一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物.pdf

本发明申请鉴于眼镜蛇蛇毒成分的复杂性和科博肽为碱性多肽、分子量大约7000道尔顿左右、相对耐热耐酸碱等理化性质，综合考虑各种层析柱填料的分离机理、应用特点、长期使用的稳定性、成本的可控性以及提取目标的达成，提供一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法，该方法工艺稳定、层析填料易得、综合成本低、操作条件适应性好、神经毒素的收率高。本发明申请进一步提供由上述方法制备得到的高纯度科博肽，用它制成的注射用科博肽制剂中与治疗作用无关的杂质少、治疗作用起效快、疗效稳定。本发明申请还提供几种以高纯度科博肽为有效成分，配方制成制剂所必要的制剂辅料的药物组合物及不同的剂型，适合口服、口腔吸收、直肠给药的科博肽制剂。

权利要求书
1.  一种高纯度科博肽的提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
1)取眼镜蛇粗毒溶解于蒸馏水或含NaCl的缓冲液中，。室温或低温离心，取上清液，待上柱层析；
2)取上清液，上SP Sepharose FF阳离子柱层析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液在低温透析后待上样；
3)将步骤2)收集的科博肽组分溶液，上样CM52Cellulose阳离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液低温透析后待上样；
4)将步骤3)收集的科博肽组分溶液，上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用磷酸盐或Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液低温透析后，把透析液装入阻断分子量为5000的透析袋中，用聚乙二醇8000包埋浓缩待上样；
5)将步骤4)收集的科博肽组分浓缩溶液，上样Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液洗脱，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，收集液用NaCl溶液低温透析，所得的科博肽组分溶液过滤除菌，在冷冻干燥机中抽真空冻干，得到高纯度的科博肽；
或
所述的高纯度科博肽的提取方法，包括下述步骤：
1)取眼镜蛇粗毒溶解于蒸馏水或含NaCl的缓冲液中，离心，取上清液，待上柱层析；
2)取上清液，上SP Sepharose FF阳离子柱层析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液在低温透析后待上样；
3)将步骤2)收集的科博肽组分溶液，上样CM52Cellulose阳离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液在低温透析、浓缩后待上样，
4)将步骤3)收集的科博肽组分浓缩溶液，上样Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液洗脱，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液低温透析后待上样；
5)将步骤4)收集的科博肽组分溶液，上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集液用NaCl溶液低温透析，所得的科博肽组分溶液过滤除菌，在冷冻干燥机中抽真空冻干，得到高纯度的科博肽。

2.  根据权利要求1所述的高纯度科博肽的提取方法，其进一步特征在于：
1)眼镜蛇粗毒溶液浓度为0.05-0.2g/ml，溶解缓冲液为10-100mmol/L PH 4.0-8.5含0.45％-0.9％(W/V％)浓度NaCl的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷 酸盐缓冲液；
2)SP Sepharose FF阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 4.0-8.55-50mmol/L的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 5.5-8.5，浓度0.0-0.20mol/L NaCl5-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
3)CM52Cellulose阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.5-8.55-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-0.80mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 5.0-7.5，盐浓度0.0-0.15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
4)DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.0-7.55-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液。洗脱盐梯度为0.00-0.80mol/L NaCl，透析缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
5)Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，洗脱缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析液为0.0-0.25mol/L NaCl溶液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
或
所述的高纯度科博肽的提取方法，包括下述步骤：
1)眼镜蛇粗毒溶液浓度为0.05-0.2g/ml，溶解缓冲液为10-100mmol/L PH 4.0-8.5含0.45％-0.9％(W/V％)浓度NaCl的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷 酸盐缓冲液；
2)SP Sepharose FF阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 4.0-8.55-50mmol/L的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 5.5-8.5，浓度0.0-0.20mol/L NaCl5-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
3)CM52Cellulose阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.5-8.55-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-0.80mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/LNaCl的磷酸盐或Tris-HCl，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
4)Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，洗脱缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液；透析缓冲液为PH 5.0-7.5，盐浓度0.0-0.15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
5)DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.0-7.55-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，洗脱盐梯度为0.00-0.80mol/L NaCl；透析液为0.0-0.25mol/L NaCl溶液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时。

3.  根据权利要求1或2所述的高纯度科博肽的提取方法，其特征在于：上述步骤中，选择的层析填料功能基团SP、CM或DEAE和连接功能基团的基质可以互换。

4.  根据权利要求1或2所述的高纯度科博肽的提取方法，其特征在于：所述DEAE阴离子柱层析作为蛇毒原液的预处理和富集目标蛋白的层析步骤可以调整为上述提取步骤的第2)步，层析参数保持不变。

5.  由权利要求1-4所述的方法提取得到的高纯度的科博肽。

6.  一种含有科博肽的药物组合物，其特征在于，含有权利要求5所述的高纯度的科博肽。

7.  一种含有科博肽的药物组合物，其特征在于科博肽神经毒蛋白含量大于50％，HPLC纯度大于96％。

8.  根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于科博肽神经毒蛋白含量介于70-100％之间，纯度为98-100％。

9.  含有如权利要求6-8所述的药物组合物的各种剂型。

10.  根据权利要求9所述的剂型，其特征在于：包括片剂、胶囊、直肠吸收栓剂、口腔吸收剂或肠溶剂。

11.  含有权利要求5所述高纯度的科博肽的以非注射形式给药的药物组合物。

12.  根据权利要求10所述的剂型，其特征在于：所述适合口服吸收的片剂，其中主药高纯度科博肽含量140-560μg/片，其余辅料按片重计算：糊精1-15％；羟丙基甲基纤维素(HPMC)1-5％；低取代羟丙基纤维素(LHPC)2-16％；淀粉20-60％；糖粉12-36％；羧甲基淀粉钠1-10；硬脂酸镁1-5％；微粉硅胶0.5-5％。

13.  根据权利要求10所述的剂型，其特征在于：所述适合肠溶吸收的片 剂，其中主药高纯度科博肽含量140-560μg/片，其余辅料按片重计算：糊精1-15％；羟丙基甲基纤维素(HPMC)1-5％；低取代羟丙基纤维素(LHPC)2-16％；淀粉20-60％  糖粉12-36％；羧甲基淀粉钠1-10％；硬脂酸镁1-5％；微粉硅胶0.5-5％；肠溶包衣粉5-15％。

14.  根据权利要求10所述的剂型，其特征在于：所述适合直肠吸收的科博肽栓剂，其中主药高纯度科博肽含量70-560μg/栓，其余辅料按栓重计算：可可豆脂90-99.9％；聚山梨酯800.1-10％(V/W)。

15.  根据权利要求9所述的剂型，其特征在于：所述口腔吸收剂为片剂，其中主药高纯度科博肽含量70-560μg/片，其余辅料按片重计算：十二烷基硫酸钠0.1-4％微晶纤维素50-90％；阿斯帕坦2-8％；枸橼酸1-10％；羧甲基淀粉钠1-20％；聚维酮(PVP-K30)0.1-3％；微粉硅胶0.1-5％；硬脂酸镁0.1-5％。

说明书一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物
技术领域
本发明申请涉及一种高纯度眼镜蛇毒神经毒素的提取方法及以该毒素为单一有效成分的药物组合物，所述药物组合物适合口服、口腔吸收和直肠给药，特别涉及一种以高纯度科博肽为主药的口服、口腔吸收、直肠给药的制剂，属于生物和生化制药领域。
背景技术
神经毒素(neurotoxin，NT)是蛇毒中一类重要的活性组分，主要分布在眼镜蛇科和海蛇科及蝰科的响尾蛇蛇毒中。纯化的微量眼镜蛇毒神经毒素具有类似吗啡的中枢镇痛作用，用于顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛的镇痛治疗。NT的镇痛作用有别于阿片类药物，表现为效价高、持续时间长、无耐受性和成瘾性，是一种很有潜力的新型镇痛药。研究表明，NT的含量以眼镜蛇毒中含量较高，从眼镜蛇毒中分离出的NT具有长短链两种，其中以短链NT镇痛效果更好。
科博肽系从湖南眼镜蛇(Naja Naja Atra)蛇毒中分离纯化的短链NT，是由68个氨基酸组成的单链多肽，四个二硫键维系其空间结构，分子量为7000道尔顿左右，适用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛、神经性头痛、三叉神经痛、麻风反应神经痛等慢性疼痛的治疗，尤其用于慢性、顽固性、持续性疼痛的治疗，现临床使用为肌注给药和口服复方制剂(科博肽、曲马多和布洛芬的组合物)给药。
蛇毒中成分复杂，其中蛋白质占干重的90％，包括5-15种酶、3-12种非酶性蛋白质或多肽，另含5-20％小分子肽、氨基酸、糖类、脂类等等。眼镜蛇毒中 已经研究确定的成分有膜活性多肽、神经毒素、神经生长因子、溶血素(DLP)、CVA蛋白、眼镜蛇毒因子等及其他成分，如碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白水解酶等。目前，眼镜蛇神经毒素和科博肽的提取，主要使用盐析(硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁等中性盐)、阳离子柱层析、亲和层析等方法组合提取。其存在的缺陷主要有：盐析沉淀经过蛋白变性、复性的过程，杂蛋白共沉淀比较多，活性蛋白损失大，在蛇毒处理过程中，价格昂贵的蛇毒资源损失严重；亲和层析填料制备困难，使用条件苛刻，大规模长期使用亲和填料容易被蛇毒杂蛋白质毒化、重现性差；阳离子柱层析只对某些类型的碱性蛋白酶、多肽、核酸类杂蛋白能够按目标蛋白分子所载电荷实施有效分离，但是对于蛇毒中复杂的其他成分或电荷相差不大的蛋白酶、多肽的分离提取存在很大的局限性，部分研究得到的神经毒素和科博肽纯度只达到SDS-PAGE电泳纯。因此，从眼镜蛇毒中有效、稳定、重现性好的提取高纯度的神经毒素和科博肽是一项复杂困难的工作。
现有国家药品质量标准中对单组份生物、生化药品的纯度要求通常为：SDS-PAGE电泳一条带或HPLC含量大于90％，如科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)、或降纤酶国家药品标准(WS1-XG-031-2000)；HPLC含量大于95％或更高的的生物、生化单组份的高纯度的药物意味着制剂中与治疗作用无关的杂物质含量更少，这对于保证药品的质量、疗效、改善药物作用的时效、减少药物的毒副反应都具有重要意义。
科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)规定要求：按干燥品计算，神经毒蛋白含量不得少于35.0％；HPLC纯度检查主峰相对百分含量不得少于90.0％。而药品原料的含量和纯度，在保证药品质量、疗效、安全性、用药剂型等方面具 有决定作用。现有市售科博肽产品，存在原料批次间含量和纯度相对低、临床疗效不稳定、起效时间慢(陈汝筑，吴秀荣.眼镜蛇神经毒素的镇痛作用[J].中国药理学通报，1988，4(2)：113.实验动物注射眼镜蛇神经毒素后2小时，大鼠痛阈显著上升，3小时后达到较佳效果，NT镇痛作用起效慢，但维持时间长。陈燕，许云禄.舟山眼镜蛇神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究[J].海峡药学，2007，19(12)：27.小鼠动物实验显示，给药后2小时起效，4小时作用达峰值。朱天新，袁彩君，任晚琼.眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究[J].华西药学杂志，2007，22(3)：247～249.小鼠热板试验、大鼠电嘶叫试验和小鼠扭体试验结果基本一致，显示CNT具有较强的镇痛作用，且具有起效缓慢的特点)、科博肽单方制剂只可肌肉注射给药、病人用药顺应性差等缺陷。
市售口服含科博肽的镇痛药只有复方制剂——克洛曲片，该药品由科博肽、盐酸曲马多和布洛芬按1∶150∶300配比组成，其组分为：每片含科博肽按神经毒蛋白计为160μg，含盐酸曲马多(C16H25NO2·HCl)25mg，含布洛芬(C13H18O2)50mg；其中科博肽主要通过抑制乙酰胆碱的释放而起镇痛作用；盐酸曲马多通过与中枢的阿片受体结合而发挥镇痛作用；布洛芬通过抑制环氧化酶而起镇痛作用；三者通过不同的作用机理发挥镇痛的协同作用；但是由于病人的个体差异和个体病人体内生理生化指标和病灶的复杂性，复方制剂中药物之间的相互作用也会引起一些与预期治疗目标相悖的副作用，存在一定的用药风险和用药局限性。为了规避复方制剂的用药风险，按照病人的个体状况，医生处方按照单方制剂联合用药也是一种医疗方案的上佳选择和需求。
发明内容
本发明申请所要解决的一个技术问题是提供一种新的高纯度神经毒素(包括科博肽)的提取方法，该方法工艺稳定、层析填料易得、综合成本低、操作条件适应性好、神经毒素(包括科博肽)的收率高。
本发明申请进一步解决的技术问题是提供一种由上述方法制备得到的高纯度科博肽，用它制成的注射用科博肽制剂中与治疗作用无关的杂质少、治疗作用起效快、疗效稳定。
本发明申请还进一步解决的技术问题是提供几种以高纯度科博肽为有效成分，配方制成制剂所必要的制剂辅料的药物组合物及不同的剂型，适合口服、口腔吸收、直肠给药的科博肽制剂。
本发明申请考虑到眼镜蛇蛇毒成分的复杂性和科博肽为碱性多肽、分子量大约7000道尔顿左右、相对耐热耐酸碱等理化性质，综合考虑各种层析柱填料的分离机理、应用特点、长期使用的稳定性、成本的可控性以及提取目标的达成，提供一种高纯度科博肽的提取方法，所述提取方法概括如下：
1.分离和纯化科博肽：根据各种填料在宽PH范围内的稳定性、离子化程度、载样量、与目标蛋白科博肽的吸附力强弱以及分辨率，使用SP阳离子柱层析高通量捕获目标蛋白-科博肽，使用CM阳离子柱层析精细纯化科博肽；
2.进一步使用Sephadex凝胶过滤柱层析按分子量大小精细纯化科博肽，使用DEAE阴离子交换柱层析去除微量残留的杂蛋白、酶类(例如酸性蛋白酶类、蛋白水解酶、丝氨酸蛋白酶类等)得到高纯度的科博肽和神经毒素；
3.按照上述纯化方法得到的科博肽神经毒蛋白含量达到50％以上，HPLC 纯度达到96％以上、最高达到100％；科博肽总收率达到3.7％，而盐析预处理方案总收率2.5-2.6％；
4.得到的高纯度科博肽经动物实验口服、注射给药均具有显著的镇痛效果，药效起效时间短，镇痛作用维持时间长。
具体来说，所述高纯度科博肽的提取方法，HPLC纯度检查主峰相对百分含量大于96.0％，神经毒蛋白含量大于50％，所述方法包括下述步骤：
1)取眼镜蛇粗毒溶解于蒸馏水或含NaCl的缓冲液中，室温或低温离心，取上清液，待上柱层析；
2)取上清液，上SP Sepharose FF阳离子柱层析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液在低温透析后待上样；
3)将步骤2)收集的科博肽组分溶液，上样CM52 Cellulose阳离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液低温透析后待上样；
4)将步骤3)收集的科博肽组分溶液，上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用磷酸盐或Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液低温透析后，把透析液装入阻断分子量为5000的透析袋中，用聚乙二醇8000包埋浓缩待上样；
5)将步骤4)收集的科博肽组分浓缩溶液，上样Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液洗脱，收集记录谱图最大峰即科 博肽组分，收集液用NaCl溶液低温透析，所得的科博肽组分溶液过滤除菌，在冷冻干燥机中抽真空冻干，得到高纯度的科博肽；
或
所述的高纯度科博肽的提取方法，包括下述步骤：
1)取眼镜蛇粗毒溶解于蒸馏水或含NaCl的缓冲液中，离心，取上清液，待上柱层析；
2)取上清液，上SP Sepharose FF阳离子柱层析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液在低温透析后待上样；
3)将步骤2)收集的科博肽组分溶液，上样CM52 Cellulose阳离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，按记录谱图收集科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液在低温透析、浓缩后待上样，
4)将步骤3)收集的科博肽组分浓缩溶液，上样Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液洗脱，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，收集液用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液低温透析后待上样；
5)将步骤4)收集的科博肽组分溶液，上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用含NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集液用NaCl溶液低温透析，所得的科博肽组分溶液过滤除菌，在冷冻干燥机中抽真空冻干，得到高纯度的科博肽。
进一步的，所述的高纯度科博肽的提取方法，包括以下步骤：
1)眼镜蛇粗毒溶液浓度为0.05-0.2g/ml，溶解缓冲液为10-100mmol/L PH4.0-8.5含0.45％-0.9％(W/V％)浓度NaCl的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液；
2)SP Sepharose FF阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 4.0-8.55-50mmol/L的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 5.5-8.5，浓度0.0-0.20mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
3)CM52 Cellulose阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.5-8.55-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-0.80mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 5.0-7.5，盐浓度0.0-0.15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
4)DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.0-7.55-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液。洗脱盐梯度为0.00-0.80mol/L NaCl，透析缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
5)Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，洗脱缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析液为0.0-0.25mol/L NaCl溶液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
或
所述的高纯度科博肽的提取方法，包括下述步骤：
1)眼镜蛇粗毒溶液浓度为0.05-0.2g/ml，溶解缓冲液为10-100mmol/L PH 4.0-8.5含0.45％-0.9％(W/V％)浓度NaCl的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液；
2)SP Sepharose FF阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 4.0-8.55-50mmol/L的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 5.5-8.5，浓度0.0-0.20mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
3)CM52 Cellulose阳离子柱层析，洗脱缓冲液为PH5.5-8.55-50mmol/L的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，洗脱盐梯度为0.0-0.80mol/L NaCl；透析缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
4)Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，洗脱缓冲液为PH 6.0-8.0，盐浓度为0.0-0.50mol/L NaCl的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析缓冲液为PH 5.0-7.5，盐浓度0.0-0.15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时；
5)DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，洗脱缓冲液为PH 5.0-7.55-50mmol/L的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液。洗脱盐梯度为0.00-0.80mol/L NaCl，透析液为0.0-0.25mol/LNaCl溶液，透析参数为4-10℃低温透析4-8小时。
科博肽组分溶液的浓缩可以采用超滤浓缩、高盐透析浓缩、或吸水材料(聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮)包埋浓缩等方法。
由于科博肽属于眼镜蛇毒中神经毒素的一种，眼镜蛇毒中各种神经毒素的理化性质具有一定的同源相似性，因此本发明申请提供的高纯度神经毒素和科博肽的提取方法，对于各种眼镜蛇神经毒素的提取具有一定的通用性。
进一步的，本发明申请提供的高纯度科博肽的提取方法的各步骤中，为了减少蛋白水解酶和丝氨酸蛋白酶类对蛇毒溶液中科博肽成分的降解作用，DEAE阴离子柱层析作为蛇毒原液的预处理和富集目标蛋白的层析步骤可以调整为上述提取步骤的第2)步，层析参数保持不变。
上述步骤中，选择的层析填料功能基团SP、CM或DEAE和连接功能基团的基质可以互换。
上述步骤中，所述DEAE阴离子柱层析作为蛇毒原液的预处理和富集目标蛋白的层析步骤可以调整为上述提取步骤的第2)步，层析参数保持不变。
本发明申请还提供所述方法提取得到的高纯度的科博肽。
本发明申请还提供含有科博肽的药物组合物，其特征在于科博肽神经毒蛋白含量大于50％，HPLC纯度大于96％。
进一步的，所述科博肽神经毒蛋白含量介于70-100％之间，HPLC纯度为98-100％。
本发明申请还提供所述的药物组合物的各种剂型。
进一步的，所述的剂型，包括口服剂、片剂、胶囊、直肠吸收栓剂、口腔吸收剂或肠溶剂。
本发明申请还提供所述高纯度的科博肽的非注射给药的各种组合物、剂型的控释、缓释、速释剂型及药物组合物。
具体地，所述适合口服给药的科博肽片，其中主药高纯度科博肽含量140-560μg/片，其余辅料按片重计算：糊精1-15％；羟丙基甲基纤维素(HPMC)1-5％；低取代羟丙基纤维素(LHPC)2-16％；淀粉20-60％；糖粉12-36％；羧 甲基淀粉钠1-10；硬脂酸镁1-5％；微粉硅胶0.5-5％。
可选择的，所述适合口服给药的科博肽肠溶片，其中主药高纯度科博肽含量140-560μg/片，其余辅料按片重计算：糊精1-15％；羟丙基甲基纤维素(HPMC)1-5％；低取代羟丙基纤维素(LHPC)2-16％；淀粉20-60％糖粉12-36％；羧甲基淀粉钠1-10％；硬脂酸镁1-5％；微粉硅胶0.5-5％；肠溶包衣粉5-15％。
可选择的，所述适合直肠吸收的科博肽栓剂，其中主药高纯度科博肽含量70-560μg/栓，其余辅料按栓重计算：可可豆脂90-99.9％；聚山梨酯800.1-10％(V/W)。
可选择的，所述适合口腔吸收的科博肽口腔吸收片，其中主药高纯度科博肽含量70-560μg/片，其余辅料按片重计算：十二烷基硫酸钠0.1-4％微晶纤维素50-90％；阿斯帕坦2-8％；枸橼酸1-10％；羧甲基淀粉钠1-20％；聚维酮(PVP-K30)0.1-3％；微粉硅胶0.1-5％；硬脂酸镁0.1-5％。
本发明申请所述的技术方案具有以下的优点：
1、本发明申请所述的高纯度科博肽的提取方法，用此方法从眼镜蛇毒中提取的神经毒素和科博肽纯度达96％以上，常规可控纯度范围达98％-100％；神经毒蛋白含量在50％以上，进一步优选含量在70％-100％之间；
2.用此方法提取的科博肽具有如下特征：SDS-PAGE电泳显示一条带，与科博肽对照品一致；HPLC纯度检查峰面积积分达96％以上，进一步优选常规可控纯度范围达98％-100％，保留时间与科博肽对照品一致；神经毒蛋白含量在50％以上，进一步优选含量在70％-100％之间；蛋白质多肽质谱测定分子量为6953±35；眼镜蛇毒抗蛇毒血清鉴别试验显示沉淀线；
3.提取方法中设计的适用PH范围比较宽，工作的适用条件和方法的重现性比较好；每一分离步骤根据蛇毒的复杂成分、科博肽的分子大小、科博肽分子电荷等特异性质结合柱填料的层析特点进行的优选设计，克服了选择性差、杂蛋白共沉淀多、蛋白损失大的盐析、有机溶剂沉淀等方法对蛋白、多肽的变性缺点，最大程度的避免了在提取过程中蛋白、多肽变性的可能性，在保证产品纯度的前提下，提高了神经毒蛋白的总收率，节约了宝贵的生物资源，降低了生产总成本；
4.方法技术的关键点还在于各个不同机理层析步骤的有效组合，进一步各个层析步骤可以根据工作条件进行次序调整，更进一步每个步骤选择的层析填料SP、CM、DEAE等功能基团和连接功能基团的基质(例如Sephadex、Sepharose、Cellulose等)可以互换；
5.由此方法提取的高纯度科博肽除了满足注射用科博肽制剂的要求外，作为药物活性成分单独组方制成口服制剂具有明显的镇痛效果。实现的途径有：口服、直肠给药、口腔含服等，涉及的剂型有：片剂、肠溶片、直肠给药栓剂、口服含片、口腔吸收膜剂、口腔吸收速崩片等，以及上述给药方式的胶囊。进一步涉及上述给药方式的速释片、缓释片、控释片及胶囊等。
附图说明
图1 步骤2)中眼镜蛇毒粗毒SP sepharose FF柱层析图，其中箭头标注的是缓冲液盐梯度达到0.7mol/L NaCl的科博肽收集峰，紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：85ml/h；柱洗脱条件：PH 5.0盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl 50mmol/L的NaAC-HAC的缓冲液线性梯度洗脱；
图2 步骤5)高纯度科博肽的精制Sephadex G-50柱层析图，其中箭头标注的是当洗脱液洗脱至二分之一柱体积时的科博肽收集峰，紫外检测参数：0.2A 280nm 记录仪参数：200mv 2cm/h恒流泵流速：50ml/h；柱洗脱条件：PH 7.0盐浓度为0.2mol/L NaCl的10mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱；
图3 科博肽对照品的HPLC图，对照品购自中国药品生物制品检定所，保留时间t＝12.385min；
图4 高纯度科博肽样品1HPLC图，保留时间t＝12.429min，科博肽峰面积积分99.89％；
图5 高纯度科博肽SDS-PAGE电泳，从左至右电泳条带依次为：科博肽对照品、高纯度科博肽样品1、样品2、样品3；
图6 高纯度科博肽抗原抗体鉴别实验，箭头所指位置可见白色沉淀线依次相连成六角形白色沉淀圈；
图7 高纯度科博肽分子量质谱图，科博肽分子量为6953，从图可见科博肽分子量为6953，7051位置有一个小峰，丰度占比不超过2.0％，可能是科博肽分子与碎片的耦合体；
图8 市售样品1：市售注射用科博肽(140μg/支)HPLC图，保留时间t＝12.930min，科博肽峰面积积分91.90％；
图9 市售样品2：市售注射用科博肽(140μg/支)HPLC图；保留时间t＝12.973min，科博肽峰面积积分94.10％。
具体实施方式
以下结合具体的实施方案，对所述技术内容进行非限制性的描述，目的为了公众更好理解所述技术。
高纯度科博肽的提取
实施例1
1)取眼镜蛇毒粗毒(购自江西余江眼镜蛇养殖场)8克溶于80毫升PH 5.050mmol/L NaAC-HAC溶液中。充分溶解后低温离心(温度：0℃--10℃、转速：3600转/分、时间：30分钟)，取上清液，待上柱；
2)蛇毒上清液上Sp sepharose FF，用PH 5.050mmol/L NaAC-HAC盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl的缓冲液共计3000毫升进行线性盐梯度洗脱，待洗脱缓冲液盐梯度达到0.7mol/L NaCl时，按记录谱图收集科博肽组分，科博肽神经毒蛋白峰共320ml，层析结果见图1；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：85ml/h；将收集的科博肽液体用PH7.425mmol/L Tris-HCl缓冲液在4-10℃低温透析6小时，待上样；
3)将步骤2收集处理好的科博肽溶液上CM-52 Cellulose柱层析，用PH7.425mmol/L Tris-HCl盐梯度为0.0-0.5mol/L NaCl的缓冲液共计2000ml进行线性盐梯度洗脱，待洗脱缓冲液盐梯度达到0.25mol/L NaCl时，按记录谱图收集科博肽组分，收集科博肽神经毒蛋白峰共280ml；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：50ml/h；收集液用PH 6.0盐浓度0.05mol/L NaCl 10mmol/L的磷酸盐缓冲液在4-10℃低温透析6小时后待上样；
4)将步骤3)收集的科博肽液体280毫升上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用PH 6.0 10mmol/L盐梯度0.0-0.5mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液共计2000ml进行线性盐梯度洗脱，待洗脱缓冲液盐梯度达到0.20mol/L NaCl时收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集蛋白吸收值最大的峰共计220毫升； 设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：50ml/h；收集液用PH7.0，盐浓度为0.2mol/L NaCl的10mmol/L磷酸盐缓冲液在4-10℃低温透析6小时后，把透析好的收集液装入阻断分子量为5000的透析袋中，用聚乙二醇8000包埋浓缩至科博肽液体体积至30ml后待上样；
5)将步骤4)处理好的科博肽浓缩液上样Sephadex G-50柱层析，用PH7.010mmol/L含0.2mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，当洗脱液洗脱至二分之一柱体积时，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，收集主峰可得神经毒蛋白溶液180ml，层析结果见图2；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：50ml/h；
6)将步骤5)收集的180ml神经毒蛋白溶液依次用注射用水、0.15mol/L NaCl溶液在4-10℃低温透析6小时，透析完成后所得的科博肽组分溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌，再转移至冻干托盘中，在冷冻干燥机中在-40℃预冻3小时后开始抽真空冻干，冻干24小时后当制品温度达到25℃时继续保温4小时后冻干结束，冻干可得高纯度科博肽成品353mg；性状：白色粉末，样品经检测：福林酚法神经毒蛋白含量85.62％；SDS-PAGE电泳一条带，与科博肽对照品一致；HPLC纯度为99.89％，色谱峰保留时间与科博肽对照品相同；神经毒蛋白总收率3.78％。
实施例2
1)取眼镜蛇毒粗毒8克溶于80毫升PH 7.4 50mmol/L Tris-HCl溶液中。充分溶解后低温离心(温度：0℃--10℃、转速：3600转/分、时间：30分钟)，取上清液，待上柱；
2)蛇毒上清液上Sp sepharose FF，用PH 7.4 50mmol/L Tris-HCl盐梯度 为0.0-1.0mol/L NaCl的缓冲液共计3000毫升进行线性盐梯度洗脱，收集科博肽神经毒蛋白峰共305ml；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：85ml/h；
后续步骤同实施例1，冻干可得高纯度科博肽成品378mg，神经毒蛋白含量78.20％；SDS-PAGE电泳一条的，与科博肽对照品一致；HPLC纯度为99.32％，色谱峰保留时间与对照品相同；神经毒蛋白总收率3.69％。
实施例3
1)取眼镜蛇毒粗毒8克溶于80毫升PH 6.850mmol/LTris-HCl溶液中。充分溶解后低温离心(温度：0℃--10℃、转速：3600转/分、时间：30分钟)，取上清液，待上柱；
2)蛇毒上清液上Sp sepharose FF，用PH 6.8 50mmol/L Tris-HCl盐梯度为0.0-1.0mol/L NaCl的缓冲液共计3000毫升进行线性盐梯度洗脱，收集科博肽神经毒蛋白峰共337ml；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：85ml/h；
后续步骤同实施例1，冻干可得高纯度科博肽成品362mg，神经毒蛋白含量80.35％；SDS-PAGE电泳一条的，与科博肽对照品一致；HPLC纯度为98.96％，色谱峰保留时间与对照品相同；神经毒蛋白总收率3.64％。
实施例4
步骤1)、2)、3)同实施例1；
4)将收集到的科博肽溶液280ml装入透析袋中用聚乙二醇8000包埋浓缩至30ml，待上样；处理好的科博肽浓缩液上样Sephadex G-50柱层析，用PH 7.010mmol/L含0.2mol/L NaCl磷酸盐缓冲液洗脱，当洗脱液洗脱至二分之一柱体积时，收集记录谱图最大峰即科博肽组分，可得神经毒蛋白溶液230ml；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：50ml/h；收集液用PH 6.0盐浓度0.05mol/L NaCl 10mmol/L的磷酸盐缓冲液在4-10℃低温透析6小时后待上样；
5)将步骤4)收集的科博肽液体230毫升上样DEAE Sepharose FF阴离子柱层析，用PH 6.0 10mmol/L/L含0.0-0.5mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液共计2000ml进行线性盐梯度洗脱，待洗脱缓冲液盐梯度达到0.20mol/L NaCl时收集记录谱图的最大峰即科博肽组分，收集蛋白吸收值最大的峰共计190毫升；设备设定参数：紫外检测参数：0.2A 280nm；记录仪参数：200mv 2cm/h；恒流泵流速：50ml/h；收集的190ml神经毒蛋白溶液依次用注射用水、0.15mol/L NaCl溶液在4-10℃低温透析6小时，透析完成后所得的科博肽组分溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌，再转移至冻干托盘中，在冷冻干燥机中在-40℃预冻3小时后开始抽真空冻干，冻干24小时后当制品温度达到25℃时继续保温4小时后冻干结束，冻干可得高纯度科博肽成品356mg，神经毒蛋白含量83.92％；SDS-PAGE电泳一条带，与科博肽对照品一致；HPLC纯度为99.56％，色谱峰保留时间与对照品相同；神经毒蛋白总收率3.73％。
以科博肽为主要成分的不同剂型的药物组合物
实施例5
科博肽注射液(规格2ml：70μg/支)

取处方量的磷酸盐各加注射用水至500ml搅拌溶解后，两种磷酸盐溶液混合备用；取处方量的药用氯化钠加适量注射用水溶解，加入上述备用的磷酸盐混匀，加注射用水至4000ml，加入处方量的药用活性炭，搅拌吸附30分钟，用0.22μm滤膜过滤，将此溶液分装于磨口瓶封口，进行110℃灭菌30分钟，取出后降温至室温加入处方量的科博肽，充分溶解后定容至4000ml，药液进行除菌过滤，取样送检含量，合格后按2ml/支灌装到2R西林瓶中，压塞、轧盖、贴签备用。
实施例6
科博肽片(规格280μg/0.25g片)


所有辅料均过80目筛，把糊精、糖粉、淀粉、LHPC等充分混匀待用；将羟丙基甲基纤维素(HPMC)制成4％(W/V)溶液125毫升，把科博肽溶于HPMC液中，以这个溶液为粘合剂和预混的辅料混合作软材，制湿颗粒，45℃干燥整粒后过16目筛，加入处方量的硬脂酸镁、微粉硅胶及羧甲基淀粉钠进行压片。
实施例7
科博肽肠溶片(规格280μg/0.25g/素片)


所有辅料均过80目筛，把糊精、糖粉、淀粉、LHPC等充分混匀待用；将羟丙基甲基纤维素(HPMC)制成4％(W/V)溶液125毫升，把科博肽溶于HPMC液中，以这个溶液为粘合剂和预混的辅料混合作软材，制湿颗粒，45℃干燥后整粒过16目筛，加入处方量的硬脂酸镁、微粉硅胶及羧甲基淀粉钠进行压片。
包衣：
肠溶包衣粉20克增重8％溶剂80％乙醇固物含量10％(W/V)
压片后素片用有孔包衣机，使用20克肠溶包衣粉包薄膜衣，片增重8％，溶剂用80％乙醇，包衣液200毫升固物含量10％(W/V)。
实施例8
科博肽直肠吸收栓剂(规格140μg/2g栓)

取配方量的可可豆脂在45℃水浴上熔化，把配方量的科博肽溶于20ml注射用水中与聚山梨酯80混合均匀，加入上述熔化的可可豆脂基质中，保温缓慢搅拌均匀后，保温灌模，冷凝后取出即得。
注：由于科博肽含量很小，科博肽的置换价f＝1
f＝W/[G-(M-W)]
G-空白纯基质栓平均重量
M-含药栓的平均栓重
W-含药栓的平均含药量
需要的基质量X＝(G-W/f)n n-栓剂枚数
为促进科博肽的释放和吸收，根据科博肽的水溶性性质，选择油脂性基质可可豆脂；选择表面活性剂聚山梨酯80。
实施例9
科博肽口腔吸收片剂(规格140μg/0.1g/片)

所有辅料均过80目筛，把十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、阿斯帕坦、枸橼酸及50％配方量的羧甲基淀粉钠充分混匀待用；将PVP制成6％(W/V)溶液25毫升，把科博肽溶于PVP液中，以这个溶液为粘合剂和预混的辅料混合作软材，制湿颗粒，45℃干燥后整粒过24目筛，加入处方量的硬脂酸镁、微粉硅胶及剩余50％羧甲基淀粉钠进行压片。
实验例
本发明申请所述方法得到的高纯度科博肽神经毒蛋白含量和纯度，如下方法测定：
一、神经毒蛋白含量测定：
按科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)规定的方法，取科博肽适量，加水制成每1ml中含约0.6mg蛋白的溶液，精密量取1.0ml，照药典附件“福林酚测定法”测定，从回归曲线中求得供试品中的蛋白含量，结果见表一。
表一科博肽神经毒蛋白含量和纯度

市售样品1、市售样品2的HPLC图及纯度数据结果分别见图8、图9。
从表一可以看出，用本发明提供的方法提取的高纯度科博肽样品1、样品2、样品3，神经毒蛋白含量和HPLC纯度％明显高于市售样品1和2，这意味着相同规格的科博肽药品中所含与治疗作用无关的其他物质含量较低，这有助于保证药品质量和疗效，缩短药物在体内的起效时间、减少药物副作用。
二、科博肽的纯度检查：
1.HPLC纯度检查：按科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)规定的方法，取科博肽适量加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中含0.3mg的溶液，作为供试品溶液，照药典规定的高效液相色谱法试验，以辛基硅烷键合硅胶为填充料(4.6mm×150mm)，以0.1％三氟醋酸溶液为流动相A，三氟醋酸-50％乙腈溶液(1∶1000)为流动相B；柱温36℃，流速为每分钟1ml；检测波长为214nm；洗脱初始状态流动相B为8％，保持4分钟，在12分钟内，流动相B增至100％，保持6分钟，再在6分钟内回到初始状态，保持10分钟。理论塔板数按神经毒蛋白的峰计算应大于3000。
取供试品溶液50μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。在3-22分钟范围内按峰面积归一化法计算，主峰相对百分含量不得少于90.0％。HPLC纯度检查结果见图3、图4。
2.SDS-PAGE电泳检查：分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为3.9％。取科博肽对照品(购自中国药品生物制品检定所)和高纯度科博肽样品适量，加供试品缓冲液制成每1μl中含1μg蛋白的供试品溶液。临用前置沸水浴中5分钟，冷却后在电泳凝胶板上样孔中上样10-30μl，在200伏电压下电泳。电泳完成后，经过固定、考马斯亮蓝染色、脱色得到电泳胶版，拍照保存，电泳结果见图5。
科博肽HPLC纯度检查是依据科博肽分子的极性，SDS-PAGE电泳检查是 依据科博肽分子的大小。从两种不同机理的科博肽样品纯度检查结果可以看出，使用本申请提供的高纯度科博肽提取方法提取的科博肽纯度高，得到的科博肽HPLC纯度介于96％-100％之间，这对于保证科博肽制剂的质量、保证药品疗效提供了根本保障。
三、科博肽的鉴别实验：
1.SDS-PAGE电泳：从图5可以看出高纯度科博肽样品1、样品2、样品3的电泳区带与科博肽对照品的电泳区带一致。
2.HPLC鉴别：从图3、图4、可以看出，HPLC纯度检查中，科博肽对照品的HPLC保留时间和高纯度科博肽样品的HPLC保留时间一致。
3.抗原抗体沉淀线鉴别试验：按科博肽国家药品标准(WS1-XG-009-2000)规定的方法，取眼镜蛇抗蛇毒血清(上海赛伦生物制品有限公司眼镜蛇抗蛇毒血清1000U/10ml)分别用0.9％NaCl溶液制成50U/ml和25U/ml的溶液。取高纯度科博肽样品适量，加0.9％NaCl溶液制成1ml含0.15mg的溶液作为供试品溶液。取琼脂糖1.5克用100毫升0.9％NaCl溶液加热溶解，铺板(140mm培养皿)制成平板。待平板冷至室温在平板中心打孔，(孔直径4mm，孔间距5mm)加入供试品溶液，在中心孔周围再打6个孔，间隔加入两种稀释度的眼镜蛇抗蛇毒血清。把平板置37℃恒温24～48小时。供试品(科博肽样品)与两种稀释度的眼镜蛇抗蛇毒血清之间出现白色沉淀线，结果见图6。
在神经毒素和科博肽的提取过程中，保持其原有的生物活性和分子立体构象、分子大小极为重要，它直接关系到产品的杂物质含量多少、纯度、产率等方面，SDS-PAGE电泳、HPLC鉴别和抗原抗体沉淀线鉴别试验分别从多肽分子大小、分子极性和抗原性等理化指标和科博肽对照品进行了全面比较，用本专利 提供的方法提取的高纯度科博肽上述性质与对照品完全一致，说明本专利提供的高纯度科博肽提取方法，对于保证产品质量和生物抗原性，进一步保证产品总收率的优势。
四、科博肽分子质量的质谱测定：
MALDI-TOF(基质辅助激光解吸离子化质谱)，是采用软电离方式测定生物大分子量的先进质谱分析手段，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点(MALDI-TOF的准确度高达99.9％～99.99％)，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术；它也可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。高纯度科博肽MALDI-TOF质谱测定结果见图7，分子量为6953±35，从质谱图中可以看出样品纯度接近100％。
本申请提供的高纯度科博肽提取方法的神经毒蛋白总收率测定
表二科博肽各种提取方法的神经毒蛋白总平均收率
提取方法总收率(科博肽mg/粗毒mg×％)本申请提取方法3.72％硫酸铵沉淀→层析2.54％硫酸钠沉淀→层析2.65％乙醇沉淀法→层析1.69％
为了便于比较，实验设定：使用同批次均质眼镜蛇毒粗毒，层析目标蛋白纯度至少达到HPLC纯度96％以上，按照方法验证原则，每种方法连续生产三批，根据得到的总蛋白量计算产率，再取平均值。
眼镜蛇毒是一种稀缺的生物资源，随着蛇毒应用研究的深化和推广及自然生态环境的逐年恶化，蛇毒的价格也逐年提高；在蛇毒产品的生产过程中，蛇毒的成本占了相当大的比重。在蛇毒产品的提取过程中，提取工艺对蛋白变性影响最小、工艺适应性强、总蛋白收率高等几项指标体现了工艺技术水平的先进程度和经济性。从表二可以看出，在相同的层析条件下，本申请提供的高纯度科博肽的提取方法，神经毒蛋白提取总平均收率明显高于其他方法。
五、高纯度科博肽镇痛效果试验：采用醋酸扭体法
原理：小鼠腹腔注射一定容积和浓度的化学物质(醋酸或盐水等)，由于刺激腹膜而致小鼠出现腹部收缩内凹、躯干与后肢伸张、臂部高举等扭体反应。镇痛药可抑制这种反应。
方法：每个剂量组10只昆明小鼠，雌雄各半，18-22克，通过不同给药途径给予小鼠实验药物，给药一定时间后(如30分钟)给小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml造模，小鼠会发生扭体反应。
空白组尾静脉注射0.9％氯化钠注射液0.2ml/只，给药组尾静脉注射按给药剂量用0.9％氯化钠注射液配制好的科博肽药液0.2ml。给药后在选定的时间点(如30分钟、2小时、4小时等)造模，对空白组、用药组的每只动物腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只。造模后观察记录15分钟内各组小鼠的扭体次数，镇痛效果可用扭体抑制率表示。
抑制率％＝(空白组平均扭体次数-用药组平均扭体次数)/空白组平均扭体次数×100％
六、不同剂量科博肽小鼠扭体实验镇痛效果
空白组小鼠尾静脉注射0.2ml/只生理盐水，给药组小鼠尾静脉注射0.2ml/只用生理盐水配制的不同剂量的高纯度科博肽药液。给药后30分钟给小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只造模，观察记录空白组和给药组15分钟内受试小鼠的扭体次数。
表三不同剂量科博肽对小鼠扭体实验镇痛效果(n＝10)

从表三中数据可以看出，高纯度科博肽在高中低三个不同剂量组均显示有镇痛效果，且镇痛作用与用药剂量呈正相关性，观察到的镇痛起效时间为30min。
七、科博肽小鼠扭体试验镇痛效果时效性研究
空白组小鼠尾静脉注射0.2ml/只生理盐水，给药组小鼠尾静脉注射按给药剂量6μg/kg用生理盐水配制的科博肽药液0.2ml/只，按给药后时间30分钟、2小时、4小时、16小时分别造模观察记录小鼠扭体次数。
表四科博肽小鼠扭体试验给药后镇痛效果维持时间(n＝10)

从表四可以看出，小鼠给药后30分钟具有明显的镇痛效果(与表三相同)，给药4小时后药效最强，镇痛药效维持时间达16小时之久。
与下表文献报道数据相比较高纯度科博肽起效时间明显缩短。
表1 CNT对醋酸致小鼠扭体的抑制作用
Table 1 Inh ibitory effect of cobra neurotox in on the writhing re-sponse in m ice induced by acetic a cid

Compared with CNT2：*P＜0.05；compared with CNT3：**P＜0.01
朱天新，袁彩君，任晚琼.眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究[J].华西药学杂志，2007，22(3)：247～249.
以上数据与既往的神经毒素研究数据、科博肽的药效数据比较，药效达峰时间和药效维持时间基本保持一致；不同的是，实验动物给药后30分钟内起效， 而过去普遍认为科博肽起效时间慢，需要给药1-2个小时后起效，有些病人甚至给药1-2天后才起效；镇痛药的起效时间快慢是一项重要的疗效评价指标，可以推论，神经毒蛋白含量较高的高纯度科博肽单位剂量内药物有效成分更多，有助于血药浓度的迅速提高，也有助于科博肽镇痛作用的快速起效。
八、科博肽口服给药镇痛效果研究
试验方法同上(醋酸扭体试验)，给药途径改为小鼠灌胃给药，灌药量为0.2ml/只，剂量如表五所示，用生理盐水配制不同剂量科博肽药液。给药后30分钟给小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只造模，观察记录15分钟内受试小鼠的扭体次数。
表五科博肽口服给药镇痛效果试验(n＝10)
组别动物数(只)扭体次数扭体抑制率％空白1028.00±5.32 12μg/kg1015.67±2.9644.04％24μg/kg1013.17±2.6552.96％48μg/kg1010.83±2.1261.32％
从表五可以看出，三个剂量组扭体抑制率呈剂量正相关，三个剂量组均显示明显的镇痛效果，且镇痛起效时间在给药后30分钟内，说明高纯度科博肽药物镇痛起效时间较以往研究、观察的起效时间大大缩短，且单独组方作为口服镇痛药依然有效。
应该理解的是，上述内容并不对本发明申请所要求保护的技术方案有任何限制，事实上，凡以相同或近似原理对所述药物组合物的各种成分进行的改变或替换，都在本发明申请所要求的技术内容之内。