一种变形链球菌的双重PCR快速检测方法.pdf

本发明公开了一种变形链球菌的双重PCR快速检测方法，属于分子生物学技术领域。利用PCR方法扩增变形链球菌的特异基因片段，通过核酸电泳观察扩增结果。本发明通过针对变形链球菌spaP和dex两个基因的特异片段设计引物spaP F和spaP R、dex F和dex R，使得双重PCR快速检测中反应条件稳定，敏感性及特异性都强，能准确判断变形链球菌的感染。

权利要求书一种变形链球菌（S.Mutans）的双重PCR快速检测方法，其特征在于，采用双重PCR扩增口腔标本或培养物中的S.Mutans特异性基因片段，所述双重PCR扩增反应体系中含有如下引物：
dex F：5’‑TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC‑3’，
dex R：5’‑TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT‑3’，
spaP F：5’‑AACGACCGCTCTTCAGCAGATA‑3’，
spaP R：5’‑AGAAAGAACATCTCTAATTTCT‑3’。
根据权利要求1所述的方法，所述双重PCR扩增反应体系为：
总体积为50μl，各组分及含量如下：5μl的10×PCR Buffer，3μl浓度为25mM的MgCl2，共4μl浓度各为2.5mM的dNTP混合物，各2μl的引物，0.25μl浓度为5U/μl的DNA聚合酶，5μl模板，24.75μl的灭菌蒸馏水。
根据权利要求2所述的方法，双重PCR扩增反应的循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃完全延伸5min。
根据权利要求1所述的方法，所述口腔标本或培养物中的S.Mutans特异性基因片段的获得通过下述方法：采集牙菌斑或挑取牙菌斑培养物，用试剂盒提取DNA作为模板。
一种检测变形链球菌（S.Mutans）的试剂盒，含有如下引物：
dex F：5’‑TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC‑3’，
dex R：5’‑TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT‑3’，
spaP F：5’‑AACGACCGCTCTTCAGCAGATA‑3’，
spaP R：5’‑AGAAAGAACATCTCTAATTTCT‑3’。

说明书一种变形链球菌的双重PCR快速检测方法
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种变形链球菌的双重PCR快速检测方法。
背景技术
龋病是人类最普遍的疾病之一，发病率高，WHO将其与癌症和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。世界卫生组织最新发布的《全球口腔健康报告》中，估计全球63亿人口有50亿人患过龋齿，在发达国家中60％～90％的学龄儿童和大部分成人患过龋齿，在我国成人发病率为50％，儿童则高达70％～90％，它已然成为威胁人类口腔健康的全球性问题。
龋病是含糖食物（特别是蔗糖）进入口腔后，在牙菌斑内经致龋菌的作用，发酵产酸，这些酸（主要是乳酸）从牙面结构薄弱的地方侵入，溶解破坏牙的无机物而产生的。变形链球菌（S.Mutans）是人类主要的致龋微生物，它在口腔中的定植与龋病的发生密切相关（张志愿.《口腔科学》，人民卫生出版社，第七版，2008年，48;岳松龄.《现代龋病学》，科学技术文献出版社，2009年，53‑54.）。因此，鉴定口腔S.Mutans的感染，对龋病的早期诊断及防治都具有重要意义。
目前已发现定植于口腔的细菌有700余种，要从众多的细菌中找到一种既简单又准确的方法鉴别S.Mutans显得尤为重要。目前检测S.Mutans方法主要有微生物学方法、免疫学方法、生物芯片技术和分子生物学方法等。①微生物学检测方法，均需分离养基S.Mutans，口腔细菌种类繁多，通常需要用选择性培养基才能分离培养，目前最常用的轻唾杆菌肽培养基(MSB)也不能有效的将S.Mutans与口腔链球菌群中的许多细菌（如远缘链球菌、血链球菌、唾液链球菌、缓症链球菌、非解乳链球菌、多动链球菌、变异库克菌等）分开。②免疫学方法，有多克隆抗体技术和单克隆抗体技术，由于前者所使用的抗体来自多个克隆，难以分离提纯，目前已被单克隆抗体技术所取代。后者准确度虽于PCR相似，但抗体的制备过程十分不易，耗时很长。③生物芯片技术将大量的基因探针、基因片段或抗原(抗体)按特定方式固定的排列在特制的载体(如玻片)上，在特定条件下与待检样品进行作用，通过精密的扫描仪器进行记录、检测和分析的一种技术，该技术灵敏度高但仪器和探针价格昂贵，而且操作复杂。④分子生物学方法，常用的有DNA杂交技术和PCR。DNA杂交技术是通过不同细菌DNA碱基顺序同源性对细菌种属间的亲缘关系作出分类鉴定，尤其对一个新菌，或对表型性状差别小，难以识别菌株的分类鉴定更有价值。因此根据血清特异性基因序列设计特异性PCR引物鉴别S.Mutans的不同血清型，与传统方法相比，具有简单、快速、可靠、特异性好的优点。
PCR基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性‑‑退火‑‑延伸三个基本反应步骤构成，DNA模板‑‑引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的DNA。2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
研究表明，S.Mutans spaP基因表达的AgI/II可以促进其定植能力，在S.Mutans株的c和f两个血清型中可克隆出spaP基因。虽然从其它链球菌也发现相似的抗原，但spaP基因仍然最有可能是变形链球菌属的特异性基因（LaPolla RJ，Haron JA，Kelly CGetal.Sequence and structural analysis of surface protein antigen1/11(SpaA)of Streptococcus sobrinus.Infect Immun1991;59：2677‑2685），而且用spaP特异性结合的探针检测S.Mutans比用通常的gtfB和ftf基因探针检测更敏感（Smorawinska M，Kuramitsu HK.DNA probes for detection of cariogenic Streptococcus mutans.Oral Microbiol Immunol1992;7：177‑181.）。
S.Mutans dex基因的产物是葡聚糖酶，葡聚糖酶通过切断α‑1,6‑键使葡聚糖中α‑1,3‑键与α‑1,6‑键的比例增加,以增加葡聚糖的非水溶性及粘附性,是龋病发生的重要因素之一。S.Mutans的葡聚糖酶dex基因和其他能够产生葡聚糖酶的口细菌的dex基因差异较大。Igarashi等(Igarashi T,Yamamoto A,Goto N.Microbiol Immunol,2001,45（5）：341‑348.)比较了变形链球菌群S.mutans、S.sobrinus、S.downei、S.salivarius的dex分子结构发现：4种菌的dex均含有1个N‑末端信号肽、2个可变区和1个保守区，保守区同源性高，可变区同源性低。S.Mutans的dex基因具有特征性的原核生物核糖体结合位点和启动子序列，核糖体结合位点与起始密码子之间的距离要远大于已知的变形链球菌群的其他基因。这些均表明S.Mutans dex基因适合用于设计特异性的PCR引物，用以鉴别变形链球菌群的其他菌种（胡晓燕.变形链球菌分子生物学鉴定技术新进展[J].国际口腔医学杂志，2006，33(5):346‑348.）。Igarashi等（Igarashi T,Asaga E,Murai C,etal.Lett Appl Microbiol,2004,38（2）：125‑129.）针对S.Mutans（S.mutans）、表兄链球菌（S.sobrinus）、汗毛链球菌（S.downei）的dex基因设计菌种特异性引物，直接对临床分离株进行PCR检测，不同菌种特异性引物的混合扩增性片段，成功鉴别S.mutans、S.sobrinus、S.downei，显示出根据dex基因设计特异性引物的良好鉴别力。
所以dex和spaP基因都是S.mutans鉴定的良好靶点，选择dex和spaP基因的特异性片段设计引物，通过PCR来鉴别S.Mutans，可以使检测更敏感，准确性更高，而且操作简单。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种S.Mutans的双重PCR快速检测方法，可快速、准确检测口腔标本或培养物中的S.Mutans，为研究龋齿及牙周病的发病机制、临床监测龋齿及牙周病的病情变化、确定治疗方案提供重要依据。
本发明还提供根据上述检测方法设计的试剂盒。
一种变形链球菌（S.Mutans）的双重PCR快速检测方法，其特征在于，采用双重PCR扩增口腔标本或培养物中的S.Mutans特异性基因片段，所述双重PCR扩增反应体系中含有如下引物：
dex F：5’‑TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC‑3’，
dex R：5’‑TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT‑3’，
spaP F：5’‑AACGACCGCTCTTCAGCAGATA‑3’，
spaP R：5’‑AGAAAGAACATCTCTAATTTCT‑3’。
所述双重PCR扩增反应体系为：
总体积为50μl，各组分及含量如下：5μl的10×PCR Buffer，3μl浓度为25mM的MgCl2，共4μl浓度各为2.5mM的dNTP混合物，各2μl的引物，0.25μl浓度为5U/μl的DNA聚合酶，5μl模板，24.75μl的灭菌蒸馏水。
双重PCR扩增反应的循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃完全延伸5min。
所述口腔标本或培养物中的S.Mutans特异性基因片段的获得通过下述方法：采集牙菌斑或挑取牙菌斑培养物，用试剂盒提取DNA作为模板。
一种检测变形链球菌（S.Mutans）的试剂盒，含有如下引物：
dex F：5’‑TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC‑3’，
dex R：5’‑TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT‑3’，
spaP F：5’‑AACGACCGCTCTTCAGCAGATA‑3’，
spaP R：5’‑AGAAAGAACATCTCTAATTTCT‑3’。
所述的试剂盒，含有如下组分及其含量：
5μl的10×PCR Buffer，3μl浓度为25mM的MgCl2，共4μl浓度各为2.5mM的dNTP混合物，各2μl的引物，0.25μl浓度为5U/μl的DNA聚合酶，24.75μl的灭菌蒸馏水。
本发明的双重PCR扩增口腔标本或培养物中的S.Mutans特异性基因片段，具体包括如下步骤：
1)DNA模板制备，具体步骤如下：
采集牙菌斑或挑取牙菌斑培养物，用试剂盒或其他方法提取DNA作为模板。
2)双重PCR扩增伴S.Mutans特异性基因片段，具体步骤如下：
反应体系：总体积为50μl


引物：
dex F5’‑TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC‑3’，
dex R5’‑TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT‑3’，
spaP F5’‑AACGACCGCTCTTCAGCAGATA‑3’，
spaP R5’‑AGAAAGAACATCTCTAATTTCT‑3’。
PCR反应循环参数为：
94℃预变性5min；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃完全延伸5min。
3)电泳检测鉴定
对上述扩增的S.Mutans特异性基因片段进行电泳检测，电泳图中同时含有长度为403bp的dex片段及192bp的spaP片段两个扩增条带为阳性。
电泳检测鉴定的具体操作方法如下：
以TAE缓冲液（40mM Tri‑醋酸，2mM EDTA，pH8.5）配制2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，待冷却至50～60℃时，加入溴化乙锭，使溴化乙锭终浓度为0.5μg/ml，充分混匀，倒入胶槽中，放好梳子，待胶凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使液面高出凝胶表面l～2mm；再将PCR扩增后的特异基因溶液与10×上样缓冲液以l：10体积比混合，用微量移液器将该混合液(样品)依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电，80V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳25～35min后，切断电源，取出凝胶，在紫外光下观察。
利用本发明所述的双重PCR快速检测S.Mutans的方法，可快速、准确检测口腔标本或培养物中的S.Mutans，为研究龋齿及牙周病的发病机制、临床监测龋齿及牙周病的病情变化、确定治疗方案提供重要依据。
附图说明
图1.为双重PCR鉴定S.Mutans琼脂糖凝胶电泳图
其中泳道l为核酸（DNA）分子量标准（TIANGEN，Marker I，MD101），泳道2为S.Mutans菌ATCC700610PCR扩增产物，泳道3为S.Mutans菌GIM1.289PCR扩增产物，泳道4为S.Mutans菌GIM1.275PCR扩增产物，泳道5为远缘链球菌ATCC33478PCR扩增产物，泳道6为血链球菌CGMCC1.2497，泳道7为唾液链球菌CGMCC1.2498PCR扩增产物，泳道8为缓症链球菌CMCC32232PCR扩增产物，泳道9为非解乳链球菌ATCC43492PCR扩增产物，泳道10为变异库克菌ATCC399PCR扩增产物，泳道11为肺炎链球菌ATCC49619PCR扩增产物，泳道12为金黄色葡萄球菌ATCC25923PCR扩增产物，泳道13为大肠杆菌ATCC25922PCR扩增产物，泳道l4为铜绿假单胞菌ATCC27853PCR扩增产物。
图2.为双重PCR快速检测牙菌斑中的S.Mutans琼脂糖凝胶电泳图
其中泳道1为核酸（DNA）分子量标准（TIANGEN，Marker I，MD101），泳道,2~19为龋病患者牙菌斑标本PCR扩增产物，泳道20~25为无龋者牙菌斑标本PCR扩增产物
具体实施方式
实施例1、双重PCR鉴定S.Mutans
一、S.Mutans及对照菌株培养
选取S.Mutans菌ATCC700610、GIM1.289、GIM1.275；远缘链球菌ATCC33478；血链球菌CGMCC1.2497；唾液链球菌CGMCC1.2498；缓症链球菌CMCC32232；非解乳链球菌ATCC43492；变异库克菌ATCC399；肺炎链球菌ATCC49619；金黄色葡萄球菌ATCC25923；大肠杆菌ATCC25922及铜绿假单胞菌ATCC27853。涂BHI培养平板（Brain Heart infusion,BD BactoTM，LOT：7128153），置37℃微需氧(85%N2，8%CO2，5%O2)培养48h。
二、模板DNA制备
挑取平板上的菌落，用“细菌基因组DNA提取试剂盒”（TIANGEN，DP302）抽提基因组，操作按说明书进行。
三、双重PCR反应
以上述方法制备的DNA为模板，分别用dex‑F、dex‑R、spaP‑F和spaP‑R为引物，采用DNA聚合酶（TaKaRa TaqTM，Code：DR001AM）进行PCR扩增。反应体系配制如下：

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃完全延伸5min。反应完毕后2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图1，3株S.Mutans标准菌株两对引物扩增双阳性，远缘链球菌和血链球菌spaP基因片段扩增阳性，其余8个不同对照菌株扩增结果均为阴性。
实施例2、双重PCR快速检测牙菌斑中的S.Mutans。
一、牙菌斑标本采集
常规清水漱口，生理盐水冲洗，无菌棉球隔湿，局部用2.5%碘酊消毒，牙科探针采集牙菌斑，立即放入装有50μL0.2M NaOH的EP管中。
二、模板DNA制备
将牙菌斑标本涡旋振荡（IKA VORTEX1）30s，室温静置5min，加入50μL0.2M HCl/PBS（200mM HCl，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4），混匀，12000g离心5min，取上清作PCR模板。
三、双重PCR反应
同实施例1。结果见图2，18个龋病患者牙菌斑标本PCR检测扩增呈双阳性，6个无龋者牙菌斑标本PCR检测扩增呈阴性。