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1、(10)申请公布号 CN 104232638 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104232638 A (21)申请号 201410155061.5 (22)申请日 2014.04.18 C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 首都医科大学附属北京佑安医院 地址 100069 北京市丰台区右安门外西头条 8 号 申请人 北京旷博生物技术有限公司 (72)发明人 李宁 李启靖 张永宏 张卫红 石佳 李鹏 魏颖颖 (74)专利代理机构 北京尚诚知识产权代理有限 公司 11322 代理人 龙淳 顾小曼 (54) 发明名称 肝硬。
2、化 microRNA 分子标志物组合及其用途 (57) 摘要 本发明提供了一种肝硬化转归 microRNA 分 子标志物， 序列号 1-13， 及其在制备肝硬化个体 化用药诊断试剂中的用途。肝硬化患者 microRNA 分子标志物在血浆 / 血清中的含量与健康对照血 浆 / 血清中含量相比， 存在显著差异， 能够有效区 分肝硬化患者和健康对照人群， 在肝硬化患者用 药过程中， 当肝硬化转归 microRNA 分子标志物调 整到正常水平， 可辅助指导停止用药。 本发明还提 供了一种指导肝硬化个体化用药的诊断试剂盒。 使用本发明的肝硬化转归 microRNA 分子标志物， 指导肝硬化患者的个体化用。
3、药， 具有操作简单， 安 全无创伤， 高特异性， 高灵敏性以及易于大量筛查 的特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104232638 A CN 104232638 A 1/1 页 2 1. 一种肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合， 其包括一种以上选自以下的 microRNA 核酸分子 ： SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID。
4、 NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID DO ： 11、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 13， 优选地， 所述的一种以上为2-13种、 更优选3-10种、 进一步优选3-8 种， 最优选 4 种。 2. 根据权利要求 1 所述的肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合， 其含有 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 10 和 SEQ ID NO ：。
5、 11。 3. 根据权利要求 1 所述的肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合在制备肝硬化个体化 用药诊断试剂中的用途， 所述的肝硬化转归microRNA分子标志物组合优选含有SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 10 和 SEQ ID NO ： 11。 4.根据权利要求3所述用途， 其中， 所述诊断试剂通过检测被试者血浆/血清中肝硬化 转归 microRNA 分子标志物组合的含量， 并与健康对照人群平均水平相比较来判断是否停 止用药。 5.根据权利要求3所述用途， 其中， 使用定量PCR的方法来检测被试者血浆中肝硬化转 归 microRNA。
6、 分子标志物组合的含量。 6. 一种指导肝硬化个体化用药的诊断试剂盒， 其特征在于 ： 包括权利要求 1 所述肝硬 化 microRNA 分子标志物组合的特异性正向引物组合， 优选含有 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 10 和 SEQ ID NO ： 11 的组合的特异性正向引物。 7. 根据权利要求 6 所述的诊断试剂盒， 其特征在于所述的特异性正向引物包括一种以 上选自以下序列的引物组合 ： SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO 。
7、： 18、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 21、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 23、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 25、 SEQ ID NO ： 26， 优选含有SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 23 和 SEQ ID NO ： 24。 8. 根据权利要求 6 所述的诊断试剂盒， 其进一步包括 ： (1) 血浆 / 血清总 RNA 提取试剂， (2)RNA 加 polyA 试剂， (3)RT-PCR 试剂， (4) 定量 PCR。
8、 试剂 ； 其中， 定量 PCR 试剂中包括权利要求 1 所述肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合的特 异性正向引物其中， 所述血浆总 RNA 提取试剂中包括序列为 SEQ ID NO ： 27 的外部控制序 列 -1(Extemal Control-1)， 其中， 所述 RNA 加 polyA 试剂中包括序列为 SEQ ID NO ： 28 的 外部控制序列 -2(Extemal Control-2)， 其中， 所述 RT-PCR 试剂中包括序列为 SEQ ID NO ： 29 的反转录引物 (RT-Primer)。 9.根据权利要求8所述诊断试剂盒， 其中， 所述定量PCR试剂中包。
9、括序列分别为SEQ ID NO ： 30 和 31 的通用反向引物 UPM-short 和 UPM-long。 权 利 要 求 书 CN 104232638 A 2 1/9 页 3 肝硬化 microRNA 分子标志物组合及其用途 技术领域 0001 本发明涉及肝硬化个体化用药诊断领域， 具体来说涉及一组肝硬化 microRNA 分 子标志物组合， 其对肝硬化患者进行诊断和 / 或预后评估的用途以及含有其特异引物的试 剂盒。其可应用于对肝硬化患者进行诊断和 / 或预后评估， 指导患者科学用药和停药， 既减 少患者用药痛苦， 也减少医疗资源的浪费。 背景技术 0002 microRNA(miRN。
10、A) 是近年来的研究热点， 它是一种广泛存在于真核生物中的单链 小分子 RNA， 不具编码功能， 但它能够结合于基因序列的侧翼区域阻遏或抑制靶 mRNA 的翻 译， 具有高度的保守性、 时序性和组织特异性， 目前在肿瘤、 血液病、 病毒感染等多种疾病的 临床诊断、 治疗及预后评价等领域发挥了重要作用。 0003 肝炎后肝硬化可由乙型肝炎病毒、 丁型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒所致慢性肝炎演 变而成。其预后与病毒复制状态、 肝功能状态和有无严重合并症密切相关。代偿性肝硬化 病人如果年龄小， 病毒复制停止或低复制状态， 抗 HBe 阳性， 肝功能尚好， 白蛋白不低， 血胆 红素近正常及门脉高压不高者，。
11、 病情可能稳定， 甚至长期代偿， 一生无症状。一旦发生失代 偿症状， 5 年存活率低于 50。失代偿的肝硬化， 若不积极治疗， 半年存活率不及半数。主 要死因为慢性肝功能衰竭、 合并症及肝癌。 0004 影响肝硬化转归的因素很多， 包括 (1) 性别、 年龄 ； (2) 肝功能与预后肝脏体积大 比偏小者预后好 ； (3) 合并症， 包括门脉高压、 腹水、 肝性脑病、 感染、 肝肾综合征等 ； (4) 病 毒感染的状态和炎症活动反应 ； (5) 肝炎病理改变与预后。但目前尚没有指标检测肝硬化 的转归， 指导临床用药。 0005 近年来的研究表明， 乙型肝炎病毒感染、 慢性乙型肝炎、 肝硬化和 m。
12、iRNA 密切相 关， miRNA 可以通过作用于病毒本身或作用于免疫系统从而影响治疗过程， 因此对肝硬化用 药的诊断也可能有相应的作用。与肝硬化相关的 miRNA 种类较多且作用不一， 已有研究表 明在乙型肝炎病毒感染后， 患者体内miRNA表达谱会发生变化， 其中一些特异性miRNA已发 表相关专利。虽然已在该领域进行了一些研究， 但是肝硬化患者用药后的 miRNA 表达变化 目前还没有研究， 在临床和研究中， 需寻找可有效判断肝硬化用药后疗效、 指导临床停药的 miRNA 标志物。 发明内容 0006 本发明的一个方面提供了一种肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合， 其包括一 种。
13、以上选自以下的 microRNA 核酸分子 ： SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 13。 0007 优选地， 所述的一种以上为 2-13 种、 更优选 3-10 种、 进一步优选 3-8 种， 最优选 4 种。 说 明 书 CN 1042326。
14、38 A 3 2/9 页 4 0008 优选地， 所述的肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合含有 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 10 和 SEQ ID NO ： 11。 0009 本发明提供了一组新的肝硬化转归相关的 miRNA 作为肝硬化转归的分子标志物， 由一组 miRNA 组成， 其序列如下所示 SEQ ID NO ： 1 至序列号 13 中的一种以上。 0010 microRNA 名称miRNA 序列 miR-1uggaauguaaagaaguauguau miR-106b-5puaaagugcugacagugcagau m。
15、iR-122-5puggagugugacaaugguguuug miR-146a-5pugagaacugaauuccauggguu miR-15a-5puagcagcacauaaugguuugug miR-185-5puggagagaaaggcaguuccuga miR-18a-5puaaggugcaucuagugcagauag miR-223ugucaguuugucaaauacccca miR-25-3pcauugcacuugucucggucuga miR-27a-3puucacaguggcuaaguuccgc miR-451aaaaccguuaccauuacugaguu miR-455-3。
16、pgcaguccaugggcauauacac miR-92a-3puauugcacuugucccggccugu 0011 在一个优选的实施方案中， 所述的至少一种microRNA在至少一种靶血浆/血清中 与在至少一种对照血浆 / 血清中差异表达。 0012 优选地， 所述的靶血浆/血清来自肝硬化患者， 所述的对照血浆/血清来自健康对 照者。 0013 在更加优选的实施方案中， 所述的至少一种microRNA在至少一种靶血浆/血清中 的表达与至少一种对照血浆 / 血清中的表达相比被上调， 和 / 或其中的至少一种 microRNA 在至少一种靶血浆 / 血清中的表达与至少一种对照血浆中的表达相比。
17、被下调。 0014 发明人发现， 肝硬化转归microRNA分子标志物在肝硬化患者血浆/血清中的含量 相比健康对照人群， 存在显著差异， 可有效区分肝硬化和健康对照人群， 由此可见， 肝硬化 转归 microRNA 分子标志物与肝硬化的治疗和预后密切相关。 0015 在上述发现的基础上， 本发明提供了肝硬化转归 microRNA 分子标志物在制备肝 说 明 书 CN 104232638 A 4 3/9 页 5 硬化个体化用药的诊断试剂中的用途。 0016 因此， 本发明的第二方面提供了一种所述的肝硬化转归 microRNA 分子标志物组 合在制备肝硬化个体化用药诊断试剂中的用途， 所述的肝硬化。
18、转归 microRNA 分子标志物 组合优选含有 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 10 和 SEQ ID NO ： 11 的组合。 0017 所述诊断试剂优选通过检测被试者血浆中肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合 的含量， 并与健康对照人群平均水平相比较来判断是否停止用药。 0018 优选地， 使用定量PCR的方法来检测被试者血浆中肝硬化转归microRNA分子标志 物组合的含量。 0019 具体地， 所述诊断试剂通过检测被试者学血浆中肝硬化转归 microRNA 分子标 志物的含量， 并与正常人群平均水平相比较来诊断肝硬化用药的疗。
19、效， 其中， 肝硬化转归 microRNA 分子标志物在肝硬化患者血浆中的含量相比健康对照人群， 存在显著差异， 优选 地， 这种差异可以是后者比前者差异性升高， 也可以是差异性降低。 在一个特定的实施方案 中， 使用定量 PCR 的方法来检测被试者血浆 / 血清中肝硬化转归 microRNA 分子标志物含 量。 0020 本发明的第三方面提供了一种指导肝硬化个体化用药的诊断试剂盒， 其特征在 于 ： 包括所述肝硬化 microRNA 分子标志物组合的特异性正向引物组合， 优选含有 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 10 和 SEQ ID NO。
20、 ： 11 的组合的特异性正向引物。 0021 优选地， 所述的特异性正向引物包括一种以上选自以下序列的引物组合 ： SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 21、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 23、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 25、 SEQ ID NO ： 26， 优选含有 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 。
21、17、 SEQ ID NO ： 23 和 SEQ ID NO ： 24。 0022 优选地， 所述的试剂盒进一步包括 ： 0023 (1) 血浆 / 血清总 RNA 提取试剂， 0024 (2)RNA 加 polyA 试剂， 0025 (3)RT-PCR 试剂， 0026 (4) 定量 PCR 试剂 ； 0027 优选地， 其中， 定量 PCR 试剂所述肝硬化转归 microRNA 分子标志物组合的特异性 正向引物。 0028 优选地， 所述血浆总 RNA 提取试剂中包括序列为 SEQ ID NO ： 27 的外部控制序 列 -1(Extemal Control-1) 0029 优选地， 其中。
22、， 所述 RNA 加 polyA 试剂中包括序列为 SEQ ID NO ： 28 的外部控制序 列 -2(Extemal Control-2)。 0030 优选地， 其中， 所述 RT-PCR 试剂中包括序列为 SEQ ID NO ： 29 的反转录引物 (RT-Primer)。 0031 优选地， 其中， 所述定量PCR试剂中包括序列分别为SEQ ID NO ： 30和31的通用反 向引物 UPM-short 和 UPM-long。定量 PCR 试剂中包括肝硬化转归 microRNA 分子标志物的 特异性正向引物， 优选地， 其序列为如下所示 SEQ ID NO ： 14 至 SEQ ID 。
23、NO ： 26。 0032 说 明 书 CN 104232638 A 5 4/9 页 6 microRNA 名称引物序列 miR-1GTGGAATGTAAAGAAGTA miR-106b-5pGTGCTGACAGTGCAGA miR-122-5pGTGGAGTGTGACAATGGT miR-146a-5pGAGAACTGAATTCCATGGGT miR-15a-5pGCAGCACATAATGGTTTGT miR-185-5pGAGAGAAAGGCAGTTCCTG miR-18a-5pAGGTGCATCTAGTGCAGA miR-223TGTCAGTTTGTCAAATACC miR-25-3pT。
24、GCACTTGTCTCGGT miR-27a-3pTCACAGTGGCTAAGTTCC miR-451aACCGTTACCATTACTGAG miR-455-3pGGCAGTCCATGGGCATA miR-92a-3pTGCACTTGTCCCGGC 0033 在 一 个 特 定 的 实 施 方 案 中， 所 述 血 浆 总 RNA 提 取 试 剂 中 包 括 序 列 为 5 -CAACCTCCTAGAAAGAGTA-3 (SEQ ID NO ： 27) 的外部控制序列 -1(External Control-1) ； 所述 RNA 加 polyA 试剂中包括序列为 5 -TGAGCAACGCG。
25、AACAA-3 (SEQ ID NO ： 28) 的外部 控制序列 -2(Extemal Control-2) ； 所述 RT-PCR 试剂中包括序列为 5 -CAGTGGTATCAACGCA CTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3 (SEQ ID NO ： 29) 的反转录引物 (RT-Primer) ( 其中， V 为 A 或 C 或 G， N 为 A 或 T 或 C 或 G) ； 所述定量 PCR 试剂中包括序列分别为 5 -CTCACACGACTCACGACAC-3 (SEQ ID NO ： 30) 和 5 -CTCACACGACTCACGACAC。
26、CAGTGGTATCAA CGCACTC-3 (SEQ ID NO ： 31) 的通用反向引物 UPM-short 和 UPM-long。 0034 使用本发明的肝硬化转归 microRNA 分子标志物指导肝硬化的个体化用药具有操 作简单， 安全无创伤， 高特异性， 高灵敏性以及易于大量筛查的特点。 附图说明 0035 图 1 说明了包含本发明用于确定至少一个肝硬化血浆 / 血清优选 microRNA 中 miR-1、 miR-106b-5p、 miR-122-5p、 miR-146a-5p、 miR-15a-5p、 miR-185-5p、 miR-18a-5p、 miR-223、 miR-2。
27、5-3p、 miR-27a-3p、 miR-451a、 miR-455-3p 和 miR-92a-3p 及 microRNA 组合 的逻辑回归模型。 说 明 书 CN 104232638 A 6 5/9 页 7 0036 图 2 说明了包含本发明用于确定至少一个肝硬化血浆 / 血清中优选 miR-122-5p、 miR-146a-5p、 miR-27a-3p 和 miR-451a 及 microRNA 组合的的逻辑回归模型。 具体实施方式 0037 如本发明所述， microRNA 或者 miRNA 具有其在本领域中的普通含义 ( 例如见 CN102943108A)。也就是说， microRN。
28、A 表示来自遗传基因位点的 RNA 分子， 其从可以形成局 部 RNA 前体 microRNA 结构的转录物加工而来。成熟 microRNA 通常长度为 20、 21、 22、 23、 24、 或 25 个核苷酸， 尽管其它数目的核苷酸也可存在， 例如 18、 19、 26、 27 或 28 个核苷酸。 0038 如本发明所述，“一种以上” 表示 2-13 种之间， 优选 2-10 种， 更优选 3-8 种， 更优选 4-6 种， 最优选 4 种。 0039 如本发明所述， 肝硬化诊断依据 2000 年中华医学会病毒性肝炎防治指南， 具体如 下 ： 具有乙肝病毒慢性感染病史， 影像学提示弥漫肝。
29、纤维化， 再生结界形成， 其他表现可有 脾大、 脾功能亢进、 食管胃底静脉曲张， 金标准为病理检查发现再生结节。 0040 本发明通过具体实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案， 但是本领域普通技 术人员可以理解的是 ： 以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明， 而不应理解为以任 何方式限制本发明。 0041 实施例 1 ： 血浆样本采集和制备 0042 在 2012 年 6 月 -2014 年 3 月期间， 150 个满足以上肝硬化定义的患者的血浆样本 和 150 个满足正常健康者的血浆样本被预先从首都医科大学附属北京佑安医院采集。 0043 采集外周静脉血 10mi， EDTA 抗凝， 。
30、血浆收集流程如下 ： 将全血样本置于离心机内 4， 1,500-3,000g离心15min。 用200L移液枪将上层血浆小心地转移到1.5mL无RNA酶 的无菌离心管中。对每个样本做好标记。务必在 4 小时内将血浆样本放到超低温 (-80 ) 冰箱中进行保存。 0044 实施例 2. 血浆中总 RNA 的提取 0045 使用 RNA 提取试剂盒 ( 北京旷博生物技术有限公司 ) 自血浆中提取总 RNA， 每 250l 血浆中加入 1l(20nM) 序列为 5 -CAACCTCCTAGAAAGAGTA-3 (SEQ ID NO ： 27) 的 External Control-1( 上海生工生物。
31、工程技术有限公司合成 ) 来监控血浆中 RNA 的提取质 量。提取的总 RNA 使用 Thermo NanoDrop 2000c 测定浓度。 0046 实施例 3. 三步法定量检测血浆中的 miRNA 0047 (1) 加 polyA 尾 ： 0048 i. 在无 RNA 酶的 PCR 管 (Axygen 公司， 200l) 中配制加 polyA 尾的反应液， 体系 为 20i。每 20l 体系中加入 1l(20nM) 序列为 5 -TGAGCAACGCGAACAA-3 (SEQ ID NO ： 28) 的 External Control-2( 上海生工生物工程技术有限公司合成 ) 来监控 。
32、miRNA 的加尾 及反转录质量。 说 明 书 CN 104232638 A 7 6/9 页 8 0049 0050 ( 注 ： 本实验所使用的酶均为北京旷博生物技术有限公司的产品。) 0051 ii. 将装有配置好反应液的 PCR 管放入 PCR 仪 (Thermo) 中 37孵育 1 小时。(2) RT-PCR 得到 cDNA 单链 ： 0052 i. 向 (1) 得到的反应液中加入 0.5l(0.5ng/l) 序列为 5 -CAGTGGTATCAACGC ACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3 (SEQ ID NO ： 29) 的 RT-Prime。
33、r( 上海生工生 物工程技术有限公司合成 )， 70孵育 5min， 立即放到冰上冰浴至少 2min。 0053 ii. 配制反转录反应液 ： 0054 0055 ( 注 ： 所用产品均为北京旷博生物技术有限公司的产品。) 0056 iii.将i与ii得到的溶液混合， 50孵育50min后70保温15min， 置冰上冷却， 得到 cDNA。 0057 iv. 将 iii 得到的产物分装后 -20保存。 0058 (3)qPCR 定量检测 ： 0059 i. 在 2ml EP 管 (Axygen 公司 ) 中配制反应液 ： 说 明 书 CN 104232638 A 8 7/9 页 9 0060 。
34、0061 ( 注 ： UPM-long、 UPM-short 均在 Invitrogen 公司合成， 其余试剂均来自北京旷博 生物技术有限公司的Green PCR Master Mix。) 0062 其 中， 通 用 反 向 引 物 UPM-short 和 UPM-long 的 序 列 分 别 为 5 -CTCACACGACTCACGACAC-3 (SEQ ID NO ： 30) 和 5 -CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAA CGCACTC-3 (SEQ ID NO ： 31)。 0063 ii. 配置好的反应液充分颠倒混匀后， 分装入 96 孔尖底 PCR 板中 。
35、(Axygen 公司 )， 每孔 18l。 0064 iii. 使用排枪 (Eppendoff 公司， 1-10l) 分别加入序列如 (SEQ ID NO ： 14 至 26) 所示的肝硬化 microRNA 分子标志物特异性正向引物 (Invitrogen 公司合成 )， 每孔 2l(10M)。 0065 iv. 加入 10l 石蜡油液封后用专用贴膜 (ABI 公司 ) 密封。 0066 v. 放入 ABI7900PCR 定量检测仪中， 程序设定为 ： 0067 0068 vi.绘制熔解曲线， 检查引物的特异性， 程序设定为 ： 9515s， 6015s， 9515s。 0069 实施例 4。
36、 ： 结果分析 ： 0070 采用 Array Tools4.1.0 进行数据分析 0071 关于RT-PCR方法以及2-CT方法见Kenneth J Livak等(Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2- CT method. Methods25， 402-408(2001)， 此处全文引入以供参考。 0072 按照实施方式， 进行了 150 例肝硬化和 150 例健康对照的肝硬化转归 microRNA 分 子标志物表达水平检测， 发现差异表达的 miRNA 有 2。
37、8 条。而其中在肝硬化和正常对照之间 差异显著的有 13 条， 结果见表 1。 0073 表 1 0074 说 明 书 CN 104232638 A 9 8/9 页 10 检测物DDCt_A-DP. 值 _A-D miR-1-1.692461.06E-11 miR-106b-5p1.6262141.16E-15 miR-122-5p-1.190645.4E-06 miR-146a-5p-1.970241.69E-19 miR-15a-5p0.8331564.71E-06 miR-185-5p1.0883844.96E-07 miR-18a-5p1.1844167.31E-10 miR-223-。
38、0.867583.93E-05 miR-25-3p1.8916454.33E-07 miR-27a-3p-1.591048.05E-13 miR-451a2.4633697.43E-21 miR-455-3p-1.784242.52E-08 miR-92a-3p1.3448491.88E-15 0075 0076 利用 Spss 作图软件， 以真阳性率 ( 灵敏度 ) 为纵坐标、 假阳性率 (1- 特异性 ) 为 横坐标， 绘制 ROC(receiver operating characteristic) 曲线， 其中 13 条相关的 miRNA 及 miRNA 组合的结果见图 1， 其中 m。
39、iRNA 组合 AUC( 曲线下面积 ) 达到 0.997， 表明肝硬化转归 microRNA 分子标志物可有效区分肝硬化和健康对照。 0077 根据以上实验结果， 对 28 例受试者血浆中 miR-1、 miR-106b-5p、 miR-122-5p、 miR-146a-5p、 miR-15a-5p、 miR-185-5p、 miR-18a-5p、 miR-223、 miR-25-3p、 miR-27a-3p、 miR-451a、 miR-455-3p 和 miR-92a-3p 组合的表达水平进行检测， 根据 miRNA 表达水平， 预 测受试者是肝硬化患者还是正常健康对照。盲测结果见如下表。
40、 2。 0078 表 2 0079 肝硬化健康对照 样本数208 结果18 例判读正确， 2 例判读为乙型肝炎8 例判读正确 说 明 书 CN 104232638 A 10 9/9 页 11 预测准确率90100 0080 实施例 5 0081 利用Spss作图软件， 以真阳性率(灵敏度)为纵坐标、 假阳性率(1-特异性)为横 坐标， 绘制 ROC(receiver operating characteristic) 曲线， 对其中 4 条相关的 miRNA 的 miR-122-5p、 miR-146a-5p、 miR-27a-3p、 miR-451a 进行分析， 其结果见图 2， 图中可见，。
41、 其中 miRNA 组合 AUC( 曲线下面积 ) 达到 0.985， 表明肝硬化转归 microRNA 分子标志物可有效区 分肝硬化和健康对照。 0082 根 据 以 上 实 验 结 果，对 28 例 受 试 者 血 浆 中 miR-122-5p、 miR-146a-5p、 miR-27a-3p、 miR-451a 组合的表达水平进行检测， 根据 miRNA 表达水平， 预测受试者是肝硬 化患者还是正常健康对照。盲测结果见如下表 3。 0083 表 3 0084 0085 肝硬化健康对照 样本数208 结果17 例判读正确， 3 例判读为乙型肝炎8 例判读正确 预测准确率85100 说 明 书 CN 104232638 A 11 1/6 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 104232638 A 12 2/6 页 13 0003 序 列 表 CN 104232638 A 13 3/6 页 14 0004 序 列 表 CN 104232638 A 14 4/6 页 15 0005 序 列 表 CN 104232638 A 15 5/6 页 16 0006 序 列 表 CN 104232638 A 16 6/6 页 17 序 列 表 CN 104232638 A 17 1/1 页 18 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104232638 A 18 。