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1、(10)申请公布号 CN 103146788 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146788 A *CN103146788A* (21)申请号 201310064520.4 (22)申请日 2013.02.28 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (71)申请人 珠海博康药业有限公司 地址 519090 广东省珠海市金湾区红旗镇小 林红灯围 (72)发明人 陈东 黄家升 方启舟 (74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11411 代理人 郑自群 (54) 发明名称 一种大豆肽的酶法制备方法 (5。
2、7) 摘要 本发明提出了一种大豆肽的酶法制备方法， 通过创造性的采用蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为酶原来 酶解大豆分离蛋白， 小麦蛋白等， 水解效率高， 并 在制备工艺中采用了超滤技术， 使得到的酶解产 物大豆肽分离的更加彻底， 收率高， 整个工艺过程 条件温和， 对环境友好。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103146788 A CN 103146788 A *CN103146788A* 1/1 页 2 1. 一种大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于， 包括以下。
3、步骤 ： （1） 称取植物蛋白， 按照物料比1:20至1:60 （w/v） 加入纯化水， 75-85灭菌20-40min， 冷却至 40 ； （2） 按植物蛋白重量 0.5-2加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶 ； （3） 酶解工艺条件 ： PH 控制在 6.0-7.8， 37-42保温水解 20-30h， 75-85灭活 30min， 然后进行过滤， 取过滤清液 ； （4） 使用截留分子量为 10000 的超滤膜进行超滤， 补加 2-3 次纯化水继续超滤 ； （5） 将超滤透出液进行干燥， 得大豆肽粉。 2. 如权利要求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述物料 比。
4、为 1:40， 灭菌温度为 80， 持续 30min。 3. 如权利要求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 加入蚯蚓 丝氨酸蛋白酶的重量为大豆分离蛋白重量的 1。 4. 如权利要求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中， PH 控制在 6.5， 保温水解的温度为 40并水解 24h， 灭活温度为 80。 5. 如权利要求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中， 所述过滤 步骤包括 ： 多层纱布过滤， 取过滤清液 ； 滤饼再加入纯化水洗涤， 多层纱布过滤， 将两次过 滤清液合并。 6. 如权利要。
5、求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中， 所述超滤 膜为中空纤维膜或者卷式膜或者管式膜或者陶瓷膜。 7. 如权利要求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （5） 中， 所述干燥 采用冷冻干燥或喷雾干燥。 8. 如权利要求 1 中所述的大豆肽的酶法制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述植物 蛋白为大豆分离蛋白或者小麦蛋白。 权 利 要 求 书 CN 103146788 A 2 1/3 页 3 一种大豆肽的酶法制备方法 技术领域 0001 本发明涉及大豆肽的制备工艺， 特别是指一种大豆肽的酶法制备方法。 背景技术 0002 利用。
6、大豆蛋白经酶水解后， 得到由多种肽分子组成的混合水解产物， 称其为大豆 肽。大豆肽与大豆蛋白具有完全相同的氨基酸组成， 一般由 2 10 个氨基酸残基构成， 必 需氨基酸平衡良好。 与大豆蛋白相比， 大豆肽具备良好的加工特性和独特的生理活性， 可用 于多种食品乃至化妆品的生产中。 0003 大豆蛋白水解物的研究最初采用酸碱化学试剂在一定温度下进行水解反应， 但在 研究中发现， 化学法制备大豆肽存在种种弊端， 如水解过程不易控制、 水解无特异性、 副反 应多、 营养成分损失及水解产物感官性能差、 苦臭味等问题未能解决等， 大豆低聚肽的研究 进展缓慢。 0004 随着酶学工业的发展， 酶法水解大豆。
7、蛋白逐渐成为了研究的主流。酶法制备大 豆多肽的工艺条件一般都比较温和， 但因酶理化特性的差异， 其反应条件必须限制在某个 最适温度和 pH 范围内， 否则酶就会失活， 而且不同酶水解时的作用位点和作用机理也不一 样。如国内外研究最多的 Alcalase 是一种非特异性碱性蛋白酶， 属于内切酶， 主要作用于 含疏水性羧基的肽键， 催化部位是丝氨酸 ； 复合蛋白酶 Protamex 的活性中心是丝氨酸残 基， 同时具有内切酶和外切酶的特性， 在大豆肽酶解中使用较多 ； 研究发现， Flavourzyme 复合风味蛋白酶可减少疏水性氨基酸所引起的苦味， 可以使大豆肽在食品工业生产中获得 更为广泛的应。
8、用， 近年来， 国内对大豆肽的有关生产工艺也有所发展， 一般的制备方法为利 用完全脱腥大豆蛋白粉作为原料， 使用 Asl398 蛋白酶、 胰蛋白酶、 菠萝蛋白酶中的一种， 于 30-50、 不同 pH 下处理， 取上清液再与氨基酸、 蛋白质等复合成氨基酸口服液 ； 采用中 性蛋白酶 Asl.398 与木瓜蛋白酶双酶复合水解的方法， 可获得比单独使用一种酶更高的水 解度， 获得分子量在 2000 以下的大豆肽 ； 采用胰蛋白酶与中性蛋白酶 Asl398 复合水解大 豆分离蛋白， 也获得了良好的效果， 水解度可达到 30以上， 大豆肽平均链长为 2-4 个氨基 酸， 相对分子量小于 1000， 但。
9、是， 常规的采用单一酶法水解的水解度通常较低， 为 40-50%， 虽然多酶水解能有一定提高， 但仍然有限， 而且多酶水解对于工艺条件的控制要求更加严 格。 0005 蚯蚓丝氨酸蛋白酶是从蚯蚓体内提取得到的一种酸性蛋白酶， 属于胰蛋白酶， 它 能水解蛋白质底物 （如酪蛋白） ， 碱性氨基酸的酯及酰胺。PI3-4 ； 20-50范围稳定 ； 是一种 糖蛋白酶类。 0006 蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为一组蛋白水解酶， 对其酶学性质的研究还不够深入。多数 蚯蚓丝氨酸蛋白酶组分受 3 种丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟、 甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基 酮、 N- 对甲苯磺酰赖氨酰氯甲基酮的抑制， 但不同组分对不同种类。
10、的蛋白酶抑制剂的敏感 性存在差异 ； 蚯蚓丝氨酸蛋白酶直接切割纤溶酶原及降解纤维蛋白原是其同时具有激酶和 纤溶酶活性的分子基础 ； 对不同合成底物具有专一性说明其具有不同活性中心 ； 蚯蚓丝氨 说 明 书 CN 103146788 A 3 2/3 页 4 酸蛋白酶能对组织纤溶酶原激活剂(t-P A)的专一性底物S-2288有水解作用， 说明其对纤 溶酶原的激活方式与 t-P A 相似。 发明内容 0007 本发明提出一种大豆肽的酶法制备方法， 极大的提高了水解的效率， 同时得到的 产物分离更加彻底， 收率高。 0008 本发明的技术方案是这样实现的 ： 一种大豆肽的酶法制备方法， 包括以下步骤。
11、 ： 0009 （1）称取植物蛋白， 按照物料比 1:20 至 1:60（w/v）加入纯化水， 75-85灭菌 20-40min， 冷却至 40 ； 0010 （2） 按植物蛋白重量 0.5-2加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶 ； 0011 （3） 酶解工艺条件 ： 通过缓冲液使得 PH 控制在 6.0-7.8 的范围内， 37-42保温水 解 20-30h， 75-85灭活 30min， 然后进行过滤， 取过滤清液 ； 0012 （4） 使用截留分子量为 10000 的超滤膜进行超滤， 补加 2-3 次纯化水继续超滤 ； 0013 （5） 将超滤透出液进行干燥， 得大豆肽粉。 0014 优选的， 步骤 。
12、（1） 中， 所述物料比为 1:40， 灭菌温度为 80， 30min。温度如果过高 容易导致蛋白质的变性。 0015 优选的， 步骤 （2） 中， 加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶的重量为植物蛋白重量的 1。 0016 优选的， 步骤 （3） 中， PH 控制在 6.5， 保温水解的温度为 40， 水解 24h， 灭活温度 为 80。 0017 优选的， 步骤 （3） 中， 所述过滤步骤包括 ： 多层纱布过滤， 取过滤清液 ； 滤饼再加入 纯化水洗涤， 多层纱布过滤， 将两次过滤清液合并 ； 0018 优选的， 步骤 （4） 中， 所述超滤膜为中空纤维膜或者卷式膜或者管式膜或者陶瓷 膜， 当然， 可用的。
13、超滤设备并不限于此， 只要能达到同样效果的超滤设备， 均可以使用。 0019 优选的， 步骤 （5） 中， 所述干燥采用冷冻干燥或喷雾干燥， 采用冷冻干燥或喷雾干 燥可以防止蛋白质发生变性。 0020 优选的， 步骤 （1） 中， 所述植物蛋白为大豆分离蛋白或者小麦蛋白， 但不限于此， 选 用不同的植物蛋白主要的不同在于产物得率的差异， 同时肽的名称随植物名称而改变。 0021 其他常规工艺控制采用现有技术。 0022 本发明的有益效果为 ： 本发明创造性的利用蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为酶法水解植物 蛋白， 尤其是大豆分离蛋白的酶原， 其水解效率显著提高， 达到 80% 以上， 明显高于其他已 知酶。
14、类 （一般为 40-50%） ， 产物肽含量高， 达到 80% 以上 ； 本发明中还通过在制备环节中添加 使用超滤技术， 使酶解产物分离彻底， 收率高， 制得的大豆肽分子量小、 生物活性高， 更易于 人体吸收 ； 本发明一种大豆肽的酶法制备方法的整个工艺过程条件温和， 对环境友好。 具体实施方式 0023 为更好地理解本发明， 下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述， 但不 可理解为对本发明的限定， 对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的 改进与调整， 也视为落在本发明的保护范围内。 0024 我们采用本发明公开的方法， 进行以下操作 ： 说 明 书 CN 1031467。
15、88 A 4 3/3 页 5 0025 （1） 称取大豆分离蛋白 500g， 采自不二富吉 （北京） 科技有限公司， 食品级， 按照物 料比 1:40（w/v） 加入纯化水 2000ml， 80灭菌 30min（温度不能过高， 防止蛋白质变性） 冷 却至 40 ； 0026 （2） 按植物蛋白重量 1加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶 0.5g （来源 ： 珠海博康药业有限公 司） ； 0027 （3） PH 控制在 6.5， 40保温水解 24h， 80灭活 30min ； 多层纱布过滤， 取过滤清 液 ； 滤饼再加入 500ml 纯化水洗涤， 多层纱布过滤， 将两次过滤清液合并得 1400ml 溶液 ； 0028 （4） 使用截留分子量为10000的中空纤维超滤膜进行超滤， 补加3次纯化水继续超 滤， 得 2000ml 滤液 ； 0029 （5） 将超滤透出液进行冷冻干燥， 得大豆肽粉 17.28g， 重量回收率为 35.56%。 。 0030 我们对得到的大豆肽份进行检测， 其中， 肽含量为 86.0%， 高于已知其他酶类的水 解后的肽含量。 0031 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103146788 A 5 。