鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法 【技术领域】
本发明涉及海洋生物疾病免疫防治技术，具体是鱼用浸泡疫苗免疫多组合佐剂及其应用和使用方法。
背景技术
我国养殖鱼类产量据世界首位，但鱼类的疾病防治技术研发速度较慢，开发的渔用疾病防治产品不能满足生产的需求，特别在渔用疫苗开发与应用方面，目前可供渔业生产上选择使用的产品不多。因此养殖中鱼类细菌性疾病治疗过多依靠投喂抗生素，其结果是长期的应用抗生素不仅会降低水产品的质量，还会导致细菌的耐药性增强，给以后的疾病控制增加难度。国外在鱼类疾病控制方面已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡用疫苗及口服疫苗等。国内的鱼用疫苗产品制剂种类不多，在鱼类疫苗研究方面多侧重于注射用疫苗。鱼类注射用疫苗对疾病预防效果明显，但注射免疫工作量大、工作效率低，且会对鱼体造成伤害。而鱼类浸泡用疫苗不存在上述缺点，但单纯的使用疫苗浸泡效果不佳。
目前，有关鱼类浸泡免疫用疫苗产品因受浸泡免疫效果较差的限制，开发的产品不多。国内已开发的鱼类浸泡疫苗佐剂有莨菪碱、葡聚糖、IMS1312，试验证实，使用后免疫保护率均不理想。而国外的鱼类浸泡免疫佐剂多为保密配方。基于以上现状，我国的鱼类浸泡疫苗研发速度处于缓慢发展状态，限制阻碍了产业的发展。因此提供鱼类浸泡疫苗佐剂，提高鱼类浸泡疫苗效果，对推动水产养殖用疫苗制剂产业的快速发展是非常必要的。
【发明内容】
本发明的目的是为鱼类浸泡用疫苗提供一种高效的多组合免疫佐剂。
鱼类选用浸泡疫苗免疫，不仅操作方便节省时间，而且相对于注射免疫对鱼的损伤小，因此鱼类选用浸泡疫苗免疫是一种最佳的免疫方案。但选用浸泡疫苗免疫时，在通常不加浸泡疫苗佐剂或特异免疫增强剂的情况下，鱼体仅仅通过鳃部接触疫苗抗原，身体表面其他的可以激发免疫反应的部位多被体表的粘液所覆盖，导致可呈递疫苗抗原的细胞不能有效接触到疫苗抗原，因此使用能够去除鱼体粘液的佐剂成分，可以提高鱼类浸泡疫苗免疫的效果。研究经过试验研究发现，N-乙酰半胱氨酸(简称NAC)、曲拉通X-100(即TRITONX-100)具有溶解鱼体表粘液的能力，皂角苷具有提高鱼类粘液免疫力与细胞免疫的功效，而消旋山莨菪碱(又称654-2)可使鱼体肌肉松弛，易于疫苗抗原向体内的渗入。四种佐剂通过组合既解决了鱼体粘液阻止疫苗抗原接触鱼体抗原呈递细胞的问题，又通过皂角苷提高了鱼体粘液免疫与细胞免疫力，同时654-2使鱼体肌肉松弛，加强了抗原渗透鱼体的效果。该四种佐剂组合有效提高了鱼类浸泡疫苗免疫效果，使用证实具备佐剂的功能，且安全试验证实在使用浓度范围内对鱼类及环境安全。因此确定NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2佐剂组合为高效鱼用浸泡疫苗免疫多组合佐剂。
因此，本发明鱼用浸泡疫苗多组合佐剂包括NAC、TRITON X-100、皂角苷和654-2，其中NAC、TRITON X-100、皂角苷和654-2的使用浓度范围分别为0.1-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L、1-60mg/L。
本发明的浓度分别在0.1-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L、1-60mg/L的NAC、TRITONX-100、皂角苷和654-2免疫多组合佐剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效免疫效果。
本发明的使用方法如下：
(1)首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上；
(2)将待免疫的鱼移入浓度范围均为0.1-10mg/l的NAC、TRITON X-100混合养殖用水溶液中，预浸泡1-20min，之后加入浓度0.1-50mg/L的皂角苷及待用疫苗，浸泡1-20min，再向疫苗浸泡液中加入浓度1-60mg/L的654-2待1-10min即完成免疫。
本发明的积极效果在于：用NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2多组合制剂作为疫苗组合佐剂后可以显著提高疫苗的免疫效果，效果显著好于单一佐剂；使用方法简便，成本较低，使用安全，对鱼的存活率与生长速度没有影响，而且不需要额外的设施与工序，对环境及操作人员同样无害。
【具体实施方式】
本发明鱼用浸泡疫苗多组合佐剂其特征在于：作为鱼类浸泡疫苗的多组合佐剂包括，NAC、TRITONX-100、皂角苷和654-2，其中NAC、TRITONX-100、皂角苷和654-2的使用浓度范围分别为0.1-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L、1-60mg/L。
上述的N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷、消旋山莨菪碱的纯度优于或相当于化学纯级。
本发明的浓度分别在0.1-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L、1-60mg/L的NAC、TRITONX-100、皂角苷和654-2免疫多组合佐剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效免疫效果。
本发明的使用方法如下：
(1)首先选用体表完好健康地待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上；
(2)将待免疫的鱼移入浓度范围均为0.1-10mg/l的NAC、TRITONX-100混合养殖用水溶液中，预浸泡1-20min，之后加入浓度0.1-50mg/L的皂角苷及待用疫苗，浸泡免疫1-20min，再向疫苗浸泡液中加入浓度1-60mg/L的654-2维持1-10min即完成免疫。为了保证免疫效果，浸泡时水中溶解氧保持7mg/L以上，温度变化控制在±2℃内。完成浸泡免疫后，小心将鱼移入养殖池进行养殖即可。
本发明中NAC、TRITON-100的使用浓度范围均为0.1-10mg/L，浸泡时间均为3-50min；皂角苷的浓度范围为0.1-50mg/L，浸泡时间2-30min；645-2的浓度范围为1-60mg/L，浸泡时间1-10min。并且适用于海水鱼类、淡水鱼类及半咸水鱼类。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：应用本发明的浓度分别为0.1mg/L、0.1mg/L、50mg/L、1mg/L的NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2多组合佐剂和灭活鳗弧菌(Vibrio.Anguillarum)疫苗对牙鲆浸泡免疫
1材料：
(1)试验用鱼及养殖管理：选用体重5g的健康牙鲆，试验前暂养1周，试验用海水稳定20-23℃，PH8.1-8.2，盐度30，试验期间投喂配合饵料，日投喂2次，24小时连续充气，流水养殖。
(2)疫苗制备：将V.anguillarum接种至2216E液体培养基，28℃培养24h；4℃下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的PBS，pH 7.2中，制成1.0×108cells/mL的弧菌悬液，0.5％甲醛28℃下灭活48h后为试验用疫苗，4℃储存；同时将灭活后的菌体接种于TSB固体平板，置28℃下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。
(3)浸泡免疫佐剂：NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2，使用浓度分别为0.1mg/L、0.1mg/L、50mg/L、1mg/L。
2试验方法
(1)试验分组：试验设注射免疫组、无佐剂疫苗浸泡免疫组、佐剂+疫苗浸泡免疫组、注射空白对照组，浸泡空白对照组，每组设三个平行，每组3×30尾鱼。
(2)免疫方法：试验鱼暂养1周后，注射免疫组每尾鱼腹腔注射浓度为1.0×108cells/mL的V.anguillarum疫苗0.1ml；无佐剂疫苗浸泡免疫组用海水配制疫苗浓度1.0×107cells/mL，浸泡11min；佐剂+疫苗浸泡免疫组为用NAC、TRITON X-100的混合溶液浸泡待免鱼20min，之后加入疫苗及皂角苷维持1min，再加入654-2维持10min；注射空白对照组与浸泡空白对照分别用PBS溶液腹腔注射和海水浸泡，方法相同。
(3)免疫后攻毒：免疫30天后各组用 鳗弧菌V.anguillarum攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为5.0× 106cells/尾。
3试验结果
攻毒15天后，统计个组的存活率，根据公式RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。计算免疫相当保护率。结果见表1
表1应用NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2为组合佐剂浸泡免疫牙鲆的免疫相对保护率
结果表明，单纯用鳗弧菌灭活疫苗浸泡免疫牙鲆，免疫相对保护率低仅为27％，使用佐剂NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2组合佐剂后与疫苗联合浸泡免疫相对保护率提高到83％，免疫保护效果明显，证明应用本发明可以显著提高浸泡疫苗对海水鱼的免疫相对保护率。
实施例2：应用本发明的浓度分别为5mg/L、5mg/L、1mg/L、30mg/L的NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2多组合佐剂和灭活点状气单胞菌疫苗对罗非鱼浸泡免疫
1材料：
(1)试验用鱼及养殖管理：选用体重3g健康罗非鱼，试验前暂养10天，试验用淡水温度27-28℃，pH7.1-7.2，试验期间投喂配合饵料，日投喂2次，日换水30％，24小时连续充气。
(2)疫苗制备：将点状气单胞菌接种到LB液体培养基，28℃培养24h；4℃下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的生理盐水中，pH 7.2中，制成1.0×109cells/mL的菌悬液，0.5％甲醛28℃下灭活48h后为试验用疫苗，4℃储存；同时将灭活后的菌体接种于LB固体平板，置28℃下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。
(3)浸泡免疫佐剂：NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2组合佐剂，使用浓度分别为5mg/L、5mg/L、1mg/L、30mg/L。
(4)疫苗使用浓度：试验组中疫苗的有效浓度为1.0×108cells/mL。
2试验方法
(1)试验分组：无佐剂疫苗浸泡免疫组、使用NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2组合制剂+疫苗浸泡免疫组、浸泡空白对照组，每组设三个平行，每组3×40尾鱼。
(2)免疫方法：试验鱼暂养10天后，无佐剂浸泡免疫组用海水配制疫苗达到浓度1.0×108cells/mL后将待免疫的鱼移入其中，浸泡15min；使用佐剂+浸泡免疫组用NAC、TRITON X-100溶液浸泡待免鱼10min，之后加入疫苗及皂角苷维持10min，再加入654-2维持5min；浸泡空白对照只用海水浸泡，方法相同。
(3)免疫后攻毒：免疫30天后各组用点状气单胞菌攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为5.0×107cells/尾。
3试验结果
攻毒15天后，统计各组的存活率，根据公式RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。计算免疫相当保护率。结果见表2
表2.各免疫组免疫相对保护率统计
实验结果表明，单纯用状气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫罗非鱼，免疫相对保护率低仅为51.4％，使用NAC、TRITON X-100、皂角苷、654-2组合佐剂浸泡免疫组，浸泡免疫相对保护率提高到84.1％，效果提高了30％以上。再次证明应用本发明可显著提高浸泡疫苗对淡水鱼的免疫保护。