鱼类浸泡疫苗特异免疫增强剂及其应用和使用方法 【技术领域】
本发明涉及海洋生物疾病免疫防治技术，具体是一种鱼类浸泡疫苗特异免疫增强剂及其应用和使用方法。
背景技术
我国养殖鱼类产量据世界首位，但鱼类的疾病防治技术研发速度较慢，开发的渔用疾病防治产品不能满足生产的需求，特别在渔用疫苗开发与应用方面，目前可供渔业生产上选择使用的产品不多。因此养殖中鱼类细菌性疾病治疗过多依靠投喂抗生素，其结果是长期的应用抗生素不仅会降低水产品的质量，还会导致细菌的耐药性增强，给以后的疾病控制增加难度。国外在鱼类疾病控制方面已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡用疫苗及口服疫苗等。国内的鱼用疫苗产品制剂种类不多，在鱼类疫苗研究方面多侧重于注射用疫苗。鱼类注射用疫苗对疾病预防效果明显，但注射免疫工作量大、工作效率低，且会对鱼体造成伤害。而鱼类浸泡用疫苗不存在上述缺点，但单纯的使用疫苗浸泡效果不佳。
目前，有关鱼类浸泡免疫用疫苗产品因受浸泡免疫效果较差的限制，开发的产品不多。国内已开发的鱼类浸泡疫苗佐剂有莨菪碱、葡聚糖、IMS1312，试验证实，使用后免疫保护率均不理想。而国外的鱼类浸泡免疫佐剂多为保密配方。基于以上现状，我国的鱼类浸泡疫苗研发速度处于缓慢发展状态，限制阻碍了产业的发展。因此提供鱼类浸泡疫苗佐剂，提高鱼类浸泡疫苗效果，对推动水产养殖用疫苗制剂产业的快速发展是非常必要的。
【发明内容】
本发明的目的是为鱼类浸泡用疫苗提供一种高效的特异免疫增强剂，即皂角苷鱼类浸泡用疫苗特异免疫增强剂及其使用方法。
鱼类选用浸泡疫苗免疫，不仅操作方便节省时间，而且相对于注射免疫对鱼的损伤小，因此鱼类选用浸泡疫苗免疫是一种最佳的免疫方案。但选用浸泡疫苗免疫时，在通常不加浸泡疫苗佐剂或特异免疫增强剂的情况下，鱼体仅仅通过鳃部接触疫苗抗原，身体表面其他的可以激发免疫反应的部位多被体表的粘液所覆盖，导致可呈递疫苗抗原的细胞不能有效接触到疫苗抗原，鱼类浸泡免疫效果不佳。因此，使用能够激活鱼体粘液免疫及增强细胞免疫的物质，可以作为鱼类浸泡疫苗的特异免疫增强剂，提高浸泡免疫效果。研究发现皂角苷(又称碱皂体，皂素，皂甙)，具有增强鱼体表粘液及细胞免疫的效果，反复试验证实，在浸泡疫苗中添加皂角苷能够有效提高鱼类浸泡疫苗的免疫相对保护率，具备特异免疫增强剂的功能，且安全试验证实在使用浓度范围内对鱼类及环境安全。因此确定皂角苷作为鱼类浸泡疫苗特异免疫增强剂。
本发明的鱼类浸泡疫苗特异免疫增强剂，其特征在于上述的特异免疫增强剂是皂角苷，且皂角苷溶解在海水及淡水中的使用浓度范围为0.5-20mg/L。
本发明的浓度在0.5-20mg/L范围内的皂角苷特异免疫增强剂，应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效的免疫效果。
本发明的使用方法：首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上；再用养殖用水将皂角苷配制成使用浓度在0.5-20mg/L的溶液，再将待用的疫苗加入其中配成浸泡免疫使用液，之后将待免疫的鱼移入其中浸泡2-30min即完成免疫。
本发明的积极效果在于：用皂角苷作为疫苗特异免疫增强剂后可以显著提高疫苗的免疫效果；使用方法简便，成本较低，使用安全，对鱼的存活率与生长速度没有影响，而且不需要额外的设施与工序，对环境及操作人员同样无害。
【具体实施方式】
本发明的鱼类浸泡疫苗特异免疫增强剂，其特征在于上述的特异免疫增强剂是皂角苷，且皂角苷溶解在海水及淡水中的使用浓度范围为0.5-20mg/L。
本发明的皂角苷使用浓度范围为0.5-20mg/L，受免鱼类在皂角苷溶液中的浸泡时间为2-30min；可以分别与海水和淡水鱼类浸泡疫苗协同使用。
本发明的使用方法如下：
(1)首先选用体表完好健康的待免疫鱼类，体重应在每尾2g以上为好；
(2)用养殖用水将皂角苷配制成使用浓度在0.5-20mg/L的溶液，并加入疫苗配成浸泡免疫使用液，之后将待免疫的鱼移入其中浸泡免疫2-30min即完成浸泡免疫。为了保证免疫效果，浸泡时水中溶解氧保持7mg/L以上，温度变化控制在±2℃内。完成浸泡免疫后，小心将鱼移入养殖池进行养殖即可。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：应用本发明的浓度为0.2mg/L的特异免疫增强剂和灭活鳗弧菌(Vibrio.Anguillarum)疫苗对牙鲆浸泡免疫。
1材料：
(1)试验用鱼及养殖管理：选用体重5g健康牙鲆，试验前暂养1周，试验用海水稳定20-23℃，pH8.1-8.2，盐度30，试验期间投喂配合饵料，日投喂2次，24小时连续充气，流水养殖。
(2)疫苗制备：将L.anguillarum接种至2216E液体培养基，28℃培养24h；4℃下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的PBS，pH 7.2中，制成1.0×108cells/mL的弧菌悬液，0.5％甲醛28℃下灭活48h后为试验用疫苗，4℃储存；同时将灭活后的菌体接种于TSB固体平板，置28℃下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。
(3)浸泡免疫特异免疫增强剂：皂角苷，使用浓度0.2mg/L。
2试验方法
(1)试验分组：试验设注射免疫组、浸泡免疫组、使用特异免疫增强剂浸泡免疫组、注射空白对照组，浸泡空白对照组，每组设三个平行，每组3×30尾鱼。
(2)免疫方法：试验鱼暂养1周后，注射免疫组每尾鱼腹腔注射浓度为1.0×108cells/mL地弧菌疫苗0.1ml；浸泡免疫组用海水配制疫苗达到浓度1.0×107cells/mL后浸泡30min；使用皂角苷+浸泡免疫组用浓度0.2mg/l的皂角苷及1.0×107cells/mL的疫苗混合液，浸泡维持30min；注射空白对照组与浸泡空白对照分别用PBS溶液腹腔注射和海水浸泡，方法相同。
(3)免疫后攻毒：免疫30天后各组用鳗弧菌V.anguillarum攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为5.0×106cells/尾。
3试验结果
攻毒15天后，统计个组的存活率，根据公式RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。计算免疫相当保护率。结果见表1
表1应用皂角苷为特异免疫增强剂浸泡免疫牙鲆的免疫相对保护率
试验结果表明单纯用鳗弧菌灭活疫苗浸泡免疫牙鲆，免疫相对保护率低仅为27％，使用特异免疫增强剂皂角苷后，浸泡免疫相对保护率提高到72％，仅次于注射免疫效果，远远优于不加皂角苷的对照组。证明应用本发明对提高海水鱼疫苗免疫效果明显。
实施例2：应用本发明的浓度为20mg/L的特异免疫增强剂和灭活点状气单胞菌疫苗对罗非鱼浸泡免疫
1材料：
(1)试验用鱼及养殖管理：选用体重3g的健康罗非鱼，试验前暂养10天，试验用淡水温度27-28℃，pH7.1-7.2，试验期间投喂配合饵料，日投喂2次，日换水30％，24小时连续充气。
(2)疫苗制备：将点状气单胞菌接种到LB液体培养基，28℃培养24h；4℃下4000rpm离心20min，收集菌体；将收集的菌体置于灭菌的生理盐水中，pH 7.2中，制成1.0×109cells/mL的菌悬液，0.5％甲醛28℃下灭活48h后为试验用疫苗，4℃储存；同时将灭活后的菌体接种于LB固体平板，置28℃下恒温培养24h、48h，确定无菌落长出。
(3)浸泡免疫佐剂：皂角苷，使用浓度20mg/L。
2试验方法
(1)试验分组：浸泡免疫组、含皂角苷浸泡免疫组、浸泡空白对照组，每组设三个平行，每组3×40尾鱼。
(2)免疫方法：试验鱼暂养10天后，随机取鱼分组，浸泡免疫组用养殖用水配制疫苗(浓度1.0×108cells/mL)，放入罗非鱼后浸泡2min；使用含皂角苷的浸泡免疫组用浓度20mg/l的皂角苷与浓度1.0×108cells/mL的疫苗混合液浸泡罗非鱼2min；浸泡空白对照只用淡水浸泡，方法相同，浸泡时各组均充气。
(3)免疫后攻毒：免疫30天后各组用点状气单胞菌攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为5.0×107cells/尾。
3试验结果
攻毒15天后，统计各组的存活率，根据公式RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。计算免疫相对保护率。结果见表2
表2应用皂角苷为特异免疫增强剂浸泡免疫罗非鱼的免疫相对保护率
实验结果表明单纯用状气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫罗非鱼，免疫相对保护率低仅为51.4％，使用本发明的特异免疫增强剂后，疫苗的浸泡免疫相对保护率提高到80.7％，证明应用本发明对提高淡水鱼疫苗免疫效果明显。