包含痘苗病毒载体和仙台病毒载体的初免加强疫苗用病毒载体.pdf

本发明提供一种病毒载体，所述病毒载体能够使细胞免疫和体液免疫两方激活，能够用于对通常难以使用疫苗疗法的由病原微生物引起的传染病、恶性肿瘤有效的初免-加强疫苗的制造。所述病毒载体为包含下述（a）和（b）的初免-加强疫苗用病毒载体，（a）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体，（b）可表达地携带编码具有所述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体。

权利要求书
1.   初免‑加强疫苗用病毒载体，其包含下述（a）和（b），
（a）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体，
（b）可表达地携带编码具有所述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体。

2.   根据权利要求1所述的初免‑加强疫苗用病毒载体，含有下述（c），
（c）可表达地携带编码CD40配体非切断型突变体的基因的痘苗病毒载体。

3.   根据权利要求1所述的初免‑加强疫苗用病毒载体，可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体为可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因和编码CD40配体非切断型突变体的基因的痘苗病毒载体。

4.   根据权利要求1至3中任一项所述的初免‑加强疫苗用病毒载体，初免用病毒载体为（a）或者（a）和（c），并且加强用病毒载体为（b）。

5.   根据权利要求1至4中任一项所述的初免‑加强疫苗用病毒载体，痘苗病毒载体为痘苗病毒LC16株、LC16m8株或者Lc16mO株，并且为在B5R基因中1个或者多个核苷酸替换、添加、插入和/或缺失而不产生具有正常功能的B5R基因产物的痘苗病毒载体。

6.   根据权利要求1至5中任一项所述的初免‑加强疫苗用病毒载体，具有免疫原性的多肽为针对人类的病原微生物的抗原蛋白质或其部分肽、或者人类肿瘤抗原蛋白质或其部分肽。

7.   根据权利要求6所述的初免‑加强疫苗用病毒载体，病原微生物为从由人类免疫缺陷病毒、流感病毒、人类肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、疱疹病毒、黄病毒、严重急性呼吸综合征病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、黄热病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰质炎病毒、圣路易斯型脑炎病毒、霍乱弧菌、结核杆菌、白喉杆菌、伤寒沙门氏菌、百日咳菌、脑膜炎菌、破伤风菌、分支杆菌以及疟原虫组成的组中选择的病原微生物。

说明书包含痘苗病毒载体和仙台病毒载体的初免‑加强疫苗用病毒载体
技术领域
本发明涉及初免‑加强疫苗用病毒载体，特别是涉及能够用于使细胞免疫和体液免疫的任一个均可激活的初免‑加强（prime‑boost）疫苗的初免‑加强疫苗用病毒载体。
背景技术
人类是暴露于由于病毒、细菌、真菌及其他各种各样的生物的感染以及由其引起的传染病的危险之中的。克服这些传染病的一种方法是接种疫苗。疫苗大致分为使用减毒细菌、病毒等病原微生物本身的活疫苗和使用通过化学处理等死去的病原微生物或者表现抗原性的其一部分的灭活疫苗。
从赋予强的免疫力这点而言，期望疫苗能够激活细胞免疫和体液免疫两方，活疫苗能够激活该两方而在获得免疫力强、免疫持续时间也长等方面是有效的，但由于作为减毒病原的病原微生物本身被给予生物体，难以完全消除由病原微生物的感染引起的副反应、由于减毒病原微生物的回复（reversion）而强毒化（回复突变或者返祖）等隐患。
因此，对于像人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类肝炎病毒（HCV）等那样，一旦感染则会患上极为严重的疾病那种病原微生物，利用灭活疫苗，特别是在对人类安全性高的感染性病毒的基因组中，通过基因重组方法重组编码来自病原微生物的抗原蛋白质的基因的病毒载体疫苗。
对于这种病毒载体疫苗，必须为具备对生物体的高度安全性与重组基因的高表达性的病毒载体。作为这样的病毒载体，利用具有在哺乳动物中不能增殖性质的病毒、改变基因组使其虽然感染但在宿主中不产生子代病毒的病毒等，具体地，已利用金丝雀痘病毒、痘苗病毒MVA（Modified Vaccinia virus Ankara）、痘苗病毒LC16m8株、痘苗病毒LC16m8株的B5R基因缺失而不产生具有正常功能的B5R基因产物的痘苗病毒m8ΔB5R株（专利文献1）、载体亚型5的E1基因和E3基因缺失的腺病毒、仙台病毒等。
另外，作为病毒载体疫苗，除了以痘苗病毒LC16m8株为载体的人类乙型肝炎疫苗（非专利文献1）以外，正在多方开发在痘苗病毒LC16m8株中重组有HIV包膜蛋白质gp160（GenBank编号U21135）的HIV疫苗（专利文献2）、在仙台病毒载体中重组有HIV的gag蛋白质的HIV疫苗（专利文献3）等各种在病毒载体（腺病毒载体、仙台病毒载体（sendal virus vector）、痘苗病毒载体（vaccinia virus vector）、金丝雀痘病毒载体等）中重组有HIV‑l的组成蛋白质基因的HIV疫苗。
主流正在从一种免疫方法仅使用一种疫苗的方法，向使用组合两种以上的疫苗的初免‑加强疫苗的方法转变。作为初免‑加强疫苗，除了大量正在尝试的组合重组有抗原蛋白质基因的质粒（DNA疫苗）与各种病毒载体的初免‑加强疫苗以外，正在开发用在安全性高的BCG中插入有HIV‑l的gag基因的rBCG/HIV‑l gag E疫苗进行初免、用在作为在人类体内不增殖的弱毒痘苗病毒的痘苗病毒DIs株中插入有HIV‑1的gag蛋白质基因的痘苗DIs/HIV‑1gag E疫苗进行加强的初免‑加强HIV疫苗（专利文献4）、组合金丝雀痘病毒载体与HIV包膜蛋白质gp120的初免‑加强HIV疫苗（非专利文献2）。
另一方面，由于活化CD4阳性T细胞、活化CD8阳性T细胞等免疫细胞表达的CD40配体（CD40L）是使树突状细胞活化的因子，因此有报道用其激活免疫的方法，还报道了给予可溶性CD40L蛋白质而激活免疫的方法，使用导入CD40L表达载体而活化的树突状细胞的恶性肿瘤的免疫疗法，将可溶性CD40L蛋白质和质粒、非增殖性痘苗病毒载体混合给予而激活免疫的方法（非专利文献3），使CD40配体（CD40L）、以及其非切断型突变体CD40Lm在重组细胞中表达从而改变该细胞的免疫反应性的方法（专利文献5）等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2005/054451号
专利文献2：日本特开2003‑321391号
专利文献3：国际公开第2001/072340号
专利文献4：日本特开2006‑149234号
专利文献5：国际公开第2005/100558号
非专利文献
非专利文献1：桥爪壮，新的弱毒痘菌株LC16m8株的基础，临床与病毒，第3卷，第3号，第229页，1975年
非专利文献2：Perks‑Ngarm S.等，N.Engl.J.Med.，第361卷，第2209‑2220页，2009年
非专利文献3：C.E.Gomez等，Vaccine，第27卷，第3165‑3174页，2009年
发明内容
发明要解决的问题
可是，在各种病毒载体中重组有HIV‑1的组成蛋白质基因的HIV疫苗虽然激活细胞免疫，但对体液免疫的激活微弱。另外，临床试验表明，使用激活细胞免疫的腺病毒载体的HIV疫苗没有抑制HIV‑1的感染的效果（Science，第321卷，第530页，2008年）。进一步地，非专利文献3中记载的、将可溶性CD40L蛋白质和质粒、非增殖性痘苗病毒载体混合给予而激活免疫的方法也是激活细胞免疫，而体液免疫的激活效果有限。
另一方面，以往的组合质粒与各种病毒载体的初免‑加强疫苗也是激活细胞免疫，而抗体诱导能力微弱。临床试验表明，非专利文献2中记载的组合金丝雀痘病毒载体和HIV包膜蛋白质gp120的初免‑加强H IV疫苗使HIV‑l的感染率在某种程度上（30%）减少，但难以说是充分的感染抑制效果。
也就是说，尚未完成对HIV、HCV等严重的疾病能够决定性地激活体液免疫和细胞免疫两方的载体疫苗、初免‑加强疫苗。特别是对于HIV而言，当激活体液免疫和细胞免疫两方被认为是必需时，现有的HIV用载体疫苗产生的中和抗体效价低，难以说是实用水平，因此期待开发诱导体液免疫和细胞免疫两方的载体疫苗。
另外，初免‑加强疫苗免疫激活效果根据各种各样的载体疫苗的组合、用哪一个进行初免用哪一个进行加强的顺序、免疫原性蛋白质的种类、表达量的调节等而不同，因此其选择、决定，也就是疫苗设计依然是不得不经过试验错误而进行的状况。
进一步地，除了病毒等的传染病以外，在作为人类的主要死亡原因之一的恶性肿瘤的治疗中，也正在开发肿瘤抗原相关疫苗、所谓癌症疫苗的利用。癌症疫苗疗法是确定在恶性肿瘤组织或者肿瘤细胞中特异性或者显著表达的抗原性物质，通过提高患者自身对该抗原性物质的免疫力而治疗恶性肿瘤的尝试。在恶性肿瘤的情况下，由于实际上不能将恶性肿瘤直接作为活疫苗，因此期待开发灭活疫苗、特别是能够使肿瘤抗原在生物体内表达的载体疫苗、尤其是针对恶性肿瘤的初免‑加强疫苗。
本发明的课题是，提供可以用于能够激活细胞免疫和体液免疫两方、对一般的疫苗疗法存在困难的由病原微生物引起的传染病、恶性肿瘤有效的初免‑加强疫苗的制造的病毒载体。
解决问题的手段
本发明人在为了制造针对病原微生物的初免‑加强疫苗的疫苗设计中发现，通过用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体进行初免、用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体进行加强，能够激活细胞免疫和体液免疫两方，并且通过在进行初免时使CD40Lm与抗原蛋白质一起表达，免疫激活效果增强，从而完成了下述各发明。
（1）包含下述（a）和（b）的初免‑加强疫苗用病毒载体：
（a）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体，
（b）可表达地携带编码具有上述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体。
（2）（1）中记载的初免‑加强疫苗用病毒载体，含有下述（c）：
（c）可表达地携带编码CD40配体非切断型突变体的基因的痘苗病毒载体。
（3）（1）中记载的初免‑加强疫苗用病毒载体，可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体是可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因以及编码CD40配体非切断型突变体的基因的痘苗病毒载体。
（4）（1）至（3）中任一项记载的初免‑加强疫苗用病毒载体，进行初免用病毒载体为（a）或者（a）和（c），并且加强用病毒载体为（b）。
（5）（1）至（4）中任一项记载的初免‑加强疫苗用病毒载体，痘苗病毒载体是痘苗病毒LC16株、LC16m8株或者Lc16mO株，并且是B5R基因中1个或者多个核苷酸替换、添加、插入和/或缺失的不产生具有正常功能的B5R基因产物的痘苗病毒载体。
（6）（1）至（5）中任一项记载的初免‑加强疫苗用病毒载体，具有免疫原性的多肽是针对人类的病原微生物的抗原蛋白质或其部分肽、或者人类肿瘤抗原蛋白质或其部分肽。
（7）（6）中记载的初免‑加强疫苗用病毒载体，病原微生物是从由人类免疫缺陷病毒、流感病毒、人类肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、疱疹病毒、黄病毒、严重急性呼吸综合征病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、黄热病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰质炎病毒、圣路易斯型脑炎病毒、霍乱弧菌、结核杆菌、白喉杆菌、伤寒沙门氏菌、百日咳菌、脑膜炎菌、破伤风菌、分支杆菌以及疟原虫组成的组中选择的病原微生物。
发明效果
根据本发明的初免‑加强疫苗用病毒载体，除了病原微生物特异性的细胞因子的产生等细胞免疫的激活以外，还能够进行病原微生物特异性的抗体的产生等体液免疫的激活，因此能够在初免‑加强疫苗中使用。也就是说，根据使用本发明的初免‑加强疫苗用病毒载体的初免‑加强疫苗，能够抑制以往不能进行充分的感染抑制的HIV等病原微生物的感染。进一步地，通过将本发明的初免‑加强疫苗用病毒载体携带的、编码具有免疫原性的多肽的基因适当变更为来自各种病原微生物、恶性肿瘤的基因，能够制造对各种传染病、恶性肿瘤的预防、治疗有效的初免‑加强疫苗。
附图说明
图l是表示在m8Δ‑〈高pro〉‑env、m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm、m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm以及m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm的基因组中插入的基因和启动子的构成的示意图。
图2是表示在分别感染m8Δ‑〈高pro〉‑env、m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm、m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm以及m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm的源自兔肾的细胞（RK13细胞）中，通过蛋白质免疫印记（Western blot）检测env和hCD40Lm的表达的结果的图。
图3是表示在用表达抗原蛋白质的质粒（DNA‑env）初免后，各自用痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉）加强的小鼠（对照组）、用共表达抗原蛋白质和CD40Lm的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm）加强的小鼠（A组）、以及用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）加强的小鼠（B组）的脾脏中，CD8阳性IFN‑γ产生细胞数的测定结果的图。
图4是表示在用表达抗原蛋白质的质粒（DNA‑env）初免后，通过双叉针刺种法用共表达抗原蛋白质和CD40Lm的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm）（小鼠A）、以及通过皮内注射用共表达抗原蛋白质和CD40Lm的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm）（小鼠B）加强的小鼠的脾脏中，CD8阳性IFN‑γ产生细胞数的测定结果的图。
图5是表示在用表达抗原蛋白质的质粒（DNA‑env）初免后、用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）加强的小鼠（小鼠A）的血清中的抗env抗体的结合活性的测定结果的图（左图），以及表示用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）进行初免后、用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（小鼠B）的血清中的抗env抗体的结合活性的测定结果的图（右图）。
图6是表示在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（A组）、用共表达抗原蛋白质和CD40Lm的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（B组）、以及没有接种任何物质的小鼠（对照组）的脾脏中，CD8阳性IFN‑γ产生细胞数的测定结果的图。
图7是表示在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（A组）、以及用共表达抗原蛋白质和CD40Lm的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（B组）的血清中，抗env抗体的结合活性的图（右图），以及表示A组和B组的血清中，抗env抗体的中和活性的测定结果的图（左图）。
图8是表示在用表达抗原蛋白质的质粒（DNA‑env）初免后，各自用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和CD40Lm低表达痘苗病毒载体（m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm）加强的小鼠（A组）、用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和CD40Lm高表达痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm）加强的小鼠（B组）、以及用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉）加强的小鼠（对照组）的脾脏中，CD8阳性IFN‑γ产生细胞数的测定结果的图。
图9是表示用表达抗原蛋白质的质粒（DNA‑env）初免后，用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和CD40Lm高表达痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm）加强的小鼠（A组）的血清中，抗env抗体的结合活性的测定结果中代表性的结果的图。
图10是表示在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和CD40Lm低表达痘苗病毒载体（m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（A组）、用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（B组）、以及没有接种任何物质的小鼠（对照组）的脾脏中，CD8阳性IFN‑γ产生细胞数的测定结果的图。
图11是表示在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和CD40Lm低表达痘苗病毒载体（m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（A组）、以及用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（B组）的血清中，抗env抗体的结合活性（右图），以及A组和B组的血清中的抗env抗体的中和活性（左图）的测定结果的图。
图12是表示在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和CD40Lm低表达痘苗病毒载体（m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（A组）、用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）和痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（B组）、用共表达抗原蛋白质和CD40Lm的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（C组）、用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体（m8Δ‑〈高pro〉‑env）初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体（Sev‑env）加强的小鼠（D组）、以及没有接种任何物质的小鼠（对照组）的脾脏中，CD4阳性IFN‑γ产生细胞数以及CD4阳性IL‑4产生细胞的平均荧光强度的测定结果的图（分别为左图和右图）。
具体实施方式
以下对本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体进行详细说明。本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体，是包含（a）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体以及（b）可表达地编码具有上述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体的初免‑加强疫苗用病毒载体。
初免‑加强疫苗是指由包含初次免疫（初免，prime，priming）中使用的疫苗与追加免疫（加强，boost，boosting）中使用的疫苗的两种以上的疫苗形成的疫苗，通常，初次免疫中使用的疫苗与追加免疫中使用的疫苗是各不相同的疫苗。
本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体包含可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体。痘苗病毒载体除了其安全性以外，在对于人类诱发合适的免疫反应这点上也是优异的载体。作为在本发明中能够使用的痘苗病毒载体，可以列举例如LC16株、LC16m8株、LC16mO株、DIs株、MVA株等，特别优选使用这些载体的B5R基因中1个或者多个核苷酸替换、添加、插入和/或缺失而不产生具有正常的功能的B5R基因产物的痘苗病毒载体（上述专利文献1）。通过不产生具有正常功能的B5R基因产物，能够消除由于痘苗病毒的回复而产生的强毒化，即回复突变、所谓返祖等问题。这样的不产生具有正常功能的B5R基因产物的痘苗病毒载体，有B5R基因缺失的LC16株、m8ΔB5R（LC16m8Δ株）、mOΔB5R（LC16mOΔ株）、m8proB5RdTM、mOproB5RdTM等，其中特别优选使用B5R基因缺失的LC16株、m8ΔB5R（LC16m8Δ株）以及mOΔB5R（LC16mOΔ株）。其中，专利文献1记载了不产生具有正常功能的B5R基因产物的痘苗病毒载体的详细信息。
用于种痘的LC16m8株接种了约10万人的婴幼儿和约3千人的成人，但没有严重的副作用的报道。可是，由于LC16m8株具有遗传不稳定而产生强毒回复突变株的缺点，本发明人因此制备了不产生回复突变株的LC16m8Δ株。LC16m8Δ株与作为不能增殖的痘苗病毒株的DIs株、MVA株相比较，具有优异的免疫诱导（M.Kidokoro等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第102卷，第4152‑4157页，2005年；H.Suzuki等，Vaccine，第27卷，第966‑971页，2009），在猴子中也报道了预防高病原性的猴痘的感染（2006年日本病毒学会）。根据以上情况，期待LC16m8Δ株能够诱导对人类安全且优异的免疫力。
这里，在本发明中，提及“1个或者多个核苷酸替换、添加、插入和/或缺失”时的缺失、替换、插入和/或添加的核苷酸的个数，只要在转录和翻译时不产生具有正常功能的B5R基因产物，则没有特殊限制，但可以列举例如1～997个，优选100～997个，更优选300～997个，进一步优选500～997个，更进一步优选700～997个的任意个数。
本发明涉及的可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体，也可以是同时可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因和编码CD40配体非切断型突变体（CD40Lm）的基因的痘苗病毒载体（共表达痘苗病毒载体）。其中，在专利文献4中记载了CD40Lm的功能、CD40Lm基因的序列信息等的详细信息。
在本发明中，所谓具有免疫原性的多肽，是指在给予生物体时能够在给予的生物体中诱导细胞免疫和/或体液免疫的免疫反应的多肽，作为这种多肽，可以列举例如针对人类的病原微生物的抗原蛋白质、人类肿瘤抗原蛋白质、或者这些蛋白质的部分肽等。这里，在本发明中“激活”可以与“诱导”或者“活化”交换使用。
另外，本发明中所谓多肽是指2个以上的氨基酸通过肽键连接而成的化合物，构成的氨基酸数没有特殊限制，包含例如由2个氨基酸形成的二肽、由3个氨基酸形成的三肽、由4个氨基酸形成的四肽、由10个左右的氨基酸形成的寡肽、由20个以上的氨基酸形成的肽、蛋白质。
在本发明中，作为针对人类的病原微生物，可以列举例如人类免疫缺陷病毒、流感病毒、人类肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、疱疹病毒、黄病毒、严重急性呼吸综合征病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、黄热病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰质炎病毒、圣路易斯型脑炎病毒、霍乱弧菌、结核杆菌、白喉杆菌、伤寒沙门氏菌、百日咳菌、脑膜炎菌、破伤风菌、分支杆菌以及疟原虫、A组β型溶血性链球菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、李斯特菌、脑膜炎球菌、淋菌、病原性大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、沙雷氏菌、柠檬酸杆菌、不动杆菌、肠杆菌、支原体、衣原体、梭状芽孢杆菌等，作为针对人类的病原微生物的抗原蛋白质，可以列举例如人类免疫缺陷病毒的包膜蛋白质gp160和gp120（env）、gp41、pol蛋白质逆转录酶、nef蛋白质、tat蛋白质、gag前体p55、p24蛋白质、流感病毒的血凝素、神经氨酸酶、M2、丙肝病毒的包膜蛋白质E1、E2、乙肝病毒的HBs抗原等。
另外，作为人类肿瘤抗原蛋白质，可以列举例如作为黑素细胞组织特异性蛋白质的gp100（Bakker等，J.Exp.Med.，第179卷，第1005页，1994年）、宫颈癌的人类乳头瘤病毒E6蛋白质、E7蛋白质、MART‑1（Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第91卷，第3515页，1994年）、酪氨酸酶（Brichard等，J.Exp.Med.，第178卷，第489页，1993年）等黑素小体相关抗原，HER2/neu（Fisk B.等，J.Exp.Med.，第181卷，第2109页，1995年）、CEA（Tsang K.Y.等，J.Natl.Cancer Inst.，第87卷，第982页，1995年），PSA（Correale P.等，J.Nat1.Cancer Inst.，第89卷，第293页，1997年）等。
在本发明中，可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体能够通过如下步骤制备：制备适于导入的连结有编码具有免疫原性的多肽的基因的质粒（转移载体，transfer vector），将其导入感染痘苗病毒的细胞中，在该细胞中发生同源重组。另外作为其他方法，也可以通过如下步骤制备：将适于导入的编码具有免疫原性的多肽的基因片段以适当的限制酶消化，直接连结入用同样的酶消化的痘苗病毒基因组，将该重组痘苗病毒基因组导入病毒感染细胞。
作为能够在可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体的制备中使用的质粒，可以列举例如pSFJ1‑10、pSFJ2‑16、pMM4、pGS20、pSC11、pMJ601、p2001、pBCB01‑3,06、pTKgpt‑F1‑3s、pTM1、pTM3、pPR34,35、pgpt‑ATA18‑2、pHES1‑3、pJW322、pVR1、pCA、pBHAR等。
编码具有免疫原性的多肽的基因的导入区域为痘苗病毒的生命周期的非必需基因区域，可以列举例如血凝素（HA）基因、胸苷激酶（TK）基因、B5R基因（B4R基因与B6R基因之间）、F片段等区域。例如，在HA基因中导入有编码具有免疫原性的多肽的基因的重组子中，HA基因被导入的外源基因打断而失去功能。因此，噬斑由于不吸附鸡红细胞而呈现白色，从而能够容易地筛选重组子。另外，在TK基因中导入有编码具有免疫原性的多肽的基因的重组子中，TK基因的功能缺失，5‑溴脱氧尿酐（BudR）没有致死性作用，因而能够通过BudR进行筛选。另外，在B5R基因中导入有编码具有免疫原性的多肽的基因时，重组子的噬斑变小，因而能够通过噬斑的大小进行筛选。这里，导入部分的基因优选由于1个或者多个核苷酸替换、添加、插入和/或缺失而病毒的性状变化、重组子的选择变得容易的基因。
作为可以感染痘苗病毒载体的细胞，可以使用Vero细胞、HeLa细胞、CV1细胞、COS细胞、RK13细胞、BHK细胞、原代兔肾细胞、BSC‑1细胞、HTK‑143细胞、Hep2细胞、MDCK细胞等痘苗病毒能感染的细胞。
将编码具有免疫原性的多肽的基因导入时，能够在编码具有免疫原性的多肽的基因的上游将适当的启动子以能够发挥功能的方式连接。这种启动子没有特殊限制，例如能够使用AT1启动子、PSFJ1‑10、PSFJ2‑16、p7.5启动子、p7.5启动子的改良型启动子（7.5E）、p11K启动子、T7.10启动子、CPX启动子、HF启动子、H6启动子、T7杂合启动子等。
在痘苗病毒载体中导入编码具有免疫原性的多肽的基因的方法，能够按照构建重组痘苗病毒载体的公知方法进行，例如能够按照“《补充实验医学，方法系列，基因转移与表达分析实验方法》（Supplement Experimental Medicine，The Protocol Series，Experimental Protocols for Gene Transfer&Expression Analysis）（斋藤泉等编，羊土社，1997年9月1日发行）”或者“《DNA克隆4‑哺乳动物系统，第2版》（D.M.Glover等编，加藤郁之进监译，宝生物）”、“The EMBO Journal，第6卷，第3379‑3384页，1987年”等的记载进行。
然后，本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体包含可表达地携带编码具有上述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体。这里，“上述免疫原性”是指本发明涉及的痘苗病毒载体可表达地携带的多肽所具有的免疫原性。也就是说，本发明涉及的仙台病毒载体可表达地携带的、编码具有免疫原性的多肽的基因可以与本发明涉及的痘苗病毒载体携带的、编码具有免疫原性的多肽的基因相同，只要具有同样的免疫原性，也可以是不同的基因。
仙台病毒不与宿主的基因组相互作用地复制，并且没有对人类的病原性，因此作为载体而被利用，可以认为它是应用于人类时安全性高的病毒。在本发明中，仙台病毒载体可以具有与野生型同样的复制能力，也可以是没有复制能力的缺陷型载体。另外，本发明中涉及的仙台病毒载体，也可以是野生型仙台病毒的基因配置、基因组的碱基序列被改变了的载体。进而，使用源自包膜蛋白质、外壳蛋白质中含有减毒突变、温度敏感性突变的仙台病毒突变株的仙台病毒载体也没有关系。
在本发明中，可表达地携带编码具有上述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体，除了能够通过在与上述可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体的制备方法相同的方法中，按照专利文献3的记载，用仙台病毒代替痘苗病毒，作为感染病毒载体的细胞用LLC‑MK2细胞、CVl细胞、BHK细胞、来自人类的细胞等仙台病毒能够感染的细胞进行，从而制备以外，作为其他方法，还可以通过将适于导入的编码具有免疫原性的多肽的基因片段用适当的限制酶消化，直接连接入添加了相同的酶识别位点的仙台病毒基因组中，将该重组仙台病毒基因组与适当的辅助质粒一起导入仙台病毒能够感染的细胞中而制备。另外，F蛋白质缺失的仙台病毒载体的制备能够按照已有报道（国际公开第2000/70055号、国际公开第2000/70070号）进行。
然后，本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体的不同形态为包含（a）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体、（b）可表达地携带编码具有上述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体以及（c）可表达地携带编码CD40配体非切断型突变体的基因的痘苗病毒载体的初免‑加强疫苗用病毒载体。
在本发明中，可表达地携带编码CD40Lm的基因的痘苗病毒载体能够通过在与上述可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体的制备方法相同的方法中，将编码具有免疫原性的多肽的基因用CD40Lm基因代替进行而制备。这里，在本发明涉及的可表达地携带编码CD40Lm的基因的痘苗病毒载体中，诱导CD40Lm的表达的启动子优选使用p7.5启动子等赋予比较中等表达量的启动子。
在本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体中，可以用任一个病毒载体进行初免，用任一个病毒载体加强而使用，但优选将（i）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体、（ii）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因和编码CD40Lm的基因的痘苗病毒载体、或者（iii）可表达地携带编码具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒载体和可表达地携带编码CD40Lm的基因的痘苗病毒载体的（i）至（iii）中任一个作为初免用，将可表达地携带编码具有上述免疫原性的多肽的基因的仙台病毒载体作为加强用。
这里，当然地，只要是属于本发明的技术领域的技术人员就能够理解：作为用本发明涉及的初免‑加强疫苗用病毒载体使哺乳动物、特别是使人类免疫的方法、免疫激活方法，将上述载体作为疫苗使用的方法（包括作为疫苗的使用），将上述载体用于医药的制造的方法，含有上述载体与药学上允许的赋形剂的医药组合物等而表示的发明也被本说明书的记载、特别是下述实施例的记载公开。
以下基于实施例对本发明涉及的包含痘苗病毒载体和仙台病毒载体的初免‑加强疫苗用病毒载体进行说明。这里，本发明的技术范围不受通过这些实施例显示的特征的限制。
实施例
<实施例1>
（1）携带编码人类免疫缺陷病毒包膜蛋白质的基因的痘苗病毒载体的制备
[1‑1]m8Δ‑〈高pro〉‑env的制备
〈1‑1‑1〉env基因的制备
通过将编码人类免疫缺陷病毒HIV‑1JR‑CSF株的包膜蛋白质gp160和gp120（env）的基因（登录号M38429）插入pJW322的Avr II/Xho I位点，得到pJW322‑env。然后，为了使env高效表达，在env基因中使存在于第6751位至第6757位、第7367位至第7373位、以及第8305位至第8311位的痘苗病毒的转录终止序列通过体外诱变（in vitro mutagenesis）方法，发生如下所述突变，将其作为pJW322‑env2。这里，通过该突变env的氨基酸序列没有变化。
第6751位至第6757位
突变前：TTTTTAT（序列编号1）
突变后：TTTCTAT（序列编号2）
第7367位至第7373位
突变前：TTTTTCT（序列编号3）
突变后：TTCTTCT（序列编号4）
第8305位至第8311位
突变前：TTTTTCT（序列编号5）
突变后：TTTCTCT（序列编号6）
接着，以pJW322‑env2为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离env基因。
正向引物：5’‑TTTCGGACCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGG‑3’（序列编号7），
反向引物：5’‑ATAGGCCGGCCTTATAGCA AAGCCCTTTCCAAGC‑3’（序列编号8）。
将得到的PCR产物纯化后，用限制酶Fse I和Rsr II消化。
〈1‑1‑2〉基因向痘苗病毒基因组的插入
将携带插入有AT1启动子、10个连续的改良型p7.5启动子（7.5E）以及多克隆位点（MCS）的基因组的痘苗病毒LC16m8Δ株（m8Δ‑〈高pro〉）（Suzuki H.等，Vaccine，第27卷，第966‑971页，2009年），通过使用20‑40%蔗糖梯度的超速离心纯化。AT1启动子以及10个重复的7.5E为使存在于其下游的基因高效表达的启动子（高表达启动子）。
接着，通过苯酚/氯仿/异戊醇法从纯化的m8Δ‑〈高pro〉抽提基因组DNA，通过乙醇沉淀而浓缩。在该基因组DNA的Fse I/Rsr II位点，插入本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑1〉的env基因，得到携带插入有高表达启动子和env基因的基因组的痘苗病毒载体m8Δ‑〈高pro〉‑env的基因组。
〈1‑1‑3〉插入有基因的痘苗病毒的纯化
在100mm培养皿中，用2.4×105个地鼠幼鼠肾脏细胞（BHK细胞）铺板，过夜培养后，加入培养基以使金丝雀痘病毒的感染复数（Multiplicity of infection，MOI）=10的量，在33℃培养1小时。
接着，将未吸附的金丝雀痘病毒洗净后，添加按照所附说明书将lipofectamine LTX plus（Invitrogen公司）与本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑2〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env的基因组混合的混合物，过夜培养。随后，将使培养的BHK细胞冻融而得的溶解液稀释，加入在24孔板上培养的源自兔肾的细胞（RK13细胞）中，在33℃培养，形成单个噬斑。得到的单个噬斑再次冻融而得到溶解液后，将其稀释，加入在24孔板上培养的RK13细胞中，在33℃培养，形成单个噬斑。回收单个噬斑，将其作为携带插入有高表达启动子和env基因的基因组的痘苗病毒载体m8Δ‑〈高pro〉‑env。
〈1‑1‑4〉env表达的确认：噬斑酶联免疫吸附实验（Plaque ELISA）
将本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑3〉中回收的m8Δ‑〈高pro〉‑env的噬斑用2%（w/v）多聚甲醛/PBS溶液固定后，用PBS洗涤，进一步用5%（w/w）脱脂奶粉/PBS溶液封闭后，用PBS洗涤。接着，用人类抗env抗体作为一抗、用偶联碱性磷酸酶的抗人类lgG抗体作为二抗，按照常规方法进行酶联免疫吸附实验（ELISA），确认到噬斑中env的表达。
〈1‑1‑5〉env表达的确认：蛋白质免疫印记
将本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑3〉的m8Δ‑（高pro）‑env以MOI=10加入RK13细胞中，在33℃吸附1小时。接着，将未吸附的病毒洗净后，加入培养基过夜培养。
接着，将约1μg该RK13细胞用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用HIV‑1感染者血清，按照常规方法进行蛋白质免疫印记，确认到env的表达。其结果示于图2。
〈1‑1‑6〉痘苗病毒载体的大量培养
将本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑3〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env在RK13细胞中大量培养后，通过使用36%（w/v）蔗糖垫层的超速离心纯化浓缩，测定RK13细胞中的病毒效价。
[1‑2]m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm的制备
〈1‑2‑1〉质粒的制备
以插入有人类CD40配体非切断型突变体（hCD40Lm）基因的pCA‑hCD40Lm3为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离p7.5启动子和hCD40Lm基因。p7.5启动子是一般经常使用的来自痘苗病毒的启动子，使存在于其下游的基因表达，但与上述高表达启动子相比较，是下游基因的表达量小的启动子。
正向引物：5’‑AGTGGATCCGCCAGCATGATCGAAACATACAACCAA‑3’（序列编号9），
反向引物：5’‑AGACCCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGA‑3’（序列编号10）。
将得到的PCR产物纯化后，用限制酶Bam HI和Ava I消化，插入质粒pVR1（Shida H.等，EMBO.J.，第6卷，第3379‑3384页，1987年）的血凝素（Hemagglutinin，HA）基因中的Bam HI/Ava I位点，从而得到pVR1‑hCD40Lm。
〈1‑2‑2〉基因向痘苗病毒基因组的插入
在60mm培养皿中培养至80%汇合（confluence）的BHK细胞中，加入痘苗病毒LC16m8Δ株以使MO1=0.05，在33℃培养1小时。
接着，加入按照所附说明书将lipofectamine LTX plus（Invitrogen公司）和本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑1〉的pVR1‑hCD40Lm混合的混合物，通过在33℃培养24小时，使痘苗病毒LC16m8Δ株携带的基因组的血凝素（HA）基因与pVR1‑hCD40Lm的p7.5启动子和hCD40Lm基因的插入位点之间发生同源重组。
〈1‑2‑3〉插入有基因的痘苗病毒的粗纯化
将使本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑2〉的BHK细胞冻融而得到的溶解液加入RK13细胞中，在33℃培养3天形成噬斑。
接着，在含有钙离子和镁离子的PBS（Ca2+‑Mg2+‑PBS）中以0.5‑2.0%（w/v）的量悬浮鸡红细胞，制备红细胞吸附试验（HAD Test）溶液。用HAD Test溶液替换形成噬斑的RK13细胞的培养基，室温下静置1小时后，用Ca2+‑Mg2+‑PBS洗涤，刮取回收未见红细胞的凝集的无色噬斑。
〈1‑2‑4〉插入有基因的痘苗病毒的纯化
对于在本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑3〉中回收的噬斑，通过进一步进行2次本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑3〉的操作，纯化携带在HA基因部位插入有p7.5启动子和hCD40Lm基因的基因组的痘苗病毒，将其作为m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm。
〈1‑2‑5〉CD40Lm表达的确认：蛋白质免疫印记
对于本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑4〉的m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm，通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑5〉中记载的方法进行蛋白质免疫印记，确认到hCD40Lm的表达。只是用于电泳的细胞是用10μg代替1μg，在hCD40Lm的检测中，代替HIV‑1感染者血清，使用抗CD40L小鼠单克隆抗体。其结果示于图2。
〈1‑2‑6〉痘苗病毒载体的大量培养
通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑6〉中记载的方法，大量培养本实施例（1）〈1‑2‑4〉的m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm并纯化浓缩，测定病毒效价。
[1‑3]m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm的制备
〈1‑3‑1〉质粒的制备
以本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑1〉的pJW322‑env2为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离env基因。
正向引物：
5’‑CTAGAATTCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGGAAG‑3’（序列编号11），
反向引物：5’‑CGTGAGCTCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC‑3’（序列编号12）。
将得到的PCR产物纯化后，用限制酶Eco RI和Sac I消化。
另外，以本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑1〉的pVR1‑hCD40Lm为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离p7.5启动子和hCD40Lm基因。
正向引物：
5’‑CTAGAGCTCGCCACCATATACTATATAGTAATACCAATA‑3’（序列编号13），
反向引物：5’‑GTACCCGGGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGG‑3’（序列编号14）。
将得到的PCR产物纯化后，用限制酶Sac I和Xma I消化。
接着，将该env基因的PCR产物以及p7.5启动子和hCD40Lm基因的PCR产物插入pJW322的Eco RI/Xma I位点，得到pJW322‑env‑hCD40Lm。
然后，以pJW322‑env‑hCD40Lm为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离env基因、p7.5启动子以及hCD40Lm基因的区域。
正向引物：
5’‑TTTCGGACCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGGAAG‑3’（序列编号15），
反向引物：5’‑AGAGGCCGGCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGA‑3’（序列编号16）。
将得到的PCR产物纯化后，用限制酶Fse I和Rsr II消化。
〈1‑3‑2〉基因向痘苗病毒基因组的插入
通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑2〉中记载的方法，在m8Δ‑〈高pro〉携带的基因组DNA的Fse I/Rsr II位点，插入本实施例（1）[1‑3]〈1‑3‑1〉的env基因、p7.5启动子以及hCD40Lm基因的区域，得到携带插入有高表达启动子、env基因以及hCD40Lm基因的基因组的痘苗病毒载体m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm的基因组。
〈1‑3‑3〉插入有基因的痘苗病毒的纯化
通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑3〉中记载的方法，纯化携带插入有高表达启动子、env基因以及hCD40Lm基因的基因组的痘苗病毒载体m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm。
〈1‑3‑4〉env表达的确认：噬斑酶联免疫吸附实验（ELISA）和蛋白质免疫印记
对于本实施例（1）[1‑3]〈1‑3‑3〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm，通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑4〉中记载的方法进行酶联免疫吸附实验，在噬斑中确认到env的表达。另外，对于本实施例（1）[1‑3]〈1‑3‑3〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm，通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑5〉和本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑5〉中记载的方法进行蛋白质免疫印记，确认到env和hCD40Lm的表达。其结果示于图2。
〈1‑3‑5〉痘苗病毒载体的大量培养
通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑6〉中记载的方法，大量培养本实施例（1）[1‑3]〈1‑3‑3〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm并纯化浓缩，测定病毒效价。
[1‑4]m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm的制作
〈1‑4‑1〉质粒的制备
以插入有hCD40Lm基因的pCA‑hCD40Lm3为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离hCD40Lm基因。
正向引物：5’‑AAACCCGGGCATGATCGAAACATACAACCAAA‑3’（序列编号17），
反向引物：5’‑CCATCTAGATCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCA‑3’（序列编号18）。
将得到的PCR产物纯化并用限制酶Xma I和Not I消化后，插入具有AT1启动子和10个连续7.5E（高表达启动子）的pBHAR（Jin N‑Y.等，Arch.Virol.，第138卷，第315‑330页，1994年）的Xma I/Not I位点，得到pBHAR‑hCD40Lm。
〈1‑4‑2〉基因向痘苗病毒基因组的插入
通过本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑2〉中记载的方法，在痘苗病毒LC16m8Δ株携带的基因组中，插入本实施例（1）[1‑4]〈1‑4‑1〉的高表达启动子和hCD40Lm基因的区域。
〈1‑4‑3〉插入有基因的痘苗病毒的纯化
通过本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑3〉和〈1‑2‑4〉中记载的方法，纯化携带插入有高表达启动子和hCD40Lm基因的基因组的痘苗病毒载体m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm。
〈1‑4‑4〉hCD40Lm表达的确认：蛋白质免疫印记
对于本实施例（1）[1‑4]〈1‑4‑3〉的m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm，通过本实施例（1）[1‑2]〈1‑2‑5〉中记载的方法进行蛋白质免疫印记，确认到hCD40Lm的表达。其结果示于图2。
如图2所示，确认到感染m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm的细胞的hCD40Lm的表达量，比感染m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm的细胞的hCD40Lm的表达量以及感染m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm的细胞的hCD40Lm的表达量大。
〈1‑4‑5〉痘苗病毒载体的大量培养
通过本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑6〉中记载的方法，大量培养本实施例（1）[1‑4]〈1‑4‑3〉的m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm并纯化浓缩，测定病毒效价。
以上本实施例（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env、m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm、m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm以及m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm中插入的基因和启动子的构成示于图1。
（2）携带env的仙台病毒载体（SeV‑env）的制作
[2‑1]质粒的制备
将两端添加了Not I识别序列的env基因插入pBluescript的Not I位点，得到pBluescript‑env。
接着，由于在env基因中存在3处在仙台病毒的基因表达中作为转录终止序列的A和T的连续序列，通过用下述引物进行PCR，在该序列中导入突变，从而得到插入有导入了突变的env基因（env‑mut基因）的pBluescript‑env‑mut。
用于突变导入的引物
突变1：
正向引物：
5’‑CCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAGGGGATCCAGAAATTG‑3’（序列编号19）
反向引物：
5’‑GAATAACACTTTAAAACAGATAGTTGAGAAGCTCCGCGAGCAGTTCA ACAACA AGACCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAG‑3’（序列编号20）
突变2：
正向引物：
5’‑GTGAAGATCGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAG‑3’（序列编号21）
反向引物：
5’‑GAGACATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAGCTCTACAAGTACAAGGTC GTGAAGATCGAACCATTAGGAGTA‑3’（序列编号22）
突变3：
正向引物：
5’‑CGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGG‑3’（序列编号23）
反向引物：
5'‑GTTTGACATAACAAAATGGCTGTGGTACATCAAGATCTTCATCATGATC GTGGGAGGCCTGATCGGTCTCCGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAG‑3’（序列编号24）
[2‑2]基因向仙台病毒基因组的插入
将本实施例（2）[2‑1]的pBluescript‑env‑mut用Not I消化，切出env‑mut基因片段，将其插入具有在仙台病毒基因组的3’末端添加了Not I识别序列的序列、并且不具有编码仙台病毒的表面蛋白质fusion的基因（F）的质粒pSeV/ΔF的Not I位点，从而得到pSeV‑env‑mut/ΔF。
[2‑3]插入有基因的仙台病毒的纯化
将本实施例（2）[2‑2]的pSeV‑env‑mut/ΔF与作为辅助质粒的pCAGGS‑NP、pCAGGS‑P、pCAGGS‑L以及pCAGGS‑T7混合，转染293T细胞并培养。
接着，将培养的293T细胞的上清加入作为F表达细胞的LLC‑MK2/F/Ad细胞中并培养，回收培养上清。
然后，将回收的培养上清进行有限稀释，用96孔板感染LLC‑MK2/F/Ad细胞，克隆具有pSeV‑env‑mut/ΔF的病毒。
将克隆化的病毒作为携带插入有env基因的基因组的仙台病毒载体SeV‑env。这里，确认SeV‑env具有的env基因的碱基序列时，第450位的A突变为G，在氨基酸序列中天冬酰胺突变为天冬氨酸。SeV‑env感染LLC‑MK2/F/Ad细胞而增殖。
[2‑4]仙台病毒载体的大量培养
在培养了LLC‑MK2/F/Ad细胞的、36个培养面积225cm2的培养瓶中加入实施例（2）[2‑3]的SeV‑env并培养24小时，更换培养基，进一步培养48小时。随后，回收培养上清并过滤，用超滤滤器浓缩。
（3）携带env基因的质粒（DNA‑env）的制作
[3‑1]基因向质粒中的插入
以本实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑1〉的pJW322‑env2为模板，用下述引物进行PCR，扩增并分离env基因。
正向引物：5’‑CTAGAATTCGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG‑3’（序列编号25），
反向引物：5’‑CGTGAATTCACCCATCTTATAGCAAAGCCCTT‑3’（序列编号26）。
将得到的PCR产物纯化后，用限制酶Eco RI消化后，插入哺乳动物细胞表达载体质粒pCAGGS的Eco RI位点，得到携带env基因的pCAGGS质粒（DNA‑env）。
[3‑2]env表达的确认
将本实施例（3）[3‑1]的DNA‑env与聚乙烯亚胺（PEI，Polyscience公司）混合，转染293T细胞后，将该细胞培养2天。接着，通过实施例（1）[1‑1]〈1‑1‑5〉中记载的方法进行蛋白质免疫印记，确认到env的表达。
[3‑3]DNA‑env的大量培养
用本实施例（3）[3‑1]的DNA‑env转化大肠杆菌XL1‑blue并大量培养后，用EndoFree Plasmid Purification（Qiagen公司）纯化。
<实施例2>细胞免疫激活效果的确认：初免，DNA‑env/加强，痘苗病毒载体的共表达痘苗病毒载体接种
（1）初次免疫（初免）
将实施例1（3）[3‑3]的DNA‑env溶解于PBS中使得成为1μg/ml，制备DNA‑env溶液。按照常规方法对9只C57BL/6小鼠各自肌肉注射50μL（50μg）上述溶液（初免）后，饲养2周。接着，再次按照常规方法各自肌肉注射50μL（50μg）DNA‑env溶液（初免）后，饲养8周。
（2）追加免疫（加强）
将实施例1（1）[1‑1]〈1‑1‑2〉的m8Δ‑〈高pro〉、实施例1（1）[1‑1]〈1‑1‑6〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env以及实施例1（1）[1‑3]〈1‑3‑5〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm，分别以1×108PFU/mL的量溶解于PBS，制备m8Δ‑〈高pro〉溶液、m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液以及m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm溶液。
接着，将本实施例（1）的小鼠分为3组，每组3只，作为对照组、A组和B组。分别按照常规方法各自皮内注射100μL（1×107PFU）如下溶液（加强），对照组的小鼠为m8Δ‑〈高pro〉溶液，A组小鼠为m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液，B组小鼠为m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm溶液，然后饲养2周。
（3）T细胞的采集
按照常规方法，从本实施例（2）的各组小鼠摘出脾脏而采集脾脏细胞。将采集的脾脏细胞悬浮于RPMI1640培养基后，在200×g、室温条件下进行10分钟离心分离，除去上清，添加0.8%（w/v）氯化铵水溶液而溶血，从而将红细胞除去。将留下的脾脏细胞悬浮于RPMI1640培养基，通过尼龙网使T细胞浓缩后，按照常规方法对细胞数进行计数。
（4）细胞内细胞因子染色
使用HIV‑1Consensus Subtype B Env（15‑mer）Peptides（艾滋病研究与参照试剂计划，AIDS Research and Reference Reagent Program），根据所附说明书刺激本实施例（3）的T细胞。接着，作为标记抗体，使用APC标记的抗小鼠IFN‑γ（APC‑labeled anti‑mouse IFN‑γ，eBioscience公司）和PE标记的抗小鼠CD8（PE‑labeled anti‑mouse CD8，eBioscience公司）、以及Fixation and Permeabilization Solution Kit with BD GolgiStop（日本BD公司），根据所附说明书将T细胞中的CD8阳性IFN‑γ产生细胞染色。
（5）使用FACS对染色细胞数的测定
用FACS CantoII（日本BD公司）测定在本实施例（4）中染色的CD8阳性IFN‑γ产生细胞数。对于测定的结果，求各组的平均值，用图形表示。其结果示于图3。
如图3所示，CD8阳性IFN‑γ产生细胞在对照组中未检出，另一方面，在A组中作为平均值约为1.25%、在B组中作为平均值约为1%。
从这些结果可知，通过用表达抗原蛋白质的质粒初免后用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体加强，细胞免疫被激活。另外表明，使此时的痘苗病毒载体除了抗原蛋白质以外，还共表达CD40Lm时，几乎没有见到细胞免疫激活的增强效果。
<实施例3>细胞免疫激活效果的确认：初免：DNA‑env/加强：痘苗病毒载体的共表达痘苗病毒载体的刺种接种
（1）初免与加强
将2只C57BL/6小鼠分别作为小鼠A和小鼠B，对于这些小鼠，通过实施例2（1）和（2）中记载的方法，进行初免和加强。只是在加强时，制备使实施例1（1）[1‑3]〈1‑3‑5〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm在PBS中以成为1×109PFU/mL的量溶解的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm溶液，在小鼠A中，将10μL（1×107PFU）该溶液通过双叉针刺种接种，在小鼠B中将实施例2（2）的1×108PFU/mL的m8Δ‑〈高pro〉‑envhCD40Lm溶液100μL（1×107PFU）通过皮内注射接种。
（2）T细胞的采集、细胞内细胞因子染色以及使用FACS对染色细胞数的测定
对于本实施例（1）的小鼠A和小鼠B，通过实施例2（3）至（5）中记载的方法进行T细胞的采集、细胞内细胞因子染色以及使用FACS对染色细胞数的测定。其结果示于图4。
如图4所示，CD8阳性IFN‑γ产生细胞在小鼠B中约为1.25%，与此相对，在小鼠A中约为3.25%。
从该结果可知，在用表达抗原蛋白质的质粒进行初免后用共表达抗原蛋白质和hCD40Lm的痘苗病毒载体加强而激活细胞免疫的情况下，通过将加强的接种方法用双叉针刺种代替皮内注射，可增强细胞免疫激活效果。
<实施例4>体液免疫激活效果的确认：初免：DNA‑env/加强：痘苗病毒载体与初免：痘苗病毒载体/加强：与仙台病毒载体的比较
（1）初免
将2只C57BL/6小鼠作为小鼠A和小鼠B。在小鼠A中通过实施例2（1）中记载的方法接种，在小鼠B中，制备使实施例1（1）[1‑1]〈1‑1‑6〉的m8Δ‑〈高pro〉‑env在PBS中以成为1×109PFU/mL的量溶解的m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液，将10μL（1×107PFU）该溶液用双叉针刺种（初免），然后饲养8周。
（2）加强
在本实施例（1）的小鼠A中，将本实施例（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液10μL（1×107PFU）用双叉针刺种（加强）后，饲养2周。另一方面，在本实施例（1）的小鼠B中，将使实施例1（2）[2‑4]的SeV‑env在PBS中以成为4×109CFU/mL的量溶解而得到的SeV‑env溶液10μL（4×107CFU）经鼻注射（加强）后，饲养2周。
（3）血清的采集
根据常规方法，从本实施例（2）的小鼠A和小鼠B采血，从而分离血清。
（4）酶联免疫吸附实验
[4‑1]env固定平板的制备
制备含有Tris‑HCl（pH7.4）10mmol/L、MgCl23mmol/L、NP400.5%（v/v）的TMN缓冲液。在100mm培养皿中培养至80%汇合的293T细胞中，转染实施例1（3）[3‑3]的DNA‑env并培养2天。将该293T细胞在TMN缓冲液中溶解后，用于超滤，制备除去了分子量小于100kDa的蛋白质的蛋白质溶液。通过将其加入酶联免疫吸附实验用96孔板并温育，得到固定有含env的抗原蛋白质的env固定平板。
[4‑2]使用env固定平板的酶联免疫吸附实验
作为一抗，使用将本实施例（3）的血清分别稀释100倍（1/100）、300倍（1/300）、900倍（1/900）、2700倍（1/2700）的稀释液以及HIV‑1感染者血清（阳性对照），作为二抗，使用偶联辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体或者偶联辣根过氧化物酶的抗人类IgG抗体，以及作为显色试剂，使用TMB ELISA Substrate Solution（eBioscience公司），按照常规方法进行酶联免疫吸附实验，在波长450nm下测定吸光度。其结果示于图5。
如图5左图所示，小鼠A的吸光度在1/100、1/300、1/900以及1/2700的任一个中均为0，未确认到抗env抗体的结合活性。与此相对，如图5右图所示，小鼠B的吸光度在1/100和1/300约为2.4、在1/900约为2.25、在1/2700约为1.5，由此确认到抗env抗体的结合活性。
从这些结果可知，在用表达抗原蛋白质的质粒初免后用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体加强的情况下，体液免疫未被激活，与此相对，在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体加强的情况下，体液免疫被激活。
<实施例5>免疫激活效果的确认：初免：DNA‑env/加强：痘苗病毒载体的共表达载体接种
（1）初免
将15只C57BL/6小鼠分为3组，每组各5只，分别作为对照组、A组和B组。在A组小鼠中用实施例4（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液、在B组小鼠中用实施例3（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm溶液各10μL（1×107PFU）分别用双叉针刺种（初免）后，饲养8周。这里，在对照组小鼠中未接种任何物质。
（2）加强
在本实施例（1）的A组和B组小鼠中，分别将实施例4（2）的SeV‑env溶液各10μL（4×107CFU）经鼻注射（加强）后，饲养2周。
（3）T细胞和血清的采集
从本实施例（2）的各组小鼠采集血清，通过实施例2（3）中记载的方法采集T细胞。
（4）细胞内细胞因子染色和使用FACS对染色细胞数的测定
对于在本实施例（3）中采集的T细胞，通过实施例2（4）和（5）中记载的方法进行细胞内细胞因子染色以及使用FACS对染色细胞数的测定。另外，对于测定的结果，在A组和B组之间进行检验。其结果示于图6。
如图6所示，CD8阳性IFN‑γ产生细胞在对照组中未检出，在A组中作为平均值约为7.2%，在B组中作为平均值约为6%。另外，A组的测定值与B组的测定值之间没有显著差异。
从这些结果可知，在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体或者共表达抗原蛋白质和hCD40Lm的痘苗病毒载体初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体加强的情况下，细胞免疫被激活。另外，使此时的痘苗病毒载体为共表达抗原蛋白质和CD40Lm的病毒载体时，未见细胞免疫激活的增强效果。
（5）酶联免疫吸附实验
在本实施例（3）采集的血清中，对于A组和B组的血清通过实施例4（4）中记载的方法进行酶联免疫吸附实验。另外，对于得到的结果，求得各组的平均值。其结果示于图7左图。
如图7左图所示，A组的吸光度在1/100和1/300约为2.4，在1/900约为2.2，在1/2700约为1.4。另一方面，B组的吸光度在1/100和1/300约为2.4，在1/900约为2.3，在1/2700约为1.95。因此，在A组和B组的任一个中，均确认到抗env抗体的结合活性。另外，确认到与A组相比较，B组的抗env抗体的结合活性大。
（6）TZM‑bI实验
对于在本实施例（3）中采集的各组血清，按照已有报道（J.Vrol.，第79卷，第10108‑10125页，2005年）进行TZM‑bI实验，测定血清中含有的抗env抗体的中和活性。具体的，首先，在100mm培养皿中培养至80%汇合的293T细胞中，转染pCAGGS‑SF162env3.3μg以及携带env基因缺失的HIV‑1基因组的质粒pSG3‑ΔEnv6.6μg并培养48小时后，回收上清，从而得到含有被env的包膜覆盖的假型病毒的假型病毒液。使该病毒液通过0.45μm滤器，在?80℃保存。
接着，在96孔板上培养的TZM‑bI细胞中，加入将假型病毒液5倍系列稀释的液体，培养48小时后，通过用BrightGlo reagent（普洛麦格公司）测定荧光素酶的发光，求得假型病毒液的TCID50。
然后，制备在本实施例（3）中采集的血清的稀释系列，分别加入200TCID50的假型病毒液，从而各制备100μl混合液，在37℃温育1小时。随后，在96孔板上培养至80%汇合的TZM‑bI细胞中加入制备的混合液，培养72小时后，通过用BrightGlo reagent（普洛麦格公司）测定荧光素酶的发光，求得假型病毒对TZM‑bI细胞的感染被50%阻断的血清的稀释倍数（ID50）。其结果示于图7右图。
如图7右图所示，ID50在A组平均值为300，与此相对，在B组平均值为8022，确认到B组的抗env抗体的中和活性明显比A组大。
从这些结果可知，在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体或者共表达抗原蛋白质和hCD40Lm的痘苗病毒载体初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体加强的情况下，体液免疫被激活。另外可知，使此时的痘苗病毒载体共表达抗原蛋白质和CD40Lm时，可增强体液免疫的激活。
<实施例6>免疫激活效果的确认：初免：DNA‑env/加强：痘苗病毒载体的病毒载体混合接种
（1）初免
对于9只C57BL/6小鼠，通过实施例2（1）中记载的方法进行初免。
（2）加强
将本实施例（1）的小鼠分为3组，每组各3只，作为A组、B组以及对照组。另外，将实施例1（1）[1‑2]〈1‑2‑6〉的m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm、实施例1（1）[1‑4]〈1‑4‑5〉的m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm以及实施例1（1）[1‑1]〈1‑1‑2〉的m8Δ‑〈高pro〉，分别在PBS中溶解以成为1×109PFU/mL，制备m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm溶液、m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm溶液以及m8Δ‑〈高pro〉溶液。
在A组、B组以及对照组小鼠中，将本实施例（2）中制备的m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm溶液、m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm溶液和m8Δ‑〈高pro〉溶液、以及实施例4（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液按照如下组合而混合的混合物、各10μL（1×107PFU）分别用双叉针刺种（加强）后，饲养2周。
A组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm溶液
B组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈高pro〉‑hCD40Lm溶液
对照组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈高pro〉溶液
（3）T细胞和血清的采集
根据常规方法从本实施例（2）的各组小鼠采集血清，通过实施例2（3）中记载的方法采集T细胞。
（4）细胞内细胞因子染色以及使用FACS对染色细胞数的测定
对于在本实施例（3）中采集的T细胞，通过实施例2（4）和（5）中记载的方法进行细胞内细胞因子染色以及使用FACS对染色细胞数的测定。其结果示于图8。
如图8所示，CD8阳性IFN‑γ产生细胞在A组中作为平均值约为7%、B组中作为平均值约为3.5%、对照组中作为平均值约为3.2%。
从这些结果可知，在通过用表达抗原蛋白质的质粒初免后用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体加强而使细胞免疫激活的情况下，如果在加强中混合表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体和表达CD40Lm的痘苗病毒载体而接种，则细胞免疫的激活增强。进一步可知，该细胞免疫激活的增强效果，在CD40Lm表达量较高时不能获得，在CD40Lm表达量较低时能够获得。
（5）酶联免疫吸附实验
对于在本实施例（3）中采集的血清，通过实施例4（4）中记载的方法进行酶联免疫吸附实验。A组血清的结果中代表性的结果示于图9。
如图9的代表性的结果所示，A组的吸光度在任一个稀释倍率均为0，未确认到抗env抗体的结合活性。另外，在B组以及对照组也未确认到抗env抗体的结合活性（未图示）。
（6）TZM‑bI实验
对于在本实施例（3）中采集的血清，通过实施例5（6）中记载的方法进行TZM‑bI实验时，在A组、B组以及对照组的任一个的血清中，均未确认到抗env抗体的中和活性（未图示）。
从这些结果可知，在用表达抗原蛋白质的质粒初免后，将表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体和表达CD40Lm的痘苗病毒载体混合而加强的情况下，体液免疫未被激活。
<实施例7>免疫激活效果的确认：初免：痘苗病毒载体/加强：仙台病毒载体的病毒载体混合接种
（1）初免
将15只C57BL/6小鼠分为3组，每组各5只，分别作为对照组、A组和B组。在A组和B组小鼠中，将实施例4（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液、实施例6（2）的m8Δ‑〈高pro〉溶液以及实施例6（2）的m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm溶液按照如下组合而混合的混合物各10μL（1×107PFU）分别用双叉针刺种（初免）后，饲养8周。这里，对照组小鼠没有接种任何物质。
A组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm溶液
B组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈高pro〉溶液
（2）加强
在本实施例（1）的A组和B组小鼠中，将实施例4（2）的SeV‑env溶液各10μL（4×107CFU）分别经鼻注射（加强）后，饲养2周。
（3）T细胞以及血清的采集
从本实施例（1）的各组小鼠采集血清，通过实施例2（3）中记载的方法采集T细胞。
（4）细胞内细胞因子染色和使用FACS对染色细胞数的测定
对于在本实施例（3）中采集的T细胞，通过实施例2（4）和（5）中记载的方法进行细胞内细胞因子染色和使用FACS对染色细胞数的测定。另外，对于测定的结果，在A组和B组之间进行检验。其结果示于图10。
如图10所示，CD8阳性IFN‑γ产生细胞在A组中作为平均值约为12%，在B组中作为平均值约为6%，另一方面，对照组中未检出。另外，确认到A组的测定值与B组的测定值相比明显大。
从这些结果可知，在通过用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体加强而使细胞免疫激活的情况下，如果在初免中将表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体和表达CD40Lm的痘苗病毒载体混合而接种，则细胞免疫的激活增强。
（5）酶联免疫吸附实验
在本实施例（3）采集的血清中，对于A组和B组的血清，通过实施例4（4）中记载的方法进行酶联免疫吸附实验。另外，对于得到的结果，求得各组的平均值。其结果示于图11左图。
如图11左图所示，A组的吸光度在1/100和1/300约为2.4，在1/900约为2.25，在1/2700约为1.6。另一方面，B组的吸光度在1/100约为2.3，在1/300约为2.1，在1/900约为1.6，在1/2700约为0.75。因此，确认到A组比B组的抗env抗体的结合活性大。
（6）TZM‑bI实验
在本实施例（3）采集的血清中，对于A组和B组的血清，通过实施例5（6）中记载的方法进行TZM‑bI实验。另外，对于得到的结果，求得各组的平均值。其结果示于图11右图。
如图11右图所示，ID50在A组中作为平均值为1542.6，与此相对，在B组中作为平均值为1581.6，确认到A组和B组的抗env抗体的中和活性大致相同。
从这些结果可知，在通过用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体加强而使体液免疫激活的情况下，如果在初免中将表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体和表达CD40Lm的痘苗病毒载体混合而接种，则体液免疫的激活增强。
<实施例8>免疫激活效果的确认：初免：痘苗病毒载体/加强：仙台病毒载体的共表达载体接种以及病毒载体混合接种
（1）初免
将25只C57BL/6小鼠分为5组，每组各5只，分别作为对照组、A组、B组、C组以及D组。在A组、B组、C组以及D组小鼠中，将实施例4（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液、实施例6（2）的m8Δ‑〈高pro〉溶液、实施例3（1）的m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm溶液以及实施例6（2）的m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm溶液按照如下组合混合的混合物各10μL（1×107PFU）分别用双叉针刺种（初免）后，饲养8周。这里，对照组小鼠没有接种任何物质。
A组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈低pro〉‑hCD40Lm
B组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液和m8Δ‑〈高pro〉
C组：m8Δ‑〈高pro〉‑env‑hCD40Lm溶液
D组：m8Δ‑〈高pro〉‑env溶液
（2）加强
在本实施例（1）[1‑1]的A组、B组、C组以及D组小鼠中，将实施例4（2）的SeV‑env溶液各10μL（4×107CFU）分别经鼻注射（加强）后，饲养2周。
（3）T细胞和血清的采集
从本实施例（1）[1‑1]的各组小鼠采集血清，通过实施例2（3）中记载的方法采集T细胞。
（4）细胞内细胞因子染色和使用FACS对染色细胞数的测定
将本实施例[1‑3]采集的各组的T细胞各自分为2组。对于其中一组，用作为标记抗体的APC标记的抗小鼠IFN‑γ（APC‑labeled anti‑mouse IFN‑γ，eBioscience公司）以及V450大鼠抗小鼠CD4（V450Rat anti‑mouse CD4，日本BD公司）通过实施例2（4）中记载的方法将CD4阳性IFN‑γ产生细胞染色，对于另一组，用作为标记抗体的PE‑Cy7大鼠抗小鼠IL‑4（PE‑Cy7Rat anti‑mouse IL‑4，日本BD公司）以及V450大鼠抗小鼠CD4（V450Rat anti‑mouse CD4，日本BD公司）通过实施例2（4）中记载的方法将CD4阳性IL‑4产生细胞染色。
接着，通过实施例2（5）中记载的方法，用FACS进行染色细胞数的测定。这里，对于CD4阳性IFN‑γ产生细胞的测定结果在A组和B组、以及C组和D组之间，对于CD4阳性IL‑4产生细胞的测定结果在各组与对照组之间，分别进行检验。其结果示于图12。
如图12左图所示，CD4阳性IFN‑γ产生细胞数在对照组中未检出，另一方面，检出在A组中作为平均值约0.2%，在B组中作为平均值约0.4%，在C组中作为平均值约0.22%，在D组中作为平均值约0.35%。另外，如图12右图所示，CD4阳性IL‑4产生细胞的平均荧光强度在A组中作为平均值约为23，在B组中作为平均值约为19，在C组中作为平均值约为29，在D组中作为平均值约为17，在对照组中作为平均值约为10。
从这些结果可知，在用表达抗原蛋白质的痘苗病毒载体初免后用表达抗原蛋白质的仙台病毒载体加强的情况下，如果在初免中通过混合接种或者共表达而表达CD40Lm时，与不表达CD40Lm时相比，CD4阳性IFN‑γ产生细胞减少，而CD4阳性IL‑4产生细胞有所增加。