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1、(10)申请公布号 CN 103173494 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173494 A *CN103173494A* (21)申请号 201310053160.8 (22)申请日 2009.09.29 200910167813.9 2009.09.29 C12N 15/861(2006.01) A61K 48/00(2006.01) (71)申请人 成都康弘生物科技有限公司 地址 610036 四川省成都市金牛区蜀西路 36 号 (72)发明人 杨艳艳 付竞峰 (54) 发明名称 一种含有重组腺病毒的制剂 (57) 摘要 本发明涉及一种含有重组腺病毒的制剂， 。
2、所 述制剂由重组腺病毒、 缓冲液或缓冲体系和保 护剂组成， 其中， 所述的缓冲液或缓冲体系选自 Tris-HCl 缓冲液、 磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液、 精氨酸 - 盐酸的任一种 ； 所述的保护剂选自丙二 醇、 聚乙二醇400或二甲基亚砜。 本发明制剂具有 组分简单， 不含有二价阳离子盐和非离子表面活 性剂， 如MgCl2和吐温-80等， 却能在28甚至 室温很好保存腺病毒， 并使其具有良好的稳定性 等突出优点。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 (10)。
3、申请公布号 CN 103173494 A CN 103173494 A *CN103173494A* 1/1 页 2 1. 一种含有重组腺病毒的制剂， 所述制剂由重组腺病毒、 缓冲液和聚乙二醇 -400 组 成， 其中， 所述的缓冲液选自 Tris-HCl 缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 精氨酸 - 盐酸 缓冲液的任一种或其组合。 2. 根据权利要求 1 所述的制剂， 所述缓冲液的 pH 为 7.4-8.6。 3. 根据权利要求 1 所述的制剂， 所述制剂中聚乙二醇 -400 的浓度为 5-20w/v。 4. 根据权利要求 3 所述的制剂， 所述制剂中聚乙二醇 -400 的浓度为 1。
4、0-20w/v。 5. 根据权利要求 1-4 任一项所述的制剂， 所述缓冲液的浓度为 10-100mM。 6. 根据权利要求 5 所述的制剂， 所述制剂由重组腺病毒、 50mM 缓冲液和 10聚乙二 醇 -400 的组成， pH 为 7.8， 其中， 所述的缓冲液选自 Tris-HCl 缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸 缓冲液、 精氨酸 - 盐酸缓冲液的任一种。 权 利 要 求 书 CN 103173494 A 2 1/10 页 3 一种含有重组腺病毒的制剂 技术领域 0001 本发明涉及重组腺病毒， 尤其涉及一种含有重组腺病毒的制剂。 背景技术 0002 根据国家食品药品监督管理局发布的 关。
5、于发布化学药品注射剂和多组分生化药 注射剂基本技术要求的通知 （国食药监注 【2008】 7 号） 中规定辅料选用的基本原则 ： 在满 足需要的前提下， 注射剂所用辅料的种类及用量应尽可能少。 重组腺病毒作为临床药物， 在 能维持其稳定性的前提下， 原则上要求制剂辅料种类和用量越少越好。 0003 已报道的现有技术中， 美国专利 US2006/0205080A1 公开了一种包含 Tris-HCl、 MgCl2、 甘氨酸和选自丙二醇、 DMSO、 PEG、 蔗糖、 甘油、 四氢呋喃、 乙二醇醚的含水共溶剂的组 合物， 该制剂可在 2 8较好地保持腺病毒的活性， 但该组合物中的组分较多， 导致产品。
6、 生产较为复杂， 甚至加大基因治疗药物的安全性风险。 0004 此外， 中国专利 CN101163794A 公开了一种腺病毒组合物， 该组合物包含腺病毒颗 粒及能维持pH在8.0-9.6的缓冲液和甘油， 具有组分简单的优点， 但其在28条件下长 期保存腺病毒的稳定性不理想。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种含有重组腺病毒的制剂， 该制剂由包括重组腺病毒、 缓冲液或缓冲体系、 阻止腺病毒发生物理或化学变化而失活的保护剂组成， 所述的缓冲液 或缓冲体系选自 Tris-HCl 缓冲液、 磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液、 精氨酸 - 盐酸的任一种或 其组合 ； 适合于本发明的保护剂选自丙二醇、 。
7、聚乙二醇 400 或二甲基亚砜的任一种或其组 合。 0006 进一步， 所述的缓冲液或缓冲体系的 pH 为 7.4-8.6。 0007 进一步， 所述的缓冲液或缓冲体系为精氨酸 - 盐酸缓冲液。 0008 进一步， 所述的缓冲液或缓冲体系为 Tris-HCl 缓冲液。 0009 进一步， 所述的缓冲液或缓冲体系为磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液。 0010 进一步， 所述的多羟基化合物为丙二醇， 进一步， 本发明制剂中丙二醇的浓度为 5-20w/v%， 优选为 10-20w/v。 0011 本发明可根据稳定维持腺病毒活性的需要， 调整和选择所需的缓冲液浓度。本发 明制剂中缓冲液的浓度为10-100mM。
8、， 所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、 磷酸氢二钠柠檬 酸缓冲液、 精氨酸 - 盐酸的任一种。这样的选择可以取得令人满意的保存结果。 0012 本发明的制剂由重组腺病毒、 10-50mM 缓冲液和 10% 丙二醇的组成， pH 为 7.8 ； 所 述的缓冲液选自 Tris-HCl 缓冲液、 磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液、 精氨酸 - 盐酸的任一种。 0013 本发明的磷酸氢二钠柠檬酸和精氨酸-盐酸缓冲液不仅具有很好的缓冲作用， 还对腺病毒具有一定程度的保护作用。 0014 本发明的制剂具有组分简单， 不含有二价阳离子盐和非离子表面活性剂， 如 MgCl2 说 明 书 CN 103173494 。
9、A 3 2/10 页 4 和吐温 -80 等， 也能在 2 8甚至室温很好保存腺病毒， 并使其具有良好的稳定性等突出 优点。 0015 本发明制剂主要应用于保存基因治疗的重组腺病毒， 还可应用于保存任何野生型 腺病毒或其他用途的重组腺病毒。具体地说， 包括所有利用重组 DNA 技术构建的复制缺陷 型腺病毒或增殖型腺病毒， 以及所有的人或动物的野生型腺病毒或其突变腺病毒。 0016 采用国际通用的 TCID50 法检定的病毒滴度值和紫外法检定的病毒颗粒数之比值 （即比活度） 来评价本发明的重组腺病毒的稳定性。 0017 本发明采用 TCID50 方法测定重组腺病毒滴度， 其原理是 ： 将经过系列。
10、稀释的病毒 样品感染 293 细胞， 将每个稀释度所感染一定数量的细胞孔培养 10 天， 在显微镜下观察各 细胞孔中的细胞状况， 统计病变细胞孔， 利用 TCID50 计算公式， 计算病毒滴度。 0018 TCID50/ml=10-L-d(s-0.5)+b 0019 其中， L ： 为最低稀释度的对数 ； d ： 为稀释对数之间的差 ； s ： 为病变阳性孔比率之 和 ； b ： 为病毒接种量， 换算为每毫升体积的倍数的对数。 0020 本发明采用分光光度法检测腺病毒的颗粒数， 其原理是 ： 理论上， 野生型 5 型腺 病毒的成分是 87% 蛋白质和 13%DNA。因此， 腺病毒颗粒的浓度可直。
11、接用紫外分光光度计 测量。蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基在 277nm 处有紫外吸收， 而双链线性 DNA 在 260nm 有 最大吸收值。本法采用含有 0.1%SDS（十二烷基硫酸钠） 的制剂缓冲液， 将病毒衣壳分解 成蛋白质和 DNA， 再利用双链线性 DNA 在 260nm 处具有最大吸收值， 在有去垢剂时， 颗粒 浓度与 260nm 吸光值成比例， 用分光光度计于 260nm 处测定供试品的吸光度值， 采用公式 （1AU=1.11012VP/mL） 计算病毒颗粒数。测试病毒颗粒数的适用范围为供试品病毒颗粒数 21011VP/mL。 0021 本发明重组腺病毒稳定性的最终的判断指标为， 根据。
12、检测所得病毒滴度和颗粒数 计算所得的病毒比活度， 即病毒比活度 = 病毒滴度 / 病毒颗粒数 100%。 0022 国家药品食品监督管理局 （SFDA） 在 人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原 则 中规定， 临床重组腺病毒比活度应高于 3.3% ； 张晓志等 （ 中华医学杂志 ， 2004 年， 第 84 卷第 10 期） ， 在 “重组腺病毒临床级基因治疗制品的质量控制” 中提到， 评价腺病毒制剂的 稳定性时， 制剂中腺病毒的比活度应该大于 3.3%。 ” 0023 除非另有说明， 本发明所述百分含量均为重量体积百分含量。 0024 本发明的重组腺病毒的制备方法可以采用本领域通常的重组腺。
13、病毒制备方法所 得， 一般来说包括细胞复苏、 种子细胞制备、 病毒感染、 扩增、 细胞裂解、 澄清过滤、 浓缩换 液、 原液制备等过程 0025 本发明的重组腺病毒制剂的制备方法可以采用本领域通常制备重组腺病毒的方 法， 一般来说包括如下步骤 ： 将原液进行换液、 检测浓度、 用配比好浓度的制剂辅料进行稀 释、 除菌、 分装得到成品。 0026 本发明的另一目的在于提供重组腺病毒制剂用于制备基因治疗药物中的应用。 0027 与现有技术相比， 本发明的重组腺病毒制剂具有下述优点 ： 0028 本发明的重组腺病毒制剂不仅可以很好保存重组腺病毒的活性， 有效地防止腺病 毒的聚集或分裂， 而且组分简单。
14、， 不含有二价阳离子盐， 如 MgCl2， 利于重组腺病毒的生产和 临床使用。 因而， 本发明的重组腺病毒制剂不仅可以良好保存重组腺病毒及其其他腺病毒， 说 明 书 CN 103173494 A 4 3/10 页 5 还具有易于生产控制和产业化， 制造成本低， 制剂安全性更高更好等优点。 本发明的制剂在 重组腺病毒的保存上具有突出的优势。 具体实施方式 0029 以下将结合实施例具体说明本发明， 本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方 案， 并不是对本发明的进一步限制。 0030 实施例 1 pH 值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0031 为了研究 pH 值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响， 。
15、在 25条件下， 我们研究了 pH6.8 8.6 范围内， pH 值分别为 6.8、 7.2、 7.4、 7.6、 7.8、 8.2、 8.6 时， pH 值对制剂中重组 腺病毒稳定性的影响。 0032 发明人通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究了 pH 值对重组腺病毒稳定性的影响， 结果见表 1。 0033 表 1 pH 值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0034 0035 注 ： 制剂的组成为 10mMTris+10% 丙二醇 （w/v） ， 用 HCl 调节 pH。 0036 由表 1 可见， 在 pH 低于 7.4 时， 制剂中的重组腺病毒较不稳。
16、定， 而 pH 过高， 刺激性 较大。因此， 本发明制剂选择 pH 为 7.4 8.6。其中 PH 值为 7.8 时， 腺病毒的稳定性很好， 且接近于人体的 PH 值， 药品不良反应较少。 0037 实施例 2 MgCl2对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0038 为了研究MgCl2对制剂中重组腺病毒稳定性的影响， 在25条件下， 本发明采用对 比试验， 研究了制剂中存在 MgCl2与否对重组腺病毒稳定性的影响。其中， 实验组制剂为本 发明的重组腺病毒制剂， 包含重组腺病毒、 Tris-HCl 缓冲液和选自丙二醇、 聚乙二醇 400、 二甲基亚砜等保护剂， 制剂中不含有 MgCl2； 对照组制剂。
17、除了含有相同组分和相同含量的本 发明重组腺病毒制剂外， 制剂中还包含 MgCl2。 0039 通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究了MgCl2对重 组腺病毒稳定性的影响， 制剂的组成和研究结果见表 2。 0040 表 2 MgCl2对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0041 说 明 书 CN 103173494 A 5 4/10 页 6 0042 0043 注 ： Tris 浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 各保护剂的浓度百分比为 w/v%。 0044 由表2可见， 本发明的重组腺病毒制剂与添加了MgCl2的对照制剂相比， 在25条 件下。
18、， 二者对保持重组腺病毒的稳定性基本没有差异。众所周知， 作为治疗用药物， 制剂中 添加的辅料种类和用量越少越好。可见， 本发明的简化制剂在重组腺病毒的保存上与现有 技术相比具有优势。 0045 实施例 3 本发明重组腺病毒制剂 25条件下的稳定性研究 0046 在 25 条 件 下， 研 究 了 本 发 明 的 重 组 腺 病 毒 制 剂 与 现 有 技 术 制 剂 （即 CN101163794A1 所公开的制剂） 中重组腺病毒的稳定性。其中， 实验组制剂为本发明的重组 腺病毒制剂， 包含重组腺病毒、 Tris-HCl 缓冲液和选自丙二醇、 聚乙二醇 400、 二甲基亚砜 等保护剂， 不含有。
19、 MgCl2； 对照制剂为 CN101163794A1 所公开的制剂。 0047 通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究了本发明重 组腺病毒制剂 25条件下的稳定性， 制剂的组成和检测结果见表 3。 0048 表 3 本发明重组腺病毒制剂 25条件下的稳定性研究 0049 说 明 书 CN 103173494 A 6 5/10 页 7 0050 注 ： Tris 浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78， 各保护剂的浓度百分比为 w/v%。 0051 由表 3 可见， 与对照组制剂相比， 本发明的重组腺病毒制剂具有更加优异的稳定 性， 在 25条件下。
20、， 可保存重组腺病毒 3 个月， 且比活度均在 3.3% 以上， 而对照组制剂的比 活度仅为 2.48%， 低于合格标准 （基因治疗重组腺病毒的比活度应不低于 3.3%） 。 0052 实施例 4 缓冲体系对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0053 在 25条件下， 本发明研究了三种缓冲体系 （柠檬酸 -Na2HPO4、 精氨酸 -HCl、 Tris-HCl） 对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。 0054 通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究了缓冲体系 对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响， 制剂的组成和研究结果见表 4。 0055 由表 4 可见， 在 25。
21、条件下， Tris-HCl、 柠檬酸 -Na2HPO4、 精氨酸 -HCl 缓冲体系都 可以较好保持制剂中重组腺病毒的稳定性。 0056 表 4 缓冲体系对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0057 说 明 书 CN 103173494 A 7 6/10 页 8 0058 注 ： Tris-HCl 缓冲液中 Tris 浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 柠檬酸 -Na2HPO4缓冲 液中柠檬酸浓度为 50mM， 用 Na2HPO4调节 pH78 ； 精氨酸 -HCl 缓冲液中精氨酸浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 各保护剂的浓度百分比为 w/v%。 0059 实施。
22、例 5 本发明重组腺病毒制剂 4条件下的稳定性研究 0060 在4条件下， 研究了本发明的重组腺病毒制剂与现有技术制剂 （即CN101163794A 所公开的制剂） 中重组腺病毒的稳定性。其中， 实验组制剂为本发明的重组腺病毒制剂， 对 照组制剂为现有技术制剂。 0061 通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究了本发明重 组腺病毒制剂在 4条件下的稳定性， 制剂的组成和研究结果见表 5。 0062 由表 5 可知， 与对照组制剂相比， 在 4条件下， 本发明的重组腺病毒制剂中重组 腺病毒的稳定性远高于现有技术中腺病毒的稳定性。 0063 另外， 表 5 数。
23、据还显示， 同一缓冲体系中不同保护剂对重组腺病毒的稳定性影响 也有差异， 保护剂优选顺序为丙二醇、 聚乙二醇 400、 二甲亚砜， 较差的是丙三醇。 0064 表 5 本发明重组腺病毒制剂的稳定性研究 0065 说 明 书 CN 103173494 A 8 7/10 页 9 0066 0067 注 ： Tris-HCl 缓冲液中 Tris 浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 柠檬酸 -Na2HPO4缓冲 液中柠檬酸浓度为 50mM， 用 Na2HPO4调节 pH78 ； 精氨酸 -HCl 缓冲液中精氨酸浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 组氨酸 -HCl 缓冲液。
24、中组氨酸浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 各保护剂的 浓度百分比为 w/v%。 0068 实施例 6 丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0069 在 25条件下， 本发明研究了丙二醇浓度 （5、 10、 15、 20%） 对制剂中重组腺 病毒稳定性的影响。通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究 了丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响， 制剂的组成和研究结果见表 6。 0070 由表 6 可见， 丙二醇浓度和重组腺病毒稳定性基本呈线性相关， 即丙二醇浓度越 高， 制剂中重组腺病毒的稳定性越好。并且， 当丙二醇的浓度不低于 1。
25、0w/v% 时， 即可很好保 存制剂中重组腺病毒的稳定性。 0071 表 6 丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 说 明 书 CN 103173494 A 9 8/10 页 10 0072 0073 0074 注 ： Tris-HCl 缓冲液中 Tris 浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH78 ； 柠檬酸 -Na2HPO4缓冲 液中柠檬酸浓度为 50mM， 用 Na2HPO4调节 pH7.8 ； 精氨酸 -HCl 缓冲液中精氨酸浓度为 50mM， 用 HCl 调节 pH7.8 ； 丙二醇的浓度百分比为 w/v。 0075 实施例 7 缓冲盐浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 00。
26、76 在 25条件下， 本发明研究了缓冲体系中缓冲盐浓度 （10mM、 50mM、 100mM） 对制剂 中重组腺病毒稳定性的影响。 0077 通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度 （TCID50/mL） 和比活度， 研究了缓冲盐浓 度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响， 制剂的组成和研究结果见表 7。 0078 表 7 缓冲盐浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响 0079 说 明 书 CN 103173494 A 10 9/10 页 11 0080 注 ： pH7.8， 丙二醇的浓度百分比为 w/v。 0081 由表 7 可见， 缓冲体系中柠檬酸浓度与制剂中重组腺病毒的稳定性呈明显的线性 关系，。
27、 柠檬酸的浓度越高， 制剂中重组腺病毒的稳定性越好， 当缓冲体系中柠檬酸的浓度不 低于 50mM 时， 即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性 ； 缓冲体系中精氨酸浓度与制剂中 重组腺病毒的稳定性呈明显的线性关系， 精氨酸的浓度越高， 制剂中重组腺病毒的稳定性 越好， 当缓冲体系中精氨酸的浓度不低于 50mM 时， 即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定 性 ； 缓冲体系中 Tris 的浓度与制剂中重组腺病毒的稳定性相关性不强， 当缓冲体系中 Tris 的浓度不低于10mM时， 本发明制剂在不同Tris浓度下， 制剂中重组腺病毒的稳定性差异不 大。 0082 实施例 8 本发明制剂保存高浓度重组腺病。
28、毒稳定性的影响 0083 为测试本发明制剂保存更高浓度重组腺病毒稳定性， 设计了 2、 4、 6、 8、 10E12vp/mL 六个重组腺病毒浓度梯度， 样品制备后于 25保存， 分别于 0、 1、 2、 3 个月取样检测病毒滴 度和颗粒数， 计算比活度， 结果见表 8。 0084 表 8 本发明制剂保存高浓度重组腺病毒稳定性的影响 0085 说 明 书 CN 103173494 A 11 10/10 页 12 0086 注 ： pH7.8， 丙二醇的浓度百分比为 w/v。 0087 由表 8 可见， 在本发明的三种制剂缓冲液中， 腺病毒的稳定性和其浓度都呈显著 的线性关系， 本发明制剂保存 2 6E12vp/mL 浓度以下重组腺病毒有较好的稳定性， 保存 8 10E12vp/mL 浓度的重组腺病毒在 25条件也能维持 1 2 个月的稳定性。 说 明 书 CN 103173494 A 12 。