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1、(10)申请公布号 CN 103103143 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103103143 A *CN103103143A* (21)申请号 201110353746.7 (22)申请日 2011.11.10 C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01) (71)申请人 中国石油化工股份有限公司 地址 100728 北京市朝阳区朝阳门北大街 22 号 申请人 中国石油化工股份有限公司抚顺石 油化工研究院 (72)发明人 孙丹凤 高会杰 李志瑞 张鹏 李宝忠 (54) 发明名称 一种硝化菌保藏方法 (57) 摘要 本发明涉及一种硝化菌保藏方。
2、法， 包括 ：（1） 将硝化菌体培养至生长稳定期， 并收集硝化菌 ； （2）配制硝化菌保藏营养液 ；（3）步骤 （1）收集 的硝化菌与步骤 （2） 配制的硝化菌保藏营养液混 合， 含水率为 40% 80%， 含水率指菌体湿重和培 养液体积比 ；（4） 添加保藏剂 ；（5） 冷冻保藏。 与现 有技术相比本发明方法适宜于大量保存硝化菌， 具有方法简单和存活率高等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103103143 A CN 103103143 A *C。
3、N103103143A* 1/1 页 2 1. 一种硝化菌保藏方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 将硝化菌体培养至生长稳定期， 并收集硝化菌 ； （2） 配制硝化菌保藏营养液 ； （3） 步骤 （1） 收集的硝化菌与步骤 （2） 配制的硝化菌保藏营养液混合， 含水率为 40% 80%， 含水率指菌体湿重和培养液体积比 ； （4） 添加保藏剂 ； （5） 冷冻保藏。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 的硝化菌体培养采用间歇式活性 污泥法。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 的硝化菌体培养温度为 15 40， pH 值为 7.0。
4、-8.5， 溶解氧 DO 为 1-5mg/L， 培养 10-20 天。 4.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 硝化菌体培养至生长稳定期 后， 通过沉降、 过滤或离心方法收集获得硝化菌。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2）中， 所述的营养液中含有 （NH4)2SO4， 同时含有微量物质 FeSO4、 KH2PO4、 MgCl2和 CaCl2。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中， 硝化菌与营养液混合物中， NH4+-N 浓度为 0.1 1.5g/L， Fe2+浓度为 0.01 0.06g/L， K+浓。
5、度为 0.05 0.5g/L， Ca2+ 浓度为 0.01 0.1g/L， Mg2+浓度为 0.05 0.5g/L。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中， 保藏剂是本领域应用的常规 的保藏剂。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中， 保藏剂是二甲亚砜。 9. 根据权利要求 1、 7 或 8 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中， 保藏剂用量为硝化菌 加入营养液后混合物体积的 2%5%。 10. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 方 法， 其 特 征 在 于 ： 步 骤 （5）中， 冷 冻 保 藏 温 度 为 。
6、-20 -70之间。 权 利 要 求 书 CN 103103143 A 2 1/4 页 3 一种硝化菌保藏方法 技术领域 0001 本发明涉及一种菌体保存方法， 具体涉及一种简单有效的低温冷冻保藏硝化菌种 的方法。 背景技术 0002 菌种是主要的生物资源之一， 一个优良的菌种被选育出来以后， 必须保持其优良 性状不变或尽可能地少变慢变， 才不至于降低菌体性能， 能长期在生产中应用。 菌种保藏方 法有很多， 冰冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径， 但传统的低 温保存需要昂贵的程序降温仪器， 步骤繁琐。 完全玻璃化是低温保存的一种新方法， 即在高 浓度保护剂下， 细胞连同保护。
7、剂于快速降温中都进入玻璃化状态， 避免胞内冰晶形成， 使器 官和组织各部分都进入相同的状态， 比其它低温保存方法具有设备简单、 程序简单和冻存 效果好等优点， 在保存器官和组织的结构完整性方面有独到之处。 0003 微生物菌种保藏的基本原理主要是根据微生物生理生化特点， 人工创造条件， 使 微生物代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态， 即采取低温、 干燥、 缺氧等条件， 使菌 种暂时处于休眠状态。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变， 同 时还需考虑到方法本身的简便和经济， 以便生产上能推广使用。 0004 为了有效地保藏微生物菌种， 首先需要有良好的培养基。 因此， 。
8、研究选用适宜的培 养基是微生物菌种保藏最基本的工作。 0005 人们在长时间的工作实践中， 根据微生物的不同要求， 在菌种保藏工作中不断摸 索出各种方法。CN01810856.3 采用高温冷冻法低温保藏生物活性物质， 通过制备要冷冻 的可存活的生物材料、 将其浸入装有冷却液的容器中、 并以基本上恒定的预定速率和温度 使冷却液环流通过该生物材料， 使其冷冻， 从而将存活的生物材料进行低温保藏 ( 低温保 存 )。该方法以足够快的速率冷冻生物材料， 以避免在细胞结构内形成冰晶， 冷却液的温度 较佳为 20到 30， 这个温度范围足够使细胞膜中由于热变化而导致的应力破坏的 形成减少到最小程度。采用该。
9、方法冷冻的细胞只具有约 80的存活率。 0006 CN200810124325.5 提供了一种菌种保藏方法， 采用半固体、 低温密封培养的方法 ： 将菌种接种于无菌的半固体培养基中， 倒入无菌液体石蜡后竖直存放入 6 8的环境温 度中保存。 所述菌种为金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌、 生孢梭 菌、 黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为 ： 制备半固体培养基， 分装、 灭菌， 然后培养 2 3 天， 确定无菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中， 平行于培养基平面穿刺接种不少于 3 点。 倒入 1 2cm 高的无菌液体石蜡， 用封口膜密封， 竖直存放入 6 8的电冰箱中保存。。
10、采 用此发明可延长菌种的保存时间， 同时菌种的浓度保持相对稳定， 为生产、 试验节约了大量 的成本， 减少了菌种使用后废弃物的处理和排放， 减少了对环境的危害。但是工序复杂繁 琐， 不适合大量菌体的保存。 0007 CN00107965.4 公开了一种制作纤维素酶粉剂用于保藏的方法， 它包括选取菌种， 在试管、 三角瓶中培养、 种子罐中搅拌培养， 将 2% 木糖渣、 0.5营养盐、 0.05微量元素、 说 明 书 CN 103103143 A 3 2/4 页 4 种子罐中培养的菌种放入 5M3发酵罐中搅拌发酵培养， 将搅拌发酵后的发酵液进行压滤， 将 压滤后的物料进一步超滤浓缩， 超滤浓缩后添。
11、加 5% 的甘油保护剂制成液体纤维素酶制剂， 喷雾干燥后制成粉剂 ； 该生产工艺简单， 操作实施方便， 原料来源广泛， 生产成本低， 无污 染 ； 但是不适用于硝化菌的大量保存。 0008 CN101003791 公开了一种用毛细玻璃管玻璃化冷冻保存胚胎和卵母细胞的方法， 属胚胎生物技术领域。该方法使用高硼硅毛细玻璃管， 具体操作步骤包括 ： ( 一 ) 冷冻液体 的配置 ； ( 二 ) 冷冻 ； ( 三 ) 解冻液体的配置 ； ( 四 ) 解冻。该方法不适合应用于类似于硝化 菌等需要大量保藏的菌体。 0009 CN201010299763.2 提供了一种冷冻保存红细胞的方法， 向红细胞中加入。
12、还原剂 和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐 ； 还原剂为抗坏血酸或 抗坏血酸盐、 半胱氨酸盐酸盐或 N- 乙酰半胱氨酸、 硼氢化钠、 亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦 亚硫酸钠、 还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物， 还原剂终浓度各 为 0.5 300mM ； 甘油的量以终体积比计为 5 10 ； 乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐 的终浓度为 0.1 10mM ； 充分混匀并调节酸度值至 6.5 8.0， 将容器封口， 静置 1 小时 后在 -40以下冷冻保存。以该方法冷冻保存的红细胞， 一年后解冻， 红细胞破碎率大于 95， 血红蛋白无变性， 未被氧化为高铁血红。
13、蛋白。此种方法适合细胞保藏法， 不适合菌种 活性的保藏。 发明内容 0010 针对现有技术的不足， 本发明提供一种硝化菌保藏方法， 适宜于大量保存硫化菌， 具有方法简单和存活率等优点。 0011 本发明硝化菌保藏方法， 包括如下步骤 ： （1） 将硝化菌体培养至生长稳定期， 并收集硝化菌 ； （2） 配制硝化菌保藏营养液 ； （3） 步骤 （1） 收集的硝化菌与步骤 （2） 配制的硝化菌保藏营养液混合， 含水率为 40% 80%， 含水率指硝化菌保藏体系中水的重量含量 ； （4） 添加保藏剂 ； （5） 冷冻保藏。 0012 本发明步骤 （1） 的硝化菌体培养采用本领域常规的方法， 如采用间歇。
14、式活性污泥 法等。 可以采用人工配置的培养液， 也可以采用废水对硝化菌进行培养， 培养液所含成分主 要为铵盐， 氨氮浓度为 200 1500mg/L， 还有少量 Fe2+、 Mg2+、 K+、 Ca2+等金属离子以及磷酸根 离子等。硝化菌体培养的硝化菌初始来源可以是任意的需要保藏的硝化菌。硝化菌体培养 至生长稳定期， 此时是指菌体适宜保藏的生长期， 通过沉降、 过滤、 离心等方法收集获得的 硝化菌。 0013 本发明步骤 （2） 中， 所述的营养液中含有的铵盐为 （NH4)2SO4， 含有微量物质 FeSO4、 KH2PO4、 MgCl2和 CaCl2。各种物质的用量按步骤 （3） 中所需有浓。
15、度确定。 0014 本发明步骤 （3） 中， 硝化菌与营养液混合物中， NH4+-N 浓度为 0.1 1.5g/L， Fe2+ 浓度为 0.01 0.06g/L， K+浓度为 0.05 0.5g/L， Ca2+浓度为 0.01 0.1g/L， Mg2+浓度 为 0.05 0.5g/L。 说 明 书 CN 103103143 A 4 3/4 页 5 0015 本发明步骤 （4） 中， 所述的保藏剂可以是本领域应用的所有常规的保藏剂， 优选二 甲亚砜， 使用量为硝化菌加入营养液后混合物体积的 2%5%。 0016 本发明步骤 （5） 中， 冷冻保藏温度为 -20 -70之间。可以采用本领域常规的 。
16、冷冻设备。 0017 本发明方法通过从菌体培养、 含水率、 营养液、 保护剂等方面进行优化考察， 得到 了最适宜的硝化菌低温冷冻保藏方法。本发明方法可以延长菌种的保存时间， 同时使菌种 的活性保持相对的稳定， 菌体保藏后优良性状好， 菌体活性恢复迅速， 对于大量菌体保藏经 济方便的特性， 为生产、 试验节约成本。本发明方法简单， 不需特殊设备， 保藏方法方便快 捷， 适合大量菌种保藏， 存活率到可以达到 90% 以上。 具体实施方式 0018 本发明的一种具体实施过程如下 ： （1） 利用适宜的培养液， 在温度 15-40， pH 为 7.0-8.5， 溶解氧 DO 为 1-5mg/L 的条件。
17、 下将硝化菌培养 10-20 天至生长稳定期， 然后进行菌体分离。 0019 （2） 菌悬液的含水率对于胞内外冰晶的形成有影响， 进而影响保藏效果， 因此需 要适宜的含水率。菌体培养液的初始含水量较高， 因此需要降低菌体含水率。 0020 （3） 营养物质是菌体生存的必备条件， 可使菌体在低温冰箱中保藏若干年， 而不 影响其活性， 需要按照适宜的营养物质浓度加入保藏所需的营养液。 0021 （4） 保藏剂可以是本领域应用的所有保藏剂， 优选二甲亚砜 C2H6SO 作冷冻保护 剂。二甲亚砜是一种渗透性保护剂， 对细胞无毒性， 分子量小， 溶解度好， 能迅速透入细胞， 降低冰点， 提高细胞膜对水的。
18、通透性， 延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结之前透出细胞 外， 在胞外形成冰晶， 提高细胞内的电解质浓度， 减少胞内冰晶， 从而减少冰晶对细胞冻伤。 加入一定配比的冷冻保护剂， 使用量为加入营养液后待保藏菌体体积的 2%5%。 0022 （5） 低温冰箱冻存 ： 低温冷冻是在 -20至 -70之间。保藏 3-5 年能力后， 考察 菌体存活率和恢复能力时间。菌体生长速率在一个星期内恢复至保藏前。 0023 实施例 1 配制进水氨氮浓度为300mg/L的培养液， 在100L生物曝气反应池中采用间歇式活性污 泥法对硝化菌进行培养， 温度 27， pH 为 7.8， 溶解氧 DO 为 2.5-3.5。
19、mg/L。当菌体进入稳定 生产期后停止培养， 沉降或离心后进行多次洗涤， 降低硝化产物浓度。按照 50% 的含水率， 菌体与配制的营养液混合， 摇匀后加入 3% 的保护剂二甲基亚砜， 于 -50低温冰箱保藏。2 年后取出考察菌体的活性和存活率， 经过 3d 的恢复， 菌体的活性可完全恢复， 存活率可达 95%。 0024 营养物质在最终混合物中的浓度为 ： 0.3g/L 的 NH4+-N， 0.02g/L 的 Fe2+， 0.1g/L 的 Mg2+， 0.1g/L 的 K+， 微量 Ca2+等。 0025 实施例 2 配制进水氨氮浓度为600mg/L的培养液， 在100L生物曝气反应池中采用间。
20、歇式活性污 泥法对硝化菌进行培养， 温度 30， pH 为 8.0， 溶解氧 DO 为 1.5-3.0mg/L。当菌体进入稳定 生长期后停止培养， 沉降或离心后进行多次洗涤， 降低硝化产物浓度。按照 60% 的含水率， 菌体与营养液 （营养物质浓度与实施例 1 相同） 混合， 摇匀后加入 5% 的保护剂二甲基亚砜， 说 明 书 CN 103103143 A 5 4/4 页 6 于 -60低温冰箱保藏。4 年后取出考察菌体的活性和存活率， 经过 5d 的恢复， 菌体的活性 可完全恢复， 存活率可达 90%。 0026 实施例 3 配制进水氨氮浓度为400mg/L的培养液， 在100L生物曝气反应池中采用间歇式活性污 泥法对硝化菌进行培养， 温度 37， pH 为 7.8， 溶解氧 DO 为 0.5-1.5mg/L。当菌体进入稳定 生长期后停止培养， 沉降或离心后进行多次洗涤， 降低硝化产物浓度。按照 70% 的含水率， 菌体与营养液 （营养物质浓度与实施例 1 相同） 混合， 摇匀后加入 5% 的保护剂二甲基亚砜， 于 -70低温冰箱保藏。5 年后取出考察菌体的活性和存活率， 经过 7d 的恢复， 菌体的活性 可完全恢复， 存活率可达 90%。 说 明 书 CN 103103143 A 6 。