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1、(10)申请公布号 CN 103146744 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146744 A *CN103146744A* (21)申请号 201310060570.5 (22)申请日 2013.02.26 C12N 15/82(2006.01) (71)申请人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 李向东 高瑞 丛倩倩 许斐斐 郭兆奎 李现道 竺晓平 (54) 发明名称 一种植物病毒接种方法 (57) 摘要 本发明提供了一种新的植物病毒接种方法， 具体是利用细菌在田间大规模接种病毒的方法， 主要针对能在农杆菌中复制的植物。
2、病毒侵染性克 隆， 其原理是将植物病毒的侵染性克隆转化农杆 菌， 利用农杆菌可以通过自然孔口和伤口侵染植 物这一特性， 将病毒带入植物细胞。 本方法操作简 单、 成本低、 效率高， 适合在田间大规模应用， 可用 来接种病毒的弱毒株系， 以保护植株免受强毒株 系的侵染， 也可以利用病毒载体在植物体内表达 高附加值的外源蛋白。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103146744 A CN 103146744 A *CN10314674。
3、4A* 1/1 页 2 1. 一种接种植物病毒的方法， 其特征在于 ： 将待接种病毒的侵染性克隆转化农杆菌， 农杆菌培养后离心收集菌体， 将其稀释到 OD600 为 0.5-1.0， 通过叶面喷施农杆菌接种植物 病毒。 2. 如权利要求 1 所述方法在表达外源蛋白以及利用弱毒株系保护植株免受强毒株系 侵染方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 103146744 A 2 1/3 页 3 一种植物病毒接种方法 技术领域 0001 本发明属于植物保护和基因工程领域， 提供了一种新的植物病毒接种方法， 具体 地说是一种利用农杆菌在田间大规模接种病毒的方法。 背景技术 0002 通过基因工程手段， 可。
4、以构建植物病毒的侵染性 cDNA 克隆。利用侵染性 cDNA 克 隆， 可以研究明确病毒的致病机理， 进而可以把该克隆改造成弱毒疫苗， 通过交叉保护来保 护植株免受强毒株系的侵染 ； 也可以把病毒的侵染性克隆改造为表达载体， 用来生产动物 疫苗、 抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。 目前， 研制开发的弱毒株系和表达载体已经越来 越多。 0003 限制弱毒株系和表达载体应用的瓶颈是大规模接种技术。 根据侵染性克隆的不同 特点， 室内试验可以通过摩擦接种， 基因枪接种或者是农杆菌浸润等方法接种试验植物。 基 因枪接种需要有专门的仪器， 操作比较复杂， 有的还需要抽真空， 每批次能接种的植株数量 很少。
5、。摩擦接种和农杆菌浸润不需要复杂的仪器， 但每人每天接种的植株数量也有限。因 此， 这些方法只适合在实验室内应用， 不适合在田间大规模地接种试验植物。 0004 在实际应用中急需开发适合植物病毒弱毒株系和表达载体大规模接种的方法。 发明内容 0005 针对现有接种方法无法满足田间大规模接种应用的需要这一问题， 本发明提供了 一种利用农杆菌在田间大规模接种病毒的方法， 其包括如下步骤 ： 将病毒的侵染性克隆转 化农杆菌， 经过培养后离心收集菌体， 适当稀释后， 将菌体喷布到叶片表面 ； 农杆菌可以通 过气孔和伤口侵染植物， 从而将病毒带入植物细胞。 本方法操作简单、 成本低、 效率高， 适合 在。
6、田间大规模接种病毒。 本方法操作简单、 成本低、 效率高， 适合在田间大规模接种病毒， 可 用来接种病毒的弱毒株系， 以保护植株免受强毒株系的侵染， 也可以利用病毒在植物体内 表达抗病毒蛋白或生产疫苗。 0006 之所以采用这种方式， 发明人主要是利用了农杆菌在自然界可以通过自然孔口 （如气孔） 和伤口侵入植物这一现象。本发明利用农杆菌的这一特点， 将病毒基因组连接到 合适的穿梭载体中， 转化农杆菌， 农杆菌通过气孔和伤口侵染植物， 从而把病毒基因组带到 植物细胞中中， 使病毒在植物细胞内增殖。 农杆菌可以用叶片喷雾的方式， 解决了大规模接 种病毒的技术问题， 克服了限制弱毒疫苗使用的瓶颈问题。
7、。 0007 本发明实施的具体技术方案是 ： 0008 一种接种植物病毒的方法， 其特征在于 ： 将待接种病毒的侵染性克隆转化农杆菌， 农杆菌培养后离心收集菌体， 将其稀释到 OD600 为 0.5-1.0， 通过叶面喷施农杆菌接种植物 病毒。喷雾时要兼顾到叶片的正反两面， 喷雾器的喷嘴距叶片 10 30 厘米。 0009 其中所述的病毒可以是能够在农杆菌内繁殖的侵染性克隆。 0010 综上所述， 本发明提供了一种全新的植物病毒接种方法。本方法操作简单、 成本 说 明 书 CN 103146744 A 3 2/3 页 4 低、 效率高， 不需要特殊的仪器设备， 利用普通的喷雾器就可以完成， 适。
8、合在田间大规模接 种病毒， 可用来接种病毒的弱毒株系， 以保护植株免受强毒株系的侵染， 也可以利用病毒在 植物体内表达抗病毒蛋白或生产疫苗， 使用简单方便， 成本低效率高， 适合在科研温室、 育 苗公司的育苗棚或大田应用。 附图说明 0011 图 1 为采用本发明喷雾接种烟草脉带花叶病毒 8 天后烟草的感染情况， 0012 图中普通烟叶片出现病毒的侵染点， 且病毒已经移动到叶脉 ； 0013 图 2 利用本方法接种病毒载体表达外源蛋白后的结果示意图， 0014 图中喷雾接种 10 天后， 外源蛋白 GFP 在本氏烟中得到大量表达， 植株上部叶片在 紫外灯下表现出强烈的绿色荧光 （右） 。左图显。
9、示喷雾接种的病毒通过叶脉近、 叶柄移动到 其它部位 ； 0015 图 3 用本方法接种的弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果示意图， 0016 图中 A 为先用喷雾法接种弱毒株系然后再接接种强毒株系的植株， 0017 B 为直接接种强毒株系的植株， 0018 图中可见先用喷雾法接种弱毒株系的植株几乎看不到症状， 而直接接种强毒株系 的植株产生严重的花叶症状 ； 0019 0020 0021 具体实施方式 0022 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容做进一步的详细说 明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。。
10、 0023 实施例 1 ： 通过农杆菌喷雾表达外源蛋白 ( 以 GFP 为例 ) 0024 1. 病毒侵染性克隆转化农杆菌， 采取液氮冻融法。 0025 从 -80冰箱中取出 1 管农杆菌 GV3101 的感受态细胞 （100-200l） ， 冰上解冻。 解冻后加入 100-300ng 病毒侵染性克隆 pCamTVBMV-GFP。放入液氮中冷冻 1-5min。取出后 立即放入 37水浴中 5min。 0026 加入 800l 无抗生素的 LB 培养液， 28摇床培养 3h。5000r/min 离心收集菌体， 离心管中保留约 200l 培养液并重新悬浮菌体。 0027 在超净台上将菌体均匀涂布于。
11、含相应抗生素的固体培养基平板， 28培养 2 天左 右， 直至出现菌落。挑取菌落进行 PCR 鉴定， 证明菌落中含有质粒 pCamTVBMV-GFP。 0028 2. 农杆菌的培养 0029 经菌落 PCR 验证后， 挑单斑接种于含有 50g/ml 卡那霉素、 50g/ml 利福霉素和 5g/ml 四环素的 5ml 液体 LB 中。28振荡培养 24 小时。 0030 取 1ml 菌液加至 100ml 含 10mmol/L2-(N- 吗啉） - 乙基磺酸和 20mol/L 乙酰丁香 酮 （AS） 及与上步相同抗生素的 LB 培养基中， 于 28振荡培养 24 小时。10000r/m 离心 1 。
12、分 钟， 收集菌体， 重新悬浮于农杆菌菌体重悬溶液 （10mmol/L MgCl2， 10mmol/L MES， 0.15mmol/ 说 明 书 CN 103146744 A 4 3/3 页 5 L AS） 中， 调整浓度使其 OD600 为 0.5-1.0 左右， 室温静置 3h。 0031 3. 接种寄主植物及外源蛋白表达 0032 将携带侵染性克隆 pCamTVBMV-GFP 的农杆菌菌体悬浮液装入小喷壶， 选取 2-3 片 真叶的普通烟和本氏烟植株， 于叶正反两面均匀喷施， 喷雾器的喷嘴距叶片 10 30 厘米。 处理完的植株放在 23光照培养箱中培养 （16h 光照 /8h 黑暗交替。
13、） 。4 天后开始每天在紫 外灯下观察绿色荧光的有无和强弱。 0033 结果表明，（1） 本氏烟叶片在喷雾接种 5 天后， 在紫外灯下可以看到明显的绿色荧 光， 而普通烟叶片上在喷雾接种 8 天后可看到绿色荧光 （图 1） ；（2） 喷雾接种 10 天后， 本氏 烟上部叶片上会出现很强的绿色荧光 （图 2） ， 说明 GFP 在本氏烟叶片中得到了大量表达。 0034 实施例 2 ： 通过农杆菌喷雾接种病毒的弱毒株系 0035 1. 病毒侵染性克隆转化农杆菌， 采取液氮冻融法。 0036 从 -80冰箱中取出 1 管农杆菌 GV3101 的感受态细胞 （100-200l） ， 冰上解冻。 解冻后。
14、加入 100-300ng TVBMV 弱毒株系 D198K 的质粒。放入液氮中冷冻 1-5min。取出后立 即放入 37水浴中 5min。 0037 加入 800l 无抗生素的 LB 培养液， 28摇床培养 3h。 0038 5000r/min 离心收集菌体， 离心管中保留约 200l 培养液并重新悬浮菌体。 0039 在超净台上将菌体均匀涂布于含相应抗生素的固体培养基平板， 28培养 2 天左 右， 直至出现菌落。挑取菌落进行 PCR 鉴定。 0040 2. 农杆菌的培养 0041 经菌落 PCR 验证后， 挑单斑接种于含有 50g/ml 卡那霉素、 50g/ml 利福霉素和 5g/ml 四。
15、环素的 5ml 液体 LB 中。28振荡培养 24 小时。 0042 取 1ml 菌液加至 100ml 含 10mmol/L2-(N- 吗啉） - 乙基磺酸和 20mol/L 乙酰丁香 酮 （AS） 及与上步相同抗生素的 LB 培养基中， 于 28振荡培养 24 小时。10000r/m 离心 1 分 钟， 收集菌体， 重新悬浮于农杆菌菌体重悬溶液 （10mmol/L MgCl2， 10mmol/L MES， 0.15mmol/ L AS） 中， 调整浓度使其 OD600 为 0.5-1.0 左右， 室温静置 3h。 0043 3. 接种寄主植物及交叉保护效果 0044 将携带 TVBMV 弱毒。
16、株系 D198K 的农杆菌菌体悬浮液装入小喷壶， 选取 2-3 片真叶 的普通烟植株， 于叶表正反两面均匀喷施。处理完的植株放置 23光照培养箱中培养 （16h 光照 /8h 黑暗交替） 。15 天后摩擦接种 TVBMV 强毒株系， 再过 20 天后观察症状。 0045 结果发现， 接种强毒株系 20 天后， 直接接种强毒株系的烟草叶片上表现出严重的 脉带花叶症状， 而先接种弱毒株系 D198K 再接种强毒株系的烟草叶片上没有明显症状 （图 3） ， 弱毒株系对强毒株系表现出良好的交叉保护效果。说明通过农杆菌喷雾接种植物病毒 的弱毒株系是可行的。 说 明 书 CN 103146744 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146744 A 6 2/2 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 103146744 A 7 。