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1、(10)申请公布号 CN 104321431 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104321431 A (21)申请号 201380026145.2 (22)申请日 2013.04.29 61/649,753 2012.05.21 US C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 安捷伦科技有限公司 地址 美国科罗拉多州 (72)发明人 KW希尔 (74)专利代理机构 北京市嘉元知识产权代理事 务所(特殊普通合伙) 11484 代理人 陈静 (54) 发明名称 在 DNA/RNA 应用中作为可裂解接头的逆狄尔 斯阿尔德反应 。
2、(57) 摘要 本发明提供一种可逆地缀合寡核苷酸的新方 法， 其包括获得用二烯部分标记的寡核苷酸和用 亲二烯体部分标记的靶向实体 ； 在溶液中于第一 温度加热用二烯部分标记的寡核苷酸和用亲二烯 体部分标记的靶向实体以进行狄尔斯阿尔德反应 产生缀合物 ； 和加热缀合物至第二温度以进行逆 狄尔斯阿尔德反应重新生成用二烯部分标记的寡 核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向实体。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.11.19 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2013/038704 2013.04.29 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/17684。
3、5 EN 2013.11.28 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 14 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书14页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104321431 A CN 104321431 A 1/1 页 2 1. 一种可逆地缀合寡核苷酸的方法， 包括 ： 获得用二烯部分标记的寡核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向实体 ； 在溶液中于第一温度加热用二烯部分标记的寡核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向 实体以进行狄尔斯阿尔德反应产生缀合物 ； 和 加热缀合物至第二温度以进行逆狄尔斯阿尔德反应以重新生成用二烯部分。
4、标记的寡 核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向实体。 2. 权利要求 1 的方法， 其中溶液为水溶液或水 / 有机溶液。 3. 权利要求 1-2 的方法， 其中第一温度为约 20且第二温度为约 75。 4. 权利要求 1-3 的方法， 其中二烯部分包含呋喃基团。 5. 权利要求 1-4 的方法， 其中亲二烯体实体包含马来酰亚胺基团。 6. 权利要求 1-5 的方法， 其中靶向实体包含载体。 7. 权利要求 6 的方法， 其中载体为固体载体、 凝胶、 纳米粒子、 蛋白质、 碳水化合物、 可 溶性聚合物或它们的混合物。 8. 权利要求 1-7 的方法， 其中靶向实体包含用于与载体偶联的配体。 9. 权。
5、利要求 8 的方法， 其中配体包含生物素， 载体包含抗生物素蛋白或链霉亲和素。 10. 权利要求 1-9 的方法， 其中寡核苷酸和二烯部分通过方形酸酯基团连接。 11. 一种可逆地缀合寡核苷酸的方法， 包括 ： 获得用亲二烯体部分标记的寡核苷酸和用二烯部分标记的靶向实体 ； 在溶液中于第一温度加热用亲二烯体部分标记的寡核苷酸和用二烯部分标记的靶向 实体以进行狄尔斯阿尔德反应产生缀合物 ； 和 加热缀合物至第二温度以进行逆狄尔斯阿尔德反应重新生成用亲二烯体部分标记的 寡核苷酸和用二烯部分标记的靶向实体 ； 用相同的或其它亲二烯体再标记释放的呋喃 - 寡核苷酸， 和 任选地重复逆狄尔斯阿尔德与狄尔。
6、斯阿尔德缀合 - 脱缀合反应的过程。 12. 权利要求 11 的方法， 其中溶液为水溶液或水 / 有机溶液。 13. 权利要求 11-12 的方法， 其中第一温度为约 20-40且第二温度为约 75。 14. 权利要求 11-13 的方法， 其中二烯部分包括呋喃基团。 15. 权利要求 11-14 的方法， 其中亲二烯体实体包括马来酰亚胺基团。 16. 权利要求 11-15 的方法， 其中靶向实体包括载体。 17. 权利要求 16 的方法， 其中载体为固体载体、 凝胶、 纳米粒子、 蛋白质、 碳水化合物、 可溶性聚合物或它们的混合物。 18. 权利要求 11-17 的方法， 其中靶向实体包含用。
7、于与载体偶联的配体。 19. 权利要求 18 的方法， 其中配体包括生物素， 载体包括抗生物素蛋白或链霉亲和素。 20. 权利要求 11-19 的方法， 其中寡核苷酸和亲二烯体部分通过方形酸酯基团连接。 权 利 要 求 书 CN 104321431 A 2 1/14 页 3 在 DNA/RNA 应用中作为可裂解接头的逆狄尔斯阿尔德反应 0001 优先权要求和相关的专利申请 0002 本申请要求 2012 年 5 月 21 日提交的美国临时申请序号 61/649,753 的优先权的 利益， 其全部内容整体引入本申请中作为参考。 发明领域 0003 本发明通常涉及将寡核苷酸与其它实体缀合的领域。更。
8、具体地， 本发明涉及其中 逆狄尔斯阿尔德反应 (retro Diels Alder reaction) 在寡核苷酸的应用中作为可裂解接 头使用的组合物和方法。 0004 发明背景 0005 相当大的努力已经针对寡核苷酸和寡核苷酸类似物作为诊断和研究试剂和作为 潜在治疗的应用。结果是， 寡核苷酸作为治疗剂或诊断试剂的应用迅速发展。在这些应用 的许多应用中， 寡核苷酸与另一分子实体缀合。 0006 大多数将寡核苷酸 ( 例如， DNA 或 RNA) 与其它实体诸如小分子、 肽、 蛋白质、 其 它寡核苷酸、 聚合物、 甚至固体表面连接的方法， 包括将寡核苷酸与期望的物质不可逆 连接的设计的 (tai。
9、lored) 接头部分。至于实现这种缀合可获得的各种化学方法， 参见 Goodchild,Bioconjugate Chemistry,1:165-187(1990) 的综述。尽管这些方法适用， 但大 多数不允许随后从缀合伴侣中除去寡核苷酸。 0007 例如， 许多基于寡核苷酸的药物含有与它们缀合的大分子量 PEG(40K)。PEG 的连 接可降低免疫原性或提高缀合物的稳定性或半衰期。多种制备 PEG- 寡核苷酸缀合物的 方法描述于 Goodchild,Bioconjugate Chem.,1:165(1990), 和 Zalipsky,Bioconjugate Chem.,6:150(199。
10、5) 中。典型的用于制备 PEG- 寡核苷酸缀合物的基于 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 的缀合方法产生非裂解接头。大尺寸的 PEG- 寡核苷酸缀合物阻止质谱分析， 致使进 行杂质表征是不可能的。在象这样的情形中， 将期望能可逆地将寡核苷酸与靶向实体连接 和分离。 0008 为了允许随后的脱缀合， 将使用其它采用可裂解接头的缀合方法。 然而， 只有基于 硫醇 - 二硫化物的可裂解的， 可逆的接头才在当前可获得。基于硫醇 - 二硫化物的方法广 泛用于蛋白质缀合化学中以及寡核苷酸缀合中。基于硫醇 - 二硫化物的缀合有一些缺点。 这些接头对许多亲核和亲电子试剂是不稳定的。该缀合需要还原剂以将寡核苷。
11、酸 -S-SR 转 变为反应性寡核苷酸 -SH( 即， 硫醇 )。寡核苷酸 -SH 物质是氧化不稳定的 ； 必须小心进行 反应和在惰性气氛下操作以避免寡核苷酸 -S-S- 寡核苷酸二聚化或重新形成起始物寡核 苷酸二硫化物(寡聚物-S-SR)。 硫醇标记的寡核苷酸的分离或储存由于它的氧化不稳定性 而不实用。 0009 另外， 硫醇 - 二硫化物化学使两种物质与同一缀合基团 (SH) 缀合。这可导致在缀 合过程中混和二聚体形成。因此， 需要能可逆地使寡核苷酸与其它实体缀合的更好方法。 0010 发明概述 0011 本发明的一方面涉及可逆地缀合寡核苷酸的方法。 根据本发明的一个实施方案的 说 明 书。
12、 CN 104321431 A 3 2/14 页 4 方法包括 ： 获得用二烯部分标记的寡核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向实体 ； 在溶液中 于第一温度加热用二烯部分标记的寡核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向实体以进行狄 尔斯阿尔德反应产生缀合物 ； 和加热缀合物至第二温度以进行逆狄尔斯阿尔德反应重新生 成用二烯部分标记的寡核苷酸和用亲二烯体部分标记的靶向实体， 其比例依赖于温度、 二 烯和亲二烯体浓度。 0012 根据本发明的一个实施方案的另一方法包括 ： 获得用亲二烯体部分标记的寡核苷 酸和用二烯部分标记的靶向实体 ； 在溶液中于第一温度加热用亲二烯体部分标记的寡核苷 酸和用二烯部分标记的靶。
13、向实体以进行狄尔斯阿尔德反应产生缀合物 ； 和加热缀合物至第 二温度以进行逆狄尔斯阿尔德反应重新生成用亲二烯体部分标记的寡核苷酸和用二烯部 分标记的靶向实体， 其比例依赖于温度、 二烯和亲二烯体浓度和是否将过量物加入到逆狄 尔斯阿尔德反应混合物中。 0013 上面描述的任何方法都可在含水溶液中进行， 其中第一温度可为 20而第二温度 可为75。 在以上的任意方法中， 二烯部分可包含呋喃且亲二烯体实体可包含马来酰亚胺。 在以上的任意方法中， 靶向实体可包括载体， 其中载体可以是固体载体或可溶性聚合物。 在 以上的任意方法中， 靶向实体可包括用于与载体偶联的配体， 其中配体可包括生物素且载 体可包。
14、括抗生物素蛋白或链霉亲和素。 0014 本发明的其它方面和优点根据以下的说明书和所附权利要求书将是显而易见的。 0015 附图简述 0016 图 1 显示示例狄尔斯阿尔德反应和逆狄尔斯阿尔德反应的示意图。 0017 图 2 显示根据本发明的一个实施方案制备呋喃 - 标记的寡核苷酸的方法。 0018 图 3 显示根据本发明的一个实施方案缀合寡核苷酸衍生物的狄尔斯阿尔德反应。 0019 图 4 显示根据本发明的一个实施方案使寡核苷酸衍生物脱缀合的逆狄尔斯阿尔 德反应。 0020 图 5 显示根据本发明的一个实施方案缀合寡核苷酸衍生物以通过载体的固定化 促进纯化的狄尔斯阿尔德反应和使加合物脱缀合以重。
15、新生成寡核苷酸衍生物的逆狄尔斯 阿尔德反应。 0021 图 6 显示逆狄尔斯阿尔德呋喃 - 寡核苷酸可以在另一狄尔斯阿尔德反应中再使 用。 0022 图 7 显示示例根据本发明的一个实施方案的方法的流程图。 0023 定义 0024 除非另有定义， 本文中使用的所有技术和科学术语为本发明所属领域的 普通技术人员通常理解的含义。本申请中使用的核酸化学、 生物化学、 遗传学、 分子生物学的术语和符号遵循本领域中标准论文和文本的那些， 例如 Kornberg and Baker,DNA Replication,Second Edition(W.H.Freeman,New York,1992) ； L。
16、ehninger,Biochemistry,Second Edition(Worth Publishers,New York,1975) ； Strachan and Read,Human Molecular Genetics,Second Edition(Wiley-Liss,New York,1999) ； Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991) ； Gait,editor,Oligonucleotide Synthesi。
17、s:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984) ； Sambrook 等 ,Molecular Cloning:A 说 明 书 CN 104321431 A 4 3/14 页 5 Laboratory Manual,2.sup.nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory,1989) ； 等。还 有， 为清晰和便于参考对某些术语在下文进行了定义。 0025 本申请中所使用的术语 “核苷” ， 指修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷或核糖核苷 或其任意化学修饰物。核苷的修饰包括但不限于， 2-、 3- 和 5- 位糖修饰，。
18、 5- 和 6- 位嘧 啶修饰， 2-、 6- 和 8- 位嘌呤修饰， 在环外胺的修饰， 5- 溴 - 尿嘧啶的取代等。可对核苷进行 适当地保护和衍生以使得能够通过本领域已知的方法进行寡核苷酸合成， 诸如采用核苷亚 磷酰胺单体、 H- 膦酸盐偶联或磷酸三酯偶联进行固相自动化合成。 0026 本申请中所使用的术语 “核苷酸” ， 指修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸。核苷酸为具有一个或几个连接在 5-、 2- 或 3- 位的磷酸酯或取代的磷酸酯的如 上定义的核苷。核苷酸典型地包括嘌呤和嘧啶， 其包括胸苷、 胞苷、 鸟苷、 腺嘌呤和尿苷。 0027 本申请中所使用的 “寡核苷酸” ， 。
19、指由如上定义的多个连接的核苷酸单元形成的多 聚核苷酸。核苷酸单元各自包括经磷酸酯连接基连接在一起的核苷单元。术语寡核苷酸也 指经非磷酸酯连接基的连接基诸如硫代磷酸酯连接基连接在一起的多个核苷酸。 寡核苷酸 可以是天然存在的或非天然存在的。在优选的实施方案中本发明的寡核苷酸具有 1-1,000 个核苷酸。寡核苷酸可以合成或可以通过酶解制备， 且在一些实施方案中， 长度为 10 至 50 个核苷酸。 寡核苷酸可包括核糖核苷酸单体(即， 可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸 单体。例如， 寡核苷酸的长度可以是 10 至 20、 21 至 30、 31 至 40、 41 至 50、 51-60、 61。
20、 至 70、 71 至 80、 80 至 100、 100 至 150、 150 至 200、 200 至 500、 或大于 500 个核苷酸。 0028 本申请中所使用的术语 “二烯” 或 “二烯部分” ， 指具有两个共轭双键的分子。如 果分子的几何形状被束缚使得促进环化加成反应， 那么二烯甚至可以非共轭的 ( 参见， Cookson,J.Chem.Soc.,5416(1964)。形成这些双键的原子可以是碳或杂原子或它们的任 意组合。 0029 本申请中所使用的术语 “亲二烯体” 或 “亲二烯体部分” ， 指具有烯烃基团、 或碳和 杂原子之间的双键、 或两个杂原子之间的双键的分子。亲二烯体可。
21、以是任意基团， 包括但 不限于， 取代或未取代的烯烃、 或取代或未取代的炔烃。典型地， 亲二烯体为式 C C-Z 或 Z-C C-Z 的取代烯烃， 其中 Z 和 Z 为吸电子取代基， 诸如 CHO、 COR、 COOH、 CO- 芳基、 CN、 NO2。亲二烯体的其它实例包括具有式 R2-C X 的化合物， 其中 X 为杂原子， 选自氧、 氮、 磷 和硫。例如， 具有伯氨基基团的分子， 诸如氨基酸或含有赖氨酸的肽， 可通过与甲醛反应转 变为高效的亲二烯体以产生它们相应的鎓盐， 其可在含水溶剂中在温和的条件下与二烯基 团进行狄尔斯阿尔德环加成。 0030 发明详述 0031 本发明的实施方案涉及。
22、使寡核苷酸与其它分子实体可逆地缀合的方法。 寡核苷酸 可包括 DNA、 RNA、 或混合的 DNA/RNA。本发明的实施方案基于以下的事实 ： 狄尔斯阿尔德反 应(例如， 在呋喃、 蒽及其它合适的二烯与马来酰亚胺及其它合适的亲二烯体之间)是可逆 的， 且在许多情况下， 在温和的条件下是容易可逆的 ( 例如， 通过施加热、 光和 pH 值变化 )。 轻易的可逆性允许技术人员使寡核苷酸暂时缀合或脱缀合。 0032 例如， 对 PEG- 缀合的寡核苷酸进行的质谱仪分析中的上述困难可通过在质谱仪 分析之前 PEG 自寡核苷酸的脱缀合来克服。作为具体的实例， 呋喃 - 寡核苷酸与马来酰亚 胺修饰的 PE。
23、G 的缀合将产生在施加的热下可裂解的稳定缀合物， 释放的呋喃寡核苷酸可容 说 明 书 CN 104321431 A 5 4/14 页 6 易地进行分析且杂质可通过 LCMS 方法表征。因此， 分析大分子量缀合物的问题可采用简易 的狄尔斯阿尔德 - 逆狄尔斯阿尔德反应组合来解决。 0033 缀合分子的狄尔斯阿尔德反应的应用是已知的。例如， 授予 Pieken 等的美国专利 6,737,236 公开了采用环化加成反应， 诸如狄尔斯阿尔德反应或 1,3- 偶极环加成， 使大分 子与其它分子实体缀合的方法。为了狄尔斯阿尔德反应， 将含有二烯部分的分子 ( 例如， 呋 喃 ) 与含有亲二烯体的另一分子 。
24、( 例如， 含有双键的部分 ) 偶联。 0034 然而， 逆狄尔斯阿尔德反应来释放狄尔斯阿尔德反应的寡核苷酸缀合物的应用还 没有被公开。 本发明的实施方案提供用于使寡核苷酸与靶向实体暂时缀合和用于有效地重 新生成寡核苷酸衍生物或依赖于在第二正向的狄尔斯阿尔德反应中加入的亲二烯体产生 新衍生物非常高效的方法。 0035 不同于基于硫的可裂解的和可逆的连接化学， 用于狄尔斯阿尔德反应的试剂 ( 例 如， 呋喃-标记的寡核苷酸)是稳定的并可容易分离。 本申请中描述的狄尔斯阿尔德反应和 逆狄尔斯阿尔德反应可使用任意合适的二烯和亲二烯体。例如， 本发明的实施方案可以使 用作为二烯的呋喃或呋喃类似物和作为。
25、亲二烯体的马来酰亚胺或其类似物。 在狄尔斯阿尔 德反应中， 参与偶联的两个基团是不同的 ( 例如， 呋喃 / 马来酰亚胺 ( 二烯 / 亲二烯体 )。 因此， 技术人员可避免不希望的二聚体形成 ( 如在硫醇 - 二硫化物方法中 )。 0036 本发明的实施方案包括在含水介质中的狄尔斯阿尔德反应。已知狄尔斯阿尔德 反应在含水溶液中更高效 (Rideout 和 Breslow,J.Am.Chem.Soc.,102:7816(1980)。例 如， 简单的二烯， 诸如3,5-己二烯酸钠和4,6-庚二烯酸钠可在室温下与各种亲二烯体在水 中容易进行狄尔斯 - 阿尔德反应。(Grieco 等 ,J.Org.。
26、Chem.,48:3137(1983)， 另外丁炔 二酸二甲酯与缺电子呋喃的困难的环加成在水中在非常温和条件下以非常好的产率进行。 (Saksena 等 ,Heterocycles,35:129(1993)。 0037 在本发明的一些实施方案中， 寡核苷酸可含有二烯部分， 而靶向实体可包括亲二 烯体。在其它实施方案中， 这些可相反， 即， 寡核苷酸可含有亲二烯体， 而靶向实体可含 有二烯。为了清晰说明， 以下描述将采用实施例， 其中寡核苷酸含有二烯 ( 例如， 呋喃 )， 而 靶向实体含有亲二烯体(例如， 马来酰亚胺)。 本领域技术人员将理解本发明的实施方案还 包括相反的配置 ( 即， 亲二烯。
27、体在寡核苷酸上而二烯在靶向实体上 )。此外， 以下实施例可 使用作为二烯的呋喃和作为亲二烯体的 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM)。再者， 实施例中这些具 体分子的使用是为了清晰说明而不是意图限制本发明的范围。 0038 狄尔斯 - 阿尔德反应为 4+2 环化加成反应 ； 它涉及 4- 电子系统 ( 二烯 ) 和 2- 电子系统 ( 亲二烯体 )。反应可在温和的条件下迅速发生， 且反应可在宽范围的反应 物中发生。狄尔斯 - 阿尔德反应的综述可见于 ：“Advanced Organic Chemistry,” (March. J.,ed.)761-798,McGraw Hill,N.Y.(1977。
28、)。 狄尔斯阿尔德反应是容易可逆的， 且该逆反应 称为逆狄尔斯阿尔德反应。 0039 图 1 显示基本的狄尔斯阿尔德反应和相应的逆狄尔斯阿尔德反应的实例。在本实 施例中， 呋喃充当二烯组分而 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM) 充当亲二烯体。狄尔斯阿尔德反应 可通过热催化。例如， (4+2) 环化加成反应可通过将溶液加热至 40持续所选择的时间来 完成。持续时间将依赖于具体的二烯和亲二烯体和所用的反应介质。本领域技术人员将不 需过度的实验能找到适当的持续时间。例如， 技术人员可采用合适的方法监测反应进程然 说 明 书 CN 104321431 A 6 5/14 页 7 后当反应完成或达到期望的程。
29、度时终止反应。狄尔斯阿尔德反应可产生两种立体异构体 ( 外型和内型异构体 )， 两者之一或两者都可以用于本发明的实施方案。 0040 如上文所述， 狄尔斯阿尔德反应是可逆的。 逆狄尔斯阿尔德反应也可通过热催化。 例如， 狄尔斯阿尔德加成物可通过将溶液加热至75持续所选择的时间来分离。 再者， 本领 域技术人员不需过度的实验可容易地测定合适的持续时间。 0041 本发明的实施方案利用狄尔斯阿尔德反应， 与图 1 中所示的类似， 用于使寡核苷 酸与靶向实体缀合。靶向实体可以是任意期望的靶标， 诸如其它寡核苷酸、 蛋白质 / 肽、 碳 水化合物、 或载体(其可包括固体载体， 诸如树脂、 玻璃珠、 磁。
30、珠、 基质表面等)。 根据本发明 的一些实施方案， 寡核苷酸可与二烯诸如呋喃偶联， 而靶向实体可与亲二烯体偶联， 或者相 反。含有二烯的寡核苷酸衍生物可在类似于图 1 中所示的条件下 ( 诸如在含水溶液中通过 加热至 40持续所选择的时间 ) 与合适的连接靶向实体的亲二烯体反应。 0042 根据本发明的实施方案， 可以任何合适的方法制备寡核苷酸衍生物 ( 含有二烯或 亲二烯体)。 例如， 可用用于与二烯或亲二烯体偶联的官能团合成寡核苷酸。 官能团， 例如， 可以是氨基基团、 羧基基团、 硫醇基团等。作为替代， 技术人员可使用核碱基上的环外氨基 用于偶联。 0043 多 种 使 官 能 团 与 。
31、寡 核 苷 酸 连 接 的 方 法 是 已 知 的。( 关 于 综 述， 参 见 Goodchild,Bioconjugate Chemistry,1:165-187(1990). 一旦化学反应性官能团与寡核 苷酸连接 ( 例如， 在 5- 端 )， 这些反应性官能团就可用于与多种缀合物偶联。例如， 脂肪 族伯氨基基基团可在寡核苷酸合成的最后步骤中在寡核苷酸的 5- 端引入。连接寡核苷 酸的 5 端的试剂可商购获得。例如， 5- 氨基 - 改性剂 C6 可得自 Glen Research Corp. (Sterling,Va.)。 0044 用于修饰寡核苷酸以提供反应性官能团的试剂可以是亚磷酰。
32、胺的形式， 当其附着 于固体载体时其可与全长寡核苷酸的游离 5 - 羟基基团偶联。这种偶联在连接另一个核苷 酸单体时将是相似的。 例如， 请参见Theison等， Tetrahedron Lett.,33:5033-5036(1992)。 0045 一旦寡核苷酸以反应性官能团(例如， 氨基或硫醇基团)衍生化， 它们就可用于与 二烯或亲二烯体偶联， 直接偶联或者经另一中间物偶联。 0046 图 2 显示通过中间物 ( 例如， 方形酸酯 (SQ) 制备呋喃 - 标记的寡核苷酸的实例。 尽管在该实例中显示的是 SQ， 但任意本领域已知的合适的中间物都可以使用。如图 2 中所 示， SQ可在非常温和条。
33、件下， 诸如在中性pH下在水中， 与氨基基团偶联。 温和的反应条件对 于偶联生物材料， 包括寡核苷酸， 是期望的。在该偶联中， 过量的 SQ 可用于促成在 SQ 部分 上的单取代(即， 仅在SQ上的两个潜在的氨基-反应性位点中只有一个与寡核苷酸偶联)。 0047 在 SQ 与氨基 - 连接的寡核苷酸偶联之后， 过量的 SQ 可以本领域已知的任何方式 除去。例如， 由于 SQ 为小分子， 因此它可基于分子的大小进行分离， 诸如尺寸排阻凝胶过滤 或分子量截留膜过滤。 0048 在该实例中， 偶联之后， 可采用超滤将反应混合物精制以除去小分子物质 ( 过量 的方形酸酯和小寡核苷酸未反应(failur。
34、e)物质)， 例如采用在Epindorf管中的3K分子量 截留膜(或用于更大规模缀合的更大超滤装置)。 采用超滤， 可通过离心迅速除去小分子组 分 / 杂质。 0049 为了制备呋喃 - 偶联的衍生物， SQ- 寡核苷酸的单 - 缀合物可用过量的 5- 甲基糠 说 明 书 CN 104321431 A 7 6/14 页 8 胺处理。再者， 该偶联反应可在温和的条件下， 诸如在 pH9.2 下在含水缓冲液中进行。该反 应可采用分子量截留膜 ( 例如， 3K 分子量截留膜 ) 再精制。可将最终的滞留物干燥 ( 例如， 冻干 ) 得到呋喃 -SQ- 寡核苷酸 1。最终产物 1 通过 LCMS 得到证。
35、实， 根据液相色谱 - 质谱联 用 (LCMS) 分析判断发现产率高于 90。 0050 以上实例显示呋喃通过方形酸酯 (SQ) 与寡核苷酸连接， 其允许采用在寡核苷酸 和呋喃两者上的氨基基团进行偶联。本领域技术人员也将理解替代方案 (alternative) 是 与氨基 - 标记的寡核苷酸直接偶联的呋喃衍生物。例如， 呋喃衍生物可含有与寡核苷酸衍 生物上的氨基基团反应的官能团。这种官能团可包括活化的羧基酯 ( 例如， NHS 酯 )、 酸酐、 酰卤、 醛、 或卤素。这些类型的化学修饰是本领域公知的。 0051 此外， 尽管以上实例使用氨基 - 标记的寡核苷酸与中间物 ( 例如， 方形酸酯 )。
36、 反应 以与呋喃衍生物偶联， 但其它的寡核苷酸可含有其它官能团。 例如， 本发明的寡核苷酸可以 使用可用于与含有氨基基团的呋喃衍生物偶联的氨基-反应性基团(例如， 羧基基团、 醛基 基团或卤素 ) 进行衍生化。本领域技术人员将理解在不脱离本发明范围的情况下多种改变 和变化是可能的。 0052 一旦获得含有呋喃的寡核苷酸， 它们就可用于与含有亲二烯体部分的靶分子缀 合。常见的亲二烯体典型地包括双键， 特别是邻近于吸电子取代基的双键。通常与生物分 子一起使用的亲二烯体包括马来酰亚胺衍生物， 诸如 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM)。 0053 图 3 显示使含有呋喃的寡核苷酸与亲二烯体 ( 即， N。
37、EM) 缀合的实例。在该实例 中， 将分离出的呋喃 -SQ- 寡核苷酸 1 溶于水中， 并加入过量的溶解于二甲亚砜 (DMSO) 中的 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM)。将所得混合物保持在 40。在 40保持三小时之后， 对反应混 合物取样并通过 LCMS 直接分析。该反应彻底地进行得到产率高于 90的预期的狄尔斯阿 尔德加成物(很可能是外型和内型异构体的混合物， 但只有外型异构体在图3中显示)。 再 者， 狄尔斯阿尔德加成物 2 可通过上文描述的超滤 (UF) 旋转筒法进行分离。 0054 尽管以上实例使用乙基马来酰亚胺 (NEM) 作为亲二烯体， 但也可使用其它亲二烯 体。例如， NEM 。
38、衍生物可与欲与寡核苷酸偶联的靶分子连接。在这种情况下， 当狄尔斯阿尔 德反应在呋喃 - 寡核苷酸和亲二烯体 - 靶分子之间发生时， 寡核苷酸和靶分子将以共价键 连接。 0055 亲二烯体和靶分子可直接连接或通过接头连接。 任意合适的接头都可以用于此目 的， 诸如烷基型的接头、 PEG 接头等。本领域技术人员将理解本发明的实施方案不限于任何 具体的用于此目的的接头。. 0056 一旦寡核苷酸与靶分子以共价键连接， 则它们就可以用于意欲的目的 ( 例如， 促 进检测或纯化 )。一旦它们起它们意图的作用， 则缀合物可通过逆狄尔斯阿尔德反应逆转， 自靶分子释放寡核苷酸。 0057 逆狄尔斯阿尔德反应的。
39、实例在图 4 中显示。如所示的， 狄尔斯阿尔德加成物的溶 液 ( 例如， 在如图 3 中所示的合成之后超滤 (UF) 纯化的滞留物 )， 其可稀释至适当的体积 ( 例如， 500L)。将溶液加热至 75以进行逆狄尔斯阿尔德反应。随着时间的推移对反应 取样并通过 LCMS 分析。在 75保持 3 小时之后， 完成逆狄尔斯阿尔德反应， 并以高于 90 的产率制得呋喃 - 寡核苷酸 1。 0058 如果寡核苷酸衍生物的回收率是期望的， 那么可用任何合适的方法， 诸如采用上 说 明 书 CN 104321431 A 8 7/14 页 9 文描述的 3K UF 旋转筒的超滤， 对反应混合物进行精制。得自。
40、过滤的滞留物可冻干得到寡 核苷酸衍生物。将冻干的固体收纳在水中并通过 LCMS 分析。该分析的 LCMS 数据显示呋 喃 -SQ- 寡核苷酸被回收。 0059 为了显示呋喃衍生物和亲二烯体衍生物 (NEM) 之间反应的确实可逆的特性， 将 1 的水溶液(从以上的逆狄尔斯阿尔德反应回收的)再次用过量的在DMSO中的NEM处理。 将 该混合物于 40加热。三小时之后， 将混合物进行 LCMS 分析。如所希望的， 逆狄尔斯阿尔 德产物 1 顺利地变回为狄尔斯阿尔德产物 2( 反应方案 3)。 0060 这些实例显示呋喃-SQ-寡核苷酸1不仅以良好的产率(在接头性能方面有要求) 进行狄尔斯阿尔德环化加。
41、成反应， 而且狄尔斯阿尔德产物 2 还能通过仅仅加热至 75一段 短时间变回为 1( 需要良好的可裂解接头 )。一旦起始物呋喃已经从狄尔斯阿尔德加成物 2( 基本上是被保护的呋喃和马来酰亚胺 ) 中释放， 它就可以在缀合反应中再使用。这些实 例清楚地显示这些呋喃 - 寡核苷酸衍生物可用于可逆地连接或标记靶分子。 0061 能有效地缀合寡核苷酸和使寡核苷酸脱缀合使得本发明的实施方案能够用于许 多应用中。例如， 这些方法可用于纯化寡核苷酸衍生物。图 5 显示这种应用的实例。 0062 本发明的实施方案可用于将寡核苷酸与靶标共价键连接。如图 5 中所示， 靶向实 体可以是用于固定寡核苷酸的载体。在一。
42、种方法中 NEM 衍生物可与载体 ( 例如， 可溶性聚 合物、 固体聚合物、 磁珠、 固体表面、 或树脂 ) 直接连接。狄尔斯阿尔德反应之后， 寡核苷酸 将与固体载体结合而未结合的杂质可洗掉。然后， 期望的寡核苷酸衍生物可通过加热固体 载体 ( 例如， 在 75下 ) 进行逆狄尔斯阿尔德反应来回收。 0063 在替代的方法中， NEM 衍生物可与偶联载体的配体 ( 例如， 作为偶联载体的配体的 生物素， 其中载体含链霉亲和素或抗生物素蛋白 ) 键合。狄尔斯阿尔德反应之后， 加成物 ( 或缀合物 ) 可用链霉亲和素衍生化的载体 ( 例如， 可溶性聚合物、 固体聚合物、 磁珠、 固体 表面、 或树。
43、脂 ) 处理。这将将寡核苷酸衍生物固定在载体上。洗掉未结合的杂质之后， 期望 的寡核苷酸可通过逆狄尔斯阿尔德反应 ( 例如， 通过在 75加热 ) 释放。 0064 图 6 显示通过逆狄尔斯阿尔德反应释放的呋喃标记的寡核苷酸可用于与相同或 不同的亲二烯体或亲二烯体混合物的另一狄尔斯阿尔德反应中。 0065 图 7 显示示例本发明方法的流程图。如所示的， 方法 60 包括获得用二烯部分标记 的寡核苷酸(步骤61)。 然后， 使该寡核苷酸衍生物与用亲二烯体部分标记的靶向实体反应 以进行狄尔斯阿尔德反应 ( 步骤 62)。之后 ( 例如， 在加成物已起意欲目的的作用之后 )， 将加成物在一定的温度下。
44、加热以进行逆狄尔斯阿尔德反应重新生成用二烯部分标记的寡 核苷酸 ( 步骤 63)。回收的二烯 - 寡核苷酸可通过用相同的亲二烯体或另一种亲二烯体处 理变回为狄尔斯阿尔德加成物。尽管以上实例显示的是用二烯部分标记的寡核苷酸， 但也 可以使用用亲二烯体标记的寡核苷酸与用二烯部分标记的靶向实体偶联。 0066 呋喃 - 寡核苷酸合成 0067 方案 A 0068 说 明 书 CN 104321431 A 9 8/14 页 10 0069 将 1.5 克的呋喃羧酸溶解于 40 mL 的 ACN 中。向其中加入 2.3 mL 的三乙胺， 之后 加入 3.0 克的二琥珀酰亚胺基碳酸酯 (DSC)。将该混合。
45、物于室温搅拌 3.5 小时。通过 TLC 分析反应混合物显示新的斑点(KMnO4染色)和几乎没有至没有剩余的呋喃羧酸。 通过旋转 蒸发去除ACN并将剩余的油收纳在二氯甲烷中并用0.5M碳酸氢钠洗涤两次和用0.5M NaCl 洗涤一次。二氯甲烷溶液经硫酸镁干燥、 过滤并进行蒸发。将所得到的固体通过硅胶色谱 纯化 (60/40 己烷 / 乙酸乙酯 )。该含有产物的级分合并并旋转蒸发至大约 20mL。向该溶 液中滴加己烷直至白色固体开始结晶。将该混合物置于 4过夜。将结晶物过滤在真空下 干燥之后得到 1.5 克 (72产率 )。1HNMR 分析显示产物为期望的呋喃 NHS 酯。 0070 将在 25。
46、 mM 硼酸钠、 pH 9.2 中的用 5 胺按照上面的描述制备的寡核苷酸 (RNA 20 聚体或 DNA 27 聚体 )， 大约 10M， 用过量的在 ACN 中的呋喃 NHS 酯处理， 方案 A。这导 致起始物 5 氨基标记的寡核苷酸物质完全转化为呋喃 - 寡核苷酸， 如 LCMS 分析所示。将 所得到的呋喃 - 寡核苷酸进行超滤 (NaCl 交换和逆水渗滤 ) 然后冻干。 0071 方案 B 0072 0073 将 2.6 克的呋喃 NHS 酯溶解于 40 mL 的 ACN 中。向其中加入 1.6 mL 的三乙胺， 之 后加入 1.5 克的氨基己醇。将该混合物于室温搅拌 2 小时。通过 。
47、TLC 分析反应混合物显示 新的斑点 (KMnO4 染色 ) 和没有剩余的呋喃羧酸 NHS 酯。通过旋转蒸发去除 ACN 并将剩余 的油收纳在乙酸乙酯中并用 0.5M 碳酸氢钠洗涤两次和用 0.5M NaCl 洗涤一次。该乙酸乙 酯溶液经硫酸镁干燥、 过滤并进行蒸发得到 2.6 克 (96产率 ) 的灰白色固体。1HNMR 分析 显示产物为期望的产物。 0074 如方案 B 中所示合成呋喃亚磷酰胺。向在 100 mL 圆底烧瓶内的 2.3 克的该呋喃 醇中加入70 mL的ACN， 将该混合物轻轻搅拌并温热直至该呋喃醇溶解。 向此搅拌的溶液中 缓慢加入 32/ 克的二异丙基乙基胺， 之后加入 3。
48、.2 克的 N,N - 二异丙基磷酰胺氯化物。将 该混合物在室温搅拌 4 小时。通过旋转蒸发去除 ACN 并将剩余的油收纳在二氯甲烷中并用 0.5M 碳酸氢钠洗涤两次和用 0.5M NaCl 洗涤一次。二氯甲烷溶液经硫酸镁干燥、 过滤并进 行蒸发。将所得到的油采用乙酸乙酯经硅胶色谱纯化。将含有产物的级分合并并旋转蒸发 得到 3.6 克 (85产率 ) 的棕色油， TLC 分析显示单个斑点。 31PNMR 显示只有一个在 147ppm 的峰， 与呋喃亚磷酰胺一致。1HNMR 分析也证实该油为期望的呋喃亚磷酰胺。 0075 该呋喃亚酰胺 (amidite)， 在 RNA 20 聚体、 DNA 27。
49、 聚体、 DNA 57 聚体和 RNA 93 聚 体的固相寡核苷酸合成中， 作为 5 端的最后的亚酰胺 (amidite) 使用。将呋喃标记的寡核 苷酸 (20， 27 和 57 聚体 ) 裂解并使用浓缩的氨和 / 或含水的甲胺使 DNA 脱保护、 和先在浓 说 明 书 CN 104321431 A 10 9/14 页 11 缩的氨中之后在 TEA 3HF 中使 RNA 20 聚体脱保护。将使用 TC 保护的 RNA 亚磷酰胺制备的 93 聚体 RNA， 在乙二胺中脱保护。LCMS 分析粗混合物显示该呋喃亚酰胺 (amidite) 以优良 的产率 (95 ) 偶联且对脱保护条件是稳定的。 0076 马来酰亚胺与呋喃 - 寡核苷酸的狄尔斯阿尔德缀合 0077 方案 C 0078 0079 与 N- 乙基马来酰亚胺的狄尔斯阿尔德反应 0080。