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1、(10)申请公布号 CN 103173425 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173425 A *CN103173425A* (21)申请号 201210593912.5 (22)申请日 2012.12.31 C12N 9/12(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 郭振飞 何思健 何雪英 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权。
2、代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 苏运贞 (54) 发明名称 黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 及其编码基因和 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2 及其编码基因和应用, 属于植物基因工程领域。 本 发明通过获得MfEF2基因, 并将获得的MfEF2基因 构建植物表达载体, 用构建的表达载体转化植物 组织, 然后培育成转基因植株。MfEF2 基因受低温 的诱导 ; 本发明提供了利用 MfEF2 基因培育耐寒 植物的方法, 将该基因在植物过量表达后, 提高了 转基因植物的耐冻性和耐冷性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 13 页 序列表 9。
3、 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 序列表9页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103173425 A CN 103173425 A *CN103173425A* 1/1 页 2 1. 一种黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2, 其特征在于其氨基酸序列如 SEQ IDNO.1 所示。 2. 编码权利要求 1 所述的黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 的核苷酸序列如 SEQID NO.2 所 示。 3. 权利要求 1 所述的黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 在提高植物抗寒性中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的黄花苜蓿延伸因子。
4、 2MfEF2 的应用, 其特征在于 : 该应用包括 用本发明获得的 MfEF2 基因构建植物表达载体 ; 用构建的表达载体转化植物组织 ; 将转化 的植物组织培育成转基因植物。 权 利 要 求 书 CN 103173425 A 2 1/13 页 3 黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 及其编码基因和应用 技术领域 0001 本发明属于植物基因工程领域, 涉及一种黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 及其编码基 因和应用。 背景技术 0002 环境中的非生物胁迫, 例如干旱、 盐碱、 冷害和热害等影响植物的生长和发育, 造 成农作物的减产, 也影响林木、 果树、 花卉、 园艺观赏植物的正常生长和品质, 。
5、培育耐逆的植 物品种是种植业的主要目标之一。 然而, 植物耐逆性是一个数量性状, 涉及至少几百个基因 的作用, 因此从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。 0003 EF2基因所编码的延伸因子EF2是一个依赖GTP水解的易位酶, 介导蛋白合成时核 糖体的易位, 每水解一个 GTP, 核糖体便在 mRNA 上前进 3 个碱基。它利用 GTP 水解释放的能 量, 将氨酰 tRNA 从核糖体上的 A 位点转移到 P 位点, 从而介导肽链的延伸。EF2 是生物细胞 蛋白质合成所必需的, 它的变化对蛋白的合成有重要影响。 0004 目前已从多种植物克隆了 EF2 基因, 但还没有从非常耐寒、 耐旱。
6、的黄花苜蓿中克 隆。Guo 等 (2002) 发现, EF2 的突变会阻碍拟南芥低温信号的传导, 并降低其抗冻性 ; EF2 的 突变只影响植物在低温 (0) 条件下合成蛋白质, 而对植物在室温下合成蛋白质无影响。 证 明EF2在植物冷信号传导中起重要作用, 从而调控植物抗冷性。 黄花苜蓿 (Medicago sativa subsp.falcata) 是一种非常耐寒的豆科牧草种质, 在寒冷的西伯利亚也有分布, 从中克隆 抗寒基因, 能为转基因育种提供更为优良的目的基因, 而且对于农林植物抗逆分子育种尤 为重要和迫切。 发明内容 0005 为克服现有技术的缺点和不足, 本发明的首要目的在于提供。
7、一种黄花苜蓿延伸因 子 2MfEF2。 0006 本发明的另一目的在于提供编码所述的黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 的基因。 0007 本发明的再一目的在于提供所述的黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 的应用。 0008 本发明的目的通过下述技术方案实现 : 一种黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2, 其氨基酸 序列如下所示 : 0009 MVKFTADELRRIMDYKHNIRNMSVIAHVDHGKSTLTDSLVAAAGIIAQEVAGDVRMTDTRADEAERGIT IKSTGISLYYEMTDESLKRFKGERNGNEYLINLIDSPGHVDFSSEVTAALRITDGALVVVDCVE。
8、GVCVQTETVLRQA LGERIRPVLTVNKMDRCFLELQVDGEEAYQTFSRVIENANVIMATYEDPLLGDVMVYPEKGTVAFSAGLHGWAFTLT NFAKMYASKFGVDESKMMERLWGENFFDPATKKWTTKNTGSASCKRGFVQFCYEPIKQIINTCMNDQKDKLWPMLTK LGVTMKSDEKDLMGKPLMKRVMQTWLPASTALLEMMIFHLPSPHTAQRYRVENLYEGPLDDQYANAIRNCDPEGPLM LYVSKMIPASDKGRFFAFGRVFAGKVSTGLKVRIMGPNFVPGEKKDLYVKSV。
9、QRTVIWMGKRQETVEDVPCGNTVAL VGLDQFITKNATLTNEKEVDAHPIRAMKFSVSPVVRVAVQCKVASDLPKLVEGLKRLAKSDPMVVCTIEESGEHIVA GAGELHLEICLKDLQDDFMGGAEIIKSDPVVSFRETVLDRSIRTVMSKSPNKHNRLYMEARPLEDGLAEAIDEGTIG 说 明 书 CN 103173425 A 3 2/13 页 4 PRDDPKNRSKILSEQYGWDKDLAKKIWCFGPETTGPNMVVDMCKGVQYLNEIKDSVVAGFQWASKEGVLSEENMRGI CFEVCDVV。
10、LHTDAIHRGGGQIIPTARRVFYASQLTAKPRLLEPVYMVEIQAPEQALGGIYSVLNQKRGHVFEEMQRP GTPLYNIKAYLPVIESFGFSSQLRAATSGQAFPQCVFDHWDTMTSDPLEAGSQAAQLVMDIRKRKGLKEQMTPLSEF EDKL 0010 编码所述的黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 的核苷酸序列如下所示 : 0011 ATGGTGAAGTTCACAGCTGATGAGTTACGTCGTATTATGGACTACAAGCACAACATTCGTAATATGTCT GTCATTGCTCATGTTGACCACGGAAAATCAACT。
11、CTAACCGACTCTCTAGTCGCTGCTGCGGGAATTATTGCCCAGGA AGTTGCAGGTGATGTCCGTATGACTGACACCCGTGCTGATGAAGCTGAGCGTGGTATTACAATCAAGTCTACCGGTA TCTCACTCTACTATGAAATGACTGATGAATCTCTCAAGAGGTTCAAGGGGGAGCGTAATGGAAATGAGTATCTCATT AATCTCATTGATTCCCCTGGGCACGTCGACTTCTCATCTGAGGTTACTGCTGCACTCCGTATTACTGATGGAGCACT TGTGGTAGTTGACTGTGTGGA。
12、AGGTGTATGTGTCCAAACTGAAACTGTGCTGCGACAAGCTCTTGGAGAAAGGATTA GGCCTGTTCTTACAGTTAATAAGATGGACAGGTGCTTCCTTGAGCTCCAGGTTGATGGAGAGGAGGCATACCAGACC TTTTCAAGGGTGATTGAGAATGCTAATG TGATTATGGCTACATATGAAGATCCACTTCTTGGTGATGTTATGGTGT ATCCAGAGAAAGGAACAGTTGCTTTTTCTGCTGGTTTGCATGGTTGGGCTTTTACTCTGACCAACTTTGCAAAAATG TATGCCTCA。
13、AAATTTGGCGTTGACGAGTCCAAGATGATGGAGAGGCTCTGGGGTGAAAATTTCTTTGATCCTGCCAC AAAAAAATGGACCACCAAGAATACTGGTTCAGCTTCGTGCAAGCGTGGGTTTGTTCAGTTCTGTTATGAGCCTATCA AGCAGATCATCAACACTTGTATGAATGATCAGAAGGATAAGTTGTGGCCTATGCTCACAAAGCTAGGGGTCACCATG AAGTCTGATGAGAAGGACCTGATGGGTAAGCCATTGATGAAACGTGTTATGCAAACCTGGTTGCCAGCAAGTACT。
14、GC CCTACTAGAAATGATGATCTTTCATCTTCCCTCACCACATACTGCCCAGAGGTACCGTGTTGAGAATTTGTATGAGG GCCCCCTTGACGATCAATATGCAAATGCTATCAGAAACTGTGATCCTGAAGGACCTCTGATGCTTTATGTGTCAAAG ATGATTCCAGCATCTGATAAAGGAAGGTTTTTTGCTTTTGGCCGTGTGTTTGCCGGTAAGGTTTCCACAGGTTTGAA GGTCAGAATTATGGGACCAAATTTTGTCCCTGGAGAGAAGAAAGATCTGTACGTGAAAAGTGT。
15、CCAGAGAACTGTTA TTTGGATGGGAAAGAGACAGGAGACTGTTGAGGATGTGCCTTGTGGTAACACTGTTGCTTTGGTTGGTTTGGATCAA TTTATTACAAAGAATGCTACATTGACAAATGAGAAGGAAGTTGATGCCCACCCTATCCGAGCTATGAAGTTTTCCG TCTCCCCTGTTGTGCGTGTTGCTGTTCAGTGCAAGGTTGCTTCAGATCTTCCCAAGCTTGTTGAAGGTCTCAAACGT TTGGCTAAGTCAGATCCTATGGTTGTTTGTACTATTGAGGAGTCTGGGGAAC。
16、ACATTGTTGCTGGTGCAGGAGAGCT TCATCTTGAGATCTGTTTGAAAGATTTGCAGGATGATTTCATGGGTGGTGCTGAGATTATTAAATCTGACCCTGTTG TGTCATTCAGGGAGACTGTTCTTGATAGATCAATCCGCACAGTGATGAGTAAATCACCCAACAAGCACAACCGGCTG TACATGGAAGCAAGACCATTGGAGGATGGACTTGCAGAGGCCATTGATGAGGGCACAATAGGACCAAGGGATGATCC CAAGAATCGTTCTAAGATCTTGTCCGAACAGTATGGTTGG。
17、GACAAGGATCTTGCCAAGAAAATTTGGTGTTTTGGCC CTGAGACCACCGGGCCCAACATGGTGGTTGATATGTGTAAGGGAGTTCAGTATTTGAATGAAATCAAGGATTCCGTG GTTGCTGGATTCCAGTGGGCATCAAAAGAAGGTGTTTTGTCGGAAGAAAACATGAGAGGCATCTGCTTTGAAGTATG TGATGTTGTCCTGCACACTGATGCTATCCACAGAGGAGGTGGTCAGATCATTCCTACTGCTAGGAGGGTCTTCTATG CCTCACAGCTCACAGCCAAACCCAGGCT。
18、TCTGGAGCCTGTTTA CATGGTGGAAATCCAAGCTCCTGAGCAAGCTCT TGGTGGTATCTACAGTGTTCTGAATCAGAAACGTGGGCACGTTTTTGAAGAAATGCAGAGGCCCGGTACCCCACTTT ACAACATCAAAGCATACCTCCCTGTCATTGAGTCCTTTGGATTTTCTAGTCAGTTGAGAGCTGCAACATCTGGGCAG GCTTTCCCCCAGTGTGTCTTTGATCATTGGGACACCATGACCTCAGATCCTTTGGAGGCTGGATCACAAGCTGCACA GCTTGTTATGGACATC。
19、CGCAAGAGGAAGGGACTCAAGGAACAAATGACTCCCCTTTCTGAGTTTGAAGACAAGCTTT AA 说 明 书 CN 103173425 A 4 3/13 页 5 0012 上述黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2 在提高植物抗寒性中的应用 : 该应用包括用本发 明的 MfEF2 基因构建植物表达载体 ; 用构建的表达载体转化植物组织 ; 将转化的植物组织 培育成转基因植株。 0013 所述的用本发明的 MfEF2 基因构建植物表达载体, 可用现有的植物表达载体构建 含有所述基因的重组表达载体 ; 0014 所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于单子叶基因枪。
20、转化的 载体 ; 所述的双元农杆菌载体包括 pBI121, pCAMBIA 系列载体 ; 所述植物表达载体还可包含 外源基因的 3 端非翻译区域, 即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应 mRNA 加工或基因表达 的 DNA 片段 ; 0015 使用所述基因构建重组植物表达载体时, 在其转录起始核苷酸前可使用任何一种 强启动子或诱导型启动子 ; 这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S 启动子和 泛素 (Ubiqutin) 启动子, 它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用 ; 此外使用本发明 的基因构建植物表达载体时, 还可使用增强子, 这些增强子区域包括但不限于 ATG 起始密。
21、 码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框相同, 以保证整个序列的翻译。翻 译控制信号和起始密码子可以使多种不同的来源, 可以是天然的, 也可以是合成的。 翻译起 始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。 0016 为了便于对转基因植株进行鉴定及筛选, 可对所使用的植物表达载体进行加工, 包括加入或替换植物可选择性标记。 可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或 具有抗性的抗生素标记物 ; 所述的除草剂包括草丁膦、 草甘膦等, 所述的抗生素包括卡那霉 素、 潮霉素、 庆大霉素等。 从转基因植物的安全性考虑, 可以不加任何选择性标记基因, 直接 以逆境筛选转化植株。 0017 含。
22、有 MfEF2 基因的表达盒、 转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。 0018 本发明的表达载体可通过使用Ti质粒、 Ri质粒、 植物病毒载体、 直接的DNA 转化, 显微注射、 电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法导入植物细胞或组织, 并将转化的植 物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是双子叶植物或单子叶植物。 0019 所述的 MfEF2 基因片段的获得和植物表达载体的制备方法, 包括以下步骤 : 0020 (1) 引物设计 0021 MfEF2 扩增上游引物 RT77 : CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAG ; 0022 MfEF2 扩增下游引物 RT78 : 。
23、CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT ; 0023 (2) MfEF2 基因片段的获得 : 0024 以黄花苜蓿 (Medicago falcata) 的 cDNA 为模板, 使用引物和引物扩增 MfEF2 基因片段, 并连接进入 pGEM-T easy 载体中, 构建获得 pGEM-MfEF2 载体 ; 0025 (3) 植物表达载体 pBI-MfEF2 的构建 0026 对重组质粒 pGEM-MfEF2 和 pBI-121 表达质粒分别用 Xba 和 BamH 进行双 酶切, 回收 MfEF2 基因片段和线性化的 pBI-121 载体, 进行连接构建获得植物表达载体 pBI-。
24、MfEF2。 0027 所述的转基因植物为转基因烟草 ; 0028 所述的转基因烟草的获得, 包括以下的步骤 : 0029 (1)用电转的方法将 pBI-MfEF2 导入根瘤农杆菌 EHA105 中, 获得含表达载体 说 明 书 CN 103173425 A 5 4/13 页 6 pBI-MfEF2 农杆菌阳性菌落 ; 0030 (2) 将活化的含有表达载体 pBI-MfEF2 的农杆菌 EHA105 浸染烟草无菌苗, 经共培 养和抗生素筛选, 获得转基因烟草。 0031 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 : 0032 发明人已从黄花苜蓿中克隆了 EF2 基因的 cDNA 序列 MfE。
25、F2。MfEF2 基因的表达受 低温胁迫诱导, 构建了适合于双子叶植物的表达载体, 转化双子叶模式植物烟草, 转基因植 株明显提高了抗冻性和抗冷性。 附图说明 0033 图 1 是植物表达载体 pBI-MfEF2 的表达框示意图。 0034 图 2 本发明所述 MfEF2 基因开放阅读框序列的 PCR 扩增琼脂糖电泳图, 其中, M 是 标准 DNA 分子 ; 1 是 MfEF2 基因的扩增片段。 0035 图 3 是 MfEF2 基因的植物表达载体的 PCR 鉴定琼脂糖凝胶电泳图, 其中, M 是标准 DNA 分子 ; 1-3 是 3 组构建的植物表达质粒的 MfEF2 基因的扩增片段。 0。
26、036 图 4 是低温诱导 MfEF2 基因表达的实时定量 PCR 检测柱状图。柱上方的字母 a 和 b 表示不同材料之间的差异显著 (P 0.05) , 即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异, 数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。 0037 图 5 是导入 MfEF2 基因的转基因烟草的 PCR 鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图, 其中, W 表示野生型 ; P 表示 pBI-MfEF2 载体, 为阳性对照 ; 编号 1 11 表示不同的转基因烟草。 0038 图6是3个导入MfEF2基因的转基因烟草的Southern杂交和Northern杂交鉴定, 其中, W 表示野生型 ; 数字 1-3 表。
27、示不同的转基因烟草 ; 图 (a) 是 Southern 杂交, 图 (b) 是 Northern 杂交。 0039 图 7 是导入 MfEF2 杂交基因的转基因烟草抗冻性检测, 其中图 (a) 是冻处理后的 存活率, 图 (b) 是冻处理前后各的植株照片。柱上方的字母 a 和 b 表示不同材料之间的差 异显著 (P 0.05) , 即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异, 数据柱上方字母不同时 表示存在显著差异。 0040 图 8 是表达 MfEF2 基因的转基因烟草抗冷性的相对电导率检测。其中, W 表示野 生型 ; 编号 1 3 表示不同的转基因烟草。柱上方的字母 a 和 b 表示不同材。
28、料之间的差异 显著 (P 0.05) , 即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异, 数据柱上方字母不同时表 示存在显著差异。 具体实施方式 0041 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述, 但本发明的实施方式不限 于此。 0042 黄花苜蓿种子 : 品种为海拉尔, 中国农科院北京畜牧兽医研究所牧草种质资源库。 0043 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) EHA105 : 购自北京天恩泽基因科技有 限公司。 0044 烟草或烟草 (Nicotiana tabacum L.) 种子 : 品种为中烟 90, 广东省农科院作物研 究所。 说 明 书 CN 1。
29、03173425 A 6 5/13 页 7 0045 pBI121 表达载体 : 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 0046 大肠杆菌 DH10B : 购自上海超研生物科技有限公司。 0047 实施例 1MfEF2 的克隆 0048 一、 黄花苜蓿 cDNA 模板制备 0049 将苗龄 8 10 周的黄花苜蓿植株放入温度为 5的人工气候箱 (光照强度为 200mol m-2s-1) 内, 光 / 暗周期为 12 小时, 进行低温处理, 连续处理 2 天。 0050 提取总的 RNA : 剪取成熟叶片, 加入液氮快速研磨成粉末, 转移至 2ml 离心管中, 加 入1.5ml TRE-Tri。
30、zol (广州博理生物科技公司) 试剂, 剧烈振荡15秒, 冰浴5分钟。 10000rpm 离心5min, 吸取上清至2ml离心管, 加入0.3ml氯仿, 剧烈振荡15秒, 冰浴10分钟。 12000rpm 离心 15 分钟, 吸取上层水相 ( 0.7ml) 至 1.5ml 离心管, 依次加入 0.4ml 异丙醇和 0.4ml Buffer A(1.2M NaCl, 80mM 柠檬酸钠, 用 DEPC 处理水配制) , 立即混匀, 室温下放置 10 分 钟。12000rpm 离心 10 分钟, 弃上清, 用 75% 乙醇 (DEPC 处理水配制) 洗涤沉淀。7500rpm 离 心 5 分钟, 。
31、弃上清, 再短暂离心 3 秒, 用枪头吸尽上清。室温下风干沉淀 5 分钟, 加入 30 35l DEPC 处理水, 60温浴 5 分钟, 溶解沉淀, 获得黄花苜蓿总 RNA。取 1 3l 总 RNA 进行甲醛变性胶电泳, 检查 RNA 的完整性, 并用紫外分光光度计测 260nm 与 280nm 的光吸收 值, 确定总 RNA 的浓度与纯度。 0051 逆转录制得黄花苜蓿的 cDNA 模板 : 以上述得到的黄花苜蓿总 RNA 为模板, 以 Oligo(dT) 18为反转录引物, 用 M-MLV 逆转录酶试剂盒 (Promega 公司) , 参照说明书的方 法合成 cDNA 第一链。逆转录反应体。
32、系为 : 2g 总 RNA, 1l1.0M Oligo(dT)18, 加入无菌 的无离子水, 使反应液总体积达到 10l, 混匀, 70保温 5min 后, 迅速放入碎冰浴 5 分钟 ; 继续向反应液依次加入以下成分 : 5l M-MLV5Reaction Buffer, 1.25l2.5mM dNTPs, 0.5l RNase 抑制剂 (25U) , 1l M-MLV 逆转录酶 (200U), 加无菌的无离子水至终体积为 25l。轻弹管壁, 混匀, 短暂离心。于 42保温, 反应 60 分钟, 再在 70下保温 10 分钟, 使酶失活。反应结束后, 制备获得黄花苜蓿的 cDNA 模板, 于 。
33、-20保存备用。 0052 二、 设计扩增 MfEF2 基因引物 0053 根据本实验室构建的黄花苜蓿冷诱导基因 cDNA 消减文库中发现的 MfEF2 基因 cDNA片段的序列, 在NCBI上进行BLASTn比对EST序列, 并下载相应核苷酸序列一致性最高 的序列, 利用 DNAStar 软件的 Seqman 工具进行序列拼接, 如此反复直到拼接得到该基因的 全长序列。通过 DNAstar 软件分析以上全长序列的开放阅读框, 根据开放阅读框两端的序 列设计引物 : 0054 MfEF2 扩增上游引物 RT77 : CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAG 0055 MfEF2 扩增。
34、下游引物 RT78 : CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT 0056 三、 扩增获得 MfEF2 基因并构建载体 0057 PCR 扩增 : 以步骤一得到的 cDNA 第一链为模板和步骤二设计的引物 RT77 和 RT78 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 : KOD-Plus DNA 聚合酶 (TOYOBO 公司, 1U/l) 1l、 10buffer5l, 2.5mM dNTPs5l、 MgSO4(25mmol L-1) 2l、 10M 上游引物 RT771.5l、 10M 下游引物 RT781.5l、 第一链 cDNA2l、 无菌的无离子水 32l。混匀后按下列程序。
35、 进行 PCR 反应 : 94 3 分钟, 94变性 0.5 分钟, 55退火 1 分钟, 68延伸 1.5 分钟, 35 个 循环后, 68延伸 1.5-2 分钟。以 0.8的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 说 明 书 CN 103173425 A 7 6/13 页 8 0058 PCR 产物回收与末端加 A : 用 PCR 产物回收试剂盒回收上述获得的 PCR 产物, 进一 步通过 Taq 酶催化的反应进行末端加 A, 反应体系如下 : 2l10buffer, 1l4mM dATP, 11g PCR回收片段, 0.1l Taq DNA聚合酶, 加入无菌的去离子水至总体积为20l, 70 反应。
36、 20 分钟, 即对 MfEF2 基因片段进行了末端加 A。 0059 末端加 A 的 MfEF2 基因片段与 T 载体的连接 : 用 PCR 产物回收试剂盒回收上述 获得末端加了 A 的 MfEF2 基因片段。用 T4DNA 连接酶 (TaKaRa 公司)将 PCR 回收片段与 pMD20T-vector(TaKaRa 公司) 进行连接, 反应体系如下 : 1l10T4 连接酶缓冲液, 回收 的目的片段 60ng, 1l T4 连接酶 (350U/l), 2lpMD20T-vector 载体 (10ng) , 加无菌水 至总体积为 10l, 16连接过夜。 0060 大肠杆菌感受态细胞的制备。
37、 : 用接种环取保存于 -80超低温冰箱的大肠杆菌 DH10B 菌液, 在 SOB 固体培养基上划板, 于 37培养箱内培养过夜 ; 挑取大肠杆菌 DH10B 单 菌落接种于 1ml 的 SOB 液体培养基中, 在 37恒温摇床上以 200rpm 振荡培养约 6h, 接种于 200ml SOB 液体培养基中, 于 37恒温摇床上以 200rpm 振荡培养至 OD550 0.6 0.8。以 2500rpm 离心 10 分钟收集菌体, 加入预冷的 10甘油洗涤, 离心收集细菌。重复用 10甘 油洗涤, 离心收集细菌。最后将细菌分装, 于 70保存备用。 0061 连接产物电激转化大肠杆菌 : 将上。
38、述 MfEF2 基因片段与 T 载体的连接产物在 1/3 的 TE(1M NaCl, 10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA) 中透析 30 分钟。取 20l 大肠杆菌感 受态细胞至电极杯 (孔径 1mm) , 加入 1l 经过透析的连接产物, 用电激仪 (MicroPulser, Bio-RAD 公司) 电激转化。电激参数为 : 电阻 200, 1800V, 25F。电激后的菌体转入 1ml SOC 液体中, 于 37恒温摇床上以 200rpm 振荡培养 1 小时。取 100l 菌液涂布于含 IPTG 和 X-gal 的 LB 固体 (含 100g/mL Amp) 培养基。
39、上, 于 37培养箱内倒置培养过夜。 0062 重组质粒的筛选、 纯化及测序 : 呈蓝斑的菌落不含插入片段, 仅挑取呈白斑的菌 落, 做菌落 PCR 检测。挑取 PCR 阳性菌落, 接种于 2ml 含 100g/ml 氨苄青霉素的 LB 液体 培养基中, 于 37恒温摇床上以 200rpm 振荡培养过夜。吸取 2ml 菌液, 用质粒 DNA 纯化试 剂盒 (Qiagen 公司) 提质粒, 4保存备用。对获得的质粒用 Xba /BamH 双酶切, 电泳检 测插入片段的大小, 进一步确定阳性克隆。将纯化的重组质粒 (命名为 pGM-MfEF2) , 测序。 用 Omiga2.0 软件对测序结果进行。
40、分析, 除去两端的 T 载体序列, 从而得到 PCR 扩增产物的 序列如下 : 0063 CAGGGATGGGTACGAACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGATTCTAGTCAAGATGGT GAAGTTCACAGCTGATGAGTTACGTCGTATTATGGACTACAAGCACAACATTCGTAATATGTCTGTCATTGCTCATG TTGACCACGGAAAATCAACTCTAACCGACTCTCTAGTCGCTGCTGCGGGAATTATTGCCCAGGAAGTTGCAGGTGAT GTCCGTATGACTGACACCCGTGCTGATGA。
41、AGCTGAGCGTGGTATTACAATCAAGTCTACCGGTATCTCACTCTACTA TGAAATGACTGATGAATCTCTCAAGAGGTTCAAGGGGGAGCGTAATGGAAATGAGTATCTCATTAATCTCATTGATT CCCCTGGGCACGTCGACTTCTCATCTGAGGTTACTGCTGCACTCCGTATTACTGATGGAGCACTTGTGGTAGTTGAC TGTGTGGAAGGTGTATGTGTCCAAACTGAAACTGTGCTGCGACAAGCTCTTGGAGAAAGGATTAGGCCTGTTCTTAC AGTTAATAAGATGGACA。
42、GGTGCTTCCTTGAGCTCCAGGTTGATGGAGAGGAGGCATACCAGACCTTTTCAAGGGTGA TTGAGAATGCTAATGTGATTATGGCTACATATGAAGATCCACTTCTTGGTGATGTTATGGTGTATCCAGAGAAAGGA ACAGTTGCTTTTTCTGCTGGTTTGCATGGTTGGGCTTTTACTCTGACCAACTTTGCAAAAATGTATGCCTCAAAATT TGGCGTTGACGAGTCCAAGATGATGGAGAGGCTCTGGGGTGAAAATTTCTTTGATCCTGCCACAAAAAAATGGACCA 说 明 书。
43、 CN 103173425 A 8 7/13 页 9 CCAAGAATACTGGTTCAGCTTCGTGCAAGCGTGGGTTTGTTCAGTTCTGTTATGAGCCTATCAAGCAGATCATCAAC ACTTGTATGAATGATCAGAAGGATAAGTTGTGGCCTATGCTCACAAAGCTAGGGGTCACCATGAAGTCTGATGAGAA GGACCTGATGGGTAAGCCATTGATGAAACGTGTTATGCAAACCTGGTTGCCAGCAAGTACTGCCCTACTAGAAATGA TGATCTTTCATCTTCCCTCACCACATACTGCCCAGAGGT。
44、ACCGTGTTGAGAATTTGTATGAGGGCCCCCTTGACGAT CAATATGCAAATGCTATCAGAAACTGTGATCCTGAAGGACCTCTGATGCTTTATGTGTCAAAGATGATTCCAGCATC TGATAAAGGAAGGTTTTTTGCTTTTGGCCGTGTGTTTGCCGGTAAGGTTTCCACAGGTTTGAAGGTCAGAATTATGG GACCAAATTTTGTCCCTGGAGAGAAGAAAGATCTGTACGTGAAAAGTGTCCAGAGAACTGTTATTTGGATGGGAAAG AGACAGGAGACTGTTGAGGATGTGCCT。
45、TGTGGTAACACTGTTGCTTTGGTTGGTTTGGATCAATTTATTACAAAGAA TGCTACATTGACAAATGAGAAGGAAGTTGATGCCCACCCTATCCGAGCTATGAAGTTTTCCGTCTCCCCTGTTGTGC GTGTTGCTGTTCAGTGCAAGGTTGCTTCAGATCTTCCCAAGCTTGTTGAAGGTCTCAAACGTTTGGCTAAGTCAGAT CCTATGGTTGTTTGTACTATTGAGGAGTCTGGGGAACACATTGTTGCTGGTGCAGGAGAGCTTCATCTTGAGATCTG TTTGAAAGATTTGCA。
46、GGATGATTTCATGGGTGGTGCTGAGATTATTAAATCTGACCCTGTTGTGTCATTCAGGGAGA CTGTTCTTGATAGATCAATCCGCACAGTGATGAGTAAATCACCCAACAAGCACAACCGGCTGTACATGGAAGCAAGA CCATTGGAGGATGGACTTGCAGAGGCCATTGATGAGGGCACAATAGGACCAAGGGATGATCCCAAGAATCGTTCTAA GATCTTGTCCGAACAGTATGGTTGGGACAAGGATCTTGCCAAGAAAATTTGGTGTTTTGGCCCTGAGACCACCGGGC CCA。
47、ACATGGTGGTTGATATGTGTAAGGGAGTTCAGTATTTGAATGAAATCAAGGATTCCGTGGTTGCTGGATTCCAG TGGGCATCAAAAGAAGGTGTTTTGTCGGAAGAAAACATGAGAGGCATCTGCTTTGAAGTATGTGATGTTGTCCTGCA CACTGATGCTATCCACAGAGGAGGTGGTCAGATCATTCCTACTGCTAGGAGGGTCTTCTATGCCTCACAGCTCACAG CCAAACCCAGGCTTCTGGAGCCTGTTTACATGGTGGAAATCCAAGCTCCTGAGCAAGCTCTTGGTGGTA。
48、TCTACAGT GTTCTGAATCAGAAACGTGGGCACGTTTTTGAAGAAATGCAGAGGCCCGGTACCCCACTTTACAACATCAAAGCATA CCTCCCTGTCATTGAGTCCTTTGGATTTTCTAGTCAGTTGAGAGCTGCAACATCTGGGCAGGCTTTCCCCCAGTGTG TCTTTGATCATTGGGACACCATGACCTCAGATCCTTTGGAGGCTGGATCACAAGCTGCACAGCTTGTTATGGACATC CGCAAGAGGAAGGGACTCAAGGAACAAATGACTCCCCTTTCTGAGTTTGAAGACAAG。
49、CTTTAAGTTATTTCTGCAAT TTATATTTATGTACTTGGCTGTTATGAAAACTGAAATCCATATGACTAGTAGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCA TGCAAGCTTTCCCCTATAGGTCACCCCTATATTTGCTGCATGCC 0064 测序结果在 NCBI 中进行序列比对, 证明所扩增出的 PCR 产物为 MfEF2 ; 用 Omiga2.0 分析软件分析所扩增的 PCR 产物序列, 获得了 MfEF2 基因的开放阅读框架 (ORF) 序列, 如上述测序序列中下划线标注部分。编码所述的黄花苜蓿延伸因子 2 的基因由 2731 个碱基组成, 其中 MfEF2 的蛋白质编码区 (Sequence coding for amino acids。