表达重组人肿瘤坏死因子受体FC融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103131676 A (43)申请公布日 2013.06.05 CN 103131676 A *CN103131676A* (21)申请号 201310001030.X (22)申请日 2013.01.04 C12N 7/01(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/866(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 天津耀宇生物技术有限公司 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区洞庭路与十三大街交口处天津国际 生物医药联合研究院 S501 (72)发明。

2、人 张耀洲 南芙蓉 张浩 舒特俊 陈剑清 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 张瑾 (54) 发明名称 表达重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白 基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种表达重组人肿瘤坏死因子受 体 -Fc 融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其 制备方法和应用， 属于生物医药技术领域。本发 明通过将重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋 白 (rhTNFR-Fc) 基因构建到家蚕杆状病毒表达系 统中获得重组杆状病毒， 从而高效表达目的蛋白， 并纯化出目的融合蛋白 rhTNFR-Fc。本发明通过 家蚕杆状病毒。

3、表达系统可以高效表达并纯化出融 合蛋白 rhTNFR-Fc， 平均每 mL 蚕血淋巴可纯化出 0.17mg 的目的融合蛋白。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图10页 (10)申请公布号 CN 103131676 A CN 103131676 A *CN103131676A* 1/1 页 2 1. 一种表达重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒， 其特征 在于， 该病毒含有重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋。

4、白基因。 2. 如权利要求 1 所述的家蚕重组杆状病毒， 其特征在于， 所述重组人肿瘤坏死因子受 体 -Fc 融合蛋白基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 3.一种权利要求1或2所述家蚕重组杆状病毒的制备方法， 其特征在于， 该方法包括以 下步骤 ： (1) 重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因的合成 ； (2) 将步骤 (1) 所合成的重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因连接到转移载体 上， 并转化感受态细胞， 构建重组转移载体 ； (3) 将步骤 (2) 构建的重组转移载体转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞， 得到重组杆 状病毒 DNA ； (4) 将步。

5、骤 (3) 得到的重组杆状病毒 DNA 转染家蚕细胞， 得到家蚕重组杆状病毒。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (1) 具体包括 ： 采用 pUC57-rhTNFR-Fc重组载体为模板， 以 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 为引物进行 PCR 扩增， 获得重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因rhTNFR-Fc。 5. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (2) 具体包括 ： 将 PCR 扩增得到的重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因用EcoR 和Xho双 酶切后回收， 通过用 T4 连接酶连接到经同样处理的转移载。

6、体 pFastBac1 上， 使重组人肿瘤 坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因位于多角体基因启动子控制之下， 然后转化到Trans10化 学感受态细胞中， 筛选阳性克隆， 得到重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc。 6. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (3) 具体包括 ： 将步骤 (2) 得到的重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态 细胞， 在含有卡那霉素、 庆大霉素、 四环素、 X-gal 和 IPTG 的 LB 培养板上避光培养 40-48 h 后挑取白斑， 培养 16-20 h 后菌液稀释 106重。

7、新涂板做筛选， 挑取白斑至 LB 液体培养基进 行摇菌培养 16-20 h 后， 用异丙醇抽提重组杆状病毒 DNA， 并用 M13 通用引物做 PCR 鉴定。 7. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 (4) 具体包括 ： 取步骤 (3) 鉴定成功的重组杆状病毒 DNA 通过脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞， 发病 后获得零代病毒悬液 0-4保存， 提取病毒基因组用 M13 通用引物进行 PCR 鉴定， 获得家蚕 重组杆状病毒 vBm-rhTNFR-Fc。 8. 一种权利要求 1 所述家蚕重组杆状病毒表达的融合蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 9.。

8、 一种权利要求 8 所述融合蛋白的制备方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： (1)将权利要求1-2任一所述的家蚕重组杆状病毒感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增， 并 做细胞中表达产物的鉴定 ； (2) 将步骤 (1) 中扩增得到的 F4 代病毒用穿刺接种法接种家蚕五龄幼虫， 收集发病蚕 血 ； (3) 从步骤 (2) 收集的蚕血中纯化出权利要求 8 所述融合蛋白。 权 利 要 求 书 CN 103131676 A 2 1/7 页 3 表达重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因的家蚕重 组杆状病毒及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种表达重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 。

9、融合蛋白基因的家蚕重组杆 状病毒及其制备方法和应用， 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 重组人型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)是一种可用于治疗如类 风湿性关节炎等自身免疫性疾病的蛋白药物。 0003 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一种多功能的细胞因子， 与多种 疾病及病理反应密切相关， 在炎症反应、 内毒素性休克、 恶液质和类风湿性关节炎等自身免 疫性疾病中起关键作用， 其过量表达是多种自身免疫性疾病的病理机制之一。对 TNF 受体 (TNFR)的研究表明， 型肿瘤坏死因子受体分布广泛， 与肿瘤坏死因子的亲和力较强。 这种。

10、 可溶性受体可以中和 TNF， 在体内对 TNF 的活性起负调节作用。 0004 用受体免疫球蛋白融合技术， 将受体的细胞外区与人免疫球蛋白的 Fc 段基因融 合， 在体外表达出相应的重组人型肿瘤坏死因子受体 (p75)-Fc 融合蛋白 (rhTNFR-Fc)。 它有免疫球蛋白的体内半衰期长、 组织穿透力强等特性， 可以特异性地与体内的 TNF 结合， 从而抑制关节的炎症反应。 0005 Etanercept (EnbrelTM) 是已经上市的商品化的 TNFR-Fc 融合蛋白， 也是抗 TNF 最 有效的药物之一。也是目前生物技术药物中销售额最高的产品， 国内已有 Etanercept 的仿。

11、 制产品如上市的益赛普， 均由中国仓鼠卵巢细胞 （CHO） 表达系统生产。但是， 用于类风湿性 关节炎 RA 治疗时每人每疗程需要 0.75 1.5 g 蛋白， 这一剂量相当大。而哺乳动物细胞 昂贵的培养费用和较低的表达水平， 是 Enbrel 和其它类似生物工程药物生产和应用的一 个重要 “瓶颈” 。 0006 家蚕杆状病毒表达载体系统是一种应用广泛的真核表达系统， 我们利用其低生产 成本和高效等优点， 表达并纯化重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白。利用家蚕杆状病 毒表达载体系统至今已表达60余种药用蛋白， 其中GM-CSF等十余种已实现产业化， 但抗体 类药用蛋白尚未表达过。 而且目。

12、前还没有用家蚕杆状病毒表达载体系统表达并纯化重组人 肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白的相关研究。 发明内容 0007 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种表达重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋 白基因的家蚕重组杆状病毒， 通过构建一种家蚕重组杆状病毒， 利用 Bac to Bac 系统将重 组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)基因构建到杆状病毒表达载体系统中进 行高效表达， 并纯化出目的融合蛋白 rhTNFR-Fc。 0008 为达到上述目的， 本发明提供一种表达重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基 因的家蚕重组杆状病毒， 该病毒含有重组人肿瘤坏死因子受体 -F。

13、c 融合蛋白基因。 说 明 书 CN 103131676 A 3 2/7 页 4 0009 优选地， 其中所述重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 0010 本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒的制备方法， 包括以下步骤 ： (1) 重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因的合成 ； (2) 将步骤 (1) 所合成的重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因连接到转移载体 上， 并转化感受态细胞， 构建重组转移载体 ； (3) 将步骤 (2) 构建的重组转移载体转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞， 得到重组杆 状病毒 DNA ； (。

14、4) 将步骤 (3) 得到的重组杆状病毒 DNA 转染家蚕细胞， 得到家蚕重组杆状病毒。 0011 优选地， 其中所述步骤 (1) 具体包括 ： 采用 pUC57-rhTNFR-Fc重组载体为模板， 以 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 为引物进行 PCR 扩增， 获得重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因rhTNFR-Fc。 0012 优选地， 其中所述步骤 (2) 具体包括 ： 将 PCR 扩增得到的重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因用EcoR 和Xho双 酶切后回收， 通过用 T4 连接酶连接到经同样处理的转移载体 pFastBac1 上， 使重组人肿瘤。

15、 坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因位于多角体基因启动子控制之下， 然后转化到Trans10化 学感受态细胞中， 筛选阳性克隆， 得到重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc。 0013 优选地， 其中所述步骤 (3) 具体包括 ： 将步骤 (2) 得到的重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态 细胞， 在含有卡那霉素、 庆大霉素、 四环素、 X-gal 和 IPTG 的 LB 培养板上避光培养 40-48 h 后挑取白斑， 培养 16-20 h 后菌液稀释 106重新涂板做筛选， 挑取白斑至 LB 液体培养基进 行摇菌培养 16-2。

16、0 h 后， 用异丙醇抽提重组杆状病毒 DNA， 并用 M13 通用引物做 PCR 鉴定。 0014 优选地， 其中所述步骤 (4) 具体包括 ： 取步骤 (3) 鉴定成功的重组杆状病毒 DNA 通过脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞， 发病 后获得零代病毒悬液 0-4保存， 提取病毒基因组用 M13 通用引物进行 PCR 鉴定， 获得家蚕 重组杆状病毒 vBm-rhTNFR-Fc。 0015 本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒表达的融合蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0016 本发明还提供上述融合蛋白的制备方法， 包括以下步骤 ： (1) 将上述家蚕重组杆状病毒感染。

17、家蚕 BmN 细胞进行病毒扩增， 并做细胞中表达产物 的鉴定 ； (2) 将步骤 (1) 中扩增得到的 F4 代病毒用穿刺接种法接种家蚕五龄幼虫， 收集发病蚕 血 ； (3) 从步骤 (2) 收集的蚕血中纯化出上述融合蛋白。 0017 本发明具有以下有益效果 ： 1、 家蚕是我国资源特色， 全国多地均可大规模饲养， 因此与昂贵的哺乳动物培养基相 比， 成本相对低廉， 可减轻中低收入患者经济负担 ； 2、 通过家蚕杆状病毒表达系统可以高效表达并纯化出融合蛋白 rhTNFR-Fc， 平均每 mL 蚕血淋巴可纯化出 0.17 mg 的目的融合蛋白。 说 明 书 CN 103131676 A 4 3/。

18、7 页 5 附图说明 0018 图 1 为rhTNFR-Fc基因扩增的电泳分析图 ； M ： 10 kb DNA 分子量标准 ； 1 ： PCR 产 物 ； 图 2 为重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc的构建示意图 ； 图 3 为重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc的鉴定图 ； M ： 10 kb DNA 分子量标准 ； 1 ： PCR 鉴定 ； 2 ： 重组质粒EcoR 和Xho双酶切鉴定 ； 图 4 为重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc的测序结果图 ； 图 5 为重组杆状病毒 Bacmid-rhTNFR-Fc鉴定图 ； M ： 10 kb。

19、 DNA 分子量标准 ； 1、 3、 5 ： 以 M 13 上游引物和rhTNFR-Fc下游引物为引物对PCR扩增产物 ； 2、 4、 6 ： 以rhTNFR-Fc上游引 物和 M 13 下游引物为引物对 PCR 扩增产物 ； 图 6 为家蚕重组杆状病毒 vBm- rhTNFR-Fc的 PCR 鉴定图 ； M ： 10 kb DNA 分子量标准 ； 1 ： 以 M 13 上游引物和 M 13 下游引物为引物对 PCR 扩增产物 ； 2 ： 以 M 13 上游引物和 rhTNFR-Fc下游引物为引物对PCR扩增产物 ； 3 ： 以rhTNFR-Fc上游引物和M 13 下游引物为 引物对 PCR 。

20、扩增产物 ； 图 7A 为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在 BmN 细胞中表达的 SDS-PAGE 图 ； M ： 预染蛋白分 子量标准 ； 1 ： 接种重组病毒 vBm-(rhTNFR-Fc) 的 BmN 细胞 ； 图 7B 为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在 BmN 细胞中表达的 Western Blotting 图 ； M ： 预 染蛋白分子量标准 ； 1 ： 接种重组病毒 vBm-(rhTNFR-Fc) 的 BmN 细胞 ； 图 8 为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在 BmN 细胞中表达的免疫荧光鉴定图 ； A ： DAPI 染色， 激光共聚焦显微镜UV激发， 100倍视野 ； B ：。

21、 鼠抗人IgG Fc一抗， iF555 羊抗鼠 IgG (FITC 标记 ) 二抗， 激光共聚焦显微镜 543nm 激发， 100 倍视野 ； C ： 鼠抗人 IgG Fc 一抗， iF555 羊 抗鼠 IgG (FITC 标记 ) 二抗， DAPI 染色， 叠加激光共聚焦显微镜， 100 倍视野 ； D ： 激光共聚 焦显微镜明场， 100 倍视野 ； 图 9A 为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕血淋巴中表达的 SDS-PAGE 鉴定图 ； M ： 预染蛋 白分子量标准 ； 1 ： 正常家蚕五龄幼虫血淋巴上清 ； 2 ： 发病家蚕五龄幼虫血淋巴上清 ； 3 ： 正常家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀。

22、 ； 4 ： 发病家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀 ； 箭头所示为目的条带 ； 图 9B 为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕血淋巴中表达的 Western Blotting 鉴定图 ； M ： 预染蛋白分子量标准 ； 1 ： 正常家蚕五龄幼虫血淋巴上清 ； 2 ： 发病家蚕五龄幼虫血淋巴上 清 ； 3 ： 正常家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀 ； 4 ： 发病家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀 ； 箭头所示为目 的条带 ； 图 10 为蚕血淋巴经 Superdex 200 柱的分离结果图 ； 图 11A 为蚕血淋巴经 Superdex 200 层析柱分离各峰的 SDS-PAGE 分析图 ； M ： 预染蛋白 分子量标准 。

23、； 1 ： 原液 ； 2-6 ： 依次为 1#峰、 2#峰、 3#峰、 4#峰、 5#峰 ； 图 11B 为蚕血淋巴经 Superdex 200 层析柱分离各峰的 Western Blotting 分析图 ； M ： 预染蛋白分子量标准 ； 1 ： 原液 ； 2-6 ： 依次为 1#峰、 2#峰、 3#峰、 4#峰、 5#峰 ； 图 12A 为亲和层析纯化后的 SDS-PAGE 分析图 ； M ： 预染蛋白分子量标准 ； 1 ： 1#吸收峰 蛋白样品 ； 2 ： 1#吸收峰蛋白样品纯化后 ； 3 ： 2#吸收峰蛋白样品 ； 4 ： 2#吸收峰蛋白样品纯化 后 ； 说 明 书 CN 103131。

24、676 A 5 4/7 页 6 图 12B 为亲和层析纯化后的 Western Blotting 分析图 ； M ： 预染蛋白分子量标准 ； 1 ： 1# 吸收峰蛋白样品 ； 2 ： 1#吸收峰蛋白样品纯化后 ； 3 ： 2#吸收峰蛋白样品 ； 4 ： 2#吸收峰蛋白样 品纯化后 ； 图 13 为不同批次蚕血淋巴中纯化后并浓缩的 rhTNFR-Fc 蛋白 SDS-PAGE 分析图 ； M ： 非 预染蛋白分子量标准 ； 1 ： 益赛普 ( 对照 ) ； 2-4 ： 不同批次纯化并浓缩后的蛋白 ； 图 14 为 rhTNFR-Fc 融合蛋白一级质谱结果图 ； 图 15A 为 rhTNFR-Fc 。

25、融合蛋白二级质谱结果图之一 ； 图 15B 为 rhTNFR-Fc 融合蛋白二级质谱结果图之二 ； 图 16 为 rhTNFR-Fc 蛋白信号肽分析图。 具体实施方式 0019 应该指出， 以下具体说明都是例示性的， 旨在对本发明提供进一步的发明。 除非另 有说明， 本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同 含义。 0020 下面结合实施例详细说明本发明的具体内容。 0021 实施例 1 ： 目的基因rhTNFR-Fc的获得 根据重组质粒 pUC57-rhTNFR-Fc中rhTNFR-Fc基因 ( 天津石桥生物科技有限责任公司 蔡胜和教授提供 ) 的 ORF 框 。

26、( 为 1473 bp, 编码 489 个氨基酸残基 ) 设计该基因的上游引 物 SEQ ID NO:3 和下游引物 SEQ ID NO:4， 上游引物引入EcoR I 酶切位点， 下游引物引入 Xho I 酶切位点， 进行 PCR 扩增， 获取融合蛋白基因rhTNFR-Fc( 见图 1)， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。具体程序和反应体系如下 ： 反应程序 ： 反应体系 ： 说 明 书 CN 103131676 A 6 5/7 页 7 将 PCR 产物用EcoR I、Xho I( 均购自 Invitrogen 公司 ) 进行双酶切后， 割胶回收以 备后用。 0022 实施例 。

27、2 ： 重组转移载体 pFastBac1-rhTNFR-Fc的构建 对实施例 1 所得rhTNFR-Fc融合蛋白基因 PCR 回收片段用EcoR I 酶和Xho I 酶 (Fermentas公司)进行双酶切， 琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段 ； 同时用EcoR I酶和Xho I 酶对pFastBac1(Invitrogen公司)进行酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段 ； 然后用 T4 连接酶 (Fermentas 公司 ) 将回收的融合蛋白基因连接到酶切后的转移载体 pFastBac1 上， 转化Trans10化学感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)， 筛选阳性克隆， 得到重 组转移载体 。

28、pFastBac1-rhTNFR-Fc ( 见图 2、 图 3)， 对其进行基因测序 ( 图 4)， 由测序结果 可知融蛋白合基因成功克隆至转移载体 pFastBac1 上。 0023 实施例 3 ： 家蚕重组杆状病毒 vBm-rhTNFR-Fc的获取与鉴定 将实施例 2 中所获得的重组转移质粒 pFastBac1-(rhTNFR-Fc) 转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞 ( 购自 Invitrogen 公司 )， 在含有购自 Bio Basic Inc 公司的卡那霉素、 庆大 霉素、 四环素、 X-gal 和 IPTG( 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷 ) 的 LB 固体培养板 (。

29、 购自 Invitrogen公司)上进行蓝白斑筛选， 避光培养48 h后挑取单菌落白斑， 培养16 h后菌液 稀释 106重新涂板做筛选， 挑取白斑至 LB 培养基摇菌培养 16 h 后， 用异丙醇在超净台中抽 提重组杆状病毒(Bacmid-rhTNFR-Fc)基因组， 用M13通用引物PCR 鉴定是否转座成功(图 5)。 0024 M13 上游引物 ： 5 -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 M13 下游引物 ： 5 -CAGGAAACAGCTATGAC-3 将鉴定成功的重组 Bacmid-rhTNFR-Fc参照 Invitrogen 公司脂质体转染试剂 Cellfectin Reag。

30、ent 说明书的方法， 经脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞 ( 本实验室保 存 )， 待该家蚕 BmN 细胞发病 ( 显微镜下观察 ) 后收集第一代家蚕重组杆状病毒悬液并于 4保存， 用 Viral DNA Kit(200)( 购自 OMEGA 公司 ) 提取病毒基因组， 然后用 M13 通用引 物进行 PCR 鉴定。将所得鉴定成功的家蚕重组杆状病毒命名为 vBm-rhTNFR-Fc( 见图 6)。 说 明 书 CN 103131676 A 7 6/7 页 8 0025 实施例 4 ： 融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕 BmN 细胞中的表达及鉴定 将实施例 3 中获取的家蚕重组杆状病毒 。

31、vBm-rhTNFR-Fc以 MOI=10 pfu/cell 的剂量 转染对数生长期的家蚕 BmN 细胞中， 在含有 10% 胎牛血清的 Sf-900 SFM 培养基 ( 购自 Invitrogen 公司 ) 中 27培养 3 4 d， 待发病后， 4， 500 rpm 离心 10 min 收集培养上 清和沉淀。细胞沉淀用 pH 7.4 的 PBS 洗涤重悬， 与 2SDS 上样缓冲液混合， 60加热 30 min， 进行SDS-PAGE 蛋白电泳， 用羊抗人 IgG-Fc一抗、 辣根酶标记的鼠抗羊 IgG(H+L)二抗 进行 Western Blotting 分析， 结果表明融合蛋白基因rh。

32、TNFR-Fc在家蚕 BmN 细胞中成功表 达 ( 见图 7A 、 图 7B)。 0026 同时采用鼠抗人 IgG Fc 一抗， iF555 羊抗鼠 IgG(FITC 标记 ) 二抗进行免疫荧 光实验。用 LEIVA TCS SP51 激光共聚焦显微镜， 分别取明场、 UV 激发光、 543 nm 激发光、 UV 激发光和 543 nm 激发光叠加 ( 均 100 倍视野 ) 观察拍照。结果也验证了融合蛋白基因 rhTNFR-Fc在家蚕 BmN 细胞中成功表达 ( 图 8)。 0027 实施例 5 ： 融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕五龄幼虫中的表达及鉴定 将实施例 4 扩增后的家蚕重组杆。

33、状病毒 vBm- rhTNFR-Fc F4 代于腹部倒数第二节处 穿刺接种眠起后的家蚕五龄幼虫 ( 江苏宿迁市三棵树蚕种场 )， 第五天大部分幼虫出现典 型病毒感染症状， 剪幼虫腹足收集蚕血淋巴， 加 0.5 (w/v) 抗氧化剂八羟基喹啉， -80保 存备用。 0028 取10 mL蚕血淋巴12,000 rpm 离心10 min。 分别取上清和沉淀， 加入2loading buffer， 60金属浴 30 min， 制成蛋白样品， 以正常蚕血淋巴作为阴性对照进行 SDS-PAGE 和 Western Blotting 鉴定。结果表明， 融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕幼虫血淋巴中获得 了。

34、成功表达 ( 见图 9 A、 图 9 B)。 0029 实施例 6 ： 家蚕五龄幼虫血淋巴中 rhTNFR-Fc 融合蛋白的纯化 预处理 ： 取出实施例 5 中的蚕血淋巴置于冰上融化， 待完全溶解后， 按 1:1 的体积比加 入预冷的 PBS 溶液 (pH7.4) ； 于 4， 15,000 g， 离心 30 min， 9 层医用纱布过滤去除脂类物 质， 留取滤液， 再次于 4， 15,000 g， 离心 30 min， 9 层医用纱布过滤， 反复三次 ； 将滤液预 冷的PBS溶液 (pH7.4)稀释后， 用0.1 m 的膜包进行超滤以去除部分色素， 收集流出液 ； 将流出液转移到 10 kD。

35、a 超滤管内进行截留浓缩。 0030 凝胶过滤层析纯化 ： 用 PBS 作为流动相， 冲洗 AKTAexplorer 蛋白纯化系统及上样 环， 30 min 后， OD280检测基线洗平后， 切换到 SuperdexTM200 层析柱位， 以 1.5 mL/min 的流 速平衡柱子， 报警压力为 0.5 Mpa ； 用 2.5 ml 注射器吸取 2 mL 预处理的浓缩液， 除去气 泡后， 手动上样， 设定程序开始运行， 将流速调整为 1 mL/min ； 插好收集管， 按管自动收集 峰 ( 见图 10) ； 对图 10 上 5 个峰尖对应收集管的蛋白用 2 上样 buffer 制备蛋白样， 进。

36、行 SDS-PAGE 检测和 Western Blotting 分析 ( 见图 11 A、 图 11 B)。 0031 rProtein A 亲和层析纯化 ： 取适量 Protein A 填料， 装入空柱， 用 10 倍柱体积的 平衡液 （pH 7.4 的 PBS 溶液） 平衡层析柱 ； 根据凝胶过滤层析纯化后的峰图 ( 见图 10) 和 Western Blotting ( 见图 11 B) 分析结果， 将 1#和 2#及其附近的几管样品分别合并， 调 整 pH 以及离子浓度后， 缓慢加入层析柱 ； 室温孵育 10 min， 反复上样 3 次 ； 用 10 倍柱体积 以上的洗涤液 （pH 7。

37、.4 的 PBS 溶液） 洗涤非特异性结合的杂蛋白， 至流出液无蛋白检出 ； 加 入 2 倍柱体积的甘氨酸 （pH3.0） ， 静置 5 分钟后收集洗脱液， 重复三次 ； 收集洗脱液后， 立即 说 明 书 CN 103131676 A 8 7/7 页 9 用 2/5 洗涤液体积的 Tris 缓冲液 （pH8.0） 中和， 使用 Millipore 蛋白浓缩管切换到 PBS 缓 冲液 ； 加入 0.02% NaN3， 进行 BCA 蛋白定量后， -80保存 ； 分别取 25L 纯化前和纯化后的 蛋白与 2 上样 buffer 混合均匀， 60煮半小时， 以制备蛋白样品， 进行 SDS-PAGE 。

38、检测和 Western Blotting 分析 ( 见图 12 A、 图 12B)。 0032 实施例 7 ： 纯化后 rhTNFR-Fc 融合蛋白的质谱分析 将三批实施例 6 中纯化得到的目的蛋白样品， 用 10 kDa 的超滤管进行浓缩后， 用益赛 普(上海中信国健药业股份有限公司)作对照， 分别与2上样buffer混合均匀， 60煮半 小时， 以制备蛋白样品， 进行SDS-PAGE鉴定(见图13)。 BCA蛋白定量后得知， 我们从350 mL 发病蚕血淋巴中纯化得到融合蛋白 60 mg， 计算出蚕血淋巴中融合蛋白的平均含量为 0.17 mg/mL。发现在 PVDF 膜上 35 kDa 和。

39、 45 kDa 之间总有一条带， 后质谱鉴定结果为降解的 IgG 的 Fc 段。 0033 用干净的刀片从 SDS-PAGE 胶上割下目的条带， 去离子水轻轻清洗两遍， 放入干净 的 EP 管中， 做好标记， 送到南开大学泰达学院生物技术公司进行 MALDI-TOF-MS 分析 ( 见图 14、 图 15 A 及图 15 B)， 根据 protein score C.I.% 大于 95% 为鉴定标准， 两个已知融合蛋 白片段TNFR 75和IgG的Fc段的分值分别为99.994%和100%， 可基本确定纯化的蛋白为目 的融合蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。 0034 生物。

40、信息学分析结果表明 （见图 16） ， 具有 22 个氨基酸残基组成的信号肽。去除 信号肽后， 基因片段 1407 bp， 编码 467 个氨基酸残基， 预测分子量为 51.238 kDa。融合蛋 白 rhTNFR-Fc 由人 75 kDa TNF 受体蛋白的胞外区与人 IgG1 的 Fc 段构成的融合蛋白二 聚体， 由 934 个氨基酸构成， 每条肽链含 467 个氨基酸， 2 条多肽链通过半胱氨酸残基形成 二硫键成为等二聚体， 相对分子量为 150 kDa。家蚕杆状病毒表达系统中表达的融合蛋白 rhTNFR-Fc 在 SDS PAGE 胶和 PVDF 膜上显示， 单体均在 55kDa， 略。

41、大于预测分子量 51.238 kDa， 凝胶过滤层析峰图显示， 1#和 2#峰蛋白大小约为 148 kDa 左右， 这些结果表明， 家蚕杆 状病毒表达系统中表达的融合蛋白 rhTNFR-Fc 多以二聚体形式存在， 且可能存在糖基化等 翻译后修饰。 0035 以上所述， 仅为本发明的实施例， 应当指出， 对于本技术中的普通技术人员来说， 在不脱离本发明的核心技术特征的前提下， 还可以做若干的改进和润饰， 这些润饰和改进 也应属于本发明的专利保护范围。 说 明 书 CN 103131676 A 9 1/4 页 10 SEQUENCE LISTING 天津耀宇生物技术有限公司 表达重组人肿瘤坏死因子。

42、受体 -Fc 融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制 备方法 122503-I-CP-TJYU 4 PatentIn version 3.3 1 1473 DNA 重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白基因 1 atggcctccaggctgaccctgctgaccctcctgctgctgctgctggctggggatagagcctcctcattgccc gcccaggtggcatttacaccctacgccccggagcccgggagcacatgccggctcagagaatactatgaccagacagc tcagatgtgctgcagcaaatgctcgccgggccaacatgcaaaa。

43、gtcttctgtaccaagacctcggacaccgtgtgtg actcctgtgaggacagcacatacacccagctctggaactgggttcccgagtgcttgagctgtggctcccgctgtagc tctgaccaggtggaaactcaagcctgcactcgggaacagaaccgcatctgcacctgcaggcccggctggtactgcgc gctgagcaagcaggaggggtgccggctgtgcgcgccgctgcgcaagtgccgcccgggcttcggcgtggccagaccag gaactgaaacatcagacgtggtgtgcaagcc。

44、ctgtgccccggggacgttctccaacacgacttcatccacggatatt tgcaggccccaccagatctgtaacgtggtggccatccctgggaatgcaagcatggatgcagtctgcacgtccacgtc ccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtgtccacacgatcccaacacacgcagccaa ctccagaacccagcactgctccaagcacctccttcctgctcccaatgggccccagccccccagctgaagggagcact ggcgacgaacctaagtcct。

45、gcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtc agtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtgg acgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatgg caaggag。

46、tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgc ctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagac cacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg。

47、cagc aggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct 序 列 表 CN 103131676 A 10 2/4 页 11 ccgggtaaatgatga 2 489 PRT 重组人肿瘤坏死因子受体 -Fc 融合蛋白 2 Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Gly Asp Arg Ala Ser Ser Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr 20 25。

48、 30 Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr 35 40 45 Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly 50 55 60 Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys 65 70 75 Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val 80 85 90 Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val 95 100 105 Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys 110 115 120 Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg 125 130 135 Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 140 。