治疗移植物抗宿主疾病的方法.pdf

一种用于预防哺乳动物患者的Gv HD并发症发展或治疗所述GvHD并发症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用富含STRO-1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体。

权利要求书一种用于预防哺乳动物患者的GvHD并发症发展或治疗所述GvHD并发症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体。
如上述权利要求1所述的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用(a)骨髓谱系细胞的前体，和(b)富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体。
如权利要求2所述的方法，其中在施用所述骨髓谱系细胞的前体之前向所述哺乳动物施用富含STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的所述细胞群体。
如权利要求2所述的方法，其中富含STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的所述细胞群体与所述骨髓谱系细胞的前体共同施用。
如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述骨髓谱系细胞的前体是施用至所述哺乳动物以治疗血液的恶性或遗传性疾病的同种异体细胞。
如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述STRO‑1亮细胞和/或其子代是同种异体的。
如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中富含STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的所述细胞群体是全身性施用。
如权利要求7所述的方法，其中富含STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的所述细胞群体是通过静脉内注射施用。
如权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法包括施用0.1×106至5×106个之间的STRO‑1亮细胞和/或其子代。
如权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法包括施用0.3×106至2×106个之间的STRO‑1亮细胞和/或其子代。
如权利要求1至10中任一项所述的方法，所述方法包括施用低剂量的STRO‑1亮细胞和/或其子代。
如权利要求11所述的方法，其中所述低剂量的STRO‑1亮细胞和/或其子代包含0.1×105至0.5×106个之间的STRO‑1亮细胞和/或其子代。
如权利要求11所述的方法，其中所述低剂量的STRO‑1亮细胞和/或其子代包含约0.3×106个STRO‑1亮细胞和/或其子代。
如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的所述群体是每周一次或以更低频率施用。
如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物正罹患化学疗法和辐射疗法后的再生障碍性贫血、骨髓纤维化或骨髓衰竭。
如权利要求1至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述哺乳动物施用免疫抑制药物。

说明书治疗移植物抗宿主疾病的方法
领域
本发明涉及用于增强造血祖细胞的移植、增强骨髓移植和预防或减少移植物抗宿主疾病的方法。在一个实施方案中，本发明涉及预防或减轻哺乳动物患者，尤其是人患者的同种异体骨髓移植后的并发症，即移植物抗宿主疾病。
背景
在破坏骨髓的过程之后要求骨髓移植。例如，在高强度全身性辐射或化学疗法后，骨髓是首先衰竭的靶标。转移性癌症通常用极高强度的化学疗法治疗，所述化学疗法意图破坏癌症，但是也有效地破坏骨髓。这诱发了对骨髓移植的需要。然而，除了最为急性的危及生命的病状以外，利用骨髓移植来减轻涉及骨髓病症的任何病状通常都认为极具风险，因为有可能造成移植物抗宿主疾病(GvHD)发作。
GvHD是作为限制同种异体骨髓或干细胞移植的成功和可用性的主要因素的免疫学病症。GvHD是全身性炎症性反应，其引起慢性疾病并且可能导致宿主动物死亡。目前，同种异体移植无不引起相关GvHD的严重风险，甚至在供体与宿主具有高度组织相容性的情况下。
GvHD是由与全身性分布的不相容宿主抗原反应，从而引起极强炎症的供体T细胞引起。在GvHD中，识别供体与宿主之间的差异的成熟供体T细胞被全身性活化。当前预防和治疗GvHD的方法涉及施用诸如环孢菌素A和皮质类固醇等药物。它们具有严重的副作用，须长期给予，并且用于施用和监测的费用高昂。已尝试使用T细胞去除来预防GvHD，但这需要精密且昂贵的设施和专业技能。T细胞去除程度过高会导致骨髓干细胞移植失败、造血重建失败、感染或复发的严重问题。对T细胞去除限制较多会留下仍有能力引发GvHD的细胞。因此，当前治疗GvHD的方法仅在有限的供体与宿主组合中获得成功，使得许多患者不能得到有可能挽救生命的治疗。
间质干细胞(MSC)显示有效的免疫抑制活性，其已在临床环境中成功用于治疗移植物抗宿主疾病(GvHD)，这种疾病本来是骨髓移植的致死性并发症。由于表征有限，因此MSC制备物异源程度相当高并且这限制了其免疫抑制作用和因此临床效益的程度。
概述

在得出本发明的工作中，发明人比较间质干细胞与STRO‑1亮多能细胞制备物对GvHD的影响。意外的是，在改善GvHD方面，Stro‑1亮多能细胞制备物远优于间质干细胞制备物。
因此，本发明提供用于减轻哺乳动物患者的GvHD并发症发展的方法，所述方法包括向患者施用富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体。
在一个实施方案中，哺乳动物患者正进行或正要进行骨髓移植。
在另一实施方案中，本发明提供用于减轻哺乳动物患者的由骨髓移植引起的GvHD并发症发展的方法，所述方法包括向患者施用(a)骨髓谱系细胞的前体和(b)富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体，其中富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体是以有效降低患者的GvHD的严重性的量施用。
在一个实施方案中，移植物抗宿主疾病是由T细胞免疫反应引起。在一个实例中，T细胞是来自供体并且抗原是来自接受者。例如，T细胞可以存在于移植物中。在另一实施方案中，T细胞是来自接受者并且抗原是来自供体。
在此方法的另一实施方案中，Stro‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子经过遗传工程改造以表达阻断T细胞的共刺激的分子。
STRO‑1亮细胞可以是自体的或同种异体的。在一个实施方案中，STRO‑1亮细胞是同种异体的。
在此方法的另一实施方案中，在施用或获得可溶性因子之前，STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞已在培养物中扩增。
细胞的示例性剂量包括0.1×106至5×106个之间STRO‑1亮细胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用0.3×106至2×106个之间STRO‑1亮细胞和/或其子代。
所述方法的一种形式涉及施用低剂量的STRO‑1亮细胞和/或其子代。这种低剂量是例如0.1×105与0.5×106个之间的STRO‑1亮细胞和/或其子代，诸如约0.3×106个STRO‑1亮细胞和/或其子代。
本发明还涵盖多次施用所述细胞和/或可溶性因子。例如，所述方法可涉及施用所述细胞和监测受试者以确定发生或复发GvHD的一种或多种症状的时间，以及施用另一剂量的所述细胞和/或可溶性因子。用于评估GvHD的症状的适合方法对于本领域的技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。
在一个实例中，富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的群体每周施用一次或频率更低，诸如每四周一次或频率更低。
在另一实施方案中，富含STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体是全身性施用。例如，富含Stro‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体可以静脉内、动脉内、肌肉内、皮下施用、施用至主动脉中、心脏的心房或心室中或连接至器官的血管中，例如腹主动脉、肠系膜上动脉、胰十二指肠动脉或脾动脉。
在另一实施方案中，本发明方法进一步包括施用免疫抑制剂。免疫抑制剂可施用持续足以允许所述移植细胞具有功能的时间。在一个实例中，免疫抑制剂是环孢菌素。环孢菌素可以每公斤体重5mg至40mg的剂量施用。
在本说明书中，用语“包括(comprise)”或变形(诸如“comprises”或“comprising”)应理解为意指包括所述要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组，而不排除任何其它要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。
附图简述

图1.TNAP(STRO‑3)和间质前体细胞标志物STRO‑1亮在成人BMMNC中的共表达。通过孵育MACS选择的BMMNC并用与FITC偶合的山羊抗鼠类IgM抗体间接标记的STRO‑1(x轴)和用与PE偶合的山羊抗鼠类IgG间接标记的STRO‑3mAb(鼠类IgG1)(y轴)进行双色免疫荧光和流式细胞术。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×104个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的1.0％的反应性水平。结果表明STRO‑1亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO‑1+细胞未能与STRO‑3mAb反应。
图2.经过培养和扩增的STRO‑1亮MPC的STRO‑1亮或STRO‑1暗子代的基因表达谱。通过胰蛋白酶/EDTA处理制备离体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液。将细胞用STRO‑1抗体染色，所述STRO‑1抗体随后通过与山羊抗鼠类IgM‑异硫氰酸荧光素一起孵育加以显现。荧光活化细胞分选(A)后，由经过纯化的表达STRO‑1暗或STRO‑1亮的细胞的群体制备总细胞RNA。使用RNAzolB提取方法和标准程序，从各子群体分离总RNA并用作cDNA合成的模板。使用如先前所述的标准方案(Gronthos等J Cell Sci.116：1827‑1835，2003)通过PCR扩增评估各种转录物的表达。此研究中所用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并通过溴化乙锭染色进行观测(B)。使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评估各细胞标志物的相对基因表达(C)。
图3.经过培养和扩增的STRO‑1+MPC的STRO‑1亮子代表达高水平的SDF‑1，STRO‑1暗子代不能。(A)使用FACS根据区域STRO‑1亮和STRO‑1暗/深将通过MACS分离的STRO‑1+BMMNC制备物划分为不同STRO‑1子集。从各STRO‑1子群制备总RNA并用于构建STRO‑1亮消减杂交文库(B‑C)。复制已用由经过STRO‑1亮消减cDNA转化的细菌克隆扩增的代表性PCR产物点印的硝化纤维素过滤器。过滤器接着用[32P]三磷酸脱氧胞苷(dCTP)标记的STRO‑1亮(B)或STRO‑1暗/深(C)消减cDNA探测。箭头指示含有对应于人SDF‑1的cDNA片段的1个克隆的差异表达。(D)逆转录酶(RT)‑PCR分析显示由培养前通过MACS/FACS新近分离的BMMNC STRO‑1群体制备的总RNA中SDF‑1和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)转录物的相对表达。bp表示碱基对。
图4.STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)抑制T细胞增殖的功效的比较。在不存在或存在制备物A或B下将PBMC用经过CD3/CD28涂布的珠粒刺激4天。通过3H‑Tdr并入根据每分钟计数(cpm)测量T细胞增殖。
图5.STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)抑制T细胞增殖的功效的比较。在不同浓度的制备物A或B存在下将PBMC用涂有CD3/CD28的珠粒刺激4天。通过3H‑Tdr并入测量各种培养物中的T细胞增殖并报道为在不存在MSC下刺激PBMC时对照T细胞增殖的百分比。
图6.STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)对GvHD的影响的比较。将去除了T细胞的来自B10.D2(H2d)供体的骨髓单核细胞(BMMC)(5×106)和脾细胞(30×106)静脉内注射至经过致死辐照(750cGy)的BALB/c(H2d)接受者小鼠中。4周后，向接受者小鼠每只小鼠注射1×106个MSC(制备物A1)或MPC(制备物B1)或者接受者小鼠不接受进一步处理(对照)。每组八只小鼠经受注射。以一周时间间隔对小鼠进行评估。时间表示周数。
图7.STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)对GvHD的影响的比较。将去除了T细胞的来自B10.D2(H2d)供体的骨髓单核细胞(BMMC)(5×106)和脾细胞(30×106)静脉内注射至经过致死辐照(750cGy)的BALB/c(H2d)接受者小鼠中。4周后，向接受者小鼠注射制备物A或B(A1、A2、B1、B2)的1或2×106个细胞，或者接受者小鼠不接受进一步处理(对照)。每组八只小鼠经受注射。
图8.高剂量STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)对GvHD的影响的比较。将去除了T细胞的来自B10.D2(H2d)供体的骨髓单核细胞(BMMC)(5×106)和脾细胞(30×106)静脉内注射至经过致死辐照(750cGy)的BALB/c(H2d)接受者小鼠中。4周后，向接受者小鼠注射制备物A或B(A2、B2)的2×106个细胞，或者接受者小鼠不接受进一步处理(对照2)。每组八只小鼠经受注射，但组B2和A2中分别有4只和3只小鼠在注射后不久死亡。
图9.低剂量STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)对GvHD的影响的比较。将去除了T细胞的来自B10.D2(H2d)供体的骨髓单核细胞(BMMC)(5×106)和脾细胞(30×106)静脉内注射至经过致死辐照(750cGy)的BALB/c(H2d)接受者小鼠中。4周后，向接受者小鼠注射制备物A或B(A0.3、B0.3)的0.3×106个细胞，或者接受者小鼠不接受进一步处理(对照2)。每组六只小鼠经受注射。图报道各小鼠的GvHD评分。
图10.低剂量STRO‑1阴性MSC(制备物A)和STRO‑1亮MPC(制备物B)对GvHD的影响的比较。将去除了T细胞的来自B10.D2(H2d)供体的骨髓单核细胞(BMMC)(5×106)和脾细胞(30×106)静脉内注射至经过致死辐照(750cGy)的BALB/c(H2d)接受者小鼠中。4周后，向接受者小鼠注射制备物A或B(A0.3、B0.3)的0.3×106个细胞，或者接受者小鼠不接受进一步处理(对照2)。每组六只小鼠经受注射。图报道各小鼠的平均GvHD评分。
详细描述
本文呈示的结果表明，在改善GvHD方面，富含STRO‑1亮细胞的细胞群体出乎意料地优于STRO‑1阴性间质干细胞制备物。
因此，本发明提供用于减轻哺乳动物患者的GvHD并发症发展的方法，所述方法包括向患者施用富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体。
例如，本发明提供用于减轻哺乳动物患者的由骨髓移植引起的GvHD并发症发展的方法，所述方法包括向患者施用(a)骨髓谱系细胞的前体和(b)富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体，其中富含STRO‑1亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体以有效降低患者的GvHD的严重性的量施用。
如本文所用，术语“可溶性因子”应理解为指可溶于水的由STRO‑1亮细胞和/或其子代产生的任何分子，例如蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。所述可溶性因子可以在细胞内和/或由细胞分泌。所述可溶性因子可以是复杂混合物(例如上清液)和/或其组分和/或可以是纯化的因子。在本发明的一个实施方案中，可溶性因子是上清液或是含于上清液内。因此，本文涉及施用一种或多种可溶性因子的任何实施方案应理解为对上清液的施用作了必要修改。。
本发明的方法可能涉及施用仅仅富含STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞的细胞群体，和/或由其得到的可溶性因子。本发明方法还可能涉及施用仅仅子代细胞，或由所述子代细胞得到的可溶性因子。本发明方法还可能涉及施用STRO‑1亮细胞和其子代细胞的混合群体，或来自STRO‑1亮细胞和其子代细胞的混合培养物的可溶性因子。
本发明优选应用于人，然而，预期本发明也适用于动物，并且它们可能包括农业动物(诸如牛、绵羊、猪等)、家养动物(诸如狗、猫)、实验室动物(诸如小鼠、大鼠、仓鼠和兔)或者可用于运动的动物(诸如马)。
因此，STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子可用于通过在移植供体细胞之前或同时向接受者施用有效减少或消除接受者的T细胞针对移植物的免疫反应的量的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子来使接受者的免疫系统适应供体或外来骨髓细胞。STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子影响接受者的T细胞以使得当出现供体或外来组织时T细胞反应得到减少或消除。
因此，在骨髓(造血干细胞)移植的情形中，移植物对宿主的攻击可得到减少或消除。在将骨髓或外周血液干细胞移植至接受者体内之前，供体骨髓可用接受者的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子预处理。在一个优选实施方案中，供体骨髓首先暴露于接受者组织/细胞，随后用STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子处理。尽管不加限制，但据信最初与接受者组织或细胞的接触的作用是活化骨髓中的T细胞。随后用STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子处理抑制或消除骨髓中T细胞的进一步活化，由此减少或消除供体组织的不良影响，即所述疗法减少或消除移植物抗宿主反应。
在另一实施方案中，可通过向罹患移植物抗宿主疾病的移植物接受者施用有效减少或消除宿主的移植物排斥反应的量的供体自身的或与供体同种异体的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子来治疗所述接受者以降低或消除所述疾病的严重性，所述同种异体细胞可以是与接受者同种异体的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞或为第三方STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞。STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子抑制或阻抑供体组织中的活化T细胞免于发起针对接受者的免疫反应，由此减少或消除移植物抗宿主反应。
接受者的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子可以在移植之前从接受者获得并且可储存和/或培养扩增以提供足以用于治疗正发生的移植物对宿主攻击的量的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的储备库。
进一步预期，可能仅需要本发明的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的单次治疗，从而消除对长期免疫抑制药物疗法的需要。或者，可能采用多次施用Stro‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子。
STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的剂量可在宽泛限度内变化，并且当然适于各特定情况下的个别要求。一般来说，在肠胃外施用的情况下，通常每公斤接受者体重施用约1万至5百万个细胞。所用细胞的数量将取决于接受者的体重和病状、施用的次数或频率以及本领域的技术人员已知的其它变量。
细胞可以悬浮于适当稀释剂中，浓度为每毫升约0.01至约5×106个细胞。所述方法的一种形式涉及施用低剂量的STRO‑1亮细胞和/或其子代。这种低剂量是例如0.1×105与0.5×106个之间的STRO‑1亮细胞和/或其子代，诸如约0.3×106个STRO‑1亮细胞和/或其子代。
适用于注射溶液的赋形剂为在生物学上和生理学上与细胞和与接受者相容的赋形剂，诸如缓冲盐水溶液或其它适合赋形剂。用于施用的组合物优选根据符合适当无菌性和稳定性的标准方法配制、制备和储存。
以下实例进一步说明本发明的各方面。然而，它们绝不对本文所述的本发明的教导和公开构成限制。
STRO‑1亮细胞或子代细胞和由其得到的上清液或者一种或多种可溶性因子
STRO‑1亮细胞为在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且通常能够分化成生殖系(germ line)，诸如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO‑1亮细胞能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞所进入的特定谱系决定和分化路径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(诸如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。STRO‑1亮细胞因此优选为非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，所述子细胞为干细胞或适时不可逆分化产生表型细胞的前体细胞。
在一个优选实施方案中，STRO‑1亮细胞是从由受试者(例如欲治疗的受试者或相关受试者或不相关受试者(无论是相同物种抑或不同物种))获得的样本富集而来。术语“富集”或其变形在本文中用于描述一种细胞群体，其中当与未处理群体相比较时，一种特定细胞类型的比例或者多种特定细胞类型的比例增加。
在一个实施方案中，相对于STRO‑1暗或STRO‑1中间细胞，STRO‑1亮细胞优先富集。
在一个优选实施方案中，本发明中所用的细胞表达一种或多种个别地或全体选自由以下组成的组的标志物：TNAP+、VCAM‑1+、THY‑1+、STRO‑2+、CD45+、CD146+、3G5+或其任何组合。
“个别地”指本发明独立地涵盖所述标志物或标志物组，以及虽然个别标志物或标志物组不能独立地在本文中列出，但随附权利要求书仍可彼此独立地和分开地定义所述标志物或标志物组。
“全体”指本发明涵盖任何数量的所述标志物或肽组或其组合，以及虽然所述数量的标志物或标志物组或其组合不能在本文中具体列出，但随附权利要求书仍可将所述组合或子组合与标志物或标志物组的任何其它组合独立地和分开地定义。
优选地，STRO‑1亮细胞另外是TNAP+、VCAM‑1+、THY‑1+、STRO‑2+和/或CD146+中的一种或多种。
对于指定标志物称为“阳性”的细胞，其可能根据标志物存在于细胞表面上的程度而表达低(lo或暗)或高(亮(bright)、亮(bri))水平的所述标志物，其中所述术语涉及细胞分选过程中所用的荧光或其它标志物的强度。lo(或暗或深)和亮的区别应放在所分选特定细胞群体上所用的标志物的情形中加以理解。对于指定标志物称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于所述细胞。所述术语指细胞表达所述标志物的水平相对极低，并且当在可检测标记时产生极低信号或者在背景水平以上不可检测。
当在本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上的标志物在可检测标记时产生相对较高的信号。虽然不希望受理论限制，但提出“亮”细胞所表达的靶标志物蛋白(例如由STRO‑1识别的抗原)比样本中的其它细胞多。例如，当用缀合FITC的STRO‑1抗体标记时，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所测定的STRO‑1亮细胞产生比非亮细胞((STRO‑1深/暗)高的荧光信号。优选地，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其它实施方案中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个优选实施方案中，STRO‑1亮细胞的STRO‑1表面表达相对于“背景”(即STRO‑1‑细胞)具有2个对数量级以上的表达。相比之下，STRO‑1暗和/或STRO‑1中间细胞的STRO‑1表面表达与“背景”相比具有小于2个对数量级的表达，通常与“背景”相比约1个对数以下。
如本文所用，术语“TNAP”意欲涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型(KAP)。在一个优选实施方案中，TNAP是BAP。在一个特别优选的实施方案中，如本文所用的TNAP是指可以结合由2005年12月19日根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定以保藏编号PTA‑7282保藏于ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO‑3抗体的分子。
此外，在一个优选实施方案中，STRO‑1亮细胞能够产生克隆CFU‑F。
优选大比例的多能细胞能够分化成至少两种不同生殖系。多能细胞可以发展成的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其具有胆道上皮细胞和肝细胞的多潜能；神经限制细胞，其可以产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；神经元前体，其会发展出神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系的前体。其它谱系包括但不限于成牙质细胞、牙质产生细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(诸如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
在另一实施方案中，STRO‑1亮细胞在培养时不能产生造血细胞。
在一个实施方案中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施方案中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在本发明的另一适用实施方案中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，则来自于另一物种)。
本发明还涵盖使用由自体外培养物产生的STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞(后者也称为扩增细胞)获得或得到的上清液或可溶性因子。本发明的扩增细胞根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等可以具有多种表型。在某些实施方案中，子代细胞是在从亲本群体传代约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次或约10次后获得。然而，子代细胞可以在从亲本群体传代任何次后获得。
子代细胞可以通过在任何适合培养基中培养而获得。如本文在提及细胞培养时使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气态或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不供养细胞生长的液体培养基。培养基也包括胶状培养基，诸如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”也指意欲用于细胞培养中的材料，即使其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培养基。当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可称为“粉状培养基”。
在一个实施方案中，适用于本发明方法的子代细胞是通过使用经过STRO‑3抗体标记的磁性珠粒从骨髓分离TNAP+STRO‑1+多能细胞，并接着培养扩增所分离的细胞来获得(关于适合培养条件的实例，请参见Gronthos等Blood85：929‑940，1995)。
在一个实施方案中，所述扩增细胞(子代)(优选至少在5次传代后)可以是TNAP‑、CC9+、I类HLA+、II类HLA‑、CD14‑、CD19‑、CD3‑、CD11a‑c‑、CD31‑、CD86‑、CD34‑和/或CD80‑。然而，在与本文所述不同的培养条件下，不同标志物的表达有可能会变化。此外，虽然具有这些表型的细胞可在扩增细胞群体中占优势，但这并不指较小比例的细胞不具有此表型(例如，小百分比的扩增细胞可以是CC9‑)。在一个优选实施方案中，扩增细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。
在一个实施方案中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少25％，更优选至少50％细胞的细胞是CC9+。
在另一实施方案中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少40％，更优选至少45％细胞的细胞是STRO‑1+。
在另一实施方案中，扩增细胞可表达一种或多种全体或个别地选自由以下组成的组的标志物：LFA‑3、THY‑1、VCAM‑1、ICAM‑1、PECAM‑1、P‑选择蛋白、L‑选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β6‑19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF‑R、EGF‑R、IGF1‑R、NGF‑R、FGF‑R、瘦素‑R(STRO‑2＝瘦素‑R)、RANKL、STRO‑1亮和CD146或这些标志物的任何组合。
在一个实施方案中，来源于STRO‑1亮细胞的子代细胞对于标志物Stro‑1暗呈阳性。这些细胞称为组织特异性定向细胞(Tissue Specific Committed Cell；TSCC)并且比STRO‑1亮细胞更趋向于分化，因此与诱导因子反应的能力较低。TSCC可以发展成的谱系的非限制性实例包括肝细胞祖细胞，其具有胆道上皮细胞和肝细胞的多潜能；神经限制细胞，其可以产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；和神经元前体，其会发展成神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌性胰腺β细胞系的前体。其它定向谱系包括但不限于软骨细胞、成骨细胞、成牙质细胞、牙质产生细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(诸如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。前体包括明确可以产生结缔组织，特别包括脂肪组织、蜂窝组织、骨组织、软骨组织、弹性组织和纤维结缔组织的那些细胞。
在另一实施方案中，子代细胞是如WO2006/032092中所定义和/或所述的多能扩增STRO‑1+多能细胞子代(MEMP)。制备可用于得到子代的STRO‑1+多能细胞的富集群体的方法描述于WO01/04268和WO2004/085630中。在体外情形中，STRO‑1+多能细胞极少以绝对纯制备物形式存在，而是一般与作为组织特异性定向细胞(TSCC)的其它细胞一起存在。WO01/04268提出以约0.1％至90％的纯度水平从骨髓采集所述细胞。包含可得到子代的MPC的群体可直接从组织来源采集，或者其可为已在离体扩增的群体。
例如，子代可获自大致上纯化的STRO‑1+多能细胞的已采集且未扩增的群体，其构成其所存在的群体总细胞的至少约0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或95％。此水平可以通过例如选择对至少一种个别地或全体选自由TNAP、STRO‑1亮、3G5+、VCAM‑1、THY‑1、CD146和STRO‑2组成的组的标志物呈阳性的细胞来实现。
MEMPS可与新鲜采集的STRO‑1亮细胞的区别之处在于其对于标志物STRO‑1亮呈阳性且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相比之下，新鲜分离的Stro‑1亮细胞对于STRO‑1亮和ALP两者都呈阳性。在本发明的一个优选实施方案中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所施用细胞具有表型STRO‑1亮、ALP‑。在另一优选实施方案中，MEMPS对于标志物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA‑3、α3β1中的一种或多种呈阳性。在另一优选实施方案中，MEMP不显示TERT活性和/或对于标志物CD18呈阴性。
STRO‑1亮细胞起始群体可源自任一种或多种组织类型，包括骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或许更广泛来说来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。
应理解，在实施本发明时，带有任何指定细胞表面标志物的细胞的分离可以通过多种不同方法来实现，然而，优选方法依赖于结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与所关注标志物的结合，随后分离显示结合(为高水平结合或低水平结合)或不结合的那些细胞。最适宜结合剂为抗体或基于抗体的分子，优选为单克隆抗体或基于单克隆抗体，因为后者具有特异性。抗体在两个步骤中都可使用，然而也可以使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可以用于富集带有所述标志物或缺乏所述标志物的细胞。
抗体或配体可连接至固体支持物以允许粗分离。分离技术优选使欲收集的部分的活力保持最大。具有不同功效的各种技术可用于获得相对较粗的分离。所用特定技术将取决于分离效率、相关细胞毒性、执行的容易性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。分离程序可包括但不限于使用涂有抗体的磁性珠粒的磁性分离、亲和色谱和利用连接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。实施FACS的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
针对本文所述的各标志物的抗体可商购获得(例如抗STRO‑1的单克隆抗体可从R&D Systems，USA商购获得)、从ATCC或其它保藏组织获得和/或可使用业内公认的技术产生。
分离STRO‑1亮细胞的方法优选例如包括第一步骤，其为利用例如识别STRO‑1的高水平表达的磁性活化细胞分选(MACS)的固相分选步骤。必要时接着可进行第二分选步骤以产生更高水平的前体细胞表达。此第二分选步骤可能涉及使用两种或更多种标志物。
获得STRO‑1亮细胞的方法还可能包括使用已知技术进行第一富集步骤之前采集细胞来源。因此，组织将以手术方式移除。接着将构成来源组织的细胞分离为所谓单细胞悬浮液。此分离可以通过物理和或酶学方式达成。
一旦获得了适合的STRO‑1亮细胞群体，就可以通过任何适合方式对其进行培养或扩增以获得MEMP。
在一个实施方案中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以作为自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施方案中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞来获得上清液或可溶性因子。在本发明的另一适用实施方案中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，则来自另一物种)来获得上清液或可溶性因子。
本发明可以使用来自任何非人动物物种的细胞加以实施，包括但不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔类动物、啮齿动物、鸟类动物和鱼类动物细胞。可用于实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猕猴和任何其它新世界或旧世界猴类的细胞。可用于实施本发明的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于实施本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可用于实施本发明的兔类动物物种的实例包括家兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。鸡(原鸡(Gallus gallus))为可用于实施本发明的鸟类物种的一个实例。
适用于本发明方法的细胞在使用前或获得上清液或可溶性因子前可储存。保藏和储存真核细胞和尤其哺乳动物细胞的方法和方案在本领域中是已知的(参见例如Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，N.J.；Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第四版，Wiley‑Liss，Hoboken，N.J.)。
遗传修饰的细胞
在一个实施方案中，对STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞进行遗传修饰，例如表达和/或分泌目标蛋白质，例如提供治疗和/或预防效益的蛋白质，例如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶，或与血管生成增强有关或引起血管生成的多肽，或与细胞分化成胰腺细胞或血管细胞有关的多肽。
遗传修饰细胞的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，使欲在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，将核酸连接至可在受试者的多种细胞中可操作的启动子，诸如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV‑IE启动子)或SV‑40启动子。其它适合启动子在本领域中是已知的并且应理解为在作了必要修改的情况下适用于本发明的实施方案。
优选地，核酸是以表达构建体的形式提供。如本文所用，术语“表达构建体”是指具有在细胞中将表达赋予到可操作地连接的核酸(例如报道基因和/或可反选择的报道基因)的能力的核酸。在本发明的上下文中，应了解，表达构建体可包含或为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达格式维持和/或复制异源DNA的其它核酸。
构建适用于实施本发明的表达构建体的方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的并且描述于以下文献中：例如Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN047150338，1987)或Sambrook等(Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)。例如，使用例如PCR从适合模板核酸扩增表达构建体的各组分并随后克隆至适合的表达构建体(诸如质粒或噬菌粒)中。
适于所述表达构建体的载体在本领域中是已知的和/或在本文中描述。例如，适于哺乳动物细胞中的本发明方法的表达载体为例如由Invitrogen供应的pcDNA载体套装的载体、pCI载体套装的载体(Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP16载体(Clontech)或pcDNA载体套装的载体(Invitrogen)。
本领域的技术人员将认识到其它载体和所述载体的来源，诸如Invitrogen公司、Clontech或Promega。
用于将分离的核酸分子或包含所述核酸的基因构建体引入细胞中用于表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定生物体的技术取决于已知成功的技术。用于将重组DNA引入细胞中的方式包括显微注射、DEAE‑葡聚糖介导的转染、脂质体(诸如使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA))介导的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(诸如使用涂有DNA的钨粒子或金粒子(Agracetus Inc.，WI，USA)以及其它方式。
或者，本发明的表达构建体是病毒载体。适合病毒在本领域中是已知的并且可商购获得。用于递送核酸和使所述核酸整合至宿主细胞基因组中的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适用于将保持游离形式的核酸引入宿主细胞中。病毒载体为靶细胞和组织中基因转移的有效且通用的方法。另外，已在多种不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
例如，逆转录病毒通常包含包装能力高达6‑10kb外来序列的顺式作用长末端重复(LTR)。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和包装，其接着用于将表达构建体整合至靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的载体：鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见例如Buchscher等，J Virol.56：2731‑2739(1992)；Johann等，J.Virol.65：1635‑1640(1992)；Sommerfelt等，Virol.76：58‑59(1990)；Wilson等，J.Virol.63：274‑2318(1989)；Miller等，J.Virol.65：2220‑2224(1991)；PCT/US94/05700；Miller和Rosman BioTechniques7：980‑990，1989；Miller，A.D.Human Gene Therapy7：5‑14，1990；Scarpa等Virology75：849‑852，1991；Burns等Proc.Natl.Acad.Sci USA90：8033‑8037，1993)。
已开发各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。AAV载体可以使用本领域中已知的技术容易地构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski等Molec.Cell.Biol.5：3988‑3996，1988；Vincent等(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter Current Opinion inBiotechnology5：533‑539，1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol，and Immunol.158：97‑129，1992；Kotin，Human Gene Therapy5：793‑801，1994；Shelling和Smith Gene Therapy7：165‑169，1994；和Zhou等JExp.Med.179：1867‑1875，1994。
适用于递送本发明的表达构建体的其它病毒载体包括例如来源于痘病毒家族的载体，诸如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或缀合病毒载体(例如Fisher‑Hoch等，Proc.Natl Acad.Sci.USA53：317‑321，1989中所述的载体)。
细胞和可溶性因子的治疗/预防潜能的分析
用于测定由STRO‑1亮细胞得到的可溶性因子治疗或预防GvHD或延迟GvHD的发作或发展的能力的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
例如，适于测定可溶性因子的免疫抑制活性的体外测试描述于本文的实施例5中。
在另一实例中，可溶性因子的功效可如本文的实施例6和7所述在GvHD的体内模型中评估。
本领域的技术人员根据前述内容显而易见，本发明还提供用于鉴别或分离用于治疗、预防或延迟GvHD的可溶性因子的方法，所述方法包括：
(i)向罹患GvHD的测试受试者施用可溶性因子并评估所述受试者中GvHD的进展；
(ii)比较(i)受试者中GvHD的水平与罹患GvHD但未施用可溶性因子的对照受试者体内GvHD的水平，
其中测试受试者体内的GvHD相较于对照受试者降低表明所述可溶性因子治疗、预防或延缓GvHD。
细胞组合物
在本发明的一个实施方案中，STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞是以组合物形式施用。优选地，所述组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mac Publishing Company(1980)。载体还可减少活性化合物的任何不当副作用。适合载体例如是稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下在接受者体内不产生明显的局部或全身性不良作用。
适用于本发明的载体包括那些常规使用的载体，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer′s solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是优选液体载体，特别是(当等渗时)溶液的载体。适合药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
在另一实例中，载体是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬浮的介质组合物。优选地，所述介质组合物不在其所施用的受试者中诱发任何不良作用。
优选介质和赋形剂不会不利地影响细胞活力和/或细胞减少、预防或延迟胰腺功能异常的能力。
在一个实例中，载体和赋形剂提供缓冲活性以使细胞和/或可溶性因子维持在适合pH下，由此发挥生物活性，例如载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子相互作用的程度最低并且允许快速释放细胞和因子，在这种情况下，可将本发明的组合物制造为用于例如通过注射直接应用至血流或组织或围绕组织周围或与组织相邻的区域中的液体。
STRO‑1亮细胞和/或其子代细胞也可以并入或包埋于与接受者相容并且降解为对接受者无害的产物的骨架中。所述骨架提供对欲移植到接受受试者体内的细胞的支持和保护。天然和/或合成生物可降解性骨架为所述骨架的实例。
多种不同的骨架可成功用于实施本发明。优选骨架包括但不限于生物可降解的骨架。天然生物可降解骨架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层连蛋白骨架。适用于细胞移植骨架的合成材料应能够支持广泛细胞生长和细胞功能。所述骨架可被吸收。适合骨架包括聚乙醇酸骨架，例如如Vacanti等，J.Ped.Surg.23：3‑91988；Cima等，Biotechnol.Bioeng.38：1451991；Vacanti等，Plast.Reconstr.Surg.88：753‑91991所述，或合成聚合物，诸如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。
在另一实例中，细胞可在凝胶骨架(诸如来自Upjohn公司的Gelfoam)中施用。
适用于本发明的细胞组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。可结合本发明组合物施用的细胞包括但不限于其它多效或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可在临施用前或施用前不久与本发明组合物混合，或者其可以在施用前一起共培养一段时间。
优选地，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的细胞。例如，组合物包含约1×105个STRO‑1亮细胞/kg至约1×107个STRO‑1亮细胞/kg或约1×106个STRO‑1亮细胞/kg至约5×106个STRO‑1亮细胞/kg。欲施用的细胞的确切量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别以及胰腺功能异常的程度和严重性。
在一些实施方案中，细胞是含于不允许细胞离开进入受试者循环中，然而允许由细胞分泌的因子进入循环中的腔室中。以此方式，可通过允许细胞分泌因子进入受试者循环中来向受试者施用可溶性因子。所述腔室同样可植入受试者的某一部位以增加可溶性因子的局部水平，例如在移植器官中或其附近植入。
在本发明的一些实施方案中，可不必或不需要在起始细胞组合物疗法前对患者进行免疫抑制。因此，移植同种异体或者甚至异种的STRO‑1亮细胞或其子代在一些情况下可能是耐受的。
然而，在其它情况下，在起始细胞疗法前以药理学方式对患者进行免疫抑制可能是需要或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这可以通过在囊封装置中递送细胞来实现。细胞可以囊封在细胞所需要的营养物和氧以及治疗因子可透过，而细胞不可透过的胶囊中来免疫体液因子和细胞。优选地，囊封剂具有低变应原性，容易地且稳定地位于靶组织中，并且对所植入的结构提供额外保护。降低或消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。作为替代，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。
可溶性因子的组合物
在本发明的一个实施方案中，由STRO‑1亮细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子是以例如包含适合载体和/或赋形剂的组合物形式施用。优选地，载体或赋形剂不会不利地影响可溶性因子或上清液的生物学作用。
在一个实施方案中，组合物包含稳定可溶性因子或上清液组份(例如蛋白酶抑制剂)的物质的组合物。优选地，所包括蛋白酶抑制剂的量不足以对受试者产生不良影响。
包含由STRO‑1亮细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的组合物可制备为适当液体悬浮液，例如于培养基或于稳定载体或缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中的悬浮液。适合载体在上文中描述。在另一实例中，包含由Stro‑1亮细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的悬浮液是用于注射的油性悬浮液。适合亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。欲用于注射的悬浮液也可含有增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。任选地，悬浮液也可含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
可以通过在具有上述成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需量的上清液或可溶性因子，需要时随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。
一般来说，通过将上清液或可溶性因子并入含有基本分散介质或来自以上列出成分的其它所需成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。根据本发明的替代方面，上清液或可溶性因子可以与一种或多种增强它的溶解度的其它化合物一起配制。
其它示例性载体或赋形剂描述于以下文献中：例如Hardman等，(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw‑Hill，New York，N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，N.Y.；Avis等，(编著)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.。
治疗性组合物通常应无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂(例如糖)、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来达成。此外，
可溶性因子可以于时间释放制剂中施用，例如于包括缓慢释放聚合物的组合物中施用。活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载体制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。多种用于制备所述制剂的方法已获得专利或通常为本领域的技术人员所已知。
上清液或可溶性因子可与例如提供可溶性因子的缓慢释放的适当基质组合施用。
施用模式
由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代可手术植入、注射、递送(例如借助于导管或注射器)或以其它方式直接或间接施用至需要修复或增强的部位(例如器官)或施用至受试者的血液系统中。
优选地，由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代是递送至受试者的血流中。例如，由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代是以肠胃外方式递送。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、腹膜内、心室内、脑室内、鞘内。优选地，由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代是动脉内递送至主动脉、心脏的心房或心室或连接至胰腺的血管(例如腹主动脉、肠系膜上动脉、胰十二指肠动脉或脾动脉)中。
在细胞递送至心脏的心房或心室的情况下，优选将细胞施用至左心房或左心室以避免可能由细胞快速递送至肺而引起的并发症。
优选地，例如使用注射器或通过导管或中心管线将由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代注射至递送部位中。
用于治疗性制剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。优选地，施用方案使与可接受水平的副作用相一致的递送至患者的治疗性化合物的量达到最大。因此，所递送制剂的量部分取决于特定实体和所治疗病状的严重性。
在一个实施方案中，由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代是以单次推注剂量来递送。或者通过连续输注、或通过间隔为例如一天、一周或每周1‑7次的剂量来施用由STRO‑1亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO‑1亮细胞或其子代。优选剂量方案是涉及最大化剂量或避免明显不当副作用的剂量频率的方案。总每周剂量取决于所使用化合物的类型和活性。适当剂量由临床医师例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。一般来说，剂量始于稍小于最佳剂量的量并在此后以较小增量增加直至相对于任何负面副作用达成所需或最佳的效果。重要诊断指标包括糖尿病症状指标。
实施例
实施例1：MSC制备
MSC是如US5,837,539中所述由骨髓重新产生。将约80‑100ml骨髓抽吸至含肝素无菌注射器中并送至MDACC细胞疗法实验室(MDACC Cell Therapy Laboratory)以供产生MSC。使用ficoll‑hypaque分离骨髓单核细胞并置于两个T175烧瓶中，其中每个烧瓶具有50mlMSC扩增培养基，所述培养基包括含有庆大霉素、谷氨酰胺(2mM)和20％(v/v)胎牛血清(FBS)(Hyclone)的α改良MEM(αMEM)。
将细胞在37℃、5％CO2下培养2‑3天，此时移除未粘附细胞；连续培养其余粘附细胞直至细胞汇合度达到70％或更高(7‑10天)，并接着将细胞用胰蛋白酶处理且置于六个具有MSC扩增培养基的T175烧瓶中(每个烧瓶50ml培养基)。如US5，837,539的表5中所述，以此方式分离和扩增的MSC为STRO‑1阴性。
实施例2：通过选择STRO‑3+细胞对MPC进行免疫选择
根据皇家阿德莱德医院(Royal Adelaide Hospital)的机构伦理委员会(Institutional Ethics Committee)批准的程序从健康正常的成人志愿者(20‑35岁)采集骨髓(BM)。简单地说，从髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素锂抗凝剂的试管中。
如先前所述TM使用Lymphoprep(Zannettino，A.C.et al.(1998)Blood92：2613‑2628)(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)通过密度梯度分离制备BMMNC。在4℃下以400×g离心30分钟后，用转移吸管移除白细胞层并在由含有5％胎牛血清(FCS；CSL Limited，Victoria，Australia)的汉克氏平衡盐溶液(HB S S；Life Technologies，Gaithersburg，MD)构成的“HHF”中洗涤三次。
随后如前所述(Gronthos et al.(2003)Journal of Cell Science116：1827‑1835；Gronthos，S.and Simmons，P.J.(1995)Blood85：929‑940)通过磁性活化细胞分选分离STRO‑3+(或TNAP+)细胞。简单地说，在冰上将约1‑3×108个BMMNC在由10％(v/v)正常兔血清于HHF中组成的阻断缓冲液中孵育20分钟。在冰上将细胞用200μl的STRO‑3mAb于阻断缓冲液中的10μg/ml溶液孵育1小时。随后通过在400×g下离心将细胞在HHF中洗涤两次。加入山羊抗小鼠γ‑生物素(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，UK)于HHF缓冲液中的1/50稀释液且在冰上将细胞孵育1小时。如上将细胞在MACS缓冲液(补充有1％BSA，5mM EDTA和0.01％叠氮化钠的无Ca2+且无Mn2+的PBS)中洗涤两次并再悬浮于最终体积为0.9ml的MACS缓冲液中。
将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach，Germany)加入细胞悬浮液中且在冰上孵育15分钟。将细胞悬浮液洗涤两次并再悬浮于0.5ml MACS缓冲液中且随后上样至微型MACS管柱(MS Columns，Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次以恢复未结合STRO‑3mAb(于2005年12月19日保藏于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection；ATCC)，保藏编号PTA‑7282‑参见国际公布号WO2006/108229)。再加入1ml MACS缓冲液后，由磁体移除管柱并通过正压力分离TNAP+细胞。将来自各部分的细胞等分试样用抗生蛋白链菌素‑FITC染色并通过流式细胞术评估纯度。
实施例3：通过STRO‑3mAb选择的细胞是STRO‑1亮细胞
设计实验以证实使用STRO‑3mAb作为用于分离细胞STRO‑1亮细胞的单一试剂的可能性。
鉴于STRO‑3(IgG1)的同种型与STRO‑1(IgM)的同种型不同，因此通过双色FACS分析基于与使用MACS程序分离的STRO‑1+细胞的共表达评估STRO‑3鉴定克隆CFU‑F的能力(图1)。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×104个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的＜1.0％的反应性水平。结果表明较小群体的STRO‑1亮细胞共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO‑1+细胞未能与STRO‑3mAb反应。随后分析所有四个象限的通过FACS分离的细胞的CFU‑F发生率(表1)。
表1：通过双色FACS分析基于细胞表面标志物STRO‑1和TNAP的共表达富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞在标准克隆条件下在补充有20％FCS的αMEM中培养。数据表示铺板的每105个细胞中第14天群落形成细胞(CFU‑F)的平均数±SE(n＝3个不同骨髓抽吸物)。这些数据表明人MPC仅局限于BM(其明显共表达STRO‑1抗原)的TNAP阳性部分。
骨髓部分每105个细胞中CFU‑F的频率富集(增加倍数)未分级的BMMNC11.0±2.21.0TNAP+/STRO‑1亮4,511±185410TNAP+/STRO‑1深0.00.0
实施例4：STRO‑1深和Stro‑1亮细胞的相对基因和表面蛋白表达
在第一系列实验中，采用半定量RT‑PCR分析来检验由通过荧光活化细胞分选分离的STRO‑1深或STRO‑1亮群体表达的各种谱系相关基因的基因表达谱(图2A)。在第二系列实验中，采用流式细胞术和平均通道荧光分析来检验由通过荧光活化细胞分选分离的STRO‑1深或STRO‑1亮群体表达的各种谱系相关蛋白质的表面蛋白质表达谱。
从2×106个STRO‑1亮或STRO‑1深分选的原代细胞、软骨细胞集结粒和其它诱导培养物制备总细胞RNA，并使用RNAzolB提取方法(Biotecx Lab.Inc.，Houston，TX)根据制造商的推荐裂解。从各子群分离的RNA接着用作cDNA合成的模板，使用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行制备。如前所述(Gronthos et al.，J.Bone and Min.Res.14：48‑57，1999)通过PCR扩增使用标准方案评估各种转录物的表达。此研究中所用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并通过溴化乙锭染色进行观测。通过GAPDH的表达来评估RNA完整性。
使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评估各细胞标志物的相对基因表达(图2B、2C)。另外，与STRO‑1抗体组合基于多种细胞谱系相关标志物的表达使用双色流式细胞分析来检验离体扩增的MPC的蛋白质表达谱。基于STRO‑1深和STRO‑1亮培养细胞的基因和蛋白质表达的一般表型的概述表示于表3中。数据表明，离体扩增的STRO‑1亮MPC显示与血管周围细胞相关的标志物(包括血管位蛋白1、VCAM‑1、SDF‑1、IL‑1β、TNFα和RANKL)的差异表达较高。STRO‑1深和STRO‑1亮培养细胞的蛋白质和基因表达谱之间的比较概述于表3和表4中。
还进行消减杂交研究以鉴定由STRO‑1亮细胞唯一表达的基因。简单地说，如上所述分离STRO‑1深和STRO‑1亮(参见图3A)。使用RNA STAT‑60系统(TEL‑TEST)由从5个不同骨髓样本汇集的STRO‑1深和STRO‑1亮细胞制备总RNA。使用SMART cDNA合成试剂盒(Clontech Laboratories)进行第一链合成。通过长程PCR(Advantage2PCR试剂盒；Clontech)使用在初始RT过程中形成的3′和5′初始末端上的特定引物位点根据制造商的说明书扩增所得mRNA/单链cDNA杂交体。用RsaI消化STRO‑1亮cDNA后，使用2个等分试样利用Clontech PCR‑Select cDNA消减试剂盒来连接不同特定接头寡核苷酸。根据制造商的方案使用STRO‑1亮(测试者)和STRO‑1深(驱动者)cDNA且反之亦然来进行两轮消减杂交。也使用针对STRO‑1亮驱动cDNA杂交的STRO‑1深测试cDNA逆向进行此程序。
为鉴定由STRO‑1亮群体唯一表达的基因，使用STRO‑1亮消减cDNA来构建包含200个随机选择的转化有连接至T/A克隆载体中的STRO‑1亮消减cDNA的细菌克隆的重复低密度微阵列过滤器。随后用[32P]dCTP标记的STRO‑1亮或STRO‑1深消减cDNA探测微阵列(图3B‑3C)。不同筛选鉴定出总共44个克隆，其在STRO‑1深与STRO‑1亮子群之间高度地差异表达。对所有差异表达的克隆进行的DNA测序揭示，仅1个克隆代表已知基质细胞有丝分裂原；即，血小板衍生生长因子(PDGF)(Gronthos和Simmons，Blood.85：929‑940，1995)。有趣的是，发现44个克隆中有6个含有对应于趋化因子基质衍生因子1(SDF‑1)的DNA插入。人STRO‑1亮细胞中SDF‑1转录物的高丰度通过由新鲜分选的STRO‑1亮、STRO‑1深和STRO‑1阴性骨髓子群制备的总RNA的半定量RT‑PCR得到证实(图3D和表3)。
表2.用于特异性扩增人mRNA的RT‑PCR引物和条件


表3.STRO‑1亮和STRO‑1深群体中相对基因表达的概述。示出当通过逆转录PCR测定时在STRO‑1亮与STRO‑1深群体之间显示可测量且差异表达的基因列表。值表示参考持家基因GAPDH的相对基因表达。

为使蛋白质表面表达与STRO‑1表达的密度相关联，通过胰蛋白酶/EDTA分离制备离体扩增的由骨髓MPC得到的细胞的单细胞悬浮液并随后与STRO‑1抗体与鉴定多种细胞谱系相关标志物的抗体的组合一起孵育。使用山羊抗鼠类IgM‑异硫氰酸荧光素鉴定STRO‑1，同时使用山羊抗小鼠或抗兔IgG‑藻红蛋白鉴定所有其它标志物。对于鉴定细胞内抗原的那些抗体，首先用STRO‑1抗体标记细胞制备物，用70％冷乙醇固定以使细胞膜渗透并接着与细胞内抗原特异性抗体一起孵育。在相同条件下使用同种型匹配对照抗体。使用COULTEREPICS流式细胞仪进行双色流式细胞分析并收集列表模式数据。点阵图表示指示各谱系细胞标志物(y轴)和STRO‑1(x轴)的荧光强度水平的5,000个列表模式事件。参考同种型匹配阴性对照抗体建立垂直和水平象限。
表4.STRO‑1亮和STRO‑1深群体中相对蛋白质表达的概述。示出当通过流式细胞术测定时在STRO‑1亮与STRO‑1深群体之间显示差异表达的蛋白质的列表。值表示染色的相对平均荧光强度。

这些结果表明SDF‑1α和RANKL由STRO‑1亮细胞大量表达。它的重要性在于这些蛋白质都已知参与CD4+CD25+调节性T细胞的上调，所述T细胞赋予抵抗免疫病症(诸如GVHD)的保护作用(Loser等，Nature Medicine12：1372‑1379，2006；Hess，Biol.Blood Marrow Transplant，12(1Suppl2)：13‑21，2006；和Meiron等，J.Exp.Medicine205：2643‑2655，2008)。
实施例5：体外免疫抑制活性
为评估培养扩增的STRO‑1亮细胞(MPC(B))的免疫抑制活性，我们使用CD3/CD28刺激作为读数。将结果与培养扩增的如实施例1中分离的骨髓来源的STRO‑1阴性细胞(MSC(A))的群体相比较。在4个递增浓度的MSC和MPC制备物存在下用涂有CD3/CD28的珠粒刺激人外周血液单核细胞(PBMC)。通过3H‑Tdr并入测量T细胞的增殖。
测试MSC(A)和STRO‑1亮MPC(B)抑制人外周血液单核细胞(PBMC)对CD3/CD28刺激的反应的能力。加入与PBMC培养物呈不同比率的MSC和MPC或商购对照人MSC(Lonza)。3天后，加入3H‑Tdr维持18个小时并接着采集培养物。
PBMC回应于CD3/CD28的增殖由所有制备物以剂量依赖性方式抑制。然而，制备物B明显优于由制备物A以及对照hMSC产生的作用(图4)。在1∶100MSC∶PBMC比率下，MPC B仍抑制70％的对照T细胞增殖，而对照商购MSC(Lonza)和MSC A分别产生50％和60％抑制(图5)。
实施例6：GvHD的诱发和治疗
使用移植物抗宿主疾病(GvHD)模型基于多个次要组织相容性位点错配的供体接受者对来对STRO‑1亮细胞(MPC(B))的体内免疫抑制活性进行研究。将去除了T细胞的来自B10.D2(H2d)供体的骨髓单核细胞(BMMC)(5×106)和脾细胞(30×106)静脉内注射至经过致死辐照(750cGy)的BALB/c(H2d)接受者小鼠中。在此情况下，来自B10.D2的脾淋巴细胞识别和攻击BALB/c接受者组织并产生体重降低、纤维化和脱毛。使用常规评分系统通过在移植后4‑5周对动物进行称重并评估皮肤表现来监测疾病。作为比较，评估如实施例1中所分离的骨髓来源的STRO‑1阴性细胞(MSC(A))的免疫抑制活性。
虽然小鼠的阳性对照组不接受任何进一步处理，但从第4周开始每周向实验组静脉内注射每只小鼠2×106、1×106或0.3×106的剂量的MSC(A)或STRO‑1亮MPC(B)持续3次。每周监测小鼠两次。各组含有八只小鼠。
实施例7：MSC和MPC对GvHD发展的影响
小鼠接受1或2×106个MSC A(A1和A2)、1或2×106个MPC B(B1和B2)。在不存在或存在MSC处理下疾病的动力学报道于图6中。输注1×106个细胞后，在B与A的作用之间存在明显差异。虽然接受制备物A的小鼠与没有接受细胞的小鼠未显示任何实质性差异，但注射了制备物B的组显示对疾病严重性有明显有益的影响。移植后十三周，已接受了B1的小鼠的平均GvHD评分为0.5，相比之下，其它组中为2.3。
我们接着研究抗GvHD作用是否具有剂量依赖性。因此根据针对先前剂量所述的相同模态，向一组小鼠注射较高剂量(每只小鼠2×106个)且一组注射较低剂量(每只小鼠0.3×106个)的A或B。图7报道最高剂量的作用。高剂量MPC(B2)的治疗作用相对于A2较优，其中在此组中在前11周根本未见GvHD。在第14周和第15周，每只小鼠GvHD的后果甚至更明显(图8)，其中在A1组中根本没有小鼠存活。
最后，注射较低剂量(每只小鼠0.3×106个)再次显示到第9周时，STRO‑1亮MPC(B)对GVHD评分降低具有优于A的效果(图9和图10)。
此试验性研究的数据一致表明，与未处理或用STRO‑1阴性MSC处理相比，STRO‑1亮MPC显示较高的免疫抑制能力。这在体外分析并且更重要的是在体内分析中是明显的。STRO‑1亮MPC在每只小鼠0.3‑2×106个细胞的剂量范围内对于预防指定GvHD产生了明显的临床效果。
本文件中引用的所有参考文献都是以引用的方式并入本文。
本领域的技术人员应了解，可在不背离本发明的作广义描述的精神和范围下如特定实施方案中所示对本发明作出多种变化和/或修改。因此在所有方面，本发明的实施方案视为仅具说明性而不具限制性。