说明书核酸计数
【相关申请】
本申请要求2010年6月7日提交的美国临时申请No.61/352,062的优先权。美国临时申请No.61/352,062的公开内容通过引用以其整体合并。
【技术领域】
本发明涉及用于可用于检测罕见事件的核酸计数的方法和系统，所述罕见事件诸如胚胎非整倍性，癌检测和感染性疾病。
【背景技术】
存在于患病的细胞中的核酸的突变的早期检测和不平衡的确定可具有重要临床含义。例如，癌细胞可携带不存在于正常细胞的突变，而该突变的检测可辅助癌的早期诊断。具有小于2个常染色体基因的正常拷贝的个体可处于发展疾病和/或成为疾病携带者的增加的风险。作为另一例，非整倍性定义为导致在发育的早期阶段可为致死，在怀孕后期导致流产或导致活的但异常怀孕的遗传不平衡的全染色体或染色体的部分的异常数。最频繁和临床显著的非整倍性涉及单数染色体（严格“非整倍体性”），其中有3个（“三体性”）或仅1个（“单体性”），代替正常对的染色体。由此，精确的核酸计数诸如染色体可具有寿命‑变化结果。因此，有对用于检测突变和/或基因组不平衡的更精确和敏感方法的大需求。
【发明概述】
本发明提供用于分析（例如,检测和/或计数）生物学样品中的靶核酸的更精确的，有效和敏感方法和系统。尤其是，本发明提供用于基于单分子扩增和基于杂交的探查的精确的核酸分子计数的方法和系统。此外，本发明对于检测罕见事件包括与疾病和病情关联的突变是有用的。
一方面，本发明提供测定生物学样品中靶核酸的相对量的方法。在一些实施方式中，本发明的发明的方法包括以下步骤：排列自生物学样品获得的多核苷酸以形成多个反应位点，其中各反应位点含有平均一个多核苷酸；扩增多个反应位点中的多核苷酸；由核酸杂交测定（i）含有靶核酸序列、或其部分的第1反应位点的第1数，及（ii）含有参照核酸序列、或其部分的第2反应位点的第2数；及比较第1反应位点的第1数与第2反应位点的第2数以测定生物学样品中靶核酸的相对量。
与已之前描述的其他方法，诸如大规模并行测序相反，本发明提供用于测定生物学样品中靶核酸的相对量的更快的，更有效和欠昂贵的方法。在一些实施方式中，本发明的方法包括提供在PCR基质上在PCR克隆（PCR集落）中排列的5百万拷贝的基因组信息；各用不同可检测的标记物标记的用于期望的序列的百万的PCR探针可然后与基质杂交；移出过量标记物，及各可检测的标记物的数和同一性可通过知道的方法测定；靶核酸的相对量可通过针对知道的参照序列标准化靶序列的比来测定，如已之前描述。
在另一方面，本发明的实施方式可用作用于由血清筛选具有阳性结果的患者或用于被认为“高风险”的患者的另外的出生前筛选工具。本发明的实施方式，如在本文详细描述，可在早至4～6周妊娠的头三个月期间利用。在其他实施方式中，本发明的方法可在大致12周妊娠阳性血清筛选之后利用。本发明的实施方式可呈现100%灵敏度，有小于1%假阳性。
在一些实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：排列自生物学样品获得的多核苷酸以形成多个扩增位点，其中各扩增位点含有平均一个多核苷酸；扩增多个扩增位点中的多核苷酸以产生扩增产物；使扩增产物与特异于多个检测位点中的（i）靶核酸、或其部分，及（ii）参照核酸、或其部分的核酸探针杂交，其中各检测位点含有平均一个来自扩增产物的多核苷酸；测定（i）含有与靶核酸、或其部分杂交的探针的第1检测位点的第1数，及（ii）含有与参照核酸、或其部分杂交的探针的第2检测位点的第2数；及比较第1检测位点的第1数与第2检测位点的第2数以测定生物学样品中靶核酸的相对量。在一些实施方式中，本发明的方法还在杂交步骤之前包括收获扩增产物的步骤。在一些实施方式中，杂交步骤用微阵列实施。
在一些实施方式中，排列步骤通过使用固体，半‑固体和/或液体支持物实施。在一些实施方式中，排列步骤在固体支持物上实施。在一些实施方式中，适合的固体支持物选自：玻璃，光学纤维，氧化硅，微芯片，塑料，珠；生物膜，纤维素。
在一些实施方式中，排列步骤包括使用流动细胞技术的步骤。在一些实施方式中，排列步骤包括在凝胶基质之内分布核酸分子收集物的步骤。在一些实施方式中，排列步骤包括使核酸分子收集物与乳剂珠混合的步骤。
在一些实施方式中，支持物包含多个其上固定的捕获部分以捕获个体多核苷酸。在一些实施方式中，捕获部分包含捕获寡核苷酸。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括首先处理多核苷酸使得个体多核苷酸在5’和3’端含有适配体序列的步骤，其中适配体序列在支持物上与固定的捕获寡核苷酸杂交。
在一些实施方式中，扩增步骤包括实施PCR反应。在一些实施方式中，扩增步骤包括实施滚环扩增。
在一些实施方式中，待计数的靶核酸是靶染色体。在一些实施方式中，靶染色体选自：第X，Y，13，18或21染色体。在其他实施方式中，靶染色体可包含第4，5，8，9，11，15，16，17或22染色体。在一些实施方式中，参照核酸是参照染色体。在一些实施方式中，参照染色体是：第1，2，6，11，X，Y，13，18或21染色体。在其他实施方式中，参照染色体可包含第4，5，8，9，11，15，16，17或22染色体。
在一些实施方式中，靶核酸含有突变。在一些实施方式中，突变选自：单核苷酸多态性（SNP），缺失，插入，复制和其组合。
在一些实施方式中，待分析的生物学样品含有过丰或亚丰的靶核酸。在一些实施方式中，生物学样品含有非整倍体染色体。
在一些实施方式中，适合的特异于靶核酸、或其部分的核酸探针特异于单个座位。在一些实施方式中，适合的特异于靶核酸、或其部分的核酸探针特异于多个座位。在一些实施方式中，将适合的特异于靶核酸、或其部分的核酸探针多重化。在替代实施方式中，适合的多重化的探针包含2～10,000个探针。在一些实施方式中，适合的多重化的探针包含约200，或300，或400，或500，或600，或700，或800，或900，或1,000，或1,500，或2,000，或2,500，或3,000，或3,500，或4,000，或5,000，或6,000，或7,000，或8,000，或9,000个探针。在一些实施方式中，适合的多重化的探针包含约500个探针。
在一些实施方式中，适合的特异于参照核酸、或其部分的核酸探针特异于单个座位。在一些实施方式中，适合的特异于靶核酸、或其部分的核酸探针特异于多个座位。在一些实施方式中，将适合的特异于参照核酸、或其部分的核酸探针多重化。在替代实施方式中，适合的多重化的探针包含2～10,000个探针。在一些实施方式中，适合的多重化的探针包含约200，或300，或400，或500，或600，或700，或800，或900，或1,000，或1,500，或2,000，或2,500，或3,000，或3,500，或4,000，或5,000，或6,000，或7,000，或8,000，或9,000个探针。在一些实施方式中，适合的多重化的探针包含约500个探针。
在一些实施方式中，特异于靶核酸、或其部分的探针，及特异于参照核酸、或其部分的探针，用特殊地可检测的信号标记。在一些实施方式中，特殊地可检测的信号是不同光信号。在一些实施方式中，不同光信号是不同荧光或发光信号。
在一些实施方式中，测定步骤包括测定靶核酸的相对拷贝数。在一些实施方式中，测定靶核酸的相对拷贝数的步骤包括以下步骤：（a）测定指示含有靶核酸、或其部分的检测位点的第1数的第1荧光信号水平，将其相对背景信号标准化；（b）测定指示含有参照核酸、或其部分的检测位点的第2数的第2荧光信号水平，将其相对背景信号标准化；（c）测定第1荧光信号水平与第2荧光信号水平的比；及（d）通过相对特异于靶核酸的探针数和特异于参照核酸的探针数之间的比标准化在步骤（c）中测定的比来测定靶核酸的相对拷贝数。
在一些实施方式中，自生物学样品获得的多核苷酸以小于一个基因组当量的量含有基因组DNA。在一些实施方式中，扩增产物以预定的水平的基因组当量含有扩增的基因组DNA。
在一些实施方式中，靶核酸占自生物学样品获得的多核苷酸的小于1%。在一些实施方式中，靶核酸占自生物学样品获得的多核苷酸的小于0.1%。在一些实施方式中，靶核酸占自生物学样品获得的多核苷酸的小于1百万分之1。在一些实施方式中，靶核酸占自生物学样品获得的多核苷酸的小于1千万分之1。或者，自生物学样品获得的多核苷酸可落入这些范围之内。
在一些实施方式中，靶核酸源于胚胎细胞。在一些实施方式中，靶核酸包含胚胎染色体。在一些实施方式中，靶核酸源于可为相同的来源或可为不同来源的患病的细胞（例如,癌细胞）或多个癌细胞（例如,原发性癌和转移）。
在一些实施方式中，本发明的方法还在排列步骤之前包括全基因组扩增的步骤。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括测定是否靶核酸的相对量相比对照异常的步骤。在一些实施方式中，本发明的方法用于检测与异常量的靶核酸关联的疾病，病症或病情，或其携带者。在一些实施方式中，本发明的方法用于胚胎非整倍性的出生前诊断。
在一些实施方式中，适合的生物学样品选自：细胞，组织，全血，血浆，血清，尿，粪便，唾液，脐带血，绒毛膜绒毛样品，绒毛膜绒毛样品培养物，羊水，羊水培养物，经子宫颈灌洗液，及其组合。或者可使用其他生物学样品（例如,组织活组织检查）。
在另一方面，本发明也提供用于实施本文所述的各种方法的系统。在一些实施方式中，本发明提供测定靶核酸的相对量的系统，包含为扩增在多个扩增位点上的多核苷酸以产生扩增产物的组分；为实施扩增产物与用特异于靶核酸、或其部分的第1可检测的信号标记的探针，及用特异于参照核酸、或其部分的第2可检测的信号标记的探针的杂交的组分；适应于测定第1可检测的信号的水平，及测定第2可检测的信号的水平的组分（例如,测定模块）；配置为存储来自测定模块的信号信息和由用户提供的指示特异于靶核酸、或其部分的探针数，及特异于参照核酸、或其部分的探针数的信息的组分（例如,存储装置）；及适应于计算第1可检测的信号的水平与第2可检测的信号的水平的比及通过相对特异于靶核酸、或其部分的探针数和特异于参照核酸、或其部分的探针数之间的比标准化信号水平比来测定靶核酸的相对量的组分（例如,计算模块）。
在仍另一方面，本发明提供用于检测在生物学样品中的罕见事件的方法和系统。在一些实施方式中，本发明提供检测生物学样品中的靶核酸的方法，包括排列自生物学样品获得的多核苷酸以形成多个反应位点，其中各反应位点含有平均一个多核苷酸；扩增多个反应位点中的多核苷酸以产生多个簇使得各簇含有扩增的核酸产物；及通过使用一种或更多特异于靶核酸的探针杂交检测含有靶核酸、或其部分的簇或反应位点，由此检测生物学样品中的靶核酸。本文所述的各替代实施方式指称任何本发明的方法或系统，除非另外陈述。
在本申请中，使用“或”是指“和/或”除非另外陈述。如在本申请中使用，术语“包含（comprise）”和该术语的变异，诸如“包含（comprising）”和“包含（comprises）”，未旨在排除其他添加剂，组分，整体或步骤。如在本申请中使用，术语“约”和“大致”用作相当体。本申请中使用的有或无/大致的任何数字意指含盖由关联领域普通技术人员同意的任何正常波动。在特定实施方式中，术语“大致”或“约”指称以任意方向（大于或小于）落入陈述的参照值的25%，20%，19%，18%，17%，16%，15%，14%，13%，12%，11%，10%，9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小范围的一系列值，除非另外陈述或自情景另外明白（除非该数会超过可能的值的100%）。
其他特征，本发明的目的和优势在以下详述和权利要求中显而易见。但是，应明白，详述，及权利要求，在指示本发明的实施方式的同时，由仅例证，而非限制的方式给予。本发明的范围之内的各种变化和修饰对本领域技术人员会变得显而易见。
【定义】
为了本发明更容易明白，以下首先定义特定术语。以下术语和其他术语的另外的定义贯穿说明书给出。
等位基因：如本文所用，短语“等位基因”与“等位基因变体”互换使用及指称座位或基因的变体。在一些实施方式中，座位或基因的特定等位基因相关于特定表型，例如，改变的发展疾病或病情的风险，进展为特定疾病或病情阶段的似然性，依从于特定治疗剂，对感染的感受性，免疫功能，等。
扩增：如本文所用，术语“扩增”指称本领域知道的任何拷贝靶核酸的方法，由此增加选择的核酸序列的拷贝数。扩增可为指数或线性扩增。靶核酸可为DNA或RNA。一般而言，以此方式扩增的序列形成“扩增子”。扩增可用各种方法实现，包括但不限于聚合酶链反应（“PCR”），基于转录的扩增，等温扩增，滚环扩增，等。扩增可用相对类似量的引物对的各引物实施，以产生双链扩增子。但是，不对称PCR可用于扩增主要或完全单链产物，如为本领域所熟知（例如,Poddar et al.Molec.And Cell.Probes 14:25‑32(2000)）。此可通过使用各引物对通过相对于对的另一引物显著减少一个引物的浓度（例如,100倍差异）来达到。由不对称PCR的扩增通常是线性的。本领域技术人员会明白，不同扩增方法可一起使用。
非整倍性：如本文所用，术语“非整倍性”指称异常数的全染色体或部分染色体。一般而言，非整倍性导致遗传不平衡，其在发育的早期阶段可为致死，在随后怀孕中导致流产或导致活的但异常怀孕。最频繁的和临床显著非整倍性涉及单染色体（严格意义上“非整倍体性”），其中有3个（“三体性”）或仅一个（“单体性”）代替正常对的染色体。
动物：如本文所用，术语“动物”指称动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”指称人，在发育的任何阶段，包括尚未出生的人（例如,胎儿）。在一些实施方式中，“动物”指称非‑人动物，在发育的任何阶段。在特定实施方式中，非‑人动物是哺乳动物（例如,啮齿动物,小鼠,大鼠,兔,猴,狗,猫,绵羊,牛,灵长类动物，和/或猪）。在一些实施方式中，动物包括，但不限于，哺乳动物，鸟，爬行动物，两栖动物，鱼，昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可为转基因动物，遗传‑加工的动物和/或克隆。
大致：如本文所用，如对一个或更多目标值应用的术语“大致”或“约”指称近似于陈述的参照值的值。在特定实施方式中，术语“大致”或“约”指称以任意方向（大于或小于）落入陈述的参照值的25%，20%，19%，18%，17%，16%，15%，14%，13%，12%，11%，10%，9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小范围的一系列值，除非另外陈述或自情景另外明白（除非该数会超过可能的值的100%）。
生物学样品：如本文所用，术语“生物学样品”包括自生物学来源获得的任何样品。生物学样品可，由非限制性例的方式，包括血，羊水，血清，尿，粪便，表皮样品，皮肤样品，颊拭子，精子，羊水，培养的细胞，骨髓样品，组织活组织检查和/或绒毛膜绒毛。方便的生物学样品可由，例如，自口腔前庭的表面刮细胞来获得。任何生物学样品的细胞培养也可用作生物学样品，例如，绒毛膜绒毛样品和/或羊水培养诸如羊水细胞培养物的培养。生物学样品也可为，例如，自，可包含细胞（无论原代细胞或培养的细胞）的任何器官或组织（包括活组织检查或尸检样本）获得的样品，根据任何细胞，组织或器官，组织培养物调节的培养基。在一些实施方式中，适合于本发明的生物学样品是已处理而释放或另外使得用于本文所述的检测核酸可利用的样品。适合的生物学样品可从生命的阶段诸如胎儿，年轻成年，成年（例如,怀孕的女性）等得到。也可使用固定的或冷冻的组织。术语“生物学样品”和“生物学样本”互换使用。
携带者：如本文所用，短语“携带者”指称包含遗传突变或等位基因变体，但不显示与遗传突变或等位基因变体关联的疾病的症状的个体。但是，携带者，一般能将遗传突变或等位基因变体传递给它们的后代，这些后代可然后表达突变的基因或等位基因变体。一般而言，此现象是许多基因的隐性性质的结果。在特定实施方式中，携带者带有的突变或等位基因变体易感或相关于特定表型，例如，改变的发展疾病或病情的风险，进展为特定疾病或病情阶段的似然性，对特定治疗剂的依从性，对感染的感受性，免疫功能，等。无限制，携带者可具有减少的或增加的基因或部分基因的拷贝数。携带者也可在基因之内包含突变（例如,点突变,多态性,缺失,插入或转位,等）。“携带者”也在本文称为“遗传携带者”。
拷贝数：如本文所用，短语“拷贝数”当参照座位使用时，指称每基因组或基因组相当体上存在的该座位的拷贝数。“正常拷贝数”当参照座位使用时，指称存在于正常个体的正常或野生型等位基因的拷贝数。在特定实施方式中，拷贝数是0～2，包括端点。在特定实施方式中，拷贝数是0～3，0～4，0～6，0～7，或0～多于7拷贝，包括端点。在座位的拷贝数在群中个体间变化大的实施方式中，为计算和/或比较目的，可取估计的中位拷贝数作为“正常拷贝数”。
编码序列对比非‑编码序列：如本文所用，术语“编码序列”指称可被转录和/或翻译而产生mRNA和/或其多肽或片段的核酸或其补体，或其一部分的序列。编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的外显子，其由细胞的生物化学机械接合在一起而提供成熟mRNA。反义链是该核酸的补体，而编码序列可由其推导。如本文所用，术语“非‑编码序列”指称不体内转录成氨基酸，或其中tRNA不相互作用而放置或尝试放置氨基酸的核酸或其补体，或其一部分的序列。非‑编码序列包括：基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的内含子序列，及基因‑关联的序列诸如启动子，增强子，沉默子，等。
补体：如本文所用，术语“补体”，“互补”和“互补”指称根据Watson/Crick配对规则的核苷酸序列的配对。例如，序列5’‑GCGGTCCCA‑3’具有5’‑TGGGACCGC‑3’的互补序列。补体序列也可为与DNA序列互补的RNA的序列。不通常见于天然的核酸的特定碱基可包括在互补核酸中，包括但不限于肌苷，7‑脱氮鸟嘌呤，锁核酸（LNA），及肽核酸（PNA）。互补性不必需是完美的；稳定的双联体可含有错配的碱基对，简并体或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可考虑许多变量包括，例如，寡核苷酸长度，寡核苷酸的碱基组成和序列，离子强度和错配的碱基对的发生率，依经验测定双联稳定性。
对照：如本文所用，术语“对照”具有其领域‑明白的含义，即为针对其比较结果的标准物。一般而言，对照用于通过分离变量增加实验中的完整性，以便得到关于该变量的结论。在一些实施方式中，对照是与测试反应或测定同时实施以提供比较的反应或测定。在一实验中，应用“测试”（即,测试的变量）。在第2实验中，“对照”，未应用测试的变量。在一些实施方式中，对照是历史对照（即,之前实施的测试或测定,或之前知道的量或结果）。在一些实施方式中，对照是或包含打印的或另外保存的记录。对照可为阳性对照或阴性对照。
粗产物：如本文所用，术语“粗产物”，当使用关联生物学样品时，指称处于基本上未精制的状态的样品。例如，粗产物样品可为细胞裂解物或活组织检查组织样品。粗产物样品可存在于溶液或作为干制备物。
缺失：如本文所用，术语“缺失”包括自天然存在的核酸移出一个或更多核苷酸的突变。
侧接：如本文所用，术语“侧接”意指与邻接寻求在靶上扩增的目标区的靶核酸杂交的引物。本领域技术人员会明白，优选的引物是自目标区3’杂交的引物对，每一个在靶双链DNA分子的各链，使得核苷酸可由适合的DNA聚合酶添加到引物的3’端。
基因：如本文所用，术语“基因”指称负责离散的细胞（例如,细胞内或细胞外）产物和/或功能的离散的核酸序列。更特别，术语“基因”指称包括编码蛋白的部分和任选地包括调控序列，诸如启动子，增强子，终止子，等，其涉及由目标基因编码的蛋白的表达的调节的核酸。如本文所用，术语“基因”也可包括不编码蛋白而是提供功能RNA分子诸如tRNA，rRNA，等的转录用模板的核酸。或者，基因可限定特定事件/功能的基因组位置，诸如蛋白和/或核酸结合位点。
基因型：如本文所用，术语“基因型”指称生物的遗传体质。更特别，术语指称存在于个体的等位基因的鉴定。个体或DNA样品的“基因分型”指称鉴定由个体在知道的多态位点具有的2个等位基因的关于核苷酸碱基的性质。
杂合：如本文所用，术语“杂合”或“HET”指称具有相同的基因的2个不同等位基因的个体。如本文所用，术语“杂合”包括“复合杂合”或“复合杂合突变体”。如本文所用，术语“复合杂合”指称具有2个不同等位基因的个体。如本文所用，术语“复合杂合突变体”指称具有等位基因的2个不同拷贝的个体，该等位基因特征在于基因的突变形式。本文所用的术语“突变体”指称突变的，或潜在地非‑功能形式的基因。
纯合：如本文所用，术语“纯合”指称具有2拷贝的相同的等位基因的个体。如本文所用，术语“纯合突变体”指称具有2拷贝的相同的等位基因的个体，该等位基因特征在于基因的突变形式。本文所用的术语“突变体”指称突变的，或潜在地非‑功能形式的基因。
杂交：如本文所用，术语“杂交（hybridize）”或“杂交（hybridization）”指称其中2个互补核酸链在适当严格条件下彼此退火的过程。适合于杂交的寡核苷酸或探针一般含有长度10～100个核苷酸（例如,长度18～50,12～70,10～30,10～24,18～36个核苷酸）。核酸杂交技术为本领域所熟知。见，例如，Sambrook，et al，1989，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港出版社，Plainview，N.Y。本领域技术人员明白如何估计及调整杂交条件的严格度，使得具有至少期望的水平的互补性的序列会稳定地杂交，而具有更低互补性的那些不会。作为杂交条件和参数的例，见，例如，Sambrook，等人，1989，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港出版社，Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.et al。1994，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Secaucus,N.J。
个别溶解的：如本文所用，术语“个别溶解的”在本文用于指示，当可视化时，可能自其相邻聚合物或克隆区别一个聚合物或克隆。可视化可通过使用报告子标记物，例如荧光团实现，其信号个别解析。对个体分辨的需求确保可在各合成步骤检测个体单体并合。
插入或添加：如本文所用，术语“插入”或“添加”指称导致相比天然存在的分子，分别添加一个或更多氨基酸残基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的变化。
体外：如本文所用，术语“体外”指称在人工环境中，例如，在试管或反应容器中，在细胞培养中，等，而非在多‑细胞生物之内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”指称在多‑细胞生物诸如非‑人动物之内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”指称已（1）自当起初产生（无论在自然界中和/或在实验环境中）时与之关联的至少一些组分分离的，和/或（2）由人工产生的，制备的和/或生产的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可从起初与它们关联的至少约10%，约20%，约30%，约40%，约50%，约60%，约70%，约80%，约90%，约95%，约98%，约99%，基本上100%或100%的其他组分分离。在一些实施方式中，分离的剂是大于约80%，约85%，约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，基本上100%或100%纯。如本文所用，如果其是基本上无其他组分，物质是“纯”的。如本文所用，术语“分离的细胞”指称不含于多‑细胞生物的细胞。
标记的：术语“标记的”和“用可检测的剂或部分标记的”在本文互换所用，以特定实体（例如,核酸探针,抗体,等）可被可视化，例如在结合另一实体（例如,核酸,多肽,等）后。可选择可检测的剂或部分，使得其产生可测量的信号，且其强度与结合的实体量相关（例如,成比例）。用于标记和/或检测蛋白和肽的广泛的系统为本领域所知。标记的蛋白和肽可由并合，或缀合于由光谱，光化学，生物化学，免疫化学，电，光学，化学或其他手段可检测的标记物来制备。标记物或标记部分可为直接可检测的（即,其不需要待可检测的任何进一步反应或操作,例如,荧光团是直接可检测的）或其可为间接可检测的（即,其通过与可检测的另一实体反应或结合而变得可检测,例如,半抗原在与包含报告子诸如荧光团的适当的抗体反应后可通过免疫染色检测）。适合的可检测的剂包括，但不限于，放射性核素，荧光团，化学发光剂，微粒，酶，比色标记物，磁标记物，半抗原，分子信标，适体信标等。
座位：如本文所用，术语“座位”指称染色体上特定DNA序列的特定位置。如本文所用，特定DNA序列可为任何长度（例如,1,2,3,10,50或更多核苷酸）。在一些实施方式中，座位是或包含基因或部分基因。在一些实施方式中，座位是或包含基因的外显子或部分外显子。在一些实施方式中，座位是或包含基因的内含子或部分内含子。在一些实施方式中，座位是或包含基因的调控元件或部分调控元件。在一些实施方式中，座位相关于疾病，病症和/或病情。例如，在座位的突变（包括缺失,插入,剪接突变,点突变,等）可与疾病，病症和/或病情相关。
核型分析：如本文所用，术语“核型分析”包括真核生物细胞中的染色体数的确定。
正常：如本文所用，术语“正常”，当用以修饰术语“拷贝数”或“座位”或“基因”或“等位基因”时，指称在群中以最高百分率存在的拷贝数或座位，基因或等位基因，例如，野生型数或等位基因。当用以修饰术语“个体”或“受试者”时，它们指称携带在群中以最高百分率存在的拷贝数或座位，基因或等位基因的个体或个体的组，例如，野生型个体或受试者。一般而言，正常“个体”或“受试者”不具有特定疾病或病情，且也不是疾病或病情的携带者。术语“正常”也在本文用以定性自正常或野生型个体或受试者分离的生物学样本或样品，例如，“正常生物学样品”。
多重PCR：如本文所用，术语“多重PCR”指称各通过使用不同引物对引发的2个或更多区的扩增。
引物：如本文所用，术语“引物”指称能与核酸样品中的互补序列杂交的短单链寡核苷酸。一般而言，引物作为模板依赖性DNA合成的起始点。可将脱氧核糖核苷酸由DNA聚合酶加入引物。在一些实施方式中，该脱氧核糖核苷酸添加到引物也被称为引物延伸。术语引物，如本文所用，包括可为合成的全部形式的引物，包括肽核酸引物，锁核酸引物，硫代磷酸酯修饰的引物，标记的引物等。对于PCR反应，“引物对”或“引物组”一般指称一般包括“正向引物”和“反向引物”的一组引物。如本文所用，“正向引物”指称退火到dsDNA的反义链的引物。“反向引物”退火到dsDNA的正义链。
多态性：如本文所用，术语“多态性”指称多于一种形式的基因或其部分的共存。
探针：如本文所用，术语“探针”，当参照核酸探针使用时，指称具有可与目标核酸结合或杂交的特定核苷酸序列（例如,RNA或DNA）的核酸分子。一般而言，探针通过一种或更多类型的化学键，通常通过氢键形成特异性结合（或特异性杂交）互补或基本上互补序列的核酸。在一些实施方式中，探针可在实时PCR反应中结合DNA扩增子的核酸。
正义链对比反义链：如本文所用，术语“正义链”指称包括功能蛋白的至少部分编码序列的双链DNA（dsDNA）的链。如本文所用，术语“反义链”指称是正义链的反向互补体的dsDNA链。
信号：如本文所用，术语“信号”指称可检测的和/或可测量的实体。在特定实施方式中，信号是由人眼可检测的，例如，可见。例如，信号可为或可涉及可见光谱中颜色的强度和/或波长。该信号的非限制性例包括自化学反应诸如酶促反应得到的着色的沉淀物及着色的可溶性产物。在特定实施方式中，信号是使用设备可检测的。在一些实施方式中，信号由当激发时发射荧光的荧光团产生，其中光是用荧光检测器可检测的。在一些实施方式中，信号是或涉及由分光光度计可检测的光（例如,可见光和/或紫外线光）。例如，可将由化学发光反应产生的光用作信号。在一些实施方式中，信号是或涉及辐射，例如，由放射性同位素发射的辐射，红外线辐射，等。在特定实施方式中，信号是物理实体的性质的直接或间接指示物。例如，可将信号用作生物学样品中和/或反应容器中核酸的量和/或浓度的指示物。
特定：如本文所用，术语“特异性”，当关联寡核苷酸引物使用时，指称在适当的杂交或洗涤条件下，能与目标靶杂交及基本上不与非目标核酸杂交的寡核苷酸或引物。更高水平的序列同一性优选及包括至少60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%序列同一性。在一些实施方式中，当比对寡核苷酸和核酸时，特定寡核苷酸或引物含有与待杂交或扩增的部分核酸具有序列同一性的至少4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50，55，60，65，70或更多碱基。
受试者：如本文所用，术语“受试者”指称人或任何非‑人动物（例如,小鼠,大鼠,兔,狗,猫,牛,猪,绵羊,马或灵长类动物）。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方式中，受试者是人。受试者可为患者，其指称送到用于诊断或治疗疾病的医疗提供者的人。术语“受试者”在本文与“个体”或“患者”互换使用。受试者可患或敏感于疾病或病症，但可或可不显示疾病或病症的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”指称呈现总或接近‑总程度或目标特征或性质的程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员会明白，生物学和化学现象罕见，即便有，完成和/或进行到完全性或达到或避免绝对结果。因此，本文所用的术语“基本上”捕获在许多生物学和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
基本上互补：如本文所用，术语“基本上互补”指称可在严格杂交条件下杂交的2个序列。本领域技术人员会明白，基本上互补序列需求沿着它们的全长不杂交。在一些实施方式中，“严格杂交条件”指称至少如以下严格的杂交条件：在50%甲酰胺，5×SSC，50mM NaH2P04，pH6.8，0.5% SDS，0.1mg/mL超声处理鲑鱼精子DNA，及5X Denhart氏溶液中于42℃过夜杂交；用2×SSC，0.1% SDS于45℃洗涤；及用0.2×SSC，0.1% SDS于45℃洗涤。在一些实施方式中，严格杂交条件应不允许在20个连续的核苷酸的延伸物上多于2个碱基不同的2个核酸的杂交。
取代：如本文所用，术语“取代”指称相比天然存在的分子，一个或更多氨基酸或核苷酸分别被不同氨基酸或核苷酸取代。
患：已被诊断“患”疾病，病症和/或病情或显示疾病，病症和/或病情的一种或更多症状的个体。
灵敏于：未被诊断为疾病，病症和/或病情的“敏感于”疾病，病症和/或病情的个体。在一些实施方式中，敏感于疾病，病症和/或病情的个体可不呈现疾病，病症和/或病情的症状。在一些实施方式中，敏感于疾病，病症和/或病情的个体会发展疾病，病症和/或病情。在一些实施方式中，敏感于疾病，病症和/或病情的个体会不发展疾病，病症和/或病情。
野生型：如本文所用，术语“野生型”指称自然界存在的典型或最常见的形式。
【发明详述】
本发明提供，尤其是，用于分析（例如,检测和/或计数）生物学样品中的靶核酸的方法和系统。一般而言，本发明涉及使用基于杂交的探查的含有靶核酸或其部分的扩增产物的单分子扩增和检测。在一些实施方式中，适合的探针可多重化到高水平，和可通过标记物诸如尤其是荧光，比色，发光等手段检测。由此，本发明提供检测生物学样品中的靶核酸的灵敏的方法。本发明是对于检测作为在生物学样品中的罕见事件存在的靶核酸特别有用的，所述罕见事件例如，尤其是与胚胎病情关联的突变，疾病诸如癌，感染性疾病，自身免疫疾病，与移植物或胚胎植入物关联的免疫学病情。
在一些实施方式中，可将探针用可归因于不同核酸的不同色彩标记（例如,靶对比参照），使得扩增产物可归因于不同核酸（例如,靶对比参照）及计数。由此，本发明的方法也可用于测定生物学样品中靶核酸的相对量，例如，生物学样品中靶和参照核酸之间的比。在一些实施方式中，探针可深深多重化，及用可归因于不同染色体的不同色彩标记，使得扩增产物可归因于不同染色体及计数。归因于不同染色体的产物的比的差异可用于诊断非整倍体怀孕。
由此，本发明是尤其有利的，因为其提供多重座位检测的能力，和由此使得尤其有效使用珍贵的样本，超过通过多重化TAQMAN探针或本领域知道的其他既有方法所能达到。在许多实施方式中，本发明可关于样本使用达到与单分子的高通量测序相同的水平的效率，但达到这些结果更廉价和快速得多。
本发明的各方面在以下部分详细描述。部分的使用未意指限制本发明。各部分可应用于本发明的任何方面。在本申请中，“或”是指“和/或”，除非另外陈述。
【靶核酸及关联的遗传疾病，病症和病情】
本发明可用于检测任何类型的靶核酸。在一些实施方式中，本发明可用于检测与疾病，病症或病情关联的靶核酸。例如，靶核酸可携带突变诸如核酸碱基取代，复制，插入，缺失和/或转位。在一些实施方式中，本发明可用于检测与在生物学样品中的罕见事件关联的突变。例如，本发明可用于检测存在于生物学样品的罕见细胞中的突变。在一些实施方式中，该罕见细胞是存在于自患者的生物学样品（例如,全血）中的癌细胞。在一些实施方式中，该罕见细胞是存在于母源血的胚胎细胞。在一些实施方式中，该罕见细胞是与感染性疾病关联的病原体。在一些实施方式中，该罕见细胞是与自身免疫疾病或与移植物关联的免疫学病情关联的免疫细胞，等。由此，本发明的实施方式可用于胚胎异常的出生前诊断和癌和其他病理学病情的早期诊断。
在一些实施方式中，本发明可用于测定靶核酸的相对量，诸如测定靶和参照核酸之间的比。因此，本发明在检测在遗传疾病中牵涉的任何染色体或许多遗传座位的不平衡中特别有用。由此，本文公开的方法可辅助携带者检测，患者诊断，出生前诊断和/或移植用胚胎的基因分型，等。如由本领域普通技术人员同意，靶核酸所关联的遗传疾病可跟随任何许多遗传模式，包括，例如，常染色体隐性，常染色体显性，性别‑联锁的显性和性别‑联锁的隐性。
在一些实施方式中，本发明特别适应于检测涉及母源和胚胎遗传核酸之间的定量差异的遗传异常。这些遗传异常包括可为母源和胚胎DNA之间杂合和纯合，及非整倍性的突变。例如，第X染色体的丢失的拷贝（单体性X）导致Turner氏综合征，而另外的拷贝的第21染色体导致Down综合征。其他疾病诸如Edward氏综合征和Patau综合征分别由另外的拷贝的第18染色体，及第13染色体导致。本方法可用于检测转位，添加，扩增，颠换，逆转，非整倍性，多倍性，单体性，三体性，包括但不限于三体性21，三体性13，三体性14，三体性15，三体性16，三体性18，三体性22，三倍性，四倍性及性染色体异常包括但不限于XO，XXY，XYY和XXX。
此外，可根据本发明分析的靶核酸包含特定遗传座位诸如基因或其部分（例如,外显子,内含子,启动子或其他调控区）。表1列出该基因及关联的遗传疾病，病症或病情的非限制性例。如由本领域普通技术人员明白，基因可知道有多于一种名称。表1中的列表不排除可相关于特定疾病的另外的基因的存在。本发明包括那些另外的基因，包括会在未来发现与各特定疾病关联的那些。
表1：与遗传疾病，病症或病情关联的例示基因
由此，可通过使用本发明的方法分析的靶座位包括，但不限于，表1中鉴定的基因、或其部分（例如,编码（例如,外显子）或非‑编码（例如,内含子或调控）区）。表1中鉴定的基因的序列为本领域所知，且容易可通过在公共数据库诸如GenBank中使用基因名称搜索入手，且该序列通过引用并入本文。
尽管多数基因是每基因组当量正常以2拷贝存在，大量的基因已发现在个体之间存在拷贝数变异。拷贝数差异可由许多机理出现，包括但不限于基因复制事件，基因缺失事件，基因转变事件，基因重排，染色体转座，等。特定基因的拷贝数差异可具有含义，包括但不限于发展疾病或病情的风险，进展为特定疾病或病情阶段的似然性，对特定治疗剂的依从性，对感染的感受性，免疫功能，等。除了表1中列的基因之外，本文公开的方法适合于分析具有该拷贝数变体的座位的拷贝数。在地址是“http://”随后立即是“projects.tcag.ca/variation”的网站维持的基因组变体的数据库（整个内容通过引用以它们的整体并入本文），列出多于至少38,406种拷贝数变体（如2009年3月11日）。（见,例如,Iafrate et al.（2004）“Detection of large‑scale variation inthe human genome”Nature Genetics.36(9):949‑51;Zhang et al.（2006）“Development of bioinformatics resources for display andanalysis of copy number and other structural variants in the humangenome.”115(3‑4):205‑14;Zhang et al.(2009)“Copy NumberVariation in Human Health,Disease and Evolution,”Annual Reviewof Genomics and Human Genetics.10:451‑481;and Wain et al.(2009)“Genomic copy number variation,human health,and disease.”Lancet.374:340‑350,它们的各整个内容通过引用并入本文）。
靶序列可在母源DNA（杂合）中以一拷贝存在但可在胎儿（纯合）中导致疾病的疾病的例，包括镰刀状细胞贫血，囊性纤维化，血友病和泰‑萨克斯病。因此，使用本文所述的方法，可区别具有1个突变的基因组与具有2个突变的基因组。镰刀状细胞贫血是常染色体隐性疾病。9%的US非洲美国人是杂合的，而0.2%是纯合隐性的。隐性等位基因在血红素的β链中导致单氨基酸取代。
泰‑萨克斯病是导致神经系统变性的常染色体隐性。症状在出生之后显现。此等位基因纯合隐性的儿童罕见生存过5岁。患者缺乏制造N‑乙酰‑己糖胺酶的能力，该酶断裂GM2神经节苷脂脂质。
另一例是苯丙酮尿症（PKU），隐性地遗传的病症，其患者缺乏合成酶以将氨基酸苯丙氨酸转变为酪氨酸的能力。此等位基因纯合隐性的个体在尿和血中具有苯丙氨酸积累和异常破断产物。
血友病是血不正常凝块的一组疾病。血中的因子涉及凝集。缺少正常因子VIII的血友病患者被称为具有血友病A，而缺乏因子IX的那些被称为具有血友病B。这些基因在X染色体上携带，因此在本方法中可使用引物和探针来检测是否胎儿遗传了母亲的缺陷X染色体，或父亲的正常等位基因。
本方法可为适应的基因突变的列表见于http://www.gdb.org/gdb，GDB人基因组数据库，The Official World‑Wide Database for theAnnotation of the Human Genome Hosted by RTI International,North Carolina USA。
【样品制备】
任何各种生物学样品可为适合于在本文公开的方法使用。一般而言，可使用含有核酸的任何生物学样品（例如,细胞,组织,等）。生物学样品的类型包括，但不限于，细胞，组织，全血，血浆，血清，尿，粪便，唾液，脐带血，绒毛膜绒毛样品羊水，及经子宫颈灌洗液。也可使用任何类型的组织活组织检查。也可根据发明的方法使用任何以上‑提及的生物学样品的细胞培养物，例如，绒毛膜绒毛培养物，羊水和/或羊水细胞培养物，血细胞培养物（例如,淋巴细胞培养物），等。在一些实施方式中，生物学样本包含患病的细胞，如癌或肿瘤细胞。
在一些实施方式中，生物学样品是出生前样品。例如，样品诸如羊水，母源血，血清或血浆可从怀孕的女性获取和可根据本发明检定。本方法对于非‑侵袭性测试是特别有用的。在一些实施方式中，原材料是母源外周静脉血。
由此，适合于本发明的典型生物学样品含有异源核酸。在一些实施方式中，生物学样品含有来自不同细胞类型（例如,正常细胞及患病的细胞诸如肿瘤细胞）的核酸的混合物。在一些实施方式中，生物学样品（例如,血,血清或血浆）含有母源核酸和胚胎核酸的混合物。本发明可用于分析存在于患病的（例如,癌）或胚胎细胞的特定靶染色体或遗传座位。
在一些实施方式中，本发明用于检测作为在生物学样品中的罕见事件存在的靶核酸。在一些实施方式中，由本发明的方法检测的靶核酸的量占生物学样品中总核酸的小于1%（例如,小于0.5%,0.1%,0.01%,0.001%,0.0001%）。在一些实施方式中，由本发明的方法检测的靶核酸的量占生物学样品中总核酸的小于1百万分之1。在一些实施方式中，由本发明的方法检测的靶核酸的量占生物学样品中总核酸的小于1千万分之1。
本发明对于分析小量的生物学样品或样本是特别有用的。在一些实施方式中，本发明可用于分析含有小于10,000（例如,小于1,000,100,50,25,20,15,10,5,2）基因组当量的总DNA的生物学样品。在一些实施方式中，本发明可用于分析含有小于1基因组当量的总DNA的生物学样品。一般而言，在早期怀孕中胚胎DNA以粗略25基因组当量/ml的母源血浆存在，及胚胎DNA浓度是总血浆DNA的约3.4%。因此，涵盖10～20ml的母源血含有约至少10,000基因组当量的总DNA。在一些实施方式中，适合的生物学样品含有约20ml，15ml，10ml，5ml，4ml，3ml，2ml，1ml，0.5ml，0.1ml，0.01ml，0.001ml的母源血。
需知，尽管本说明书通篇说到DNA，也可分析见于母源血的胚胎RNA。如描述于Ng等人，“mRNA of placental origin is readilydetectable in maternal plasma,”Proc.Nat.Acad.Sci.100(8):4748‑4753（2003），hPL（人胎盘催乳激素）和hCG（人绒毛膜促性腺激素）mRNA转录物可在母源血浆中检测。例如，可使用编码在胎盘中表达及存在于目标染色体上的基因的mRNA。例如，DSCR4（Down综合征关键区4）见于第21染色体及主要在胎盘中表达。其mRNA序列可见于GenBank NM 005867。在此情况中，RNA酶H减（RNA酶H‑‑）反转录酶（RT）可用于制备检测用cDNA。
在一些实施方式中，母源血可使用本领域知道的各种方法处理以富集胚胎DNA浓度。例示胚胎DNA富集方法描述如下。
【自血浆的DNA或RNA的富集】
例如，循环DNA可从母源血浆使用商业柱技术（例如,Roche High纯模板DNA纯化试剂盒;Roche,Basel,Switzerland）组合真空泵提取。在提取之后，DNA由琼脂糖凝胶（1%）电泳（Invitrogen,Basel,Switzerland）分离，且小心地切下含有具有大致300bp的尺寸的循环DNA的凝胶级分。DNA从此凝胶片通过使用提取试剂盒（QIAEX IIGel提取试剂盒;Qiagen,Basel,Switzerland）提取及洗脱到40μL无菌10mM Tris盐酸的最终体积，pH8.0（Roche）。
DNA可由知道的方法，包括离心和各种酶抑制物浓缩。DNA结合到选择性膜（例如,氧化硅）以分离其与混杂物。DNA优选富集血浆中循环的片段，其长度小于1000bp，通常小于300bp。此尺寸选择可在DNA尺寸分离介质，诸如电泳凝胶或层析物质上进行。该物质描述于Huber等人，“High‑resolution liquid chromatography of DNAfragments on non‑porous poly(styrene‑divinylbenzene)particles,”Nucleic Acids Res.1993 March 11;21(5):1061‑1066，凝胶过滤层析，TSK凝胶，如描述于Kato等人，“A New Packing for Separation ofDNA Restriction Fragments by High Performance LiquidChromatography,”J.Biochem,1984,Vol.95,No.183‑86。或者，可使用其他富集特定尺寸的DNA片段的方法。
此外，富集可由通过使用肽核酸（PNA）的特定等位基因的阻遏实现，所述肽核酸结合它们的互补靶序列，但不扩增。
血浆RNA提取描述于Enders等人，“The Concentration ofCirculating Corticotropin‑releasing Hormone mRNA in MaternalPlasma Is Increased in Preeclampsia,”Clinical Chemistry 49:727‑731,2003。如在该文描述，在离心步骤之后收获的血浆与Trizol LS试剂（Invitrogen）和氯仿混合。将混合物离心，及水层转移到新管。将乙醇加入水层。混合物然后应用到RNeasy mini柱（Qiagen）和根据生产商的建议处理。或者，可使用本领域中接受的其他RNA提取方法。
【自胚胎细胞的血‑‑提取】
胚胎DNA可由本领域知道的方法富集。例如，Dhallan，RavinderS的美国专利申请20040137470，2004年7月15日出版的，名称为“Methods for detection of genetic disorders”，及通过引用以其整体并入本文，描述胚胎DNA的富集过程，其中血收集到9ml EDTAVacuette管（货号NC9897284），并将0.225ml的含有甲醛（4%w/v）的10%中性缓冲溶液加入各管，及各管轻轻倒置。将管于4℃存储，直到准备处理。
可将阻碍细胞裂解或稳定化细胞膜的剂加入管。该剂可包括但不限于，甲醛和甲醛的衍生物，福尔马林，戊二醛和戊二醛的衍生物，交联剂，伯胺反应性交联剂，巯基反应性交联剂，巯基添加或二硫化物减小，碳水化合物反应性交联剂，羧基反应性交联剂，光敏交联剂，可切割的交联剂等。可添加稳定化细胞膜或阻碍细胞裂解的任何浓度的剂。在优选的实施方式中，以不阻碍或阻碍随后反应的浓度添加稳定化细胞膜或阻碍细胞裂解的剂。
流式细胞术技术也可用于富集胚胎细胞（见例如,Herzenberg等人,PNAS 76：1453‑1455（1979）；Bianchi等人,PNAS 87：3279‑3283（1990）；Bruch等人,Prenatal Diagnosis 11：787～798（1991）通过引用并入本文）。美国专利No.5,432,054也通过引用以其整体并入本文，描述使用聚乙烯制造的具有宽顶部和窄毛细管底部的管分离胚胎有核的红细胞的技术。使用可变的速度程序的离心导致毛细管中基于分子密度的红细胞的堆叠。回收含有低‑密度红细胞，包括胚胎红细胞的密度级分，然后区别溶血以优先毁坏母源红细胞。高渗剂培养基中的密度梯度用于分离红细胞，现在在自淋巴细胞的胚胎红细胞及破裂的母源细胞中富集。高渗剂溶液的使用缩红细胞，其增加它们的密度，及辅助自更密淋巴细胞纯化。在胚胎细胞已分离之后，胚胎DNA可通过使用本领域标准技术纯化。
而且，可将稳定化细胞膜的剂加入母源血，以减少母源细胞裂解。该剂可包括，但不限于，醛，脲甲醛，苯酚甲醛，DMAE（二甲基氨基乙醇），胆甾醇，胆甾醇衍生物，高浓度的镁，维生素E和维生素E衍生物，钙，葡萄糖酸钙，牛磺酸，烟酸，羟胺衍生物，氯吡哌醇，蔗糖，虾青素，葡萄糖，阿米替林，异构体A_何帕烷四醛苯乙酸酯，异构体B何帕烷四醛苯乙酸酯，胞磷胆碱，肌醇，维生素B，维生素B复合物，胆甾醇半琥珀酸酯，山梨糖醇，钙，辅酶Q，泛醌，维生素K，维生素K复合物，甲基萘醌，唑尼沙胺，锌，银杏（Ginko biloba）提取物，二苯基海因，perftoran，聚乙烯吡咯烷酮，磷脂酰丝氨酸，酰胺咪嗪，PABA，色甘酸二钠，奈多罗米钠，苯妥英，柠檬酸锌，脉舒律，狄兰汀，透明质酸钠，或polaxamer 188。
使用此剂的流程的一例如下：血存储于4℃直到处理。在具有设置在0的制动力的离心机中以1000rpm旋转管10分钟。将管以1000rpm旋转第2次10分钟。将各样品的上清液（血浆）转移到新管，及以3000rpm旋转10分钟，制动设置在0。将上清液转移到新管，及存储于‑80℃。将约2ml的含有母源细胞的“血沉棕黄层”放入分离管及存储于‑80℃。
【无血浆的胚胎DNA】
可从血浆使用用于自血细胞纯化DNA的Qiagen Midi试剂盒，根据生产商的使用说明（QIAmp DNA血Midi试剂盒,货号51183）分离基因组DNA。DNA在100μl的蒸馏水中洗脱。Qiagen Midi试剂盒也用于自“血沉棕黄层”中含有的母源细胞分离DNA。
最终，需知，在特定实施方式中，也可使用自组织，唾液，尿，泪，阴道分泌，乳腺流体，母乳，或汗的样品。
【全基因组扩增】
在一些实施方式中，生物学样品中的总DNA首先通过使用全基因组扩增（WGA）方法扩增。各种WGA方法为本领域所知，和可在本发明中使用。例示方法描述于美国申请公开No.20030082559和20030104431，其通过引用并入本文。
在一些实施方式中，将核酸样品随机片段化，然后处理使得不同片段的末端全部含有相同的DNA序列。具有通用端的片段可然后在单个反应中用单对扩增引物扩增。用于片段化和端处理的例示方法描述于以下“桥PCR扩增”部分。各种其他方法为本领域所知和可在本发明中使用。
【单分子扩增】
术语“单分子扩增”在本文用来与本领域知道的高密度多‑分子扩增反应区别。单分子扩增一般涉及首先分离或排列自生物学样品获得的核酸分子，以形成多个扩增位点，且其中各扩增位点含有平均一个核酸分子；及扩增扩增位点中的各个体核酸分子，以产生扩增产物。一般而言，扩增产物形成可个别溶解的簇。术语“个别溶解的”在本文用来指示，当可视化时，其可能区别一个簇与其相邻簇。可视化可通过使用可与簇杂交的标记的探针实现。在一些实施方式中，含有扩增产物的簇由聚合酶反应产生。该簇也称为PCR集落或核酸克隆或集落。基于聚合酶的扩增方法包括，但不限于，聚合酶链反应（PCR）和链位移扩增（例如,滚环扩增）。各种其他扩增方法为本领域所知和可用于本发明。另外的用于扩增的例示方法包括，但不限于，自身‑持续的序列反应，连接酶链反应，cDNA端的快速扩增，连接酶链反应，Q‑β噬菌体扩增，及剪接重叠延伸。
在一些实施方式中，核酸可在固体支持物上分离及扩增。适合于本发明的固体支持物可为核酸可共价附接的任何固体表面，诸如例如胶乳珠，葡聚糖珠，聚苯乙烯，聚丙烯表面，聚丙烯酰胺凝胶，金表面，玻璃表面和硅晶片。在一些实施方式中，固体支持物是玻璃表面。
将核酸附接到本文所用的固体支持物的手段指称任何化学或非‑化学附接方法，包括可化学修饰的官能团。“附接”涉及核酸由共价连接或经不可逆被动吸附或经分子之间的亲和性固定到固体支持物（例如,由生物素化的分子固定到亲和素‑包被的表面）。一般而言，附接具有不可通过用水或水性缓冲剂在DNA‑变性条件下洗涤移出的足够的强度。本文所用的“可化学‑修饰的官能团”指称基团诸如例如，磷酸基，羧酸或醛部分，氢硫基或氨基。
例如，一批核酸分子可分布在固体支持物表面，使得可将个体分子附接于离散位点。适合于用在本发明的固相支持物可具有广泛的形式，包括微粒；珠，膜，载玻片，板微细加工的芯片，管等。本发明的固相支持物可由广泛的物质制成，包括但不限于玻璃，塑料，硅，烷硫醇盐‑衍生的金，纤维素，低交联的和高交联的聚苯乙烯，硅胶，聚酰胺，光学纤维，塑料，等。在一些实施方式中，核酸分子收集物可通过使用流动细胞技术分离。
在一些实施方式中，核酸可在半‑固体或液相中分离及扩增。例如，核酸分子收集物可在凝胶基质（例如,琼脂糖凝胶基质）内分布。在一些实施方式中，核酸分子收集物可与乳剂珠混合。
在一些实施方式中，捕获寡核苷酸固定在固体或半‑固体支持物上，以辅助个体核酸分子（例如,多肽）的捕获及固定。在一些实施方式中，捕获寡核苷酸可含有与核酸模板分子上存在的通用序列互补的序列，诸如标签或衔接子序列。例如，生物学样品中的核酸分子可首先处理以在5’和/或3’端附接标签或衔接子序列，而标签或衔接子序列可结合到固体或半‑固体支持物上固定的捕获寡核苷酸。在一些实施方式中，可使用一个或更多捕获序列。
在一些实施方式中，适合的捕获寡核苷酸可与标签或衔接子序列在本发明的适合的条件（例如,高严格条件）下杂交。例示捕获寡核苷酸可含有各种数的核苷酸。例如，适合的寡核苷酸可含有1～50个核苷酸（例如,3～40,3～30,3～20,30～15,3～10,6～40,6～30,6～20,6～10,8～30，8～20，8～15，10～30，10～20，10～15个核苷酸）。在一些实施方式中，适合的寡核苷酸可含有1，2，3，6，8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸。用于设计及合成适合的捕获寡核苷酸的各种方法为本领域所知，且该方法在本领域普通技术人员能力范围之内。在一些实施方式中，捕获寡核苷酸也可用作扩增用PCR引物（见“桥PCR扩增”部分）。由此，捕获寡核苷酸也指称为集落引物。
捕获寡核苷酸可与它们所合成，或它们可独立地合成的固相支持物使用及附接到用于使用的固相支持物，例如如由Lund et al.NucleicAdds Research,16:10861‑10880（1988）；Albretsen et al,Anal.Biochem.,189:40‑50（1990）；Wolf et al,Nucleic Acids Research,15:2911‑2926（1987）；或Ghosh et al,Nucleic Acids Research,15:5353‑5372（1987）公开，全部通过引用并入本文。
在一些实施方式中，捕获寡核苷酸和核酸模板附接到固体支持物在核酸扩增反应期间支持物可经历的温度，例如最高大致100℃，例如大致94℃的温度是热稳定的。在一些实施方式中，附接在性质上是共价的。在进一步实施方式中，捕获寡核苷酸和核酸模板共价结合到固体支持物被交联剂诸如例如l‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二亚胺盐酸盐（EDC），琥珀酸酐，苯基二异硫代氰酸盐或马来酸酐，或杂‑双功能交联剂诸如例如m‑马来酰亚胺苯甲酰‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯（MBS），N‑琥珀酰亚胺基[4‑碘乙酰]氨基苯甲酸酯（SIAB），4‑[N‑马来酰亚胺甲基]环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC），N‑y‑马来酰亚胺丁酰氧基‑琥珀酰亚胺酯（GMBS），琥珀酰亚胺基‑4‑[p‑马来酰亚胺苯基]丁酸酯（SMPB）和磺基（水溶性）对应化合物诱导。
在一些实施方式中，适合于本发明的固体支持物具有衍生的和/或官能化的表面。在一些实施方式中，固体支持物的衍生的表面随后用双功能交联基团，优选用反应性交联基团修饰，以提供官能化的表面。本文所用的“交联的表面”指称已用化学反应性基团，例如氨基，氢硫基或丙烯酸基修饰的表面。本文所用的“官能化的表面”指称已用特定官能团，例如马来酸或琥珀酸官能部分修饰的衍生的表面。
在一些实施方式中，捕获寡核苷酸的附接应不被暴露于高温和在核酸扩增过程期间采用的重复的加热/冷却循环影响。而且，在替代实施方式中，支持物应允许至少1fmol/mm2（例如,至少10fmol/mm2,至少20fmol/mm2,至少30fmol/mm2,至少40fmol/mm2,至少50fmol/mm2）的附接的捕获寡核苷酸（或集落引物）密度的获得。
适合的支持物应具有有低荧光背景的均匀平表面和也应是热稳定的（非‑可变形的）。允许DNA的被动吸附的固体支持物，如在特定类型的塑料和合成硝酸纤维素膜中，可不适合于特定应用。最终，固体支持物应是一次性的，由此应不具有高成本。
在一些实施方式中，本发明使用利用捕获寡核苷酸均匀包被的微粒或珠（即,具有基本上统一的包被）实施。微粒支持物和共价或非共价连接寡核苷酸和它们的表面的方法良好知道，如由以下参考文献例示：Beaucage and Iyer（以上引用的）；Gait,editor,OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach（IRL Press,Oxford,1984）；及以上引用的参考文献。一般而言，微粒的尺寸和形状不是关键的；但是，小，例如1～2到几百，例如200～1000μm直径的尺寸范围的微粒是可优选的，由于它们辅助以最小试剂和样品利用构建和操作大库的寡核苷酸标签。
在一些实施方式中，可商购的受控‑孔玻璃（CPG）或聚苯乙烯支持物在本发明中作为固相支持物被采用。该支持物使可与碱不稳定接头和附接的初始核苷利用，例如。Applied Biosystems（Foster City,Calif）。在一些实施方式中，采用具有500和之间的孔径的微粒。
其他捕获部分可在本发明的方法中使用。例如，可将链霉亲和素附接于支持物，且核酸可生物素化，使得链霉亲和素可结合生物素化的核酸分子。
【桥PCR扩增】
在一些实施方式中，桥PCR扩增可用于本发明的单分子扩增。一般而言，桥PCR涉及通用扩增反应，其中DNA样品随机片段化，然后处理，使得不同片段的端全部含有相同的DNA序列。具有通用端的片段可然后在单反应中使用单对扩增引物扩增。在扩增之前，片段收集分离到单分子水平确保扩增的分子形成可然后进一步分析的离散群。该分离可在乳剂中，在表面，或凝胶之内实施。
在一些实施方式中，待扩增的核酸首先以双链形式获得。当核酸以单链形式提供时，例如mRNA，其首先由本领域熟知的及记载的手段，例如，使用寡‑dT引物和反转录酶和DNA聚合酶制造成双链形式。待在本发明的方法中使用的核酸可具有可变的长度。例如，它们可为至少50bp长度。在一些实施方式中，它们可为150～4000bp长度。本领域知道的各种方法可用于制备适当的核酸片段诸如，例如，鸟枪法，限制酶消化，及其他。
在一些实施方式中，将2种通用适配体或标记序列附接于个体核酸片段的5’和3’端。此可通过使用本领域良好知道及记载的方法，例如由连接，或通过将待扩增的核酸在侧翼有适当的寡核苷酸序列的位点插入生物学载体来进行。
在核酸的5’端附接的衔接子序列可具有任何序列和任何长度，及在本文表示为序列A5’。在核酸的3’端附接的寡核苷酸序列可具有任何序列和任何长度，及在本文表示为序列A3’。衔接子寡核苷酸的适合的长度和序列可通过使用本领域熟知的及记载的方法选择。例如，在待扩增的核酸的各端附接的寡核苷酸序列是长度在5和100个核苷酸之间（例如,5～50,5～40,5～30,5～25,5～20,5～15,10～50,10～40,10～30,10～25，10～20，15～30或15～25个核苷酸或此范围内的其他范围）的正常的相对短的核苷酸序列。
在一些实施方式中，3’端衔接子A3’的序列是使得其可与捕获寡核苷酸（X）之一杂交。在一些实施方式中，5’端衔接子A5’的序列是使得其与捕获寡核苷酸（X）之一相同。在一些实施方式中，3’端衔接子A3’的序列与5’端衔接子A5’的序列互补。本发明的衔接子寡核苷酸序列可通过使用在本领域中标准或常规的，或可购自商业源的技术制备。
在一些实施方式中，将如本文所述制备的核酸片段的5’端修饰为携带用于将核酸片段共价附接到固体支持物的手段。该手段可为，例如，可化学修饰的官能团，诸如，例如磷酸基，羧酸或醛部分，氢硫基或氨基。
本发明的捕获寡核苷酸（也被称为集落引物）可通过使用在本领域中标准或常规的技术制备。一般而言，本发明的捕获寡核苷酸会是由本领域熟知的及记载的方法产生的合成寡核苷酸或可购自商业源。根据本发明的方法，1或2种不同集落引物X，可用于扩增任何核酸序列。
一般而言，捕获寡核苷酸由5’端固定到支持物，使得其3’端自支持物远离，使得捕获寡核苷酸对于一旦发生了与在核酸模板的3’端含有的互补寡核苷酸序列杂交时由聚合酶链延伸是可利用的。
在一些实施方式中，本发明的核酸模板和集落引物以适当的比例使用，从而当它们附接于固体支持物时，获得适当的密度的附接的核酸模板和集落引物。在一些实施方式中，集落引物在混合物中的比例相比核酸模板的比例更高。在一些实施方式中，集落引物与核酸模板的比是使得当集落引物和核酸模板固定到固体支持物时，形成集落引物“草坪”，其包含以大致均一的密度位于固体支持物的全体或定义的区的多个集落引物，个体核酸模板固定在集落引物的草坪之内的间隔。
核酸模板可以单链形式提供。例如，在将核酸模板附接到固体支持物之前，其可使用本领域良好知道及记载的方法，例如通过加热到大致94℃和在冰上快速冷却来制成单链形式。但是，它们也可完全或部分以双链形式提供，修饰一个5’端或两个5’端，由此允许附接到支持物。在该情况中，在附接过程完成之后，2链可由本领域知道的手段分离，例如通过在洗涤出释放的链之前加热到94℃。需知，在双链分子的两条链与表面反应且均附接的情况中，结果会与当仅一条链附接及已实施一个扩增步骤的情况相同。换言之，在双链模板核酸的两条链已附接的情况中，两条链必然附接彼此邻近，且与附接仅一条链及实施一个扩增步骤的结果无法区别。由此，单链和双链模板核酸可用于提供附接到表面和适合于集落产生的模板核酸。
个体集落引物和个体核酸模板之间的距离（及因此集落引物和核酸模板的密度）可通过改变固定到支持物的集落引物和核酸模板的浓度来控制。在一些实施方式中，集落引物的适合的密度是至少1fmol/mm2（例如,至少10fmol/mm2,至少20fmol/mm2,至少30fmol/mm2,至少40fmol/mm2,至少50fmol/mm2）。在一些实施方式中，集落引物的适合的密度是至少30～60fmol/mm2之间。用于在本发明的方法中使用的核酸模板的密度一般是10,000/mm2～10,000,000/mm2（例如，10,000/mm2～1,000,000/mm2，10,000/mm2～100,000/mm2，100,000/mm2～10,000,000/mm2，100,000/mm2～1,000,000/mm2之间）。或者，可使用这些范围之内的范围，或包括这些范围的范围。
控制附接的核酸模板和集落引物的密度，进而允许控制支持物表面上核酸集落的最终密度。此是由于，根据本发明的方法，一个核酸集落可由一个核酸模板的附接得到，提供本发明的集落引物存在于固体支持物上的适合的位置。单集落内的核酸分子的密度也可通过控制附接的集落引物的密度来控制。在一些实施方式中，集落密度可基于检测方法测定（例如,探针数,检测信号和检测方法的分辨率（例如,照相机分辨率等））。本领域技术人员可基于关联参数容易测定期望密度。
在一些实施方式中，集落的适合的密度提供足够大到允许由多重化的靶和/或参照‑特异性探针的杂交的集落数，及提供允许统计学地显著分析的足够的可检测的集落计数。在一些实施方式中，集落的适合的密度包含达1,000,000（例如,达800,000,600,000,400,000,200,000,100,000）个可检测的集落计数。
一旦本发明的集落引物和核酸模板已以适当的密度固定到固体支持物，本发明的核酸集落可然后通过在共价结合的模板核酸上实施适当的数的扩增循环来产生，从而各集落包含多拷贝的原固定的核酸模板和其互补序列。一个循环的扩增由杂交，延伸和变性步骤组成，且这些步骤通常通过使用本领域熟知的用于PCR的剂和条件来实施。
典型扩增反应包括使固体支持物及附接的核酸模板和集落引物经历诱导引物杂交的条件，例如使它们经历约65℃的温度。在这些条件下，在核酸模板的3’端的寡核苷酸序列A3’会与固定的集落引物X杂交，及在条件和试剂存在下以支持引物延伸，例如约72℃的温度，核酸聚合酶，例如，DNA依赖性DNA聚合酶或反转录酶分子（即,RNA依赖性DNA聚合酶），或RNA聚合酶，加三磷酸核苷分子或任何其他核苷酸前体，例如修饰的三磷酸核苷分子的供给的存在，集落引物会通过与模板核酸序列互补的核苷酸的添加来延长。
可在本发明中使用的核酸聚合酶的例是DNA聚合酶（Klenow片段,T4DNA聚合酶），自各种热稳定的细菌的热‑稳定的DNA聚合酶（诸如Taq,VENT,Pfu,Tfl DNA聚合酶）以及它们的遗传修饰的衍生物（TaqGold,VENTexo,Pfu外）。RNA聚合酶和反转录酶的组合也可用于产生DNA集落的扩增。一般而言，用于集落引物延伸的核酸聚合酶是PCR反应条件下，即，加热及冷却的重复的循环下，在稳定的，且在使用的变性温度，通常大致94℃是稳定的。在一些实施方式中，使用的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶。
在一些实施方式中，使用的三磷酸核苷分子是脱氧核糖核苷酸三磷酸酯，例如dATP，dTTP，dCTP，dGTP，或是三磷酸核糖核苷例如dATP，dUTP，dCTP，dGTP。三磷酸核苷分子可为天然地或非‑天然存在的。
在杂交和延伸步骤之后，在使支持物及附接的核酸经历变性条件时，存在2个固定的核酸会，第1个是初始固定的核酸模板，和第2个是与其互补的核酸，自固定的集落引物X之一延伸。原固定的核酸模板和形成的固定的延伸的集落引物然后能在使支持物经历进一步杂交，延伸和变性循环时起始新轮扩增。该新轮扩增会导致核酸集落包含多个固定的拷贝的模板核酸和其互补序列。
模板核酸的初始固定是指模板核酸可仅与以一个距离位于模板核酸的总长度之内的集落引物杂交。由此，形成的核酸集落的边界限制于相对局部区至固定初始模板核酸的区。明显，一旦更多拷贝的模板分子和其补体已通过实施新轮扩增，即，新轮杂交，延伸和变性来合成，然后产生的核酸集落的边界会能进一步延伸，尽管形成的集落边界仍限制于相对局部区至固定初始核酸模板的区。适当轮循环可基于原材料量，杂交和/或检测方法（例如,探针数,检测信号和检测方法的分辨率（例如,照相机分辨率等））测定。本领域技术人员可基于关联参数容易测定期望循环轮。在一些实施方式中，使用达35（例如,达34,33,32,31,30,29,28,27）个循环。
一般而言，扩增产物提供预定的水平的基因组当量。在一些实施方式中，扩增产生达100,000（例如,达50,000,40,000,30,000,20,000,10,000）个基因组当量。
桥扩增的各种修饰是本领域可能的及知道的。例如，各种桥扩增方法描述于美国专利No.7,115,400，美国公开No.20090226975，及在互联网上Promega网站上可利用的Bing D.H.et al.“BridgeAmplification:A Solid Phase PCR System for the Amplification andDetection of Allelic Differences in Single Copy Genes,”SeventhInternational Symposium on Human Identification，全部通过引用在此合并。
【珠乳剂PCR】
乳剂PCR可用于用克隆扩增的DNA产生小珠，即，各珠含有一种类型的自单分子模板由PCR产生的扩增子。例示乳剂PCR描述于Dressman et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100,8817（2003年7月22日）)和Dressman et al.PCT publication WO2005010145,“METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTION ANDENUMERATION OF GENETIC VARIATIONS”，在2005年1月3日出版，并就其基于珠的产生克隆扩增的DNA的方法的描述通过引用在此合并。
例如，可将用捕获寡核苷酸（或集落引物）包被的珠与具有互补衔接子或标记序列的核苷酸混合。含有PCR用全部必需组分加结合引物的珠和模板DNA的水性混合物可然后与油/去污剂混合物搅拌在一起，以创建微乳剂。水性隔室（其可描述为油层中的小滴）会通常含有平均<1模板分子和<1珠。不同模板（对照和测试）可以一个或更少滴描绘，以代表其序列有一个或许多核苷酸不同的2个模板分子。微乳剂如在常规PCR中一样温度循环。如果DNA模板和珠在单水性隔室中一起存在，珠结合的寡核苷酸发挥扩增用引物的作用。
由各种物质制造及各种尺寸的珠可用于本发明。例如，适合的珠可为磁珠，塑料珠，金粒子，纤维素粒子，聚苯乙烯粒子，等。适合的珠可为小尺寸范围，例如1～2，到几百，例如200～1000μn直径的微粒。在一些实施方式中，在本发明中采用可商购的受控‑孔玻璃（CPG）或聚苯乙烯支持物作为固相支持物。该支持物用碱不稳定接头和附接的初始核苷变得可利用的，例如Applied Biosystems（FosterCity,Calif）。在一些实施方式中，采用具有500和之间的孔径的微粒。
寡核苷酸可使用本领域中的各种方法偶联于珠。用于桥扩增的例示方法可用于将寡核苷酸偶联到珠。作为另外的非限制性例，可共价结合到链霉亲和素（自Dynal Biotech,Inc.（650.01;Lake Success,N.Y.）可商购）珠的磁珠可洗涤，然后悬浮于Bind和Wash缓冲剂（BWB）（5mM Tris‑HCI,0.5mM EDTA,1.0M NaCl,pH7.5）。珠可然后在BWB中于室温在10mM寡核苷酸的存在下温育30min。这些寡核苷酸可然后用双生物素基团在5’端修饰，生物素基团被6‑碳接头（IDT;Coralville,Iowa）分开。在结合之后，珠可然后洗涤以彻底移出未结合的寡核苷酸。
作为非限制性例，PCR用微乳剂可在矿物油（Sigma;M‑3516）中由4.5% Span 80（S6760;Sigma,St.louis,Mo.），0.40%吐温80（Sigma;S‑8074），及0.05% Triton X‑100（Sigma;T‑9284）组成的油相中制备。水相在300μl的总体积中可由67mM Tris‑HCI（pH8.8），16.6mM NH4S04，6.7mM MgCl2，10mM(3‑巯基乙醇，1mM dATP，1mM dCTP，1mM dGTP，1mM dTTP，0.05μM正向引物，25μM反向引物，45U铂Taq（Invitrogen;10966‑034），各种量的模板DNA，及~108个寡核苷酸‑偶联的珠组成。
作为非限制性例，油包水微乳剂可通过将200μl的水相滴加到之前放入2ml圆底低温瓶（430661;Corning,Corning,N.Y.）中的400μl的油相中来制备。实施滴加超过1分钟，通过将混合物是以1400RPM用磁微搅棒（58948‑353;VWR,Plainfield,N.J.）在VWR模型565磁搅拌器中搅拌。在添加水相之后，将混合物持续搅拌30分钟的总时间。2种乳剂可通过将2个管放入放置在磁搅拌器中心的架来立即制造。
作为非限制性例，为PCR循环，可将乳剂等分入，例如，96孔PCR板（例如,各含有100μl）。PCR可在通常条件下实施。例如，PCR流程可如下：94℃2分钟；94℃15s，57℃30s，70℃30s的40个循环。或者，可使用类似流程。
【杂交】
各种方法可用于分析扩增的核酸以检测和/或计数靶核酸分子。在一些实施方式中，本发明利用基于杂交的方法。例如，特异于靶核酸的探针可用于原位杂交核酸集落，以鉴定含有靶核酸序列、或其部分的核酸集落。一般而言，将探针用可检测的信号标记，使得可测定含有靶核酸序列、或其部分的集落数。在一些实施方式中，特异于参照核酸的探针可用于原位杂交核酸集落，以鉴定含有参照核酸序列、或其部分的核酸集落。一般而言，将特异于参照核酸的探针用明显可检测的信号标记，使得参照核酸序列、或其部分的集落数可平行测定。在一些实施方式中，靶核酸的相对量可通过比较含有靶核酸序列的集落的第1数与含有参照核酸序列的集落的第2数来测定。
替代性地或另外地，含有扩增的核酸的集落可用基于阵列的杂交收获及分析。适合的阵列可含有特异于靶核酸或其部分的探针和/或特异于参照核酸或其部分的探针。
【探针设计】
适合的探针特异于目标核酸（例如,靶或参照染色体或基因）。术语“特异性”当关联杂交探针使用时，指称可与其靶在严格条件下结合但不与其他区结合的探针。
用于特定染色体或基因（包括特定疾病形式）的探针基于与目标染色体或基因关联的核苷酸序列制备。特定染色体或基因的序列可从数据库诸如GenBank，EMBL等得到。适合的探针一般具有对于与其靶特异性杂交足够大，但不大到阻碍杂交过程的长度。在替代实施方式中，适合的探针含有约10～70个核苷酸（例如,10～60,10～50,10～40,10～30,10～25,10～20,15～70,15～60,15～50,15～40，15～30，15～25，20～70，20～60，20～50，20～40，20～30个核苷酸）。或者，可使用这些范围之内的范围。本领域中可利用的各种方法和软件可用于设计特异性探针。
有在NIH UniSTS网站列出的多于1,000种第21染色体特异性PCR引物组，其可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists及用搜索短语“人[生物]AND 21[chr]”寻找。UniSTS是源于基于STS的图谱和其他实验的序列标记的位点（STS）的综合数据库。STS相关于附加信息诸如基因组位置，基因和序列。类似地，用于其他人染色体的引物序列可通过适当修饰搜索查询来寻找。这些染色体特异性引物可用于设计适合于本发明的染色体特异性探针。
其他染色体特异性引物公开于2005年7月28日出版的Hahn，Sinuhe，等人的美国专利申请20050164241，名称为“Non‑invasivedetection of fetal genetic traits”，在此通过引用以其整体合并。
探针也可源于被分离，纯化及扩增的染色体DNA的片段。例如，人基因组可使用序列‑特异性内切核酸酶或短枪方法断裂成片段，和适当的尺寸的片段可通过使用尺寸排阻层析分离，以制备探针。在一些实施方式中，探针可源于维持单个人工染色体的BAC，细菌的克隆群。人工染色体（BAC）可生长，提取及标记。
在一些实施方式中，探针基于单个座位设计。在一些实施方式中，探针基于在相同的染色体上的多个基因或座位设计。尽管单探针可在本发明中使用，在许多实施方式中，设计多重化的探针。多重化的探针提供稳健的信号和目标核酸的更精确的检测。适当的水平的多重可基于目标核酸（例如,靶或参照）的尺寸，原材料量和用于统计学分析的可检测的计数的期望水平确定。在替代实施方式中，多重化的探针含有2～10,000个探针（例如,10～10,000,10～5,000,10～1,000,10～500,10～250,10～100,10～50个探针）。在一些实施方式中，多重化的探针含有约10，100，200，300，400，500，1,000，5,000，10,000个探针。在一些实施方式中，相同的数的探针用于靶核酸和参照核酸。在一些实施方式中，不同数的探针用于靶核酸和参照核酸。
探针可用各种可检测的部分诸如荧光团直接标记。标记可以各种方式进行，诸如切口翻译，或使用标记的核苷酸的PCR。
【可检测的实体】
任何广泛的可检测的剂可在本发明的实践中使用。适合的可检测的剂包括，但不限于：各种配体，放射性核素；荧光染料；化学发光剂（诸如,例如,吖啶鎓酯,稳定化的二氧杂环丁烷等）；生物发光剂；光谱可分辩的无机荧光半导体纳米晶体（即,量子点）；微粒；金属纳米粒子（例如,金,银,铜,铂,等）；纳米簇；顺磁金属离子；酶；比色标记物（诸如,例如,染料,胶体金,等）；生物素；地高辛配基；半抗原；及抗血清或单克隆抗体可利用的蛋白。
在一些实施方式中，可检测的部分是生物素。生物素可结合到亲和素（诸如链霉亲和素），其一般缀合（直接或间接）于本身是可检测的其他部分（例如,荧光部分）。
以下描述了一些其他可检测的部分的非限制性例。
【荧光染料】
在特定实施方式中，可检测的部分是荧光染料。广泛的多种知道的荧光染料的化学结构和物理特征适合于在本发明的实践中使用。荧光可检测的部分可由激光器用由检测器捕获的发射的光刺激。检测器可为记录其强度的电荷耦合装置（CCD）或共聚焦显微镜。
适合的荧光染料包括，但不限于，荧光素和荧光素染料（例如,荧光素异硫代花青苷或FITC,萘并荧光素,4’,5’‑二氯‑2’,7’‑二甲氧基荧光素,6‑羧基荧光素或FAM,等），羰基花青苷，部花青苷，苯乙烯基染料，氧鎓醇染料，藻红蛋白，赤藓红，伊红，若丹明染料（例如,羧基四甲基‑若丹明或TAMRA,羧基若丹明6G,羧基‑X‑若丹明（ROX），丽丝胺若丹明B,若丹明6G,若丹明绿,若丹明红色,四甲基若丹明（TMR），等），香豆素和香豆素染料（例如,甲氧基香豆素,二烷基氨基香豆素,羟基香豆素,氨基甲基香豆素（AMCA），等），俄勒冈绿染料（例如,俄勒冈绿488,俄勒冈绿500,俄勒冈绿514.,等），德克萨斯红色，德克萨斯红‑X，谱红TM，谱GREENTM，花青苷染料（例如,CY‑3TM,CY‑5TM,CY‑3.5TM,CY‑5.5TM,等），ALEXA FLUORTM染料（例如,ALEXA FLUORTM 350,ALEXAFLUORTM 488,ALEXA FLUORTM 532,ALEXA FLUORTM 546,ALEXA FLUORTM 568,ALEXA FLUORTM 594,ALEXA FLUORTM633,ALEXA FLUORTM 660,ALEXA FLUORTM 680,等），BODIPYTM染料（例如,BODIPYTM FL,BODIPYTM R6G,BODIPYTM TMR,BODIPYTM TR,BODIPYTM 530/550,BODIPYTM 558/568,BODIPYTM564/570,BODIPYTM 576/589,BODIPYTM 581/591,BO DIPYTM630/650，BODIPYTM 650/665，等），IRDyes（例如,IRD40,IRD 700,IRD 800,等），等。对于适合的荧光染料和用于将荧光染料偶联到其他化学实体诸如蛋白和肽的方法的更多例，见，例如，“The Handbookof Fluorescent Probes and Research Products”，9th Ed.,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR。荧光标记剂的有利的性质包括高摩尔吸收系数，高荧光量子产率，及光稳定性。在一些实施方式中，标记荧光团在光谱的可见光范围（即,在400和750nm之间）而非紫外线范围（即,少于400nm）内呈现吸收和发射波长。
可检测的部分可包括多于一种化学实体诸如在荧光共振能量转移（FRET）中。共振转移导致发射强度的总体增强。例如，见Ju et.al.(1995)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)92:4347，整个内容通过引用并入本文。为了达到共振能量转移，第1荧光分子（“供体”氟）吸收光，及将其通过激发的电子的共振转移到第2荧光分子（“受体”氟）。在一方法中，供体和受体染料可连接在一起及附接到寡引物。将供体和受体染料连接到核酸的方法已之前描述于，例如，Lee等人的美国专利No.5,945,526，整个内容通过引用并入本文。可使用的染料的供体/受体对包括，例如，荧光素/四甲基若丹明，IAEDANS/荧光素，EDANS/DABCYL，荧光素/荧光素，BODIPY FL/BODIPY FL，及荧光素/QSY 7染料。见，例如，Lee等人的美国专利No.5,945,526。许多这些染料也是可商购的，例如，自Molecular Probes Inc.（Eugene,Oreg.）。适合的供体荧光团包括6‑羧基荧光素（FAM），四氯‑6‑羧基荧光素（TET），2’‑氯‑7’‑苯基‑1,4‑二氯‑6‑羧基荧光素（VIC）等。
【酶】
在特定实施方式中，可检测的部分是酶。适合的酶的例包括，但不限于，在ELISA中使用的那些，例如，辣根过氧化物酶，β‑半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶，等。其他例包括β‑葡萄糖醛酸糖苷酶，β‑D‑葡萄糖苷酶，脲酶，葡萄糖氧化酶，等。可将酶使用接头基团诸如碳二亚胺，二异氰酸酯，戊二醛，等缀合于分子。
【放射性同位素】
在特定实施方式中，可检测的部分是放射性同位素。例如，分子可为同位素‑标记的（即,可含有一个或更多已被具有不同于通常见于天然的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子取代的原子）或同位素可附接于分子。可合入分子的同位素的非限制性例包括氢，碳，氟，磷，铜，镓，钇，锝，铟，碘，铼，铊，铋，砹，钐和镥的同位素（即,3H,13C,14C,18F,19F,32P,35S,64Cu,67Cu,67Ga，90Y，99mTc，111In，125I，123I，129I，131I，135I，186Re，187Re，201T1，212Bi，213Bi，211At，153Sm，177Lu）。
在一些实施方式中，通过使用标记的树状聚体作为可检测的部分来达到信号扩增（见,例如,Physiol.Genomics 3:93‑99,2000），整个内容通过引用整体并入本文。荧光标记的树状聚体是自Genisphere（Montvale,N.J.）可利用的。这些可由本领域知道的方法化学缀合到寡核苷酸引物。
【原位杂交】
如本文所用，术语“原位杂交”或“原位杂交”指称探针与扩增的目标核酸（例如,靶或参照核酸）在扩增的核酸产物形成的位置杂交的方法。例如，如果桥PCR用于扩增核酸，原位杂交指称特异于靶核酸和/或参照核酸的探针与PCR扩增的核酸集落在集落形成的位置杂交的方法。
在一些实施方式中，本发明的核酸集落可制备用于本文所述的杂交。该制备涉及处理集落，从而构成集落的全部或部分核酸模板以单链形式存在。此可例如由集落中任何双链DNA的加热变性达到。替代性地，集落可用特异于模板核酸中的双链形式的序列的限制性内切酶处理。例如，内切核酸酶可特异于衔接子序列A3’或A5’中含有的序列。在消化之后，加热集落，从而双链DNA分子分离，及洗涤集落以移出非固定的链，由此将附接的单链DNA留在集落中。
在制备用于杂交的集落之后，将在对于探针与其特异性靶序列杂交适当的条件下适当的探针加入集落。该条件可由本领域技术人员使用知道的方法确定和会依赖于例如探针序列。
在一些实施方式中，杂交可通过同时使用多个探针实施。例如，特异于靶和参照核酸的探针可在一个反应中杂交。在一些实施方式中，杂交可在不同轮实施。例如，可首先杂交及检测特异于一个区的探针，然后由加热变性移出，及可杂交及检测特异于第2区的探针。这些步骤可根据期望重复许多次。
标记的与核酸集落杂交的探针可然后通过使用设备包括适当的检测装置来检测。在一些实施方式中，用于荧光标记物的检测系统是电荷耦合装置（CCD）照相机，其可任选地偶联于放大装置，例如显微镜。对于同时平行监测许多集落使用该技术其是可能的。例如，CCD照相机可与具有10×或20×物镜的显微镜使用。在一些实施方式中，可同时观察1mm2和4mm2之间的表面的集落。在一些实施方式中，平行观察10,000和1,000,000集落之间。在一些实施方式中，平行观察10,000和500,000集落之间。在一些实施方式中，平行观察10,000和200,000集落之间。或者，可使用这些范围之内的范围。而且，预期此数会随着改善的光学及更大芯片而增加。
替代性地或另外地，监测产生的集落的方法包括扫描用集落覆盖的表面。例如，CCD照相机可用于取用任意数的集落覆盖的表面的图像。
允许表面上荧光的检测和优选定量的任何其他装置可用于监测本发明的核酸集落。例如可使用荧光成像仪或共聚焦显微镜。
在一些实施方式中，如果珠乳剂PCR用于单分子扩增，原位杂交可通过将含有扩增的核酸集落的珠与适当的探针混合来实施。在一些实施方式中，流式细胞术可用于检测标记的珠。例如，珠悬浮液可在10mM Tris‑HCI，1mM EDTA（351‑010‑131,Quality Biological,Inc.,Gaithersburg,Md.）中稀释为106～107珠/ml的浓度，及通过使用LSR仪器（BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.）分析。仪器可设置用于使用在2种荧光染料之间区别的氩激光和滤光器的标准2‑色彩分析。在一些实施方式中，由于主要珠群良好分离而无需光谱去卷积。在一些情况中，扫描用FACScan或FACSCalibur仪器（BD Biosciences）实施。
【基于阵列的杂交】
在一些实施方式中，含有扩增产物的核酸集落可通过使用基于阵列的杂交方法检测。一般而言，包括特异于靶和/或参照核酸的探针的探针阵列可用于杂交扩增的核酸。基于阵列的杂交可通过使用本领域知道的微芯片，多‑孔板，微‑加工的玻璃载玻片，微流体装置和各种其他手段实施。
在一些实施方式中，扩增的核酸可收获，合并及针对包括特异于靶和/或参照核酸的探针的探针阵列杂交。含有扩增的核酸的集落可由，例如，限制酶消化捕获寡核苷酸中的特定序列，衔接子序列A3’或A5’中含有的序列，或模板中的其他序列来从支持物除去。收获的DNA可加热，使得双链DNA分子分离。
在一些实施方式中，将如上述收获的DNA稀释，从而每检测位点（例如,每孔）有，平均起来，一个来自扩增产物的多核苷酸。
由此，当分析个体离散模板中目标核酸（例如,靶或参照核酸）的存在时，各检测位点会，平均起来，存在或缺乏靶或参照核酸。因此，一般，各反应位点具有以下结果之一：无信号，用与靶核酸关联的信号标记的，或用与参照核酸关联的信号标记的。
由此，在一些实施方式中，阵列‑杂交基于在各检测位点上的单分子分析，及目标靶（例如,第21染色体三体性）的量可基于大量的检测位点的结果测定。
在一些实施方式中，适合于基于阵列的杂交的探针是淬灭的荧光探针。淬灭的荧光探针一般包含设计为与和荧光团及与荧光猝灭剂缀合的目标核酸，一般PCR扩增产物（例如,自靶座位或参照座位的扩增子）杂交的寡核苷酸。荧光猝灭剂正常邻近给定探针上的荧光团；因此，自荧光团无信号可检测。当探针分子与核酸模板杂交时，荧光团可从探针释放。一旦自探针释放和（由此自猝灭剂分开）时，荧光团可检测。当由适当的波长激发时，荧光团会发射该荧光团的特定波长谱特征的光。一般而言，自荧光团的可检测的信号可归因于靶或参照核酸（例如,差异染色体）。
可使用任何各种荧光团，如将它们缀合到探针的方法。（见,例如,R.P.Haugland,“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals 1992‑1994”,5th Ed.,1994,Molecular Probes,Inc.）。适合的荧光团的非限制性例包括荧光素，若丹明，藻胆蛋白，花青苷，香豆素，芘，绿荧光蛋白，和它们的衍生物。可使用荧光团的天然存在的和合成的衍生物。荧光素衍生物的例包括异硫氰酸荧光素（FITC），俄勒冈绿，东京绿，半萘并荧光素（SNAFL），及羧基萘并荧光素。若丹明衍生物的例包括若丹明B，若丹明6G，若丹明123，四甲基若丹明衍生物TRITC和TAMRA，磺基若丹明101（及其磺酰氯形式德克萨斯红色），及若丹明红。藻胆蛋白包括藻红蛋白，藻蓝素，别藻蓝素，藻红花青素和多甲藻素叶绿素蛋白（PerCP）。藻红蛋白的类型包括R‑藻红蛋白，B‑藻红蛋白和Y‑藻红蛋白。花青苷染料和它们的衍生物的例包括Cy2（花青苷），Cy3（吲哚羰花青素），Cy3.5，Cy5（吲哚二羰花青素），Cy5.5，Cy7，BCy7和DBCy7。绿色荧光蛋白衍生物的例包括增强的绿荧光蛋白（EGFP），蓝荧光蛋白（BFP），氰荧光蛋白（CFP），及黄色荧光蛋白（YFP）。染料（Invitrogen）就它们可代替的共同荧光团或就它们的吸收/发射波长命名。染料包括BODIPY FL，BODIPY R6G，BODIPYTMR，BODIPY TR，BODIPY 581/591，BODIPY 630/650和BODIPY650/665。
【检测方法】
各种方法可用于检测靶核酸及以测定靶核酸的相对量。在特定实施方式中，相对于此确定参照核酸的靶核酸的量基于代表该信号，指示靶核酸或参照核酸的信号，和/或数值的比较。“指示”靶核酸的信号一般与靶核酸的反应位点或检测位点关联；类似地，“指示”参照核酸的信号一般与参照核酸的反应位点或检测位点关联。
在一些实施方式中，信号自一种或更多与关联反应位点或检测位点关联的可检测标记的探针发射。在一些实施方式中，可检测标记的探针是可杂交及特异于靶核酸或参照核酸的核酸探针。在一些实施方式中，信号自在检测信号的时间与探针物理学关联的实体（例如,可检测的部分）发射。在一些实施方式中，信号自在检测信号的时间未与探针物理学关联的实体发射。例如，信号可自探针与其核酸补体（例如,靶核酸或其部分或参照核酸或其部分）杂交之后从探针释放的实体发射。
指示靶核酸的信号是通常与指示参照核酸的信号可区分的。例如，在一些实施方式中，特异于靶核酸（或其部分）的探针及特异于参照核酸（或其部分）的探针用特殊地可检测的信号标记。在一些实施方式中，这些特殊地可检测的信号是不同光信号，诸如，例如，不同荧光或发光信号。例如，在将探针用荧光部分标记的实施方式中，特异于靶核酸（或其部分）的探针可用相比标记特异于参照核酸（或其部分）的探针的荧光部分是不同发射光谱（即,色彩和波长）的荧光部分标记。例如，发射绿光的荧光团可用于标记特异于靶核酸（例如,第21染色体）的探针，和发射红光的荧光团可用于标记特异于参照核酸（例如,第1染色体）的探针，或反之亦然。
在特定实施方式中，测定相对于参照核酸的靶核酸的量或拷贝数。在一些实施方式中，相对量或拷贝数表达为核酸样品中靶核酸的量或拷贝数（每基因组）与单拷贝参照核酸的拷贝数的比。在一些实施方式中，此比预期为1。
在一些实施方式中，测定靶核酸的相对拷贝数包含以下步骤：（a）测定指示含有靶核酸、或其部分的检测位点的第1数的第1荧光信号水平；（b）测定指示含有参照核酸、或其部分的检测位点的第2数的第2荧光信号水平；（c）测定第1荧光信号水平与第2荧光信号水平的比；及（d）通过相对特异于靶核酸的探针数和特异于参照核酸的探针数之间的比标准化在步骤（c）中测定的比来测定靶核酸的相对拷贝数。一般而言，荧光信号水平相对背景信号水平标准化。
用于实施探针与靶核酸（或其部分）或参照核酸（或其部分）的杂交的手段可与一个或更多装置或机连接以辅助检测。例如，用于实施杂交的手段可与一个或更多显微镜，二极管，光刺激装置（例如,激光器），光电倍增管，处理器或其组合连接。该装置可用于检测与靶核酸或参照核酸关联的信号。一般信号是光信号和使用光学检测器。光学检测器可包括一个或更多，例如，导到光电倍增管，显微镜和/或摄像机（例如,负荷的偶联装置（CCD）照相机）的光电二极管（例如,雪崩光电二极管），纤维‑光学导光器。
检测器可制造为用于实施杂交的平台或手段的部分，或物理学附接于用于实施杂交的平台或手段。替代性地或另外地，使用扫描系统。例如，特定自动化的系统可相对于杂交用手段扫描光源，及特定自动化的系统可在检测器，或包括多通道检测器上扫描发射的光。由例证性例的方式，可将杂交用手段附接于可翻译的台，及在显微镜物镜下扫描。如此获取的信号然后路由到用于信号解析及处理的处理器。在一些实施方式中，使用光电倍增管的阵列。在一些实施方式中，使用具有自不同反应位点或检测位点同时收集信号而自各反应位点或检测位点测定信号的能力的光学系统。
在一些实施方式中，检测器使用提供大视野和高数值孔以最大化自各检测位点或反应位点（或阵列中的斑点,如果使用阵列）收集的光量的CCD照相机和光路。在该实施方式中，将CCD用作光检测器阵列，其中各像素或像素组对应于反应室而非用于产生阵列像。由此，光学可改变，使得成像质量减少或散焦点到增加光学系统的视野深度，以自各检测位点或反应位点（或阵列中的斑点,如果使用阵列）收集更多光。
在一些实施方式中，检测器可包括用于刺激产生可检测的信号的实体（“报告子”）的光源。使用的光源的类型可部分依赖于活化以产生信号的报告子的性质。适合的光源可包括，但不限于，激光器，激光二极管，及高强度灯。在使用激光器的实施方式中，激光可用于扫描一组检测位点或反应位点，或单检测位点或反应位点，或阵列上的斑点，如果使用阵列。激光二极管可制造为用于测定本文所述的相对量的系统的部分，或可制造成放在用于实施杂交的手段的相邻处的另一装置。
可使用许多商业上‑可利用的外部检测器，包括荧光检测器。可根据本发明使用的荧光检测器的例包括，但不限于，Applied PrecisionArray WoRx（Applied Precision,Issaquah,WA）。在使用微阵列的实施方式中，机器诸如GENEPIXTM 4000B微阵列读取器（AxonInstruments,USA）可用于扫描荧光信号。
一般而言，选择可检测的标记物，从而它们的相应光信号可涉及存在的标记的核酸量，且从而可比较由不同光‑产生标记物产生的光信号。荧光标记物的发射强度的测量是迎合此设计目的的典型手段。对于荧光染料的给定选择，将它们的发射强度与标记的核酸的相应量相关涉及考虑几种因素，包括不同染料的荧光发射最大值，量子产率，发射带宽，吸收最大值，吸收带宽，激发光源的性质，等。用于进行荧光强度测量及用于将它们与分析物的量相关的指南是在与化学和分子分析相关的文献中可利用的，例如Guilbault,editor,PracticalFluorescence,Second Edition(Marcel Dekker,New York,1990);Pesce et al.,editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,NewYork,1971);White et al.,Fluorescence Analysis:A PracticalApproach(Marcel Dekker,New York,1970)；等。
如本文所用，术语“相对光信号”是指可涉及不同标记的核酸的比的自不同光‑产生标记物的信号比。在一些实施方式中，相对光信号是2种或更多不同荧光染料的荧光强度比。
在特定实施方式中，将信号使用本领域知道的标准软件转化为数值。在一些实施方式中，将信号（或代表信号的数值）基于背景信号标准化。
在一些实施方式中，信号（或代表信号的数值）基于相对于使用的特异于参照核酸（或其部分）的探针数的使用的特异于靶核酸（或其部分）的探针数标准化。例如，使用的特异于靶核酸（或其部分）的探针数可相比使用的特异于参照核酸（或其部分）的探针数不同；由此，基于使用的探针数的信号的标准化允许靶核酸的相对量的精确的比较。在一些实施方式中，信号（或代表信号的数值）基于相对于存在于全部使用的特异于参照核酸（或其部分）的探针中的可检测的部分数的存在于全部使用的特异于靶核酸（或其部分）的探针中的可检测的部分数标准化。在一些实施方式中，不同探针可具有不同数的可检测的部分。例如，对于用标记的脱氧核苷酸标记的核酸探针，各探针中可检测的部分数可依赖于探针序列和/或探针长度。在该实施方式中，基于相比存在于全部特异于参照核酸（或其部分）的探针的可检测的部分总数的存在于全部特异于靶核酸（或其部分）的探针的可检测的部分总数的标准化允许靶核酸的相对量的精确的比较。在各种实施方式中，依赖于探针方案的特定性质（包括,例如,使用的探针总数,每探针可检测的部分数,使用的各探针的摩尔量,等），根据需要使用信号（或表示信号的数值）的标准化。
如本文所述，任何本领域知道的各种软件程序可用于分析信号，包括但不限于GENEPLX PROTM 4.0.1.12软件（Axon Instruments,USA），Feature Extraction（Agilent），Matlab（Mathworks）等。
【实施例】
【实施例1．由PCR的单分子扩增】
从含有自怀孕的女性的血的生物学样本制备DNA。DNA然后由超声处理剪切以产生短片段（因为血浆中的胚胎DNA已短,此剪切步骤可为任选的）。将适配体连接到全部剪切的DNA片段的各端。将与适配体连接的DNA稀释进聚丙烯酰胺溶液。在玻璃载玻片表面，根据标准制备技术扩展DNA/聚丙烯酰胺溶液，以形成聚合酶集落（PCR集落PCR）。DNA的适当的稀释可依经验确定，使得DNA分子当在载玻片上扩展时可个别溶解，以产生数千到数百万的空间上不同的PCR集落。一旦设置聚丙烯酰胺，将具有特异于连接的适配体序列的引物的PCR扩增试剂溶液输注到载玻片。接下来，载玻片使用标准条件经历PCR热循环，以扩增DNA片段，产生含有目标区的DNA集落。
【实施例2．由滚环扩增的单分子扩增】
如在实施例1中描述制备DNA样品及与适配体连接。适配体连接后，将片段由连接环化。环化的DNA稀释进聚丙烯酰胺溶液及如在实施例1中描述在玻璃载玻片表面扩展。将DNA适当稀释，使得环化的DNA分子当在载玻片上扩展时可个别溶解而形成数千到数百万的空间上不同PCR集落。一旦设置聚丙烯酰胺，将含有滚环扩增（RCA）试剂（包括随机六聚体和Phi29或类似聚合酶）的溶液输注到凝胶。通过使用标准RCA条件（延伸的时期大致30℃,一般过夜或12小时）进行扩增。
【实施例3．由桥PCR的单分子扩增】
如在实施例1中描述制备DNA样品及与适配体连接。适配体连接后，DNA稀释进杂交溶液，及在用与连接的适配体互补的通用捕获探针包被的玻璃载玻片表面扩展，使得具有适配体的DNA分子可与载玻片表面上的捕获探针杂交。将含有核苷酸和聚合酶的溶液加入载玻片，并实施桥扩增以产生片段的克隆群。
【实施例4．杂交和靶检测】
对于在载玻片上聚丙烯酰胺凝胶中扩增的样品，将荧光标记的特异于靶染色体和参照染色体的寡核苷酸探针溶液输注到载玻片。靶可为第21，18或13染色体（或任何其他疾病关联染色体）上的座位或座位组合，和参照可为不同于靶的在第1，2，6，11染色体或任何其他染色体上的座位或座位组合。用于靶探针的荧光标记物相比用于参照探针的标记物是不同色彩。例如，将靶探针用CY3染料（绿色）标记，而参照探针通过使用CY5（红色）标记。载玻片然后使经历允许探针与它们的互补DNA靶特异性杂交的条件。接下来，将未杂交的探针通过一系列洗涤洗涤出载玻片。
或者，对于由桥PCR扩增的样品，将荧光标记的特异于靶和参照染色体的寡核苷酸探针溶液在载玻片上扩展，及允许与它们的互补DNA片段杂交。杂交后，未杂交的探针洗涤出载玻片。
最终，载玻片在商业激光扫描仪中成像。对靶和参照染色体杂交事件数计数；即，计数载玻片上存在多少绿和红点。计算这些事件的比以确定是否拷贝数像差存在于样本中。
【相当体和范围】
本领域技术人员使用无非常规实验会认识到，或能确定本文描述的特定实施方式的许多相当体。本发明的范围未旨在限制于以上描述，而是如随附的权利要求所示。
本领域技术人员使用无非常规实验会认识到，或能确定根据本文所述的本发明的特定实施方式的许多相当体。本发明的范围未旨在限制于以上描述，而是如随附的权利要求所示。
在权利要求中，诸如“a”，“an”和“the”可表示一个或多于一个，除非相反指示或自情景另外明白。在权利要求或说明书中，在组的一个或更多成员之间包括“或”被认为的满足存在于，采用于或另外关联于给定产品或方法的一个，多于一个，或全部组成员，除非相反指示或自情景另外明白。本发明包括实施方式，其中组的一个成员精确地存在于，采用于或另外关联于给定产品或方法。本发明包括实施方式，其中多于一个，或全部组成员存在于，采用于或另外关联于给定产品或方法。此外，需知，本发明包括全部变异，组合和置换，其中自一个或更多所列的权利要求的一个或更多限制，要素，从句，描述性术语，等，导入另一权利要求。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求可修饰为包括一个或更多限制见于从属于相同的基础权利要求的任何其他权利要求。此外，当权利要求叙述组合物时，需知，包括就任何本文公开的目的使用组合物的方法，及包括根据本文公开的任何制造方法或本领域知道的其他方法制造组合物的方法，除非另外指示，或除非本领域普通技术人员明白争议或不一致性会出现。
当要素表示为列表时，例如，以Markush组形式，需知，要素的各亚组也被公开，及任何要素可从组除去。应明白，一般而言，当本发明或本发明的方面说到包含特定要素，特征，等时，本发明的特定实施方式或本发明的方面由或基本上由该要素，特征，等组成。为简单性的目的，那些实施方式未特别如本文这些字所示。也需知，术语“包含”旨在是开放的及允许包括另外的要素或步骤。
当给出范围时，包括端点。此外，需知，除非另外指示，或自情景和本领域普通技术人员的理解另外明白，表达为范围的值可推定任何特定值或陈述的范围之内的子域，在本发明的不同实施方式中，到范围的下限的往下一个十进制数量级，除非情景明显另外指示。
此外，需知，落到现有技术之内的本发明的任何特定实施方式可明确地自任何一个或更多权利要求排除。由于该实施方式被认为为本领域普通技术人员所知，它们即便未在本文明确地显示排除，也可排除。本发明的组合物（例如,任何细胞类型;任何神经元细胞系统;突触囊泡循环的任何报告子;任何电刺激系统;任何成像系统;任何突触囊泡循环测定;任何突触囊泡循环调节物;任何使用方法;等）的任何特定实施方式可自任何一个或更多权利要求排除，对于任何原因，无论与现有技术的存在相关。
【援引加入】
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