盒纯化 DNA。具体步骤同上。 0022 通过全基因合成 (Invitrogen) 得到 2kb 长度的猪 - 骨骼肌肌动蛋白基因的启 动子DNA片段， 用PvuI和NdeI双酶切， 酶切体系为3g质粒DNA， 3l 10buffer， 1.5l PvuI 酶， 1.5l NdeI 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 30l， 37温浴 3 小时。然后将酶切体系 在 1的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出 2kb 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化试剂盒纯化 D。
18、NA。具体步骤同上。 0023 将 pZT1(PvuI/NdeI) 和猪 - 骨骼肌肌动蛋白基因的启动子 DNA(PvuI/NdeI) 连 接， 连接反应同上。 0024 将连接产物转化到 E.coli 的感受态细胞中。具体步骤同上， 除了只用博莱霉素进 行抗性筛选。 0025 克隆生长出来后， 挑单克隆菌落至 3ml 含博莱霉素的 LB 培养液中， 37震荡培养 12 小时， 提取质粒 DNA， 用 EcoRI 酶切鉴定， 阳性克隆中可得到 3.8kb 和 2.0kb 的两条 DNA 条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性， 得到的克隆即为 pZT20。 0026 实施例 3 ： 插入猪。
19、 PEPCK-C 编码区域 DNA 片段， 构建 pZT43。 0027 将 pZT20 用 NdeI 和 KpnI 双酶切， 酶切体系为 2g 质粒 DNA， 3l 10buffer， 1.5l KpnI 酶， 1.5l NdeI 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 30l， 37温浴 3 小时。然后将 酶切体系在 1的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出 5.5kb 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化 试剂盒纯化 DNA。具体步骤同上。 0028 通过全基因合成(Invitrogen)得到猪PEPCK-C编码区域DNA片段， 用NdeI和KpnI 双酶切， 酶切体系为 3g 质粒 DNA， 。
20、3l 10buffer， 1.5l PvuI 酶， 1.5l NdeI 酶， 加 入 ddH2O 补足体积至 30l， 37温浴 3 小时。然后将酶切体系在 1的琼脂糖凝胶中通过 说 明 书 CN 103074372 A 5 4/4 页 6 电泳分离， 切出 2.1kb 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化试剂盒纯化 DNA。具体步骤同上。 0029 将 pZT20(KpnI/NdeI) 和猪 PEPCK-C 编码区域 DNA 片段 (KpnI/NdeI) 连接， 连接反 应同上。 0030 将连接产物转化到 E.coli 的感受态细胞中。具体步骤同上， 除了只用博莱霉素进 行抗性筛选。 00。
21、31 克隆生长出来后， 挑单克隆菌落至 3ml 含博莱霉素的 LB 培养液中， 37震荡培养 12 小时， 提取质粒 DNA， 用 EcoRI 酶切鉴定， 阳性克隆中可得到 3.3kb、 2.1kb 和 2.0kb 的三 条 DNA 条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性， 得到的克隆即为 pZT43。 0032 实施例 4 ： 插入 MCK 增强子 DNA 片段， 构建 pZT52。 0033 将 pZT43 用 PvuI 酶切， 酶切体系为 2g 质粒 DNA， 3l 10buffer， 1.5lKpnI 酶， 1.5l NdeI酶， 加入ddH2O补足体积至30l， 37温浴3小时。。
22、 然后将酶切体系在1 的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出7.5kb大小的DNA条带， 用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。 具体步骤同上。 0034 pZT43 载体的去磷酸化， 35l pZT43(PvuI)， 4l 10buffer， 1l 牛小肠碱性 去磷酸化酶(CIP)， 37温浴1小时。 然后将反应体系在1的琼脂糖凝胶中通过电泳分离， 切出 7.5kb 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化试剂盒纯化 DNA。具体步骤同上。 0035 通过 PCR 扩增得到 MCK 增强子 DNA 片段， PCR 条件如下 ： 1l( 约 10ng) 模板 DNA pST181， 引物 1(gataCGAT。
23、CGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA) 和引物 2(ccggCGATCGGGCGGGCCAT TTACCGTAAGTTAT) 的终浓度均为 0.5M， dNTPs 的终浓度为 0.2mM， 5l 10buffer， 1l HiFi Taq 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 50l。PCR 循环为， 95， 2 分钟 ； 接着是 95， 30 秒， 55， 30 秒， 72， 30 秒， 35 个循环 ； 72， 5 分钟 ； 4， 保温。然后将 PCR 产物在 1的琼脂 糖凝胶中通过电泳分离， 切出 500bp 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化试剂盒纯化 DNA。具体 步。
24、骤同上。 0036 用 PvuI 酶切 MCK 增强子 DNA 片段， 酶切体系为 3g DNA， 4l 10buffer， 3l PvuI 酶， 加入 ddH2O 补足体积至 40l， 37温浴 3 小时。然后将酶切体系在 1的琼脂糖 凝胶中通过电泳分离， 切出 500bp 大小的 DNA 条带， 用胶回收纯化试剂盒纯化 DNA。具体步 骤同上。 0037 将 pZT43(PvuI/CIP) 和 MCK 增强子 DNA 片段 (PvuI) 连接， 连接反应同上。 0038 将连接产物转化到 E.coli 的感受态细胞中。具体步骤同上， 除了只用博莱霉素进 行抗性筛选。 0039 克隆生长出来。
25、后， 挑单克隆菌落至 3ml 含博莱霉素的 LB 培养液中， 37震荡培养 12 小时， 提取质粒 DNA， 用 PvuI 酶切鉴定， 阳性克隆中可得到 7.5kb 和 0.5kb 的两条 DNA 条 带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性， 得到的克隆即为 pZT52。 说 明 书 CN 103074372 A 6 1/11 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103074372 A 7 2/11 页 8 0003 序 列 表 CN 103074372 A 8 3/11 页 9 0004 序 列 表 CN 103074372 A 9 4/11 页 10 0005 序 列 表 CN。
26、 103074372 A 10 5/11 页 11 0006 序 列 表 CN 103074372 A 11 6/11 页 12 0007 序 列 表 CN 103074372 A 12 7/11 页 13 0008 序 列 表 CN 103074372 A 13 8/11 页 14 0009 序 列 表 CN 103074372 A 14 9/11 页 15 0010 序 列 表 CN 103074372 A 15 10/11 页 16 0011 序 列 表 CN 103074372 A 16 11/11 页 17 序 列 表 CN 103074372 A 17 1/2 页 18 图 1 说 明 书 附 图 CN 103074372 A 18 2/2 页 19 图 2 说 明 书 附 图 CN 103074372 A 19 。