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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410750833.X (22)申请日 2014.12.10 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 河南省动物疫病预防控制中心 地址 450008 河南省郑州市经三路 91 号 (72)发明人 吴志明 闫若潜 谢彩华 赵雪丽 陈涛 赵明军 郑岩 严平 王淑娟 刘琨 曹伟伟 张代宝 王翠 韩庆斌 朱凤霞 王永强 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时。
2、荧光定量 PCR 检测引物及探针 (57) 摘要 本发明提供口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时 荧光定量PCR检测引物及探针， 所述引物包括P0、 P1、 P2、 P3 和 P4， 所述探针包括 P5 和 P6。本发明 基于所述引物和探针建立的二重实时荧光定量 PCR 检测可实现一个反应同时对口蹄疫病毒 O、 A、 Asia 3 个亚型的通用型和口蹄疫病毒 A 型进行 快速鉴别检测， 可在 1-2h 内完成检测， 具有快速、 特异、 敏感、 高通量等优点， 能满足大批量、 快速鉴 别检测口蹄疫病毒、 A 型口蹄疫病毒的要求。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104404170 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104404170 A 1/1 页 2 1. 口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时荧光定量 PCR 检测引物及探针， 其特征在于， 所述引 物包括 ： P0 ： 5 -CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3 P1 ： 5 -CGGCCTCTCATCCAACAGA-3 P2 ： 5 -ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3 P3 ： 5 -AACCCCACCGCCTACCA-3 P4 ： 5 -GGTGTAAGGGAGCGCAA。
4、GTC-3 所述探针包括 ： Probe-P5 ： 5-F1-TCATTTGTGAAACGCG-Q1-3 Probe-P6 ： 5-F2-AAGCAGCCGTTTACG-Q2-3 其中， F1、 F2 为荧光基团， Q1、 Q2 为非荧光淬灭基团。 2. 根据权利要求 1 所述的引物及探针， 其特征在于， F1 为 FAM， F2 为 VIC， Q1 和 Q2 为 MGB。 3. 含有权利要求 1 或 2 所述引物及探针的用于实时荧光定量 PCR 检测口蹄疫病毒和 A 型口蹄疫病毒的试剂盒。 4. 权利要求 1 或 2 所述引物及探针， 或权利要求 3 所述试剂盒在实时荧光定量 PCR 检 测。
5、口蹄疫病毒和 A 型口蹄疫病毒中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 提取待测病毒样品的总 RNA， 进行反转录获得 cDNA ； 其中， 反转录体系为 ： 5M-MLV 缓冲液 4L， 2.5mmol/L dNTP 4L， 引物 P01L， M-MLV 反转录酶 0.5L， RNase 抑制剂 0.5L， RNA 10L ； 反转录条件为 ： 37， 1h ； 2)将cDNA克隆入pGEM-T Easy载体中， 筛选阳性重组质粒， 以质粒为模板， 进行PCR扩 增反应 ； 3) 分析 PCR 产物。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征。
6、在于， 进行 PCR 扩增反应使用的反应体系 以 25l 计为 ： P1、 P2、 P3、 P4 终浓度各为 0.4mol/L， Probe-P5 终浓度为 0.6mol/L， Probe-P6终浓度为0.7mol/L， 2.5mmol/L dNTPs 2L， 10Ex Taq酶缓冲液2.5L， 5U/ L Ex Taq DNA 酶 0.25L， 1.0105拷贝 /L 的质粒模板 2L， 补足去离子水至终体积 25L。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， PCR扩增反应条件为 ： 945分钟 ； 9415 秒， 60 30 秒， 共 40 个循环。 权 利 要 求 书 CN 104。
7、404170 A 2 1/8 页 3 口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时荧光定量 PCR 检测引物及探 针 技术领域 0001 本发明属于动物疫病检疫检测技术领域， 具体地说， 涉及口蹄疫病毒通用型、 A 型 二重实时荧光定量 PCR 检测引物及探针。 背景技术 0002 口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(Footand Mouth Disease Virus， FMDV)引起的猪、 牛、 羊等主要家畜和其它家养、 野生偶蹄动物共患的一种急性、 恶性、 高度接触性传染病， 易 感动物达 70 多种。该病传播途径多、 速度快， 曾多次在世界范围内暴发流行， 造成巨大政 治、 经济损失。世界动物卫生组。
8、织 (OIE) 将其列为 A 类传染病之首。目前， 有三分之二的 OIE 成员国流行 FMD， 时刻威胁着无 FMD 国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫包括 7个血清型， 中国流行的和受邻国威胁的主要有O、 A、 Asia3个血清型， 而各血清型之间的 交叉保护力很差。因此， 利用简单、 快速、 准确的检查方法尽早对口蹄疫作出型的鉴别诊断 对控制口蹄疫疫情至关重要。实时荧光定量 PCR(fluorescent quantitative PCR， 简称为 FQ-PCR) 是一种新型诊断工具， 具有敏感、 快速、 准确的特点， 并且在核酸快速扩增的同时实 现模板的定量测定。目前发展起来的多联。
9、实时荧光 PCR 技术可以在同一个 PCR 反应中， 通 过 Tm 值分析来区分不同的核酸片段， 这为同时检测多种病原提供了技术基础。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种可快速、 准确地检测O、 A、 Asia3个血清型口蹄疫病毒 通用型和鉴别 A 型口蹄疫病毒的口蹄疫病毒通用型、 A 型二重实时荧光定量 PCR 检测引物 及探针。 0004 本发明的另一目的是提供上述引物及探针在检测口蹄疫病毒和鉴别 A 型口蹄疫 病毒中的应用。 0005 为了实现本发明目的， 本发明提供的口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时荧光定量 PCR( 二重 FQ-PCR) 检测引物及探针， 所述引物包括 ： 0。
10、006 P0 ： 5 -CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3 (SEQ ID NO:3 所示序列 ) ； 0007 P1 ： 5 -CGGCCTCTCATCCAACAGA-3 (SEQ ID NO:4 所示序列 ) ； 0008 P2 ： 5 -ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3 (SEQ ID NO:5 所示序列 ) ； 0009 P3 ： 5 -AACCCCACCGCCTACCA-3 (SEQ ID NO:6 所示序列 ) ； 0010 P4 ： 5 -GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3 (SEQ ID NO:7 所示序列 ) ； 0011 所述探针包括 ： 0。
11、012 Probe-P5 ： 5-F1-TCATTTGTGAAACGCG-Q1-3(SEQ ID NO:8 所示的序列 5 端连接 F1， 3 端连接 Q1) ； 0013 Probe-P6 ： 5-F2-AAGCAGCCGTTTACG-Q2-3(SEQ ID NO:9 所示的序列 5 端连接 F2， 3 端连接 Q2) ； 说 明 书 CN 104404170 A 3 2/8 页 4 0014 其中， F1、 F2 为荧光基团， Q1、 Q2 为非荧光淬灭基团， F1 为 FAM， F2 为 VIC， Q1 和 Q2 为 MGB。 0015 其中， P0 为反转录引物， 用于对待测病毒样品的。
12、总 RNA 进行反转录获得 cDNA ； P1、 P2、 P3、 P4 和 Probe-P5 和 Probe-P6 为实时荧光定量 PCR 引物及探针。 0016 本发明还提供含有上述引物及探针的用于实时荧光定量 PCR 检测口蹄疫病毒通 用型和 A 型口蹄疫病毒的试剂盒。 0017 其中， 在本发明所提供的试剂盒中还可以含有阳性对照品和阴性对照品， 阳性对 照品可以为 O 型、 A 型和 Asia 型口蹄疫病毒标准株， 阴性对照可以为水或其它病毒标准 株。 0018 本发明进一步提供上述引物及探针、 或试剂盒在实时荧光定量 PCR 检测口蹄疫病 毒和 A 型口蹄疫病毒中的应用。所述应用包括以。
13、下步骤 ： 0019 1) 提取待测病毒样品的总 RNA， 进行反转录获得 cDNA ； 其中， 反转录体系为 ： 5M-MLV 缓冲液 4L， 2.5mmol/L dNTP 4L， 引物 P01L， M-MLV 反转录酶 0.5L， RNase 抑制剂 0.5L， RNA 10L ； 反转录条件为 ： 37， 1h ； 0020 2) 将 cDNA 克隆入 pGEM-T Easy 载体中， 筛选阳性重组质粒， 以质粒为模板， 进行 PCR 扩增反应 ； 0021 3) 分析 PCR 产物。 0022 其中， 进行 PCR 扩增反应使用的反应体系以 25l 计为 ： P1、 P2、 P3、 P。
14、4 终浓度各 为 0.4mol/L， Probe-P5 终浓度为 0.6mol/L， Probe-P6 终浓度为 0.7mol/L， 2.5mmol/ L dNTPs 2L， 10Ex Taq 酶缓冲液 2.5L， 5U/L Ex Taq DNA 酶 0.25L， 1.0105拷 贝 /L 的质粒模板 2L， 补足去离子水至终体积 25L。 0023 PCR 扩增反应条件为 ： 94 5 分钟 ； 94 15 秒， 60 30 秒， 共 40 个循环。 0024 本反应中， 需同时做阳性对照和阴性对照， 分别设置通用型检测体系和 A 型检测 体系为 FAM 和 VIC 荧光通道。 0025 在。
15、本发明中， 检测结果的判定方式可以为 ： 阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性 对照品扩增曲线的最高点为准， 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测 结果应无特定的扩增曲线， 且 Ct 值 30.0 或无， 阳性对照的 Ct 值应 27.0， 且出现特定 的扩增曲线， 判定检测结果成立。 如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件， 此次实验视 为无效。在检测结果成立的前提下， 若样品检测结果 Ct 值 27.0， 而且出现特定的扩增曲 线， 判定为阳性 ； Ct 值 30.0 或无， 并且无特定的扩增曲线， 则判定为阴性 ； 30.0 Ct 值 27.0 且有特定扩增曲线的样品判定为可疑。
16、， 对可疑样品重新试验， 结果为阳性者判定为 阳性， 结果为阴性者判定为阴性 ； 对可疑样品重新试验， 结果再次为可疑者应重新采集该动 物样品重新试验。同一份样品判定 ： 通用型检测体系 FAM 荧光通道和 A 型 VIC 荧光通道均 为阳性者判定为本样品为T/A型双阳性样品， 即该样品为A型口蹄疫感染样品 ； 通用型检测 体系 FAM 荧光通道阳性， A 型检测体系 VIC 荧光通道阴性者判定为本样品为通用型阳性样 品， 即该样品为其他型口蹄疫感染样品， 而非 A 型口蹄疫感染样品。 0026 本发明提供的口蹄疫病毒通用型、 A 型二重实时荧光定量 PCR 检测引物及探针， 以及基于所述引物。
17、和探针建立的二重实时荧光定量 PCR 检测可实现一个反应同时对 O、 A、 Asia 3 个血清型口蹄疫病毒 FMDV-T 和 A 型口蹄疫病毒 FMDV-A 进行快速鉴别检测， 可 说 明 书 CN 104404170 A 4 3/8 页 5 在 1-2h 内完成检测， 具有快速、 特异、 敏感、 高通量等优点， 能满足大批量、 快速鉴别检测 FMDV-T、 FMDV-A 的要求。 附图说明 0027 图 1 ： 通用 FMDV 重组质粒的鉴定 ； 其中， M 为 DL2000Marker， 1 为通用 FMDV 重组质 粒 PCR 扩增产物， 扩增产物为 633bp。 0028 图 2 ：。
18、 A 型 FMDV 重组质粒的鉴定 ； 其中， M 为 100bp Marker， 1 为 A 型 FMDV 重组质 粒 PCR 扩增产物， 扩增产物为 326bp。 0029 图 3 ： 口蹄疫二重实时荧光定量 PCR 诊断方法的建立 ； 其中， 1 为 FAM 探针 FMDV-T 扩增曲线， 2 为 VIC 探针 FMDV-A 扩增曲线， 3、 4 为阴性对照。 具体实施方式 0030 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件， 如 Sambrook 等分子克隆实验手册 (Sambrook J&Russell DW,Molecular 。
19、cloning:a laboratory manual,2001)， 或按照制造厂商说明书建议的条件。 0031 实施例 1 口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时荧光定量 PCR 检测体系的建立 0032 1. 材料与方法 0033 1.1 材料 0034 1.1.1 毒株 0035 O 型、 A 型和 Asia 型口蹄疫病毒标准株， 均购自农业部兰州兽医研究所 ； 其他对 照病毒或质粒由河南省动物疫病预防控制中心保存。 0036 1.1.2 仪器和试剂 0037 荧光 PCR 仪， 美国 ABI 公司产品， 型号 ABI7000 ； PCR 扩增仪， 德国 Biometra 公司 产品 ； 凝胶。
20、成像分析系统， 美国 Alpha Innotech 公司产品 ； 恒温水浴震荡器 (HZQ-Q)， 哈尔 滨东联电子技术开发有限公司产品 ； 台式高速冷冻离心机， 美国 Heraeus 公司产品 ； Ex Taq DNA 聚合酶、 dNTPs、 DNA 回收试剂盒等均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， pGEM-T Easy 载体、 JM109 感受态细胞购自 Promega 公司。 0038 1.2 方法 0039 1.2.1 引物设计和合成 0040 经大量比对 GenBank 中 FMDV 7 个血清型的基因和 FMDV-A 基因序列， 选取 FMDV 的 O、 A、 Asia 3。
21、 个血清型基因高度保守基因序列 (SEQ ID NO:1) 和 FMDV-A 基因高度 保守且具有型特异性基因序列 (SEQ ID NO:2) 为模板设计 FMDV-T/FMDV-A 的特异性引物 对和 TaqMan MGB 探针， 分别命名为 FMDVR(P0)、 FMDV-T(P1)、 FMDV-T(P2)、 FMDV-A(P3)、 FMDV-A(P4)、 FMDV-T-MGB-FAM-Probe(Probe-P5)、 FMDV-A-MGB-VIC-Probe(Probe-P6)， 由宝 生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成， 用于 FMDV-T/FMDV-A 二重 TaqMan MGB 。
22、FQ-PCR 扩增的引 物和探针序列如下 ： 0041 P0 ： 5 -CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3 0042 P1 ： 5 -CGGCCTCTCATCCAACAGA-3 0043 P2 ： 5 -ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3 说 明 书 CN 104404170 A 5 4/8 页 6 0044 P3 ： 5 -AACCCCACCGCCTACCA-3 0045 P4 ： 5 -GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3 0046 Probe-P5 ： 5-FAM-TCATTTGTGAAACGCG-MGB-3 0047 Probe-P6 ： 5-VIC-AAG。
23、CAGCCGTTTACG-MGB-3 0048 1.2.2 总 RNA 的制备 0049 模板 RNA 的制备 ： 以 FMDV-T/FMDVA 阳性质粒为阳性对照， 水为阴性对照， 与 O 型、 A 型和 Asia 型口蹄疫病毒标准株同时采用 Trizol 法提取总 RNA。具体操作如下 ： 分 别取 O 型、 A 型和 Asia 型口蹄疫病毒标准株、 阴性对照及待检样品各 200L 于 1.5ml 离 心管中， 再加入 600L 的 Trizol 于涡旋器震荡 2-3min， 加入 200L 氯仿， 离心后， 取上 清转入另 1.5ml 离心管中， 加 200L 异丙醇沉淀， 75乙醇洗涤。
24、沉淀， 干燥， 最后用 20L DEPC( 焦磷酸二乙酯 ) 水溶解沉淀， 取 10L 用于反转录， 其余 -20保存。 0050 1.2.3 反转录 0051 每管 FMDV 反转录反应体系含如下成份 ： 5M-MLV 缓冲液 4L ； 2.5mmol/L dNTPs( 三磷酸脱氧核苷酸 )4L ； M-MLV 反转录酶 0.5L ； RNase 抑制剂 0.5L ； 引物 P01L ； 总体积10L。 向每管反转录反应体系中加入步骤1.2.2中制得的RNA 10L， 37 水浴 1h 或置于 PCR 仪中 37反应 1h， 反应结束后， 70， 15min 灭活反转录酶， 直接用于后 续 。
25、PCR 扩增或 -20冻存备用。 0052 1.2.4FMDV-T/FMDV-A 标准品的制备 0053 将 FMDV-T/FMDV-A 的阳性扩增产物分别克隆入 pGEM-T Easy 载体中， 筛选阳性重 组质粒送宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司采用 T7 和 SP6 引物进行测序。测序正确的 FMDV-T/ FMDV-A 重组阳性质粒应用分光光度计测定其 OD260和 OD280值及 OD260/OD280值， 共重复 5 次 ； 参考质粒DNA拷贝数计算方法， 计算pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A质粒DNA溶液的浓度 分别为 9.121010拷贝 /L 和 9.。
26、111010拷贝 /L， 定量并稀释至 1.0100 1.01010 拷贝 /L， -20保存备用。对通用 FMDV 重组质粒 (pGEM-T/FMDV-T) 和 A 型 FMDV 重组质 粒 (pGEM-T/FMDV-A) 进行鉴定。( 如图 1 和 2， 通用 FMDV 重组质粒的扩增产物为 633bp， A 型 FMDV 重组质粒的扩增产物为 326bp。) 0054 1.2.5FMDV-T/FMDV-A 二重 FQ-PCR 反应条件的优化 0055 将步骤 1.2.4 中获得的 pGEM-T/FMDV-T 和 pGEM-T/FMDV-A 重组质粒分别稀释至终 浓度 1.0105拷贝 /。
27、L 作为检测模板， P1/P2、 P3/P4 引物对分别稀释为终浓度 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8 和 1.0mol/L， Probe-P5、 Probe-P6 探针分别稀释到终浓 度为 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8 和 1.0mol/L， 应用荧光 PCR 仪 ( 美国 ABI 公司， 型号 ： ABI7000) 采用矩阵法筛选不同浓度的 FMDV-T/FMDV-A 引物和探针组合， 筛选针 对 FMDV-T/FMDV-A 的二重 FQ-PCR 最佳引物浓度、 探针浓度和最。
28、佳反应条件。 0056 优化的 25L PCR 反应体系， FMDV-T/FMDV-A 上、 下游引物 P1/P2、 P3/P4 终浓度 各 0.4mol/L， Probe-P5 终浓度为 0.6mol/L， Probe-P6 终浓度为 0.7mol/L， 2.5mmol/ L dNTPs 2L， 10Ex Taq 酶缓冲液 2.5L， 5U/L Ex Taq DNA 酶 0.25L， 1.0105拷 贝 /L 的质粒模板各 2L， 补足去离子水至终体积 25L。优化的 PCR 反应程序为 ： 94， 5min ； 94 15s， 60 30s， 40 个循环 ( 如图 3， 1 为 FAM 。
29、探针 FMDV-T 扩增曲线， 2 为 VIC 探针 FMDV-A 扩增曲线， 3、 4 为阴性对照 )。 说 明 书 CN 104404170 A 6 5/8 页 7 0057 结果判定 ： 阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准， 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线， 且 Ct 值 30.0 或无， 阳性对照的 Ct 值应 27.0， 且出现特定的扩增曲线， 判定检测结果成立。 如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件， 此次实验视为无效。在检测结果成立的前提 下， 若样品检测结果 Ct 值 27.0， 而且出现特定的扩增曲线， 判定。
30、为阳性 ； Ct 值 30.0 或 无， 并且无特定的扩增曲线， 则判定为阴性 ； 30.0 Ct 值 27.0 且有特定扩增曲线的样品 判定为可疑， 对可疑样品重新试验， 结果为阳性者判定为阳性， 结果为阴性者判定为阴性 ； 对可疑样品重新试验， 结果再次为可疑者应重新采集该动物样品重新试验。通用型检测体 系 FAM 荧光通道和 A 型 VIC 荧光通道均为阳性者判定为本样品为 T/A 型双阳性样品， 即该 样品为 A 型口蹄疫感染样品 ； 通用型检测体系 FAM 荧光通道阳性， A 型检测体系 VIC 荧光通 道阴性者判定为本样品为通用型阳性样品， 即该样品为其他型口蹄疫感染样品， 而非 。
31、A 型 口蹄疫感染样品。 0058 1.2.6 敏感性试验和标准曲线的建立 0059 将步骤1.2.4中获得的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒分别作10倍系 列稀释， 两种质粒1:1比例混合， 每种质粒终浓度调整为1.01071.0100拷贝/L， 共 8 个稀释度， 以纯水为阴性对照， 按步骤 1.2.5 优化的 FQ-PCR 反应条件进行 FMDV-T/FMDV-A 二重 FQ-PCR 敏感性试验。分别以 pGEM-T/FMDV-T 和 pGEM-T/FMDV-A 重组质粒起始模板数 的对数为 X 轴， 以 FQ-PCR 循环次数 Ct值为 Y 轴作回归曲线，。
32、 建立二重 FQ-PCR 方法的标准 曲线。二重 FQ-PCR 检测 FMDV-T 和 FMDV-A 最低检出限均为 1.0101拷贝 /L， 实验结果 见表 1。 0060 表 1 0061 说 明 书 CN 104404170 A 7 6/8 页 8 0062 1.2.7 特异性试验 0063 按步骤 1.2.2 所述方法对猪瘟病毒 (CSFV)、 猪蓝耳病病毒 (PRRSV) 等提取 RNA 并 按步骤1.2.2进行反转录， 猪伪狂犬病毒(PRV)、 猪圆环病毒2型(PCV)、 猪细小病毒(PPV)、 猪肺炎支原体等则直接提取 DNA， 同时将浓度分别为 1.0105拷贝 /L 的 pG。
33、EM-T/FMDV-T 和 pGEM-T/FMDV-A 重组质粒混合物作为阳性对照， 高致病性蓝耳病疫苗为阴性对照， 按步 骤 1.2.5 优化的 FQ-PCR 反应条件进行二重 FQ-PCR 扩增以验证该方法的特异性。Ct 值分 别为13.5641和14.2809， 且出现特定的扩增曲线 ； 但纯水、 猪瘟病毒(CSFV)、 猪蓝耳病病毒 (PRRSV)、 猪伪狂犬病毒 (PRV)、 猪圆环病毒 2 型 (PCV)、 猪细小病毒 (PPV) 均未出现特定的 扩增曲线。实验结果见表 2， 表 2 中各样品浓度均为 1.0107拷贝 /L。 0064 表 2 0065 说 明 书 CN 1044。
34、04170 A 8 7/8 页 9 0066 1.2.8 稳定性和重复性试验 0067 分别将 4 个浓度的 10 倍系列稀释的 pGEM-T/FMDV-T 和 pGEM-T/FMDV-A 重组质粒 等量混合物 ( 每种质粒终浓度 1.0103 1.0100) 按照步骤 1.2.5 优化的 FQ-PCR 反应 条件进行扩增， 每个系列设定 3 个重复， 以验证该方法的稳定性和重复性。重复性试验结 果表明， 浓度为 1.0103拷贝 /L、 1.0102拷贝 /L、 1.0101拷贝 /L 的 3 个浓度的 FMDV-T/FMDV-A 重组质粒等量混合物 3 次试验结果均为阳性， 浓度为 1.0。
35、100拷贝 /L 的 FMDV-T/FMDV-A重组质粒等量混合物3次试验结果均为阴性， 说明建立的FMDV-T/FMDV-A二 重 FQ-PCR 方法具有很好的稳定性和重复性。检测结果见表 3。 0068 表 3 0069 0070 实施例 2 口蹄疫病毒通用、 A 型二重实时荧光定量 PCR 检测体系的应用 0071 依据本研究建立的 FMDV-T/FMDV-A 二重 FQ-PCR 和本实验室曾建立的 FMDV-T/ FMDV-A 普通 RT-PCR 检测方法， 配制检测试剂， 以 FMDV-T/FMDV-A 阳性质粒混合物为阳 性对照， 水为阴性对照， 对 13 份临床疑似 FMDV 感。
36、染样品 ( 样品编号为 ： 1 13) 进行了 应用检测， 首先对 13 份样品、 阴阳性对照进行匀浆机研磨匀浆， 5000r/min 离心 5 分钟， 取上清 100L， 核酸提取仪提取总 RNA， 利用本发明所提供的方法和口蹄疫病毒 O 型、 A 型与 Asia 三重 RT-PCR 检测试剂及其检测方法 ( 普通 RT-PCR 检测， 授权公告号 CN 102230029B) 对每个样品和阴阳性对照进行实验室检测， 最后对这两种方法的检测结果 进行比较分析， 并与测序结果比较。结果表明， 采用本发明所提供的 FMDV-T/FMDV-A 二重 说 明 书 CN 104404170 A 9 8。
37、/8 页 10 PCR 检测， 2 份为 FMDV-T 阳性， 1 份为 FMDV-T/FMDV-A 双阳性 ； 采用普通 RT-PCR 检测 1 份为 FMDV-T阳性， 1份为FMDV-T/FMDV-A双阳性。 表明本发明建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR 方法比普通 RT-PCR 方法的灵敏性高， 该 FQ-PCR 方法检测结果与 FMDV-T/FMDV-A FMDV 基因 测序结果符合率为 100。检测结果见表 4。 0072 表 4 0073 0074 0075 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修。
38、改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 104404170 A 10 1/5 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 104404170 A 11 2/5 页 12 0003 序 列 表 CN 104404170 A 12 3/5 页 13 0004 序 列 表 CN 104404170 A 13 4/5 页 14 0005 序 列 表 CN 104404170 A 14 5/5 页 15 序 列 表 CN 104404170 A 15 1/1 页 16 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104404170 A 16 。