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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410584311.7 (22)申请日 2014.10.27 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中南大学 地址 410083 湖南省长沙市岳麓区麓山南路 932 号 (72)发明人 李桂源 曾朝阳 熊炜 龚朝建 李小玲 张文玲 李夏雨 曾勇 周鸣 马健 彭淑平 向波 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所 43114 代理人 袁靖 (54) 发明名称 长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、 试剂及其应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 长 。
2、链 非 编 码 RNA LOC401317 的原位杂交探针、 试剂及其应用。该 长链非编码 RNA LOC401317 可以用于制备鼻咽 癌患者的预后制剂, 特别是制备出原位杂交检测 法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证 实 LOC401317 在鼻咽癌组织中表达下调, 低表达 LOC401317 的鼻咽癌患者比高表达 LOC401317 的 鼻咽癌患者预后差, 因此, 将 LOC401317 的表达用 于鼻咽癌患者的预后预测, 可以为鼻咽癌患者的 预后提供强有力的分子生物学依据, 具有深远的 临床意义和重要的推广应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
3、12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 序列表4页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104388543 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104388543 A 1/2 页 2 1. 长链非编码 RNA LOC401317 的应用方法, 其特征在于, 用于制备鼻咽癌辅助诊断或 者疗效预测的制剂, 该长链非编码 RNA LOC401317 的序列见 SEQ NO:1。 2. 根据权利要求 1 所述的应用方法, 其特征在于, 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预 测的制剂为原位杂交检测试剂。 3. 根据权利要求 2 所述的应用方法, 其特征在于, 所述的原位杂交检测试剂中。
4、包括用于原位杂交检测 LOC401317 表达的寡核苷酸探针, 序列如下 : LOC401317 探针 1 : 5 -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3 LOC401317 探针 2 : 5 -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3 。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的应用方法, 其特征在于, 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。 5. 根据权利要求 4 所述的应用方法, 其特征在于, 试剂盒中含有用于原位杂交检测 LOC401317 表达的寡核苷酸探针 : LOC401317 探针 1 : 5 -TTAAAAATAAA。
5、TCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3 LOC401317 探针 2 : 5 -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3 ; 试剂盒中还含有阳性对照探针, GAPDH 探针 1 : 5-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 GAPDH 探针 2 : 5-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3。 6. 根据权利要求 4 所述的应用方法, 其特征在于, 试剂盒中还含有 : 地高辛寡核苷酸加尾试剂、 抗地高辛 - 辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、 DAB 染色试剂 ; 其它常规生物化学试剂, 包括 20。
6、x SSC, 硫酸葡聚糖, 去离子甲酰胺, 多聚腺苷酸, 多聚 脱氧腺苷酸, 变性剪切的蛙精 DNA, 酵母转运 RNA, 二硫苏糖醇, 50xDenhardts s solution, PBS buffer, 胃蛋白酶 K, 牛血清白蛋白, 三乙醇胺, 醋酸酐, TNB 缓冲液 : pH7.5 的 0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5阻断试剂 ; TNT 缓冲液 : pH7.5 的 0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05 Tween 20。 7. 用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针, 序列 如下 : LOC401317 探针。
7、 1 : 5 -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3 LOC401317 探针 2 : 5 -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3 。 8. 用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂, 是包含有权利要求 7 所述 的寡核苷酸探针的试剂盒。 9. 根据权利要求 8 所述的原位杂交检测试剂, 其特征在于, 试剂盒中还含有阳性对照 探针 : GAPDH 探针 1 : 5-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 GAPDH 探针 2 : 5-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTG。
8、TA-3。 10. 根据权利要求 8 或 9 所述的原位杂交检测试剂, 其特征在于, 试剂盒中还含有 : 地高辛寡核苷酸加尾试剂、 抗地高辛 - 辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、 DAB 染色试剂 ; 权 利 要 求 书 CN 104388543 A 2 2/2 页 3 其它常规生物化学试剂, 包括 20x SSC, 硫酸葡聚糖, 去离子甲酰胺, 多聚腺苷酸, 多聚 脱氧腺苷酸, 变性剪切的蛙精 DNA, 酵母转运 RNA, 二硫苏糖醇, 50xDenhardts s solution, PBS buffer, 胃蛋白酶 K, 牛血清白蛋白, 三乙醇胺, 醋酸酐, TNB 缓冲液 : pH7.。
9、5 的 0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5阻断试剂 ; TNT 缓冲液 : pH7.5 的 0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05 Tween 20。 权 利 要 求 书 CN 104388543 A 3 1/14 页 4 长链非编码 RNA LOC401317 的原位杂交探针、 试剂及其应 用 技术领域 0001 本发明属于肿瘤分子生物学领域, 具体涉及长链非编码 RNA LOC401317 的原位杂 交探针、 试剂及其应用方法。 背景技术 0002 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤, 容易发生颈部淋巴结转移, 预后较差。 研究 表明, 这种肿瘤的发生发。
10、展是多基因参与、 多步骤、 多阶段的复杂过程, 其中抑癌基因的失 活与癌基因的激活发挥了关键的作用。 0003 TP53基因(编码p53蛋白)自1979年被克隆以来, 一直是肿瘤分子生物学研究领 域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的证据表明, TP53 基因通过调控一系列信号转导 通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展。在细胞受到各种致癌因素的刺激时, p53 蛋白 激活并通过转录调控下游关键靶基因的表达, 阻滞细胞周期、 诱导细胞分化、 启动细胞衰老 及凋亡、 参与 DNA 损伤修复维持基因组的稳定、 调节能量代谢和抑制肿瘤血管生成, 从而阻 止肿瘤的发生发展。已有的研究发现, TP53 基。
11、因是包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤中最常 见的突变基因之一, 3376的患者存在TP53基因异常。 因此, 恢复鼻咽癌中TP53基因 功能或逆转其下游信号通路, 对鼻咽癌的治疗具有重要的意义。 0004 长链非编码 RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs) 是一类长度超过 200nt、 缺少 特异完整的开放阅读框、 无或很少有蛋白编码功能的 RNAs 分子。最近的研究表明, lncRNAs 通过在表观遗传、 转录和转录后水平广泛调节基因的表达, 它们参与了生物体生长、 发育、 衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明 lncRNAs 的异常表达或功能缺失 与。
12、肿瘤的发生发展密切相关。一些 lncRNAs 分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意 义, 且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前, 已经克隆的人类 lncRNAs 基因已超过 4 万多个, 但绝大部分 lncRNA 的功能未知。 0005 为了寻找鼻咽癌中TP53基因调控的下游lncRNAs及其在鼻咽癌中的应用价值, 我 们在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因, 收集不同时间点的细胞用新一代lncRNAs芯片检测了 已知 lncRNA 的表达水平。芯片检测的结果显示, lncRNA LOC401317 的表达差异最显著, 其 表达明显上调, 提示 LOC401317 可能具有抑瘤基因的作用。 。
13、0006 我们构建了表达 LOC401317 的真核表达载体, 转染到鼻咽癌细胞株中, 在体外培 养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实lncRNA LOC401317可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖, 抑制肿瘤细胞的生长, 因此 LOC401317 是一个新的抑瘤性 lncRNA。将 LOC401317 真核表达 载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体, 多聚赖氨酸修饰的硅纳 米颗粒, 可保护 LOC401317 载体免受核酸酶降解, 延长作用时间, 且有更高的转染效率。 0007 进一步地, 我们检测了 LOC401317 在临床离体肿瘤样本中的表达水平, 并分析了 LOC4013。
14、17 表达水平与临床病例资料的相关性。我们从鼻咽癌及相对应的正常对照组织中 抽提 RNA 后通过逆转录, 实时定量 PCR, 检测了 LOC401317 的表达情况, 结果显示 LOC401317 说 明 书 CN 104388543 A 4 2/14 页 5 在鼻咽癌组织中表达下调。我们随后又利用原位杂交的方法, 进一步在存档石蜡样本验证 了 LOC401317 在鼻咽癌中表达显著下调, 因此针对 LOC401317 的检测制剂可用于鼻咽癌的 辅助诊断, 结合临床回访资料进行生存曲线分析发现 LOC401317 表达低的患者其生存时间 短于该 lncRNA 表达高的患者, 因此针对该 lnc。
15、RNA 的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判 断。 发明内容 0008 本发明的目的是提供长链非编码 RNA LOC401317 的原位杂交探针、 试剂及其应用 方法, 利用长链非编码 RNA LOC401317 序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的 制剂。 0009 lncRNAsLOC401317 的应用方法, 用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂, 该长链非编码 RNA LOC401317 的序列见 SEQ NO:1。 0010 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。 0011 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测 LOC401317 表达的寡核苷酸。
16、 探针, 序列如下 : 0012 LOC401317 探针 1 : 5 -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3 0013 LOC401317 探针 2 : 5 -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3 。 0014 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。 0015 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测 LOC401317 表达的寡核苷酸探针 : 0016 LOC401317 探针 1 : 5 -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3 0017 LOC401317 探针 2 : 5 -AAGGAGGGA。
17、AAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3 ; 0018 阳性对照探针 ( 检测看家基因 GAPDH) : 0019 GAPDH 探针 1 : 5-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3 0020 GAPDH 探针 2 : 5-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3。 0021 试剂盒中还含有 : 地高辛寡核苷酸加尾试剂、 抗地高辛 - 辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、 DAB 染色试剂 ; 0022 其 它 常 规 生 物 化 学 试 剂, 包 括 20x 柠 檬 酸 钠 缓 冲 溶 液 (saline sodium citra。
18、te,SSC), 硫酸葡聚糖 (Dextran sulphate), 去离子甲酰胺 (Deionized Formamide), 多聚腺苷酸 (polyadenylic acid, Poly A), 多聚脱氧腺苷酸 (polydeoxyadenylic acid, Poly dA), 变性剪切的蛙精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA, ssDNA), 酵母转运 RNA(yeast t-RNA, tRNA), 二硫苏糖醇 (DTT), 50x 邓罕氏缓冲液 (Denhardts s solution), 磷酸缓冲液 (PBS buffer), 。
19、胃蛋白酶 K, 牛血清白蛋白 (BSA), 三乙醇胺 (TEA), 醋酸酐, 阻断试剂 (Blocking reagent agent), TNB 缓冲液 ( 即 : pH7.5 的 0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5阻断试剂 ), TNT 缓冲液 ( 即 : pH7.5 的 0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05 Tween 20)。 0023 我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现 LOC401317 在鼻咽癌中表达显著下调, 且 LOC401317 的表达与预后密切相关, LOC401317 表达低的患者 更快地死亡, 提示 L。
20、OC401317 可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅助 诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具, 具有深远的临床意义和重要的推广应用 说 明 书 CN 104388543 A 5 3/14 页 6 前景。 附图说明 0024 图 1 为 TP53 基因可诱导 lncRNA LOC401317 表达情况 ; 0025 A : 在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、 12、 24和48小时后用实时荧光定 量 PCR 检测 TP53 基因的表达, TP53 基因 mRNA 表达水平显著上调 ; 0026 B : 在鼻咽癌细胞系中转染 TP53 基因表达载体 0、 12、 2。
21、4 和 48 小时后用 Western Blotting 方法检测 TP53 基因的表达, TP53 基因蛋白表达水平显著上调 ; 0027 C : 在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、 12、 24和48小时后用荧光素酶报 告基因活性方法检测 TP53 基因表达的 p53 蛋白作为核转录因子的转录活性, p53 转录活性 显著上调 ; 0028 D : 在鼻咽癌细胞系中转染 TP53 基因表达载体 12、 24 和 48 小时后利用 lncRNA 芯 片检测细胞内 lncRNA 表达水平的变化, 本图显示了细胞中转染 TP53 基因后表达上调最显 著的 30 个基因 ; 0029 E。
22、 : 实时荧光定量 PCR 技术验证 lncRNA 芯片的结果, 转染 TP53 基因后细胞中 lncRNA LOC401317 的表达显著上调 ; 0030 图 2 为在鼻咽癌细胞中导入 lncRNA LOC401317 抑制鼻咽癌细胞的生长情况 ; 0031 A : 生长曲线实验表明在鼻咽癌细胞中转染 LOC401317 表达载体后细胞生长速度 减慢 ; 0032 B : 流式细胞分析仪检测转染 LOC401317 表达载体后, 鼻咽癌细胞周期阻滞于 G0/ G1 期 ; 0033 C : 流式细胞分析仪检测转染 LOC401317 表达载体后, 凋亡的鼻咽癌细胞明显增 多 ; 0034 。
23、图 3 为动物实验证实 lncRNA LOC401317 抑制鼻咽癌细胞的生长和增殖情况 ; 0035 A : 在鼻咽癌细胞中转染 LOC401317 表达载体后, 注射到裸鼠腋窝皮下, 每周测量 移殖瘤大小, LOC401317 可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖 ; 0036 B : 35 天后处死裸鼠, 大体观察表明重表达 LOC401317 组移殖瘤最小 ; 0037 C : 处死裸鼠后取出移殖瘤比较和测量移殖瘤大小, 重表达 LOC401317 组移殖瘤最 小 ; 0038 图 4 为利用实时荧光定量 PCR 的方法检测鼻咽癌离体样本中 LOC401317 的表达情 况 ; LOC40131。
24、7 在鼻咽癌 (T) 中的表达比正常对照 (N) 样本中显著下调 ; 0039 图 5 为原位杂交检测 LOC401317 在鼻咽癌及正常鼻咽粘膜中的表达情况 ; 左图为 鼻咽癌组织, 右图为正常鼻咽粘膜组织 ( 放大倍数 : 200), LOC401317 在鼻咽癌中表达水 平较低 ; 0040 图 6 为鼻咽癌中 LOC401317 的表达与患者的预后相关分析 ; LOC401317 表达低或 者不表达的患者更快的死亡。 具体实施方式 0041 以下结合具体实施方式进一步说明本发明, 而非限制本发明。 说 明 书 CN 104388543 A 6 4/14 页 7 0042 实施例 1, 。
25、在鼻咽癌细胞中导入 TP53 基因, lncRNA LOC401317 表达显著上调 0043 1. 材料与方法 : 0044 1.1 试剂及试剂盒 0045 琼脂糖 (agrose) 等常用生化试剂、 胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限 公司, 利用 Mini Kit(Qiagen) 抽提试剂盒抽提高质量的 RNA, SuperScriptTM III(Invitrogen) 试 剂 盒 将 RNA 逆 转 录 成 cDNA。 荧 光 素 酶 报 告 基 因 检 测 试 剂 盒 Dual-Luciferase Reporter Assay System 购自 Promega 公司。本发明所。
26、用的鼻咽癌细胞 HNE2 为中南大学肿瘤研究所保存。细胞培养所用 RPMI1640 培基和胎牛血清, 及消化细胞 所用的胰蛋白酶均为美国 Gibco 公司产品。lncRNA 芯片为安捷伦公司产品, 该芯片规格为 4*180K, 其中 lncRNAs 探针 46506 条。 0046 TP53 真核表达质粒购自美国 Clontech 公司, 用于检测 p53 蛋白转录活性的 pp53-TA-luc 荧光素酶报告质粒购自碧云天公司。 0047 实时荧光定量检测引物序列有 : 0048 TP53 基因上游引物 : 5 -CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3 0049 TP53 基因下游引物 。
27、: 5 -CTCCGTCATGTGCTGTGACT-3 0050 内参看家基因 GAPDH 上游引物 : 5 -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 0051 内参看家基因 GAPDH 下游引物 : 5 -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 0052 LOC401317 上游引物 : 5 -CTTTCTTGCTGGCATCGTTACC-3 0053 LOC401317 下游引物 : 5 -CTTGCCCCTCTAAGAACTTCGT-3 0054 Western blotting 检 测 p53 蛋 白 及 内 参 基 因 GAPDH 表 达 的 抗 体 购 自 Cell S。
28、ignaling Technology 公司。 0055 1.2 细胞培养与转染 0056 将生长状态良好的鼻咽癌细胞HNE2按2105个细胞/孔接种于6孔板中, 将6孔 板置于 37, 5 CO2培养箱中, 待培养细胞生长至 50-70密度即可开始 TP53 真核表达载 体的转染 ; 转染过程如下 : 0057 在无菌 EP 管中加入 3l 的 lipofectamine 2000 于 100l 无血清培养基中混匀 静置5min ; 将TP53表达载体加入100l无血清培养基中 ; 然后与上述包含lipofectamine 的 100l 无血清培养基温和混匀, 室温静置 30 分钟, 使 D。
29、NA 与脂质体形成复合体 ; 用 D-Hanks 液洗涤细胞 3 次 ; 将上述混合物中加入 800l 无血清培养基 ( 无抗生素 ), 温和 混匀后加入 6 孔板中的 1 个孔 ; 将 6 孔板置于 CO2培养箱中, 37培养 6 小时, 然后弃上清, 加入完全培养基继续培养 12、 24 和 48 小时。 0058 1.3 实时荧光定量法检测 TP53 基因和 LOC401317 的表达 0059 鼻咽癌细胞 HNE2 转染 TP53 真核表达载体后于 0、 12、 24 和 48 小时收集细胞, 抽提 细胞中的总 RNA, 2g RNA 经逆转录成 cDNA 后, 进行实时荧光定量 PC。
30、R。 0060 实时荧光定量 PCR 反应体系 0061 说 明 书 CN 104388543 A 7 5/14 页 8 0062 实时荧光定量 PCR 反应步骤 0063 0064 反应结束后确认实时荧光定量 PCR 的扩增曲线和熔解曲线, 各基因的表达强度根 据CT值(threshold cycle values)、 内参基因(GAPDH)标化后, 采用group t-test检验计 算 P 值。 0065 1.4 Western blotting 检测 p53 蛋白的表达 0066 鼻咽癌细胞 HNE2 转染 TP53 真核表达载体后于 0、 12、 24 和 48 小时收集细胞, 抽提。
31、 细胞中的总蛋白, 常规 Western blotting 方法检测 p53 蛋白的表达, GAPDH 作为内参基因。 0067 1.5 荧光素酶报告基因检测 p53 的转录活性 0068 鼻咽癌细胞 HNE2 转染 TP53 真核表达载体, 同时转染 pp53-TA-luc 荧光素酶报告 质粒, 于 0、 12、 24 和 48 小时收集细胞, 根据 Promega 公司荧光素酶报告基因检测试剂盒说 明书检测 p53 转录因子活性。 0069 1.6 lncRNA 芯片检测转染 TP53 基因后鼻咽癌细胞中 lncRNA 表达变化 0070 按安捷伦公司产品说明, 抽提细胞总 RNA、 纯化。
32、, 随机引物合成 cDNA, 并在 cDNA 上 标记荧光 Cy3, 与 lncRNA 芯片杂交, 芯片杂交后经洗涤后在安捷伦专用芯片扫描仪上扫描, 获得芯片上每个探针点的荧光强度, 专用软件分析转换成对应的 lncRNA 表达水平。比较鼻 咽癌细胞 HNE2 转染 TP53 真核表达载体后 0、 12、 24 和 48 小时细胞内 lncRNA 的表达水平, 获得差异表达基因图谱。 0071 2. 结果 0072 2.1 TP53 真核表达质粒转染鼻咽癌细胞 HNE2 后的表达效果 : 说 明 书 CN 104388543 A 8 6/14 页 9 0073 将TP53真核表达载体转染HNE。
33、2细胞后, 12、 24和48小时均可检测到TP53mRNA(图 1A) 和 p53 蛋白 ( 图 1B) 的表达显著升高, 且表达出的 p53 蛋白具有较强的转录因子活性 ( 图 1C)。 0074 2.2 转染 TP53 真核表达载体后鼻咽癌细胞中部分 lncRNA 的表达水平显著改变 : 0075 利用 lncRNA 芯片, 我们检测了转染 TP53 表达载体 0、 12、 24 和 48 小时后鼻咽癌细 胞 HNE2 中 lncRNA 的表达状态, 部分 lncRNA 表达水平发生了显著的变化 ( 图 1D 列举了表 达上调最显著的 30 个 lncRNA)。随后, 我们对转染 TP5。
34、3 载体后 HNE2 细胞中 LOC401317 的 表达水平用实时荧光定量法进行验证, 证实 LOC401317 的表达确实显著上调 ( 图 1E), 表明 TP53在HNE2细胞中调控了LOC401317的表达, 鉴于TP53基因是最重要的抑瘤基因之一, 提 示 LOC401317 可能也具有抑瘤基因功能。 0076 实施例 2, lncRNA LOC401317 抑制鼻咽癌细胞周期阻滞、 诱导细胞凋亡 0077 1. 材料与方法 0078 1.1 试剂及试剂盒 0079 限制性内切酶 Nhe I 和 EcoR I 及 T4DNA 连接酶等购自 TakaRa 公司 ; TRIZOLTM R。
35、eagent(Invitrogen) ; 质 粒 抽 提 试 剂 盒、 胶 回 收 试 剂 盒 (OMEGA) ; 逆 转 录 试 剂 盒 (Promega) ; 蛋白酶 K、 DNase I、 RNAsin、 RNase A(GBICOL 公司 ) ; 四甲基偶氮唑蓝 (MTT, Sigma) ; 抗生素 G418(Ameresc)。 0080 1.2pcDNA3.1LOC401317 真核表达载体的构建 0081 我们选择 pcDNA3.1 空白载体 ( 来源于 Invitrogen 公司 ) 构建 LOC401317 的过表 达载体。我们选择 Nhe I 和 EcoR I 酶切位点用于酶。
36、切 pcDNA3.1 载体并将 LOC401317 序列 插入该位点。 0082 构建 pcDNA3.1LOC401317 真核载体步骤如下 : 0083 1) 以转染 TP53 质粒的 HNE2 细胞 cDNA 为模板, 利用 TaKaRa LA 酶进行 PCR 扩增全长 LOC401317 序列。LOC401317 全长序列扩增引物如下 : 0084 上游引物 : 5 -atcgggggtgtgtgtttgcct-3 0085 下游引物 : 5 -tgacgtaatggacctgtatcc-3 0086 在上、 下游引物的 5 端分别加上限制性内切酶 Nhe I 和 EcoR I 识别位点。
37、及保护 碱基后, 引物序列如下 : 0087 上游 : 5 -AGGAGCTAGCatcgggggtgtgtgtttgcc-3 (下划线部分为Nhe I识别位点) 0088 下游 : 5 -ATGCGAATTCtgacgtaatggacctgtatcc-3 ( 下划线部分为 EcoR I 识别位 点 ) 0089 2)PCR 扩增, LOC401317 全长序列, PCR 反应条件如下 : 0090 0091 说 明 书 CN 104388543 A 9 7/14 页 10 0092 PCR 反应步骤 0093 0094 3) 将 PCR 产物电泳、 胶回收目的片段后经 Nhe I 和 Eco。
38、R I 双酶切后电泳, 再次胶 回收。 0095 4)pcDNA3.1 质粒经 Nhe I 和 EcoR I 双酶切后电泳胶回收目的片段。 0096 5) 以 T4DNA 连接酶连接 4) 和 5) 步胶回收产物, 即可得到可用于真核表达 lncRNA LOC401317 的载体质粒。 0097 6)将第5)步得到的包含LOC401317全长序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受 态细菌 JM109, 以扩增质粒。 0098 1.3 制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒 0099 多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用 OP-10/ 环己烷 / 氨水微乳液自组装技术进 行硅纳米颗粒(silica na。
39、noparticle,SiNP)的合成, 并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离 子静电作用, 制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒 ; 所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得 到 : 0100 1) 将 OP-10、 环己烷和氨水混合, 室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯 (TEOS), 继续搅 拌至聚合完成, 加入等体积丙酮, 超声分散, 离心, 双蒸水洗涤三次, 离心收集沉淀于 80干 燥, 研细得硅纳米颗粒 (SiNP)。其中 H2O 与 OP-10 及 H2O 与 TEOS 的摩尔比为 2 10、 氨水 浓度为 1.6 28、 TEOS 在环己烷中的摩尔浓度为 0.1 3mol/L。 0101 2) 将 。
40、SiNP 按 0.1 10mg/ml 重悬于 0.6M NaCO3溶液中, 超声分散, 离心, 弃上清, 再将沉淀物按 0.1 10mg/ml 重悬于 PBS(pH 7.4) 中, 超声分散, 加多聚赖氨酸 ( 终浓度为 4 15nmol/mL), 充分混匀, 室温混摇 ; 离心, 弃上清, 沉淀重悬于双蒸水中, 得到多聚赖氨 酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为 4 15nmol/mL。 0102 3)将改性硅纳米颗粒超声分散, 按质量比530:1与上述LOC401317表达载体混 合, 室温静置使其结合。 0103 1.4 细胞培养与转染 0104 将生长状态良好的鼻咽癌细胞HNE2按。
41、2105个细胞/孔接种于6孔板中, 将6孔 说 明 书 CN 104388543 A 10 8/14 页 11 板置于 37, 5 CO2培养箱中, 待培养细胞生长至 50-70密度即可开始 LOC401317 真核 表达载体的转染 ; 转染过程如下 : 0105 在无菌 EP 管中加入 100l 制备好的携带 LOC401317 真核表达质粒的多聚赖氨酸 修饰的硅纳米颗粒悬液, 与 100l 无血清培养基温和混匀 ; 用 D-Hanks 液洗涤细胞 3 次 ; 将上述混合物中加入 800l 无血清培养基 ( 无抗生素 ), 温和混匀后加入 6 孔板中的 1 个 孔 ; 将 6 孔板置于 CO。
42、2培养箱中, 37培养 6 小时, 然后弃上清, 加入完全培养基继续培养过 夜。用携带 pcDNA3.1 空载体的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。 0106 1.5 MTT 细胞增殖实验 0107 1) 消化上一步得到的细胞, 用细胞计数仪对细胞进行计数, 将转染 LOC401317 和 pcDNA3.1 空载体的细胞接种于 96 孔板中, 每孔接种 1000 个细胞, 每种细胞接种 5 孔, 结果 取其均值。 0108 2)37, 5CO2培养箱培养6小时, 待细胞贴壁后, 每孔加MTT液(5mg/ml)20l。 继续孵育4小时, 终止培养, 弃去培养液。 每孔再加入150l DMS。
43、O, 振荡10分钟, 使结晶物 溶解。 0109 3) 选择 490nm 波长, 同时设定调零孔, 在酶联免疫检测仪上, 测定各孔吸光度值并 记录结果。 0110 4) 每隔 24 小时重复步骤同上, 共检测 6 天。以吸光度值为纵坐标, 间隔时间为横 坐标绘制 MTT 曲线。 0111 5) 实验重复三次。以各时间点为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 绘制细胞生长曲线。 0112 1.6 流式细胞仪分析细胞周期 0113 1) 培养细胞达到 85融合时用胰酶消化细胞, 1200rpm/min 离心 5min, 收集细胞 沉淀。 0114 2)1xPBS 重悬细胞, 1200rpm/min, 离心。
44、 5min, 收集细胞。重复此步骤 2 次。 0115 3)1xPBS 重悬细胞, 加入预冷的 70乙醇固定细胞过夜。 0116 4)1000rcf/min, 离心 5min, 收集细胞沉淀。 0117 5)PH7.4PBS 洗涤细胞 1 次, 离心后加入 PBS 重悬细胞, 并调整细胞浓度至 Ix 106/ ml。 0118 6)加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI,1g/L Triton X-100, 100g/L RNase) 混匀, 4避光孵育 30min。 0119 7) 流式细胞仪 FACStar( 美国 BD 公司 ) 检测。接收的信号经 Cellquest 软件处 。
45、理, 对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复 3 次。 0120 1.7 流式细胞仪分析细胞调亡率 0121 1) 培养细胞达到 85融合时, 用胰酶消化各组细胞并收集于离心管内, 同时收集 各组上清悬浮细胞。注意轻轻吹打细胞, 避免胰酶过度消化。 0122 2) 分别合并各组细胞并转移至离心管内, 1000rpm 离心 5min, 弃上清收集细胞, PBS 轻轻重悬后, 细胞计数。 0123 3)取510万重悬细胞, 1000rpm离心5min, 弃上清, 加入195ul Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。 0124 4) 加入 5ul Annexin V, 轻轻混匀。避光室。
46、温孵育 10min。 说 明 书 CN 104388543 A 11 9/14 页 12 0125 5)1000rpm离心5min, 弃上清, 加入190ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 0126 6) 加入 10ul PI 染色液, 轻轻混匀, 冰浴避光。 0127 7) 随即进行流式细胞仪检测, Annexin V-FITC 为绿色荧光, PI 为红色荧光。 0128 2. 结果 0129 2.1LOC401317 抑制鼻咽癌细胞的生长 0130 转染 LOC401317 真核表达载体后, 与转染空载体的细胞相比, 鼻咽癌细胞 HNE2 的 生长速度显著减慢 ( 图 。
47、2A)。 0131 2.2 LOC401317 通过阻滞细胞周期、 诱导细胞凋亡抑制鼻咽癌细胞的生长 0132 流式细胞仪分析表明, 在鼻咽癌细胞 HNE2 中转染 LOC401317 后, G0/G1 期细胞比 例显著增加, 而 S 期及 G2/M 期细胞比例减少, 表明 LOC401317 可将 HNE2 细胞阻滞于 G0/G1 期, 使其细胞分裂减慢速度 ( 图 2B)。同时, 在鼻咽癌细胞 HNE2 中转染 LOC401317 后凋亡细 胞比例明显增加 ( 图 2C), 这也是 LOC401317 抑制鼻咽癌细胞生长的原因之一。 0133 实施例 3, 裸鼠移殖瘤模型中 LOC4013。
48、17 抑制鼻咽癌细胞生长 0134 1. 材料与方法 0135 30只雄性BALB/C裸鼠, 4周龄, 重量为192g, 购买于上海斯莱克实验动物有限公 司。所有裸鼠均质检合格, 在中南大学实验动物部, 于无特定病原体 (SPF) 条件下饲养。 0136 LOC401317 真核表达载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、 细胞培养 与转染等同实施例 2。 0137 转染 LOC401317 或 pcDNA3.1 空白载体的 HNE2 细胞, 以及未作任何处理的 HNE2 细 胞 (Mock) 各取 2106分别注入裸鼠腋下的皮下, 观察比较肿瘤的生长情况, 第 10 天起, 用 游 标卡尺隔着皮肤测量移殖瘤大小, 第 35 天时处死裸鼠, 取出移殖瘤测量, 比较各组移殖 瘤的大小。 0138 2. 结果 0139 裸鼠移殖瘤模型进一步证实, lncRNA LOC401317可抑制鼻咽癌细胞的生长(图3) 0140 实施例 4, 实时荧光定量法检测证实 LOC401317 在鼻咽癌中表达下调 0141 1. 材料与方法 : 0142 18例正常鼻咽粘膜上皮和22例鼻。