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1、(10)申请公布号 CN 103154260 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103154260 A *CN103154260A* (21)申请号 201180032927.8 (22)申请日 2011.06.30 1011079.9 2010.07.01 GB C12P 7/16(2006.01) C12P 7/36(2006.01) C12P 7/34(2006.01) (71)申请人 塞尔特可再生能源有限公司 地址 英国爱丁堡 (72)发明人 简萨曼莎怀特 肯尼思亚历山大利珀 马丁坦尼 桑德拉麦森杰 (74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理 有限公司 11262。
2、 代理人 杨洲 郑霞 (54) 发明名称 制造丁醇或丙酮的工艺 (57) 摘要 提供了一种用于制备丁醇、 丙酮和 / 或其它 可再生的化学物质的工艺， 其中该工艺利用包括 以下的组中的一个或多个 ： 制造麦芽威士忌酒的 副产物， 诸如酒糟和 / 或废粕， 生物质基质， 诸如 纸、 来自造纸的残渣及来自蒸馏酒厂和啤酒厂的 麦糟， 以及稀释剂， 诸如水和来自其它发酵的废 液。该工艺包括处理基质使其水解并使处理过的 基质发酵。还提供了包含根据本发明的工艺制造 的丁醇的生物燃料。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.12.31 (86)PCT申请的申请数据 PCT/GB20。
3、11/051238 2011.06.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/001417 EN 2012.01.05 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图7页 (10)申请公布号 CN 103154260 A CN 103154260 A *CN103154260A* 1/2 页 2 1. 一种用于制造丁醇和 / 或丙酮的工艺， 包括至少以下步骤 ： - 处理包含糖类源和酒糟的基质以使所述糖类源的至少一部分溶解以提供处理过的基 质 ； 及 -在形成丁醇和/。
4、或丙酮的微生物的培养物的存在下， 在小于20M的游离铜离子的浓 度下， 使所述处理过的基质发酵以提供含有丁醇和 / 或丙酮的发酵产物。 2. 如权利要求 1 所述的工艺， 其中处理所述基质的步骤包括 ： - 在水和氢离子或者水和氢氧根离子的存在下使所述糖类源水解。 3. 如权利要求 1 或权利要求 2 所述的工艺， 其中处理所述基质的步骤包括 ： - 在硫酸水溶液的存在下使所述糖类源水解。 4. 如权利要求 1 至 3 中任一项所述的工艺， 其中处理所述基质的步骤包括 ： - 用一种或多种酶来处理所述糖类源。 5. 如权利要求 1 至 4 中任一项所述的工艺， 其中处理所述基质的步骤还包括 ：。
5、 - 稀释所述基质以提供小于 20M 的游离铜离子的浓度。 6. 如权利要求 1 至 5 中任一项所述的工艺， 其中使所述处理过的基质发酵的步骤在 5.1 或 5.1 以上的 pH 下进行。 7. 如权利要求 1 至 6 中任一项所述的工艺， 其中在发酵步骤中所述游离铜离子的浓度 小于 15M。 8. 如权利要求 1 至 7 中任一项所述的工艺， 其中所述形成丁醇和 / 或丙酮的微生物的 培养物包括梭菌属的细菌。 9. 如权利要求 1 至 8 中任一项所述的工艺， 其中发酵步骤在不从其中除去固体的情况 下进行。 10. 如权利要求 1 至 9 中任一项所述的工艺， 其中处理步骤和发酵步骤同时进。
6、行。 11. 如权利要求 1 至 9 中任一项所述的工艺， 其中处理步骤和发酵步骤按顺序进行。 12. 如权利要求 1 至 11 中任一项所述的工艺， 其中所述酒糟通过以下步骤提供 ： - 向包含水和选自包括葡萄糖和葡萄糖的寡糖的组的一种或多种糖类的麦芽汁中加入 酵母 ； - 使所述麦芽汁发酵以提供包含水和一种或多种醇的酒醪 ； 及 - 在铜制蒸馏容器中稀释所述酒醪以提供包含一种或多种醇和酒糟的蒸馏残余物的低 度酒蒸馏物。 13. 如权利要求 12 所述的工艺， 其中所述麦芽汁通过以下另外的步骤提供 ： - 将包含淀粉的发芽大麦磨碎以提供磨碎的发芽大麦 ； - 使所述磨碎的发芽大麦与水混合以提。
7、供包含水和磨碎的发芽大麦的麦芽浆 ； - 使所述麦芽浆的所述磨碎的发芽大麦中的至少一部分淀粉水解以提供包含废大麦固 体的糟粕和包含水和选自包括葡萄糖和葡萄糖的寡糖的组的一种或多种糖类的麦芽汁 ； 及 - 使所述糟粕与所述麦芽汁分离。 14.如权利要求1至13中任一项所述的工艺， 其中所述酒糟是制造麦芽威士忌酒、 优选 苏格兰麦芽威士忌酒的副产物。 15. 如权利要求 1 至 14 中任一项所述的工艺， 其中所述糖类源选自包括以下的组的一 种或多种 ： 纸、 来自造纸的残渣、 水果和蔬菜废弃物、 来自烘焙工业的废弃物、 海藻及海藻提 权 利 要 求 书 CN 103154260 A 2 2/2 。
8、页 3 取物、 林业衍生产品、 粮食作物、 谷物残余物和作物残余物、 麦糟、 巧克力、 藻类、 不可食用作 物及其残余物， 及能源作物。 16.如权利要求1至15中任一项所述的工艺， 其中所述发酵产物还包括选自包括乙醇、 二氧化碳、 氢、 醋酸酯和丁酸酯的组的一种或多种化合物。 17. 一种生物燃料， 包含根据权利要求 1 至 16 中任一项所述的工艺制造的丁醇。 18.一种产品， 包含根据权利要求1至16中任一项所述的工艺制造的丁醇和/或丙酮。 19. 来自生产麦芽威士忌酒的酒糟在通过发酵来制造丁醇和 / 或丙酮中的用途。 权 利 要 求 书 CN 103154260 A 3 1/9 页 4。
9、 制造丁醇或丙酮的工艺 发明领域 0001 本发明涉及用于制造生物燃料和可再生化学物质的工艺。更具体地， 本发明涉及 用于制造丁醇的工艺。本发明还涉及用于制造丙酮的工艺。 0002 发明背景 0003 近些年来， 较高的油价、 耗尽的燃料供应和环境关注已重新引起对由生物质来 生产燃料 (“生物燃料” ) 的兴趣。生物丁醇是通过利用细菌 ( 通常是梭菌属 (genus Clostridium)使生物质发酵而产生的。 除丁醇以外， 这些生物体还产生丙酮(其为重要的 溶剂 ) 和乙醇。这样的发酵反应通常被称为 “ABE 工艺” ( 丙酮 / 丁醇 / 乙醇工艺 )。当前 使用的原料或基质包括能源作物。
10、， 诸如甜菜、 甘蔗、 玉米谷物和小麦， 以及农业副产物， 诸如 秸秆和玉米秆。 在发酵过程中这样的基质提供了对促进生物体的生长所必需的营养物的平 衡。与使用乙醇相比， 使用生物丁醇作为燃料具有一些优势。然而， 目前由于生物丁醇生产 比乙醇生产昂贵， 因此其没有大规模地商业化。 0004 目前通过发酵来制造丁醇和 / 或丙酮的许多基质利用以上讨论的能源作物， 这些 能源作物作为食品的成分而不是作为用于生物燃料的基质已经是需求量大的。因此， 存在 对提供一种利用可选择的基质来制造丁醇和 / 丙酮的工艺的需求。 0005 与能源作物和农业副产物一样， 其它有机材料诸如制造工艺的有机废产物和 / 或。
11、 有机副产物可以是潜在的基质组分。然而， 许多被证明是不合适的。例如， 一些有机废产物 或副产物可能不含有适合于促进生物体生长的均衡营养物， 可能对生物体有害和 / 或可能 不含有可进入生物体的形式的足够的必需营养物。因为这一原因， 许多有机废弃物或副产 物作为基质具有有限的作用且因此具有很小的经济价值。 0006 本发明提供了利用包括作为制造威士忌酒(尤其是麦芽威士忌酒)的一部分而产 生的酒糟 (pot ale)、 低价值有机副产物的基质来制造丁醇和 / 或丙酮的工艺。 0007 麦芽威士忌酒是指仅由发芽大麦的谷物生产的威士忌酒。 麦芽威士忌酒的生产以 通过将大麦浸泡在水中使大麦发芽开始。 。
12、发芽释放分解谷物中的淀粉并将淀粉转化成糖的 酶。当达到期望的发芽状态时， 将发芽大麦干燥。将干燥的发芽大麦在芽浆桶中捣碎。捣 碎时， 允许在发芽过程中产生的酶将大麦淀粉转化或水解为糖。得到的含有糖的液体被称 为麦芽汁。将该麦芽汁转移到被称为发酵槽的大容器中， 在其中使麦芽汁冷却并允许发酵 形成 “酒醪 (wash)” 。在提取可溶性糖或麦芽汁之后残留的残余物被称为糟粕。糟粕包含 废大麦固体或麦糟 (spent grain)。 0008 将酒醪在铜制蒸馏容器或罐式蒸馏锅(也称为初馏锅)中蒸馏以产生含酒精的液 体蒸馏物， 也称为低度酒。将酒精 (spirit) 第一次蒸馏之后残留在初馏锅中的蒸馏残。
13、余物 或液体 (liquor) 称为酒糟或过烧强麦酒。在酒精蒸馏锅中使低度酒进行第二次蒸馏并且 有时进行第三次以产生无水酒精 (raw spirit)， 其在橡木桶中陈化以产生麦芽威士忌酒。 第二次以及后续的蒸馏中残留的液体被称为废粕 (spent lees)。 0009 因此， 制造麦芽威士忌酒的副产物包含糟粕 (draff)、 酒糟和废粕。酒糟具有低的 总固体含量并含有死亡的酵母细胞、 酵母残余物、 可溶性蛋白、 可溶性营养物、 糖类以及来 说 明 书 CN 103154260 A 4 2/9 页 5 自发酵步骤和捣碎步骤的其它材料。酒糟还可含有来自蒸馏锅自身的大量的铜。酒糟中的 营养物是。
14、低的并可能具有高的含铜量， 使其难以在工业中进行处置。以对工业的代价被大 量地处置到海中。 0010 发明概述 0011 本申请的发明人开发了利用可获自制造麦芽威士忌酒的酒糟、 低的或负的经济价 值的副产物， 以及糖类源诸如获自有机废产物和 / 或有机副产物的一些来制造丁醇、 丙酮 和 / 或任选地其它化学物质的工艺。 0012 根据本发明的第一方面， 提供了用于制造丁醇和 / 或丙酮的工艺， 包括至少以下 步骤 ： 0013 - 处理包含糖类源和酒糟的基质以使糖类源的至少一部分溶解以提供处理过的基 质 ； 及 0014 -在形成丁醇和/或丙酮的微生物的培养物的存在下， 在小于20M的游离铜离。
15、子 的浓度下， 使处理过的基质发酵以提供含有丁醇和 / 或丙酮的发酵产物。 0015 在一个实施方案中， 酒糟是制造麦芽威士忌酒 ( 优选地是苏格兰麦芽威士忌酒 ) 的副产物。 0016 在另一个实施方案中， 糖类源可包括但不限于城市有机废弃物、 工业有机废弃物、 农作物和作物残余物、 木材和林业废弃物、 海洋生物质和生物能源作物。因此， 糖类源可选 自包括以下的组中的一种或多种 ： 纸、 来自造纸的残渣、 麦糟诸如来源于蒸馏酒厂和啤酒厂 (brewer) 的那些、 水果和蔬菜废弃物、 来自烘焙工业的废弃物、 海藻及海藻提取物、 木片及 其它林业衍生产品、 粮食作物、 谷物残余物和作物残余物、。
16、 巧克力、 藻类 ( 大型藻类和微藻 类 )、 不可食用作物 ( 及残余物 )， 及能源作物诸如柳枝稷。根据优选的实施方案， 糖类源不 是麦芽威士忌酒糟粕。 0017 在特别优选的实施方案中， 基质是纸， 诸如废纸。可选择地， 基质可以是食品废弃 物和 / 或小麦或小麦来源的基质诸如面包。 0018 在另一个实施方案中， 发酵产物还可包括选自包括乙醇、 二氧化碳、 氢、 醋酸酯和 丁酸酯的组的一种或多种化合物。 0019 在另一实施方案中， 基质还可包括稀释剂。在某些实施方案中， 稀释剂选自包括 水、 废粕以及来自其它发酵的废液的组中的一种或多种。具体地， 稀释剂可以是水。 0020 在又一个。
17、实施方案中， 处理基质的步骤还可包括 ： 0021 - 稀释基质以提供小于 20M 的游离铜离子浓度。 0022 在一个实施方案中， 处理基质的步骤可包括 ： 0023 - 在水和氢离子或者水和氢氧根离子的存在下使糖类源水解。 0024 在另一个实施方案中， 处理基质的步骤可包括 ： 0025 - 在硫酸水溶液的存在下使糖类源水解。 0026 在另一个实施方案中， 处理基质的步骤不包括在高温 ( 即， 在 120以上， 优选地 在 100以上， 且更优选地在 80以上 ) 下加热基质和 / 或用酸诸如硫酸来处理基质。这 一特别的实施方案特别适合于纸或纸来源的产品作为基质的处理。 0027 在又。
18、一个实施方案中， 处理基质的步骤包括 ： 0028 - 用一种或多种酶来处理糖类源。 说 明 书 CN 103154260 A 5 3/9 页 6 0029 在一个实施方案中， 使处理过的基质发酵的步骤可在 5.1 或 5.1 以上的 pH 下， 更 通常地在 5.3 至 5.7 的范围内的 pH 下， 更通常地在约 5.5 的 pH 下进行。在另一个实施方 案中， 在使处理过的基质发酵的步骤过程中可用缓冲液来调节 pH。可选择地， 不需要 pH 调 节， 特别是当基质来自木材或纸来源时。 0030 在另一实施方案中， 在发酵步骤中游离铜离子的浓度可以是小于 15M。在另一 个实施方案中， 在。
19、发酵步骤中可通过向处理过的基质中加入稀释剂 ( 诸如以上描述的稀释 剂 ) 来降低游离铜离子的浓度。 0031 在又一个实施方案中， 形成丁醇和 / 或丙酮的微生物的培养物可包含 梭 菌 属 的 细 菌 诸 如 ： 丙 酮 丁 醇 梭 菌 ATCC 824(C.acetobutylicum ATCC 824)、 C.saccharolyticum NCP 262、拜 氏 梭 菌 NCIMB 8052(C.beijerinckii NCIMB8052) 和 C.saccharoperbutylacetonicum NCIMB 12606(N1-4)。 0032 在另一实施方案中， 发酵步骤可在不。
20、从其中除去固体的情况下进行。 0033 在另一个实施方案中， 处理步骤和发酵步骤可同时进行或者可按顺序进行。 0034 在一个实施方案中， 可通过以下步骤提供酒糟 ： 0035 - 向包含水和选自包括葡萄糖和葡萄糖的寡糖的组的一种或多种糖类的麦芽汁中 加入酵母 ； 0036 - 使麦芽汁发酵以提供包含水和一种或多种醇的酒醪 ； 及 0037 - 在铜制蒸馏容器中稀释酒醪以提供包含一种或多种醇和酒糟的蒸馏残余物的低 度酒蒸馏物。 0038 在另一个实施方案中， 麦芽汁可通过以下另外的步骤来提供 ： 0039 - 将包含淀粉的发芽大麦磨碎以提供磨碎的发芽大麦 ； 0040 - 使磨碎的发芽大麦与水。
21、混合以提供包含水和磨碎的发芽大麦的麦芽浆 ； 0041 - 使麦芽浆的磨碎的发芽大麦中的至少一部分淀粉水解以提供包含废大麦固体的 糟粕和包含水和选自包括葡萄糖和葡萄糖的寡糖的组的一种或多种糖类的麦芽汁 ； 及 0042 - 使糟粕与麦芽汁分离。 0043 根据本发明的另一方面， 提供了包含根据本发明的任一方面的工艺制造的丁醇的 生物燃料。 0044 根据本发明的另一方面， 提供了包含根据本发明的任一方面的工艺制造的丁醇和 / 或丙酮的产品。 0045 根据本发明的又一方面， 提供了来自生产麦芽威士忌酒的酒糟在通过发酵来制造 丁醇和 / 或丙酮中的用途。发明详述 0046 本发明在通过发酵工艺来。
22、制造丁醇和 / 或丙酮中利用酒糟和糖类源作为基质。具 体地， 该发明人惊奇地发现， 可以在酒糟的存在下进行发酵。预期的是， 来自铜制初馏锅的 酒糟中的高的含铜量将抑制形成丁醇和 / 或丙酮的微生物， 诸如梭菌属的细菌。然而， 该发 明人表明， 当基质具有 20M 以下的游离铜离子的浓度时， 不存在抑制效果。 0047 由铜制初馏锅 (copper pot) 的第一蒸馏残余物直接提供的酒糟通常具有对形成 丁醇和 / 或丙酮的微生物有害的水平的游离铜离子的浓度， 诸如超过 20M 的铜浓度。因 此， 未改性的酒糟可能不是用于形成生物质基质的合适的培养基。然而， 对形成丁醇和 / 或 丙酮的微生物不。
23、产生抑制的游离铜离子浓度可通过降低游离铜离子浓度 ( 例如在酒糟与 说 明 书 CN 103154260 A 6 4/9 页 7 糖类源结合以提供基质之前、 在酒糟与糖类源结合以提供基质之后， 或者在处理基质以提 供处理过的基质之后通过稀释酒糟 ) 来实现。然而， 显然， 每当进行游离铜离子浓度的降低 时， 这优选地应该在包含酒糟的处理过的基质与形成丁醇和 / 或丙酮的微生物结合之前， 以防止微生物被损害。 0048 酒糟在制造丁醇、 丙酮和 / 或其它可再生化学物质中的用途具有若干相关的优 势。当前， 酒糟被分类为具有低的或负的经济价值。在本发明中酒糟的用途使得酒糟的经 济价值增加。此外， 。
24、酒糟作为稀释剂以使糖类源发生水合。因此， 当使用酒糟时降低了所需 的水或其它稀释剂的量。另外， 酒糟提供了对微生物的必需营养物 ( 尤其提供了氮源 )， 从 而改善了发酵以及基质到产品的总体转化。 0049 有机废弃物或副产物作为基质中的糖类源在制造丁醇和 / 或丙酮和任选地其它 化学物质中的用途的优势还在于 ： 对这些基质的处理提供了解决方案。 在某些方面， 本发明 利用纸且尤其是废纸作为糖类源。因此， 本发明还提供了处理废纸 ( 例如， 旧报纸或用过的 复印纸 ) 的解决方案。应注意， 发现酒糟的使用对于由基于纸的基质生产用于生产丁醇和 / 或丙酮的合适的发酵培养基是必需的。 0050 基。
25、质必须被处理以使糖类源的至少一部分水解。溶液化可采取水解的形式， 因此 将糖类源分解成适合于发酵的形式。 因此， 在某些实施方案中， 使基质经受一个或多个处理 步骤以使糖类源溶解且尤其是使糖类源水解， 例如， 捣碎、 加热、 加入酸或碱、 加入酶， 或其 组合。在某些实施方案中， 处理基质以使糖类源溶解包括在水和氢离子或水和氢氧根离子 的存在下使糖类源水解的步骤。在某些实施方案中， 处理糖类源以使其溶解是在能够使糖 类源水解的任何合适的酸的存在下进行的。合适的酸的实例包括硫酸和硝酸。硫酸是用于 本文所描述的工艺中的酸的优选的实例。当基质是基于纸的或纸来源的时， 不需要温度或 酸处理。 0051。
26、 在某些实施方案中， 处理基质以使糖类源水解包括加入一种或多种酶， 诸如纤维 素酶和半纤维素酶。在某些实施方案中， 可以利用处理的组合 ( 例如， 加入酸和酶 ) 以提供 适合于发酵的形式的处理过的基质。处理的组合可被同时应用或按顺序应用。 0052 在其中基质包括纸、 废纸、 小麦和基于小麦的产品诸如面包的至少一种的另一实 施方案中， 处理可包括加入酶。这种酶处理可在比对于酶活性来说最佳的温度 ( 即， 约 50 ) 低的温度下发生。更具体地， 温度可以与发酵温度 ( 例如 33 ) 相同， 允许两个过 程同时进行。合适的温度范围可以是 25 至 40， 优选地是 30 至 35， 且更优选。
27、地是 32 至 34。可以仅需要酶处理， 因为在产品诸如面包和 / 或废纸的制造早期的步骤可使糖类含 量浓缩并除去抑制材料 ( 例如来自基于纸的产品的木素 )。 0053 处理过的基质的发酵在 5.1 或 5.1 以上的范围的 pH 下， 更优选地在 5.2 至 6.2 的 范围的 pH 下， 更加优选地在 5.3 至 5.7 的范围的 pH 下， 且还更优选地在约 5.5 的 pH 下进 行。表明 5.3 至 5.7 的 pH 范围的使用提供了丁醇和 / 或丙酮的高收率。此外， 这一 pH 范 围允许在无需从其中除去固体的情况下进行发酵， 因此降低了成本并避免了由需要除去固 体而引起的任何技。
28、术问题。这一 pH 范围避免了来自处理过的基质的任何可能的毒性， 同时 使丁醇和 / 或丙酮的生产最大化。 0054 发酵在形成丁醇和 / 或丙酮的微生物的培养物的存在下进行。形成丁醇和 / 或丙 酮的微生物可选自能够使基质发酵形成丁醇和 / 或丙酮的任何产生溶剂的微生物。合适 说 明 书 CN 103154260 A 7 5/9 页 8 的微生物包括被改造为产生溶剂的微生物。合适的微生物的实例包括当前被用于 ABE( 丙 酮 / 丁醇 / 乙醇 ) 制造中的那些， 并且， 具体地包括梭菌属的细菌诸如丙酮丁醇梭菌、 拜 氏 梭 菌、 C.saccharoperbutylacetonicum 和。
29、 C.saccharobutylicum。 在 一 些 实 施 方 案 中， 形成丁醇和 / 或丙酮的微生物包括丙酮丁醇梭菌。在其它实施方案中， 微生物包括 C.saccharoperbutylacetonicum。这种特定的菌株对基于纸的基质特别地有效。 0055 发酵在小于 20M 的游离铜离子的浓度下进行。这确保了存在的铜离子不具有不 利作用 / 具有最低限度的不利作用。在某些实施方案中， 可加入水或另外的水溶液以使游 离铜离子的浓度降低至低于 20M 的游离铜离子。在某些实施方案中， 在至少发酵步骤过 程中游离铜离子的浓度小于 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 1。
30、2、 11、 10、 9、 8、 7、 6 或 5M 的游离铜 离子。在某些实施方案中， 游离铜离子的浓度小于 15M。在某些实施方案中， 游离铜离子 的浓度小于 10M。 0056 在某些实施方案中， 处理步骤和发酵步骤同时进行。 这降低了所需的时间量、 所涉 及的步骤数以及相关的制造成本。 0057 在可选的实施方案中， 处理步骤和发酵步骤按顺序进行。例如， 在进行发酵之前， 可以用两个步骤， 首先用酸， 然后用酶来预处理基质。 0058 在某些实施方案中， 发酵产物还包含选自包括乙醇、 二氧化碳、 氢、 醋酸酯和丁酸 酯的组的一种或多种化合物。可利用常规的分离技术将丁醇和 / 或丙酮从发。
31、酵产物中分离 出来。可选择地， 发酵产物可以被用作燃料或另外无需进一步纯化。 0059 如本文所用的， 术语 “生物丁醇” 是指由生物质制成的丁醇。 0060 如本文所用的， 术语 “酒糟” 是指在麦芽威士忌酒的制造中， 在第一次蒸馏之后酒 醪 ( 铜制初馏锅 ) 中残留的液体。酒糟为通过蒸馏来提取低度酒之后的酒醪的残余物。 0061 如本文所用的， 术语 “废粕” 是指在麦芽威士忌酒的制造中， 在第二次蒸馏以及后 续的蒸馏之后蒸馏容器中残留的液体。 废粕为通过蒸馏来提取无水酒精之后的低度酒的残 余物。 0062 术语 “游离铜离子的浓度” 是指没有结合到固体的铜离子的浓度， 也就是说， 在上。
32、 清液中的铜离子的浓度。酒糟中的铜的总浓度将比游离铜离子的浓度高， 因为一些铜仍然 结合到固体， 诸如死亡的酵母细胞。 0063 如本文所用的， 术语 “苏格兰威士忌酒” 是指在苏格兰制造的威士忌酒。在可选择 的实施方案中， 麦芽威士忌酒是在其它国家诸如爱尔兰或印度制造的麦芽威士忌酒， 其中 在那些国家中用于制造麦芽威士忌酒的工艺与在苏格兰使用的用于制造苏格兰麦芽威士 忌酒的工艺类似或相同。 0064 现将参照以下实施例来描述本发明， 这些实施例是为了说明的目的而提供并且不 旨在被解释为对本发明的限制。 0065 附图简述 0066 图 1 显示了初始 pH 对酸和酶预处理过的糟粕在酒糟中由丙。
33、酮丁醇梭菌 ATCC 824 发酵的影响。将糟粕用 0.08M H2SO4预处理并在加入酶之前将 pH 调节至 pH 5.0-6.0 之间。 酶水解之后， pH 被调节至 4.5、 4.8、 5.0、 5.5、 6.0 或 6.5 以进行发酵。图 1(a) 显示了由酸 和酶处理产生的糖， 图 1(b) 显示了发酵之后的残糖， 图 1(c) 显示了发酵产生的 ABE 产物， 且图 1(d) 显示了糟粕产生的丁醇及 ABE 的收率 ； 说 明 书 CN 103154260 A 8 6/9 页 9 0067 图 2 显示了由溶解于水或 50酒糟中的 (a) 白色的办公用纸和 (b) 报纸通过 C.s。
34、accharoperbutylacetonicum NCIMB 12606 产生的 ABE。 0068 图3显示了由水、 醋酸铵或50酒糟溶解的白纸进行发酵(150ml)来生产丙酮、 丁 醇和乙醇。 0069 图 4a 至 4c 显示了用四种梭菌菌株对 a) 白纸、 b) 新闻用纸和 c) 传单用纸进行发 酵 (150ml) 来生产丙酮、 丁醇和乙醇。将基质在 50酒糟中稀释， 缓冲至 pH 5.5 并用工业 酶处理。 0070 图 5 显示了在酒糟中用四种梭菌菌株对面包进行发酵 (150ml) 来生产丙酮、 丁醇 和乙醇。 0071 图 6 显示了在酒糟中用四种梭菌菌株对小麦进行发酵 (15。
35、0ml) 来生产丙酮、 丁醇 和乙醇。 0072 图 7 显示了在酒糟中用两种梭菌菌株对食品废弃物进行发酵 (150ml) 来生产丙 酮、 丁醇和乙醇。 0073 图8显示了在酒糟中用四种梭菌菌株对受过酸处理的小麦进行发酵(150ml)来生 产丙酮、 丁醇和乙醇。 0074 图 9 显示了用新闻用纸、 白纸和传单用纸且无缓冲下进行发酵 (1 升 ) 来生产丙 酮、 丁醇和乙醇。 实施例 0075 参照实施例 1 和实施例 2 以及实施例 3 显示了 pH 和基质的游离铜离子浓度对发 酵工艺的影响。在参照实施例 1 和实施例 3 中， 葡萄糖被用作糖类源。参照实施例 1 因在 基质中不存在酒糟而。
36、被指定为参照试验。 0076 参照实施例1显示， ABE可在4.5之上至6.5的pH范围内由葡萄糖的发酵来生产。 在 4.5 的 pH 下， 没有葡萄糖被消耗或没有 ABE 产生。在 6.5 的 pH 下， 仅产生酸， 而没有产 生 ABE。实施例 2 显示了用于包含酒糟的基质以及基质 ( 糟粕 ) 进行发酵的约 5.5 的优选 的初始 pH 范围。 0077 实施例 3 显示出未稀释的酒糟具有对发酵有害的游离铜离子浓度， 导致与未加入 游离铜离子的基质相比降低的 ABE 收率。此外， 随着游离铜离子的浓度从 20M 降低至 5M， ABE 的收率增加至未加入游离铜离子的基质所获得的收率。 0。
37、078 实施例 4 显示， 与加入稀释剂诸如水相比， 向基质中加入酒糟导致 ABE 收率增加。 0079 实施例 5 显示， 向基质中加入酒糟具有与加入硫酸铵相同的效果， 这表明酒糟作 为氮源。 0080 实施例6显示， 可利用酒糟结合各种基质和微生物来产生ABE。 所示例的基质是各 种类型的纸质材料、 面包、 小麦和食品废弃物。 0081 实施例 7 显示， 某些基质不需要进行酸处理。实际上， 酸处理的小麦比未处理的小 麦的 ABE 的收率低。 0082 实施例 8 显示， 基于纸的基质不总是需要发酵前缓冲。 0083 一般方法 0084 以下生物体被使用 ： 丙酮丁醇梭菌 ATCC 824。
38、、 C.saccharolyticum NCP262、 拜氏 说 明 书 CN 103154260 A 9 7/9 页 10 梭菌 NCIMB 8052 和 C.saccharoperbutylacetonicum NCIMB12606(N1-4)。梭菌被维持为 在 4下的孢子悬液。在 80下使孢子热激 10 分钟并接种到强化梭菌培养基 (RCM， Oxoid Ltd， Cambridge， UK) 中。 0085 在实施例 1 至 3 中， 在被用作所有实验的起始培养物 ( 以 5 v/v) 之前， 将培 养物温育 24 小时， 然后传代培养到胰蛋白胨 - 酵母提取物 - 醋酸铵培养基 (T。
39、YA) 的含 有葡萄糖的培养基中。TYA 由以下组成 (g/l) ： 胰蛋白胨， 6 ； 酵母提取物， 2 ； 醋酸铵， 3 ； KH2PO4， 0.5 ； MgSO4.7H2O， 0.3 ； FeSO4.7H2O， 0.01 ； 补充有 5葡萄糖。在无氧工作区域中在 N2-H2-CO2(80 10 10) 的气氛下在 33下温育所有梭菌培养物。在实施例 4 至 8 中， 将 起动培养物温育 24 小时， 然后传代培养到被缓冲至 pH 5.5 的 50酒糟中。在无氧工作区 域中在 N2-H2-CO2(80 10 10) 的气氛下在 33下温育所有梭菌培养物。在无氧工作区 域中在玻璃瓶中进行小规。
40、模的发酵 (150ml)。 0086 对于 1L 的规模， 在发酵罐 (Biostat A Plus， Sartorius Stedim Ltd， Surrey， UK) 中进行发酵。在用梭菌接种之前， 通过用无氧 N2喷雾发酵罐中的培养基持续 1 小时来达到 无氧条件。对于所有 1L 发酵， 搅动被设定为 200rpm 且温度为 33。 0087 酒糟获自酒厂并按体积计以 1 1 的比用水稀释。这足以使游离铜离子的浓度降 低至小于 20M。 0088 从酒厂接收到的湿糟粕具有在 75 -80之间的含水量。如所陈述的， 将糟粕在 80下干燥至大约 4的含水量并且在进一步处理之前将其研磨。 00。
41、89 利用配备有火焰电离检测器和长度为 10m 且直径为 0.32mm 的 CPSIL 5CB 柱的 Chrompack 9001 气相色谱仪 ( 全部是 Chrompack， Middelburg， Netherlands) 来测量乙醇、 丙酮和丁醇。在分析之前， 通过 0.2m 的醋酸纤维素注射器式过滤器过滤所有样品， 然后 参照乙醇、 丙酮和丁醇标准品来测定浓度。 0090 对于酸(醋酸和丁酸)和单糖(葡萄糖、 木糖和阿拉伯糖)的分析， 通过0.2m的 注射器式过滤器过滤样品并用 H2SO4酸化。利用安装有集成的 UV-VIS 双波长检测器和折射 率检测器的 Varian 920LC(V。
42、arian Ltd.， Oxford， UK) 通过 HPLC 来分析样品。在室温下在 Rezex ROA 有机酸 H+8 3007.8mm 柱 (Phenomenex， Cheshire， UK) 上用 0.005N 的 H2SO4 作为流动相以 0.5ml/min 的流速分离各组分。在 210nm 下检测酸， 而用 RI 检测器检测糖， 并且参照相应的标准品来测定浓度。 0091 参照实施例 1-pH 控制对由梭菌产生 ABE 的影响 0092 研究了 pH 对在 TYA 培养基中通过丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 进行葡萄糖的发酵的影 响。在 1L 规模下进行发酵， 且 pH 被控制在 。
43、pH 4.5-6.5 之间的设定点的范围内， 且自动加 入碱或酸。在 pH 4.5 下， 未检测到葡萄糖利用、 酸或 ABE 产生。对于所有其它发酵， 在 48 小时内葡萄糖被完全消耗并且产生酸 ( 丁酸和醋酸 ) 和溶剂 ( 丙酮、 丁醇和乙醇 )( 表 2)。 在 pH4.8 和 5.0 时 ABE 产量最高， 分别对应于 0.34 和 0.30g ABE/g 糖的收率。在 pH 5.5 至 6.5 之间， 酸产量增加， 且使糖至 ABE 的转化相应地降低。在 pH6.5 时， 仅产生酸， 且分别 为 7.8 和 12.8g/l 的醋酸和丁酸的最终浓度。 0093 表 1. 在 pH 4.。
44、8、 5.0、 5.5、 6.0 或 6.5 控制下的 TYA 培养基中通过丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 由 5葡萄糖至酸和 ABE 的转化。在 68 小时之后测定酸 ( 丁酸和醋酸 ) 的浓度 和 ABE 的浓度， 其中 ABE 收率表达为 g 产生的 ABE/g 消耗的糖。 说 明 书 CN 103154260 A 10 8/9 页 11 0094 0095 实施例 2- 初始 pH 对通过梭菌产生的 ABE 的影响 0096 研究了初始 pH 对包含糟粕和酒糟的预处理的基质的发酵的影响。通过向具有在 50酒糟中的0.08MH2SO4的250ml的duran瓶中加入10.5(w/v)且在。
45、121下灭菌15分 钟来预处理干燥的研磨的糟粕。冷却后， 通过加入 10M NaOH 将 pH 调节至 pH 5.0-6.0 之间 并在33下用纤维素酶和半纤维素酶温育24小时。 为了发酵， 在用丙酮丁醇梭菌ATCC 824 温育之前， 溶液的初始 pH 被调节至 4.5、 4.8、 5.0、 5.5、 6.0 或 6.5。在发酵之前监测初始糖 浓度， 并且在发酵之后计算残糖、 ABE 浓度和 ABE 收率 ( 图 1)。对于所有样品来说， 初始糖 浓度类似， 其中大约是 9.6、 11.2 和 9.9g/l 的葡萄糖、 木糖和阿拉伯糖。在 pH 5.0 或更低 的 pH 下未显示出生长或气体。
46、产生， 并且糖未被利用。在 pH 5.5 下 ABE 的产量最多 (14.2g/ l)， 具有 13.2g/100g 糟粕的收率。在 pH 6.0 下 ABE 的产量下降， 具有 9.3gABE/100g 糟粕。 在 pH 6.5 下， 利用了大约一半的糖， 但是很差地转化成 ABE， 且最终浓度为 2.3g/l。 0097 实施例 3- 酒糟作为用于通过梭菌来生产 ABE 的生长培养基 0098 从苏格兰麦芽酒厂中收集酒糟并分析含铜量。酒糟具有 71.8M 的总的 Cu， 其中 21.1M 被确定为可以上清液中的 “游离” Cu 的形式获得， 且剩余部分被束缚到固体。为了 评估这种 Cu 浓。
47、度对丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 是否是有毒的， 比较了在补充有不同浓度的 Cu 的 100ml TYA 培养基中的 5葡萄糖的发酵 ( 表 3)。Cu 在 5M 和 10M 下对 ABE 生产没 有影响， 具有与没有Cu的对照的ABE浓度类似的大约12g/l的ABE浓度。 在较高的Cu浓度 下， ABE浓度降低至8.6g/l， 表明在此浓度下的Cu对梭菌产生抑制。 由于酒糟具有21.1M 的 “游离” Cu 含量， 因此决定测试在半强度酒糟中的梭菌发酵以使 Cu 浓度降低到抑制水平 以下。补充有葡萄糖的半强度酒糟提供了用于 824 生长的足够的营养物， 且 ABE 生产类似 于 TYA 对。
48、照 ( 表 3)。 0099 表 2. 在 TYA、 含有 5M、 10M 或 20M Cu 或含有 50酒糟的 TYA 中通过丙酮丁 醇梭菌 ATCC 824 的 5葡萄糖至 ABE 的转化。 0100 0101 实施例 4- 将废纸转化成丁醇和丙酮的工艺 0102 将白色的办公用纸和报纸切碎为 5mm 宽的带， 并在 250ml 的 duran 瓶中将 6.7 (w/v) 与水或 50酒糟混合并将 pH 调节至 pH 5.5。灭菌之后， 将瓶冷却并加入纤维素酶 和 C.saccharoperbutylacetonicum NCIMB12606。发酵之后， 测定 ABE 浓度 ( 图 2)。。
49、与在 酒糟中相比， 在水中纸很差地转化成ABE， 说明需要酒糟来提供额外的营养物。 在酒糟中， 用 C.saccharoperbutylacetonicum 进行发酵之后的 ABE 收率是每 100g 办公用纸 24.8g ABE 和每 100g 报纸 16.8g ABE。 说 明 书 CN 103154260 A 11 9/9 页 12 0103 实施例 5- 酒糟作为氮源对通过梭菌来生产 ABE 的影响 0104 通过加工来增加其糖类含量的某些基质可能缺乏氮。 将包含纸作为糖类源和50 酒糟的基质与包含纸和水的基质以及包含纸和含水醋酸铵的基质进行比较。 所使用的做法 与先前实施例所使用的做法相同。 0105 如。