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1、(10)申请公布号 CN 103146653 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146653 A *CN103146653A* (21)申请号 201310061700.7 (22)申请日 2013.02.27 CGMCC No.6910 2012.11.29 C12N 7/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 哈药集团生物疫苗有限公司 地址 150069 黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平 路新发屯 (72)发明人 丁国杰 张杨 郑德富 刘洪斌 焦利红 李东。
2、伟 杨鹏欣 孙心 王全杰 孙德君 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 韩小雷 (54) 发明名称 一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应 株 H11 株及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤 维细胞适应株及其应用。本发明的一种传染性法 氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株， 其保藏编号为 CGMCC NO.6910， 保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心。 此外， 本发明还提供了分 离该 H11 株的方法， 及该毒株在制备预防鸡传染 性法氏囊病的活疫苗中的应用。本发明的提出克 服了鸡胚组织苗成本高、 产品批间。
3、质量相差较大、 且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点， 具有 广泛的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 103146653 A CN 103146653 A *CN103146653A* 1/1 页 2 1. 一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株， 其特征在于所述的适应株命名 为 H11 株， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC NO.6910。 2. 权利要求 1 所述的传染性法。
4、氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株在制备预防鸡传染性 法氏囊病的活疫苗中的应用。 3. 一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物， 其特征在于所述的疫苗组合物中， 其有 效成分包含权利要求 1 所述的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株。 权 利 要 求 书 CN 103146653 A 2 1/8 页 3 一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株 H11 株及其 应用 技术领域 0001 本发明属于生物疫苗领域， 具体涉及一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应 株 H11 株及其应用。 背景技术 0002 鸡传染性法氏囊病 （Infeetious Bursal Disease， IBD） 是由传染性法。
5、氏囊病毒 （Infeetious Bursal Disease Virus， IBDV） 引起的一种高度接触性传染病， 是目前危害世 界养禽业的主要传染病之一， 主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊器官， 该病的危害不仅直接 造成鸡只死亡、 增加淘汰率、 影响增重， 更重要的是破坏法氏囊中的 B 淋巴细胞， 导致免疫 抑制， 使病鸡更易感其它疫病， 对疫苗接种的免疫应答下降或丧失。 0003 由于 IBD 在外界环境中较为稳定， 采取消毒和隔离措施来控制本病不易达到目 的。本病至今仍无有效的治疗方法， 预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种。目前， 市 售的法氏囊疫苗绝大多数为鸡胚组织苗， 相对于细胞。
6、苗而言， 其具有成本高、 产品批间质量 相差较大、 且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点。 2011年初， 哈药集团生物疫苗有限公 司分离了一株法氏囊病毒， 其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性， 基于此， 本研究针对组 织苗的不足， 驯化出了一株细胞适应毒， 命名为 H11 株， 故此， 提出对该病毒株进行专利保 护。 发明内容 0004 针对现有技术中的问题， 本发明提供了一种传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适 应株， 命名为 H11 株， 分类命名为传染性法氏囊病毒， 保藏编号为 CGMCC NO.6910， 保藏日期 为 2012 年 11 月 29 日， 保藏单位为中国微生物菌种保藏管理。
7、委员会普通微生物中心， 地址 位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院。 0005 本发明分离的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株 H11 株通过以下方法制 备得到 ： 0006 1、 病毒的分离 ： 0007 病料来自黑龙江省阿城市郊某养殖场， 采集濒死法氏囊， 无菌条件下剪碎， 氯仿处 理， 离心， 取上清接种鸡胚， 收集48h120h鸡胚和尿囊膜。 用组织捣碎机研磨后， 至-20 保存备用。 0008 2、 病毒分离株的初步鉴定 0009 组织液的红细胞凝集试验呈阴性 ； 与抗鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清进行琼脂 双向扩散试验， 结果为阳性。 0010 3、 在鸡胚原代成纤维细胞 （CEF）。
8、 上的传代与收获 0011 （1） 将收获的组织毒， 用灭菌生理盐水稀释后， 接种长成单层的 CEF 上， 37培养 5 天， 放入 -20中冻融 3 次， 收获病毒液。 说 明 书 CN 103146653 A 3 2/8 页 4 0012 （2） 重复上述试验 10 次， 直至病毒在 CEF 增殖良好， 即得 H11 株。 0013 本发明还提供了所述的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株 H11 株在制备 预防鸡传染性法氏囊病的活疫苗中的应用。 0014 将本发明获得的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株H11株利用CEF细胞生 产 IBDV H11 活疫苗， 其具体方法如下 ： 001。
9、5 1、 生产用毒种制备 0016 （1） 毒种繁殖 0017 将毒种 H11 株 （保藏编号为 CGMCC NO.6910） 用灭菌生理盐水作 103 104倍稀释 后， 接种单层鸡胚成纤维细胞 （CEF） 。弃掉细胞培养液， 按培养液体积的 1/10 接毒， 37吸 附 1 小时， 加入培养液， 并向其添加 1% 体积的 10% 还原型谷胱甘肽溶液。37， 5%CO2条件 下， 培养 3 4 天， 待 80% 细胞出现特异性病变时收获病毒液。于 -20冰柜中反复冻融 3 次， 收获于灭菌容器内， -20保存。注明收获日期、 毒种代次及装量。 0018 （2） 毒种鉴定 0019 应符合生产。
10、用种子标准。 0020 （3） 毒种保存 0021 在 -20以下保存， 应不超过 9 个月。 0022 （4） 毒种继代 0023 应不超过 3 代。 0024 2、 制苗材料制备 0025 （1） 细胞的制备 0026 取 9 10 日龄 SPF 鸡胚， 制备鸡胚成纤维细胞， 37培养， 待细胞长成单层后， 用 质量分数为 0.2% 的胰酶溶液进行消化， 加入原体积 2 倍的含 10% 初生牛血清的 DMEM， 吹打 均匀， 再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养， 直至长成单层， 即可使用。 0027 （2） 传代培养 0028 传代次数不超过 5 代。 0029 3、 IBDV H11。
11、 株细胞病毒液的制备 0030 （1） 接种 0031 弃掉细胞培养液， 取生产用种毒 H11 株， 用灭菌生理盐水作适当稀释 （103 104 倍） ， 按培养液体积的 1/10 接种单层鸡胚成纤维细胞。37吸附 1 小时， 加入培养液， 并向 其添加 1% 体积的 10% 还原型谷胱甘肽溶液， 轻轻混匀， 37培养。 0032 （2） 培养 0033 病毒接种 24 小时后， 每 6 小时向培养液中加入总体积 0.2% 的 0.5mol/LNaHCO3， 培 养 3 4 天， 待 80% 细胞出现特异性病变时收获病毒液。 0034 （3） 病毒液收获 0035 将装有病毒液的培养瓶， 放入。
12、 -20冰柜中反复冻融 3 次， 收获于灭菌容器内， 在 -15以下保存， 应不超过 1 个月。 0036 4、 半成品检验 0037 （1） 无菌检验 0038 每组病毒液分别取样， 应无菌生长。 说 明 书 CN 103146653 A 4 3/8 页 5 0039 （2） 病毒含量测定每 0.2ml 病毒含量应为 105.5EID50， 方可配苗。 0040 5、 配苗及分装 0041 （1） 冻干保护剂的制备 0042 A 液 ： 明胶 5、 蔗糖 5、 糊精 5、 胰蛋白胨 2， 去离子水配制， 116， 高压灭菌 30min， 15保存， 不超过 7 天。 0043 B 液 ： V。
13、c0.1、 山梨醇 2、 谷氨酸钠 1.5， 去离子水配制， 0.22m 滤膜过滤除 菌， 4保存， 不超过 3 天。 0044 （2） 分装 0045 将保护剂 A 液、 B 液按 1 1 体积混合均匀， 将检验合格的细胞病毒液， 按 1 1 加 入保护剂中， 定量分装。 0046 6、 冻干 0047 分装后迅速进行冷冻真空干燥。 0048 进一步的， 本发明还提出了一种预防鸡传染性法氏囊病的疫苗组合物， 其特征在 于所述的疫苗组合物中， 其有效成分包含本发明所述的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞 适应株 （H11 株） 。 具体实施方式 0049 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本。
14、发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0050 材料和试剂 ： 0051 毒 株 ： 传 染 性 法 氏 囊 病 毒 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 适 应 株 H11 株， 保 藏 编 号 为 CGMCCNO.6910， 保藏日期为 2012 年 11 月 29 日， 保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 地址位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院。 0052 材。
15、料 ： 9 10 日龄 SPF 鸡胚、 10 12 日龄 SPF 鸡胚为哈药集团生物疫苗有限公司 SPF 鸡场种蛋在本研发中心孵化、 鸡胚原代成纤维细胞购自中国兽药监察所、 0.22m 滤膜 购自 PALL 公司。 0053 试剂 ： 抗鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所、 还原型谷胱 甘肽购自 Sigma、 胰酶购自 Gibco、 明胶购自 Sigma、 蔗糖购自国药化学试剂有限公司、 糊精 购自上海酶联生化试剂有限公司、 胰蛋白胨购自Amresco、 维生素C购自SIGMA、 山梨醇购自 Amresco、 谷氨酸钠购自 MBCHEM。 0054 实施例 1 传染性法氏囊病毒。
16、鸡胚成纤维细胞适应株 H11 株的分离 0055 1、 病毒的分离 ： 0056 病料来自黑龙江省阿城市郊某养殖场， 采集濒死法氏囊， 无菌条件下剪碎， 氯仿处 理， 离心， 取上清接种鸡胚， 收集48h120h鸡胚和尿囊膜。 用组织捣碎机研磨后， 至-20 保存备用。 0057 2、 病毒分离株的初步鉴定 0058 组织液的红细胞凝集试验呈阴性 ； 与兔抗法氏囊病毒多克隆抗体进行琼脂双向扩 说 明 书 CN 103146653 A 5 4/8 页 6 散试验， 结果为阳性。 0059 3、 在鸡胚原代成纤维细胞 （CEF） 上的传代与收获 0060 （1） 将收获的组织毒， 用灭菌生理盐水稀。
17、释后， 接种长成单层的 CEF 上， 37培养 5 天， 放入 -20中冻融 3 次， 收获病毒液。 0061 （2） 重复上述试验 10 次， 直至病毒在 CEF 增殖良好， 即得 H11 株。 0062 本发明获得的传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株 H11 株， 保藏编号为 CGMCC NO.6910， 保藏日期为 2012 年 11 月 29 日， 保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 地址位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院。 0063 实施例 2 利用传代鸡胚成纤维细胞生产 IBDV H11 活疫苗 0064 1、 生产用毒种制备 0065 （1） 毒种繁殖 0。
18、066 将毒种 H11 株 （保藏编号为 CGMCC NO.6910） 用灭菌生理盐水作 103 104倍稀释 后， 接种单层鸡胚成纤维细胞 （CEF） 。弃掉细胞培养液， 按培养液体积的 1/10 接毒， 37吸 附 1 小时， 加入培养液， 并向其添加 1% 体积的 10% 还原型谷胱甘肽溶液。37， 5%CO2条件， 培养 3 4 天， 待 80% 细胞出现特异性病变时收获病毒液。于 -20冰柜中反复冻融 3 次， 收获于灭菌容器内， -20保存。注明收获日期、 毒种代次及装量。 0067 （2） 毒种鉴定 0068 应符合生产用种子标准。 0069 （3） 毒种保存 0070 在 -2。
19、0以下保存， 应不超过 9 个月。 0071 （4） 毒种继代 0072 应不超过 3 代。 0073 2、 制苗材料制备 0074 （1） 细胞的制备 0075 取 9 10 日龄 SPF 鸡胚， 制备鸡胚成纤维细胞， 37培养， 待细胞长成单层后， 用 质量分数为 0.2% 的胰酶溶液进行消化， 加入原体积 2 倍的含 10% 初生牛血清的 DMEM， 吹打 均匀， 再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养， 直至长成单层， 即可使用。 0076 （2） 传代培养 0077 传代次数不超过 5 代。 0078 3、 IBDV H11 株细胞病毒液的制备 0079 （1） 接种 0080 弃掉。
20、细胞培养液， 取生产用种毒H11株， 用灭菌生理盐水作103104倍适当稀释， 按培养液体积的1/10接种传代后的单层鸡胚成纤维细胞， 37吸附1小时， 加入培养液， 并 向其添加 1% 体积的 10% 还原型谷胱甘肽溶液， 轻轻混匀， 37培养。 0081 （2） 培养 0082 病毒接种 24 小时后， 每 6 小时向培养液中加入总体积 0.2% 的 0.5mol/LNaHCO3， 培 养 3 4 天， 待 80% 细胞出现特异性病变时收获病毒液。 0083 （3） 病毒液收获 0084 将装有病毒液的培养瓶， 放入 -20冰柜中反复冻融 3 次， 收获于灭菌容器内， 说 明 书 CN 1。
21、03146653 A 6 5/8 页 7 在 -15以下保存， 应不超过 1 个月。 0085 4、 半成品检验 0086 （1） 无菌检验 0087 每组病毒液分别取样， 应无菌生长。 0088 （2） 病毒含量测定每 0.2ml 病毒含量应为 105.5EID50， 方可配苗。 0089 5、 配苗及分装 0090 （1） 冻干保护剂的制备 0091 A 液 ： 明胶 5、 蔗糖 5、 糊精 5、 胰蛋白胨 2， 去离子水配制， 116， 高压灭菌 30min， 15保存， 不超过 7 天。 0092 B 液 ： Vc0.1、 山梨醇 2、 谷氨酸钠 1.5， 去离子水配制， 0.22m 。
22、滤膜过滤除 菌， 4保存， 不超过 3 天。 0093 （2） 分装 0094 将保护剂 A 液、 B 液按 1 1 体积混合均匀， 将检验合格的细胞病毒液， 按 1 1 加 入保护剂中， 定量分装。 0095 6 冻干 ： 分装后迅速进行冷冻真空干燥。 0096 试验例 1 利用鸡胚生产 IBDV H11 株活疫苗 0097 1、 生产用毒种制备 0098 （1） 毒种繁殖 0099 将毒种 H11 株用灭菌生理盐水作 100 1000 倍稀释后， 经绒毛尿囊膜途径接种 10 12 日龄 SPF 鸡胚， 每胚 0.2ml。置 37孵育， 选接种 48 120 小时死亡鸡胚， 收取病 变胎儿及。
23、尿囊膜， 装于无菌容器内， 同时吸取部分鸡胚液作无菌检验。将培养无菌的鸡胚、 尿囊膜剪碎混合， 用普通肉汤或同批尿囊液制成 5 倍稀释的乳剂， 离心去渣， 上清液加适量 的抗生素分装， -20保存。注明收获日期、 毒种代次及装量。 0100 （2） 毒种鉴定 0101 应符合生产用种子标准。 0102 （3） 毒种保存 0103 在 -10以下保存， 应不超过 6 个月。 0104 （4） 毒种继代 0105 应不超过 3 代。 0106 2、 制苗材料选择 0107 选择发育良好， 10 12 日龄 SPF 鸡胚作为制苗材料。 0108 3、 制苗毒液的制备 0109 （1） 接种 0110。
24、 取生产用毒种 H11 株， 用灭菌生理盐水稀释 50 100 倍， 每胚经尿囊腔或绒毛尿 囊膜途径接种 0.1 0.2ml， 封口后， 置 37继续孵育， 不必翻蛋。 0111 （2） 孵育和观察 0112 接种后， 将 36 小时前死亡的鸡胚弃去。36 小时后， 每隔 4 8 小时照蛋一次， 随时 取出 48 168 小时死亡鸡胚， 置 2 8冷却。 0113 （3） 收获 说 明 书 CN 103146653 A 7 6/8 页 8 0114 将冷却424小时的鸡胚取出， 用碘酊消毒气室部， 以无菌手术除去蛋壳， 收获胎 儿和尿囊膜， 分组置于无菌容器内， 置-10以下冷冻保存。 在收获。
25、的同时， 应逐个检查胎儿 病变， 须具有传染性法氏囊病病毒 H11 株所引起的特异性病变。 0115 4、 半成品检验 0116 （1） 无菌检验 0117 每组鸡胚分别取样， 应无菌生长。 0118 （2） 病毒含量测定 0119 每 0.2ml 病毒含量应为 105.5EID50， 方可配苗。 0120 5、 配苗及分装 0121 将检验合格的鸡胚、 鸡胚尿囊膜磨碎， 按适当比例加入 5% 蔗糖脱脂奶制成乳剂， 同时加入适量的抗生素充分混匀， 定量分装。 0122 6、 冻干 0123 分装后迅速进行冷冻真空干燥。 0124 试验例 2 0125 实施例 2 通过细胞培养制备的 10 批次。
26、 IBDV H11 株活疫苗 （细胞苗 （毒） ） 与试验例 1 通过组织培养制备的 10 批次 IBDV H11 株活疫苗 （组织苗 （毒） ） 相比较， 现将其中一些指 标的比较结果总结如下 ： 0126 表 1 两种种毒鸡胚毒力的比较 0127 批次12345678910 组织毒20/2019/20 19/20 17/20 17/20 19/20 18/20 20/20 20/20 20/20 细胞毒17/2017/20 20/20 18/20 18/20 18/20 20/20 19/20 19/20 20/20 0128 注 ： 病变数 / 接种数 0129 表 2 两种生产方法半成。
27、品杂检阳性率比较 0130 批次12345678910 组织苗 1%000.5% 01%1.5% 01%0 细胞苗 0000000000 0131 表 3 两种生产方法产品合格率比较 0132 批次12345678910 组织苗99.9% 100%100%100%100%99.5% 100%98%100%99.9% 细胞苗100%100%100%100%100%100%100%100%100%100% 说 明 书 CN 103146653 A 8 7/8 页 9 0133 表 4 两种生产方法产品成本比较 （单位 ： 元 /ml） 0134 批次12345678910 组织苗 1.22 1.2。
28、11.21 1.20 1.201.21 1.22 1.22 1.21 1.25 细胞苗 0.60 0.600.60 0.60 0.600.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0135 表 5 两种生产方法制备的活疫苗不同保存温度病毒含量的比较 （单位 ： 0136 10XELD50/0.2ml） 0137 0138 两种生产方法疫苗免疫保护率的比较 ： 0139 21 28 日龄 SPF 鸡 60 只， 由购自哈药集团生物疫苗有限公司 SPF 鸡场的 SPF 鸡 胚自行孵化后使用。疫苗免疫组为 2 组， 每组 20 只鸡， 分别免疫细胞毒活苗 （按照实施例 2 方法制备得到） 和组织。
29、毒活苗 （按照试验例 1 方法） ， 点眼， 1 羽份 / 只， 另 20 只作对照组。接 种后21日， 免疫组各取10只鸡、 对照组取10只鸡， 用10个法氏囊最小感染量的强毒BC6-85 株点眼 0.1ml， 至 72 小时全部剖检， 观察法氏囊变化， 判断免疫效果， 两种种毒活苗免疫保 护率的比较如表 6 所示。 0140 表 6 两种种毒活苗免疫保护率的比较 0141 批次12345678910 组织苗保护率80%100%90%80%100%90%100%100%100%100% 细胞苗保护率100%80%100%90%100%100%100%100%100%100% 0142 如上表所示， 利用传代细胞生产的疫苗 （细胞苗） 与鸡胚培养的疫苗 （组织苗） 相 比， 保存温度由原来的-15储藏变为28保存 ； 病毒含量、 产品合格率和免疫攻毒保护 说 明 书 CN 103146653 A 9 8/8 页 10 率都有显著的提高 ； 产品的耐热性能显著， 而半成品阳性杂检率和单位体积的生产成本都 有明显的降低， 故细胞苗更能提升产品质量， 节约生产费用。 说 明 书 CN 103146653 A 10 。