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1、(10)申请公布号 CN 102925360 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102925360 A *CN102925360A* (21)申请号 201210491324.0 (22)申请日 2012.11.27 C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号南 开大学生命科学学院生物楼 101 (72)发明人 宋存江 孙杨 王淑芳 李强 (54) 发明名称 一种高细胞密度发酵制备小球藻的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高细胞密度发酵制备小球 藻的方法。该方法包括。
2、以下步骤 ： 先在发酵罐中 安装防水、 防爆照明灯 ； 将含有 5mL 固体培养基的 L 管藻种活化培养， 然后在锥形瓶中光照液体摇 瓶扩大培养 ； 再将扩大培养后的藻种接种到带有 光照的全自动液体发酵罐的发酵培养基中通气发 酵培养， 期间流加补碳和流加补氮， 并始终保持发 酵液中葡萄糖浓度在20， NH4NO3浓度在15， 发 酵进行至 60 小时， 停止补料 ； 发酵总时间为 72 小 时 ； 发酵结束后， 将培养液离心， 弃去上清， 得小 球藻。利用本发明的自养和异养并行的发酵方法 高细胞密度制备小球藻， 工艺简单， 发酵周期短， 小球藻营养成分完整， 使在发酵罐中异养法规模 化生产小球。
3、藻成为可能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种高细胞密度发酵制备小球藻的方法， 其特征在于采用光照、 机械搅拌通气发酵 和流加补碳补氮并行方式培养 ； 该方法包括以下步骤 ： 首先在发酵罐中安装防水、 防爆照 明灯， 使得发酵液在发酵罐中处于照度为3500Lux的条件 ； 先将含有5mL固体培养基的L管 藻种在 28下活化培养 24h， 然后在锥形瓶中光照液体摇瓶扩大培养， 28振荡培养 24h ； 再将扩大培养后的藻种接种到带有光照的全自动液体。
4、发酵罐的发酵培养基中 26-30发酵 培养， 前 8 小时采用光照与低速搅拌微通气的方法进行， 通气量 0.1-0.3VVM ； 第 9 小时开始 采用光照与机械搅拌通气发酵培养并行的方法进行 ； 通气量 1.0-1.5VVM， 直至发酵结束 ； 发酵 24 小时后， 开始流加补碳和流加补氮， 并始终保持发酵液中葡萄糖浓度在 20， NH4NO3 浓度在15， 发酵进行至60小时， 停止补料 ； 发酵总时间为72小时 ； 发酵结束后， 将培养液 离心， 弃去上清， 得小球藻 ； 进行小球藻有效成分的检测 ； 所述固体培养基、 锥形瓶用液体 培养基和发酵罐用发酵培养基成分分别为 ： 1) 固体培。
5、养基成分 ： 葡萄糖 2g/L、 NaNO3 1.5g/L、 MgSO4.7H2O 0.075g/L、 CaCl2.2H2O 0.036g/L 酵母浸出粉 0.03g L， 琼脂 0.05g/L， pH 6.8 ； 2) 锥形瓶用液体培养基成分 ： 葡萄糖 2g/L、 NaNO3 1.5g/L、 MgSO4.7H2O 0.075g/L、 CaCl2.2H2O 0036g/L 酵母浸出粉 0.03g/L， pH 6.8 ； 3) 发酵培养基成分 ： 葡萄糖 2g/L、 NH4NO31.5g/L、 MgSO4.7H2O0.075g/L、 CaCl2.2H2O 0.036g/L 酵母浸出粉 0.05。
6、g L， pH6.8。 权 利 要 求 书 CN 102925360 A 2 1/3 页 3 一种高细胞密度发酵制备小球藻的方法 技术领域 0001 本发明是一种高细胞密度发酵制备小球藻的方法， 属生物技术领域。 技术背景 0002 小球藻作为一种重要的微藻资源， 具有极其丰富的营养成分和优良的医疗保健作 用。含有丰富的蛋白质、 氨基酸、 色素、 多不饱和脂肪酸等， 营养全面， 是水产及畜牧养殖理 想的饲料原料。其蛋白质含量 50 67， 其中含有人体所必须的 20 种氨基酸、 多种维 生素和微量元素， 以及亚麻酸、 亚油酸、 类胡萝卜素等成分。小球藻中富含小球藻生长因子 (CGF)， 能迅速。
7、恢复养殖动物机体造成的损伤。小球藻中含有的生物活性物质糖蛋白、 多糖 体以及高达 13的核酸等物质具有显著的抑瘤抗癌、 增强免疫及抗病毒感染的活性。在水 产养殖上， 单细胞的小球藻可直接作为海水鱼育苗的水质调节以及轮虫、 卤虫等海水鱼育 苗活饵料的培育饵料， 也可以用于海水鱼、 海参、 对虾等的饵料添加剂， 具有很高的经济价 值。 0003 近二十年来， 环渤海地区乃至全国的海水养殖发展迅猛。 小球藻作为海水鱼、 对虾 等苗期生长饲料和水质调节的开发愈显重要。目前， 限制小球藻在海水养殖方面应用的原 因概括起来包括 ： 藻种营养成分含量偏低、 产出成本高、 大规模培养下控制杂菌污染等技术 瓶颈。
8、尚待突破。时下采用的生产方式大多为跑道式养殖池或袋式光合培养， 这种培养方式 受气候条件 ( 温度、 光照等 ) 的影响比较大， 而且易受敌害 ( 轮虫、 纤毛虫等 ) 的侵袭， 养殖 产量低且难以稳定。 日本、 韩国等国家海水鱼育苗已大量使用发酵小球藻， 而国内使用的发 酵小球藻全部依赖进口产品。小球藻的异养培养 ( 发酵法 ) 为解决这一问题提供了可能。 本专利技术提供了一种自养和异养并行的小球藻制备高细胞密度的发酵方法。利用异养 化技术进行小球藻的高细胞密度培养， 克服户外开放式养殖和光生物反应器培养的诸多缺 陷， 发挥异养化培养小球藻具有的生长速度快、 能实现纯种培养、 单位体积产率高。
9、、 便于自 动化控制等优势， 为实现规模化生产小球藻， 且小球藻的营养成分与关照培养方式获得的 小球藻基本持平。为海水养殖提供优良的饵料奠定了技术保障。 发明内容 0004 本发明的目的是利用自养和异养并行的培养方法高细胞密度发酵制备小球藻。 0005 为了实现这一目的， 本发明采用以下技术方案 ： 首先在发酵罐中安装防水、 防爆照 明灯， 使得发酵液在发酵罐中处于照度为3500Lux的条件 ； 先将含有5mL固体培养基的L管 藻种在 28下活化培养 24h， 然后在锥形瓶中光照液体摇瓶扩大培养， 28振荡培养 24h ； 再将扩大培养后的藻种接种到带有光照的全自动液体发酵罐的发酵培养基中 2。
10、6-30发酵 培养， 前 8 小时采用光照与低速搅拌微通气的方法进行， 通气量 0.1-0.3VVM ； 第 9 小时开始 采用光照与机械搅拌通气发酵培养并行的方法进行 ； 通气量 1.0-1.5VVM， 直至发酵结束 ： 发酵 24 小时后， 开始流加补碳和流加补氮， 并始终保持发酵液中葡萄糖浓度在20， NH4NO3 浓度在15， 发酵进行至60小时， 停止补料 ； 发酵总时间为72小时 ； 发酵结束后， 将培养液 说 明 书 CN 102925360 A 3 2/3 页 4 离心， 弃去上清， 得小球藻 ； 进行小球藻有效成分的检测 ； 所述固体培养基、 锥形瓶用液体 培养基和发酵罐用发。
11、酵培养基成分分别为 ： 0006 1) 固体培养基成分 ： 0007 葡萄糖 2g/L、 NaNO3 15g/L、 MgSO47H2O 0.075g L、 CaCl22H2O 0.036g/L 0008 酵母浸出粉 0.03g L， 琼脂 0.05g L， pH6.8 ； 0009 2) 锥形瓶用液体培养基成分 ： 0010 葡萄糖 2g L、 NaNO3 1.5g L、 MgSO47H2O 0.075g/L、 CaCl22H2O 0.036g/L 0011 酵母浸出粉 0.03g/L， pH6.8 ； 0012 3) 发酵培养基成分 ： 0013 葡萄糖 2g/L、 NH4NO3 1.5g 。
12、L、 MgSO47H2O 0.075g L、 CaCl22H2O 0.036g L 0014 酵母浸出粉 0.05g L， pH6.8。 0015 与现有技术相比， 本发明的突出优点在于 ： 采用光照和机械搅拌通风发酵培养并 行交替的方法进行小球藻发酵生产， 既利用了小球藻的自养生长方式， 也利用了小球藻的 异养生长方式， 发酵周期短， 小球藻营养成分保持完整。 避免了目前箱式光照培养易于染菌 等诸多不利影响， 使在发酵罐中异养法规模化生产小球藻成为可能。 具体实施方式 0016 实施例 1 0017 前培养是在 L- 试管中， 以无菌操作加入 5ml 液体培养基， 以无菌牙签接入在固体 培养。
13、基上的小球藻单藻菌落， 28， 140rpm 培养 24h。将前培养物 5ml 接种至含有 100ml 液 体培养基的 500ml 锥形瓶中， 28 150rpm 振荡培养 24h。将 1600ml 锥形瓶培养液， 接种于 30升光照机械搅拌发酵罐中的16升灭过菌的发酵液中， 28发酵培养 ； 72小时的发酵过程 中， 前8小时采用光照与低速搅拌微通气的方法进行， 通气量为 ： 0.3VVM， 第9小时开始采用 光照与机械搅拌通气发酵培养并行的方法进行 ； 通气量 1.2VVM， 直至 72 小时 ； 发酵至第 24 小时， 开始流加补料 ： 保持发酵液中葡萄糖浓度为 ： 2g/L， NH4N。
14、O3的浓度为1.5gL ； 发酵进 行至 60 小时， 停止补料 ； 72 小时结束发酵， 取样检测， 发现小球藻的色素、 蛋白质、 氨基酸、 多不饱和脂肪酸等成分均达到期望值 ； 小球藻的生长量亦达到期望值。 0018 实施例 2 0019 前培养是在 L- 试管中， 以无菌操作加入 5ml 液体培养基， 以无菌牙签接入在固体 培养基上的小球藻单藻菌落， 28， 140rpm 培养 24h。将前培养物 5ml 接种至含有 100ml 液 体培养基的 500ml 锥形瓶中， 28 150rpm 振荡培养 24h。将 1600ml 锥形瓶培养液， 接种于 30 升光照机械搅拌发酵罐中的 16 升。
15、灭过菌的发酵液中， 26发酵培养 ； 72 小的发酵过程 中， 前8小时采用光照与低速搅拌微通气的方法进行， 通气量为 ： 0.1VVM， 第9小时开始采用 光照与机械搅拌通气发酵培养并行的方法进行 ； 通气量 1.5VVM， 直至 72 小时结束发酵。取 样检测， 发现小球藻的色素、 蛋白质、 氨基酸、 多不饱和脂肪酸等成分均低于期望值 ； 小球藻 的生长量为实施例 1 的 30。 0020 实施例 3 0021 前培养是在 L- 试管中， 以无菌操作加入 5ml 液体培养基， 以无菌牙签接入在固体 说 明 书 CN 102925360 A 4 3/3 页 5 培养基上的小球藻单藻菌落， 2。
16、8， 140rpm 培养 24h。将前培养物 5ml 接种至含有 100ml 液 体培养基的 500ml 锥形瓶中， 28 150rpm 振荡培养 24h。将 1600ml 锥形瓶培养液， 接种于 30 升机械搅拌发酵罐中的 16 升灭过菌的发酵液中， 30发酵培养 ； 72 小的发酵过程中， 前 8 小时采用低速搅拌微通气的方法进行， 通气量为 ： 0.2VVM， 第 9 小时开始采用机械搅拌通 气发酵培养并行的方法进行 ； 通气量 10VVM， 直至 72 小时结束发酵， 发酵至第 24 小时， 开 始流加补料 ； 保持发酵液中葡萄糖浓度为 ： 2g L， NH4NO3的浓度为 1.5g L ； 发酵进行至 60 小时， 停止补料 ； 72 小时结束发酵， 取样检测， 发现小球藻的色素极度低下、 蛋白质、 氨基 酸、 多不饱和脂肪酸等成分均未达到期望值。小球藻的生长量为实施例 l 的 50。 说 明 书 CN 102925360 A 5 。