从间充质细胞制备棕色脂肪组织BAT.pdf

本发明描述了制备功能性人棕色脂肪细胞的方法，所述方法包括：将人干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞暴露于使用分化混合液的培养，所述分化混合液包含一种或多种棕化剂(例如，一种或多种大分子拥挤剂)和任选的一种或多种脂肪形成剂，描述了通过所述方法制备的人棕色脂肪细胞群以及所述群的用途。还描述了在个体中制备功能性人棕色脂肪细胞的方法，诸如施用包含分化混合液的药物组合物。

权利要求书
1.  一种从人干细胞或祖细胞制备功能性人棕色脂肪细胞的方法，所述方法包括：用包含一种或多种脂肪形成剂和一种或多种棕化剂的分化混合液培养所述细胞，其中所述细胞由此分化成功能性人棕色脂肪细胞。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述人干细胞或祖细胞源自间充质或中胚层谱系。

3.  根据权利要求1所述的方法，其中所述人干细胞或祖细胞衍生自能够从间充质或中胚层谱系分化成细胞的细胞。

4.  根据权利要求1所述的方法，其中所述人干细胞或祖细胞包含选自以下的细胞：脂肪衍生的干细胞、人胚胎干细胞(HES)、诱导的多能干细胞(iPS)、人骨髓间充质干细胞(hbmMSC)、前脂肪细胞和存在于脂肪组织或骨骼肌中的祖细胞。

5.  根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种脂肪形成剂选自：胰岛素、糖皮质激素或合成的等效物、cAMP增强子和维生素C。

6.  根据权利要求1所述的方法，其中所述棕化剂包含一种或多种大分子拥挤剂。

7.  根据权利要求6所述的方法，其中所述棕化剂还包含选自以下的试剂：甲状腺激素、PPARγ受体激动剂、骨形态发生蛋白、类视色素、心利钠肽、肌因子、成纤维细胞生长因子、微RNA、催乳激素、胰岛素样生长因子、食欲素、胆汁酸、一氧化氮、超乙酰化剂、低甲基化剂、前列腺素、PPARα配体、TLQP-21、源自脑的神经营养因子、瘦素、β-肾上腺素能激动剂、AMPK活化剂、capaisin或其类似物、墨角藻黄素、2-羟基油酸、白藜芦醇、缀合的亚油酸、海洋起源的n-3脂肪酸、扇贝壳粉末和防风通圣散。

8.  根据权利要求7所述的方法，其中所述棕化剂包含PPARγ受体激动剂，所述PPARγ受体激动剂为选自罗格列酮、环格列酮、吡格列酮、达格列酮和曲格列酮的噻唑烷二酮。

9.  根据权利要求1所述的方法，其中所述大分子拥挤剂包含：
(a)有机基亲水大分子，所述有机基亲水大分子具有50kDa至500kDa 的分子量和中性表面电荷；
(b)有机基亲水大分子，所述有机基亲水大分子具有2-50nm的半径范围和中性或负表面电荷；或
(c)2种或更多种在(a)和/或(b)中描述的有机基亲水大分子的混合物。

10.  根据权利要求9所述的方法，其中一种或多种所述有机基亲水大分子是基于碳水化合物的亲水大分子。

11.  根据权利要求9所述的方法，其中一种或多种所述有机基亲水大分子是葡萄糖和/或蔗糖的聚合物。

12.  根据权利要求10所述的方法，其中一种或多种所述有机基亲水大分子选自：中性的或衍生的葡聚糖；果聚糖；左聚糖；糖胺聚糖；及其混合物。

13.  根据权利要求1所述的方法，其中所述大分子拥挤剂包含：
(a)至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷；
(b)至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和中性表面电荷的有机基亲水大分子；或
(c)至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和负表面电荷的有机基亲水大分子。

14.  根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括，通过包括以下步骤的方法证实所述人棕色脂肪细胞的功能性：
a)用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂和/或升高cAMP的细胞内水平的化合物刺激所述人棕色脂肪细胞，和
b)定量一种或多种选自以下的活性：所述人棕色脂肪细胞的UCP1基因/蛋白的表达；线粒体生物发生；氧耗量；解偶联的呼吸；葡萄糖摄取；脂解；和燃料代谢，
其中在以下情况下证实所述人棕色脂肪细胞的功能性：与在没有用所述特异性的β-肾上腺素能受体激动剂和/或升高cAMP的细胞内水平的化合物模拟存在下得到的可比较测量结果相比，所述人棕色脂肪细胞的UCP1基因/蛋白 的表达、线粒体生物发生、氧耗量、解偶联的呼吸、葡萄糖摄取、脂解、或燃料代谢增加。

15.  根据权利要求14所述的方法，其中使用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂，且所述激动剂选自异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴酚丁胺、特布他林、化合物CL316243和异丙肾上腺素。

16.  根据权利要求15所述的方法，其中使用升高cAMP的细胞内水平的化合物，且所述化合物选自二丁酰基-cAMP、8-CPT-cAMP、8-溴-cAMP、二辛酰基-cAMP、吲哚美辛、IBMX和福司柯林。

17.  一种从人白色脂肪细胞制备功能性人棕色脂肪细胞的方法，所述方法包括：用包含一种或多种棕化剂的分化混合液培养所述细胞，所述一种或多种棕化剂包含一种或多种大分子拥挤剂，其中所述细胞由此分化成功能性人棕色脂肪细胞。

18.  根据权利要求17所述的方法，其中所述分化混合液还包含选自以下的脂肪形成剂：胰岛素、糖皮质激素或合成的等效物、cAMP增强子和维生素C。

19.  根据权利要求17所述的方法，其中所述棕化剂还包含选自以下的试剂：甲状腺激素、PPARγ受体激动剂、骨形态发生蛋白、类视色素、心利钠肽、肌因子、成纤维细胞生长因子、微RNA、催乳激素、胰岛素样生长因子、食欲素、胆汁酸、一氧化氮、超乙酰化剂、低甲基化剂、前列腺素、PPARα配体、TLQP-21、源自脑的神经营养因子、瘦素、β-肾上腺素能激动剂、AMPK活化剂、capaisin或其类似物、墨角藻黄素、2-羟基油酸、白藜芦醇、缀合的亚油酸、海洋起源的n-3脂肪酸、扇贝壳粉末和防风通圣散。

20.  根据权利要求17所述的方法，其中大分子拥挤剂包含：
(a)有机基亲水大分子，所述有机基亲水大分子具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷；
(b)有机基亲水大分子，所述有机基亲水大分子具有2-50nm的半径范围和中性或负表面电荷；或
(c)2种或更多种在(a)和/或(b)中描述的有机基亲水大分子的混合物。

21.  根据权利要求20所述的方法，其中一种或多种所述有机基亲水大分 子是基于碳水化合物的亲水大分子。

22.  根据权利要求20所述的方法，其中一种或多种所述有机基亲水大分子是葡萄糖和/或蔗糖的聚合物。

23.  根据权利要求20所述的方法，其中一种或多种所述有机基亲水大分子选自：中性的或衍生的葡聚糖；果聚糖；左聚糖；糖胺聚糖；及其混合物。

24.  根据权利要求17所述的方法，其中大分子拥挤剂包含：
(a)至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷；
(b)至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和中性表面电荷的有机基亲水大分子；或
(c)至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和中性表面电荷和负表面电荷的有机基亲水大分子。

25.  根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括，通过包括以下步骤的方法证实所述人棕色脂肪细胞的功能性：
a)用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂和/或升高cAMP的细胞内水平的化合物刺激所述人棕色脂肪细胞，和
b)定量一种或多种选自以下的活性：所述人棕色脂肪细胞的UCP1基因/蛋白的表达；线粒体生物发生；氧耗量；解偶联的呼吸；葡萄糖摄取；脂解；和燃料代谢，
其中在以下情况下证实所述人棕色脂肪细胞的功能性：与在没有用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂和/或升高cAMP的细胞内水平的化合物模拟存在下得到的可比较测量结果相比，所述人棕色脂肪细胞的UCP1基因/蛋白的表达、线粒体生物合成、氧耗量、解偶联的呼吸、葡萄糖摄取、脂解、或燃料代谢增加。

26.  根据权利要求25所述的方法，其中使用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂，且所述激动剂选自异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴酚丁胺、特布他林、化合物CL316243和异丙肾上腺素。

27.  根据权利要求25所述的方法，其中使用升高cAMP的细胞内水平的化合物，且所述化合物选自二丁酰基-cAMP、8-CPT-cAMP、8-溴-cAMP、二辛酰基-cAMP、吲哚美辛、IBMX和福司柯林。

28.  通过根据权利要求1所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群。

29.  通过根据权利要求1所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群作为筛选平台的用途，所述筛选平台鉴别这样的试剂：所述试剂能够通过活化所述棕色脂肪细胞的产热程序而改变个体的代谢活性。

30.  通过根据权利要求1所述的方法制备的功能性人棕色脂肪细胞群用于基于自体细胞的疗法的用途，所述疗法将棕色脂肪组织引入个体中用于代谢疾病的临床治疗。

31.  通过根据权利要求17所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群。

32.  通过根据权利要求17所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群作为筛选平台的用途，所述筛选平台鉴别这样的试剂：所述试剂能够通过促进白色脂肪细胞至棕色脂肪细胞转分化而改变个体的代谢活性。

33.  通过根据权利要求17所述的方法制备的功能性人棕色脂肪细胞群用于基于自体细胞的疗法的用途，所述疗法将棕色脂肪组织引入个体中用于代谢疾病的临床治疗。

34.  一种在个体中产生功能性人棕色脂肪细胞的方法，所述方法包括：给所述个体施用包含分化混合液的药物组合物。

35.  根据权利要求34所述的方法，其中所述药物组合物包含用分化混合液浸渍的生物材料。

36.  根据权利要求34所述的方法，其中所述药物组合物包含选自以下的介质：水凝胶、电旋转网、纳米颗粒和微粒。

37.  通过根据权利要求1所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群作为筛选平台的用途，所述筛选平台鉴别这样的试剂：所述试剂能够通过促进人干细胞或祖细胞至棕色脂肪细胞的分化而改变个体的代谢活性。

38.  通过根据权利要求17所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群作为筛选平台的用途，所述筛选平台鉴别这样的试剂：所述试剂能够通过促进人干细胞或祖细胞至棕色脂肪细胞的分化而改变个体的代谢活性。

说明书从间充质细胞制备棕色脂肪组织(BAT)
相关申请
本申请要求2012年3月12日提交的美国临时申请号61/609,456的权益。上述申请的整个教导通过引用并入本文。
背景技术
超过10亿成年人是超重或肥胖的BMI，且超过1.5亿成年人具有糖尿病，其中的大多数是由肥胖相关的胰岛素抗性驱动的II型糖尿病，综述见Cypess,A.M.和Kahn,C.R.,Curr.Opin.Endocrin.Diabetes&Obesity 17,143-149(2010)。25％的美国儿童现在也是超重或肥胖的，从而导致II型糖尿病在该先前未受影响的群体中的出现。预期这些数字会在世界范围内在2025年之前再增加超过半数，在欠发达国家中具有特别严重的影响。新加坡健康促进委员会(HPB)披露，新加坡的肥胖率已经从2004年的6.9％增加至10.8％。在45个亚太国家中的23个中，糖尿病在2025年之前将影响>10％的人口；中国：2400万>2007年的2000万——预测在2025年为4700万；印度；14％，从3600万增加至7300万；新加坡：30％(International Diabetes Federation 2009)。
发明内容
本发明涉及通过用分化混合液培养细胞来从人干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞制备功能性人棕色脂肪细胞的方法。当使用干细胞或祖细胞时，所述分化混合液包含一种或多种棕化剂(browning agent)(例如，大分子拥挤剂(macromolecular crowder))和一种或多种脂肪形成剂；当使用白色脂肪细胞时，所述分化混合液包含一种或多种棕化剂和任选的一种或多种脂肪形成剂。代表性的干细胞和祖细胞包括：从间充质或中胚层谱系衍生出的那些，以及能够分化成这样的细胞的那些。在某些实施方案中，所述细胞包含脂肪衍生的干细胞、人胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、人骨髓间充质干细胞、前脂肪细胞 或存在于脂肪组织或骨骼肌中的祖细胞。如果使用白色脂肪细胞，所述分化混合液由棕化剂和任选的脂肪形成剂组成。
在其中所述分化混合液包含一种或多种脂肪形成剂的实施方案中，所述脂肪形成剂可以包含一种或多种试剂诸如胰岛素、糖皮质激素或合成的等效物(例如，地塞米松)、cAMP增强子诸如吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和维生素C。
所述棕化剂可以包含大分子拥挤剂，且任选地还可以包括下述的一种或多种：甲状腺激素(例如三碘甲腺原氨酸)、PPARγ受体激动剂、骨形态发生蛋白(例如BMP7)、类视色素(例如视黄酸)、心利钠肽、肌因子(myokine)(例如鸢尾素)、成纤维细胞生长因子(例如FGF 21、FGF 2)、微RNA(例如mir193b-165)、催乳激素(例如催乳素)、胰岛素样生长因子(例如IGF-2)、食欲素、胆汁酸、一氧化氮、超乙酰化剂、低甲基化剂、前列腺素、PPARα配体、TLQP-21、源自脑的神经营养因子、瘦素、β-肾上腺素能激动剂、AMPK活化剂、辣椒素或其类似物、墨角藻黄素、2-羟基油酸、白藜芦醇、缀合的亚油酸、海洋起源的n-3脂肪酸、扇贝壳粉末(有机相)和/或防风通圣散(bofutsushosan)。在一个特定实施方案中，所述棕化剂包含PPARγ受体激动剂，其为选自罗格列酮、环格列酮、吡格列酮、达格列酮和曲格列酮的噻唑烷二酮。在另一个特定实施方案中，所述棕化剂是罗格列酮或三碘甲腺原氨酸(T3)。
大分子拥挤剂可以包括一种或多种有机基亲水大分子(例如，基于碳水化合物的大分子)，诸如葡萄糖和/或蔗糖的聚合物。如果需要的话，所述有机基亲水大分子可以是中性的或衍生的(硫酸化的、乙酰化的、甲基化的)葡聚糖；果聚糖；左聚糖(levan)；糖胺聚糖；和/或它们的混合物。
在某些实施方案中，所述大分子拥挤剂可以包含：有机基亲水大分子，其具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷；有机基亲水大分子，其具有2-50nm的流体动力学半径范围和中性或负表面电荷；或它们的混合物。在其它实施方案中，所述大分子拥挤剂可以包含：至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷；至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷， 以及第三类具有2-50nm的半径范围和中性表面电荷的有机基亲水大分子；和/或至少两类有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和负表面电荷的有机基亲水大分子。
可以如下证实通过本文所述的方法制备的人棕色脂肪细胞的功能性：刺激所述脂肪细胞(例如，用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂诸如异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴酚丁胺、特布他林、化合物CL316243或异丙肾上腺素；或用升高cAMP的细胞内水平的化合物诸如二丁酰基-cAMP、8-CPT-cAMP、8-溴-cAMP、二辛酰基-cAMP、吲哚美辛、IBMX或福司柯林)，然后定量一种或多种活性，诸如基因/蛋白的表达、线粒体生物发生、氧耗量、解偶联的呼吸、葡萄糖摄取、脂解、燃料代谢或指示代谢活性增加的任意其它参数、热产生或脂肪细胞的其它特征，并证实所述人棕色脂肪细胞的特征是在期望的参数内。
本发明还涉及通过这样的方法制备的人棕色脂肪细胞群。所述群可以用作例如筛选平台以鉴别这样的试剂：其可用于改变个体的代谢活性(例如，通过促进白色脂肪细胞至棕色脂肪细胞转分化，或通过促进干细胞或祖细胞分化成棕色脂肪细胞)，以及用于基于自体细胞的疗法和在个体中产生功能性人棕色脂肪细胞的方法。另外，本文描述的分化混合液可以用在药物组合物中。例如，对于用分化混合液浸渍的生物材料而言，或对于包括生物材料、水凝胶、电旋转网、纳米或微米颗粒在内的其它材料而言，可以用于在个体中产生棕色脂肪细胞。
附图说明
图1描绘了人类中的棕色脂肪组织的活化。β3-肾上腺素能受体的刺激会借助于2型5'去碘酶(DIO2)导致三碘甲腺原氨酸(T3)的细胞内浓度的急剧增加；T3又会刺激解偶联蛋白1(UCP1)的转录，所述UCP1造成质子从线粒体的内膜渗漏，因此以热的形式消散能量。cAMP＝环腺苷一磷酸，CRE＝cAMP应答元件，TRE＝甲状腺激素应答元件。图得自Celi F.N Engl J Med.2009。
图2描绘了与成年人中的分布相比，棕色脂肪组织(BAT)在人新生儿中的 分布。2(A)婴儿中的BAT位于肩胛间、肾周、纵隔以及锁骨上面和下面的颈区域中。2(B)经由高葡萄糖摄取的FDG-PET突出显示区域，在冷攻击的成年人中的BAT的示意图，一种最初用于检测肿瘤的方法。图得自Nedergaard等人.Am J Physiol Endocrinol Metab.2007。
图3描绘了去细胞化的基质的盐洗脱液的ELISA分析，其指示MMC会使被隔离进基质中的FGF2的量增加30倍，尽管对于IGF1而言没有明显变化(n＝3；误差棒是±标准差；**P<0.01)。
图4证实，脂肪细胞衍生的ECM会诱导MSC表达脂肪生成的表现遗传标记。在没有(-)和有(+)大分子拥挤(MMC)存在下，脂肪形成地分化的MSC(adip)会沉积ECM；然后将去细胞化的和新鲜未分化的MSC接种在这些基质上。基因PDRM 16上的2个基因座的CpG甲基化的Sequenome分析揭示了，与化学诱导的那些相比，已经在脂肪细胞基质上培养的细胞中所发生的类似甲基化模式(n＝3；误差棒是±标准差；**P<0.01)。
图5指示，单独的大分子拥挤可以刺激脂肪形成地诱导的间充质的基质细胞(MSC)中的UCP1mRNA表达。5(a)：使用白色诱导方案(Iw+MMC)的拥挤已经诱导了UCP1的10倍增加；而与棕色诱导方案(Ib+MMC)一起，UCP1表达增加了23倍。没有大分子拥挤剂的单独棕色诱导方案不会显著增加UCP1表达。应当指出，与Ib(-BMP7)组相比，仅BMP7(Ib组)不大地增加UCP1表达，从而指示，BMP7在分化过程中可能不是关键性的(n＝3；误差棒是±标准差；*P<0.05**P<0.01)。
图6指示，在棕色诱导方案下的大分子拥挤会在福司柯林刺激4小时以后诱导产热基因的大量向上调节。与没有MMC和福司柯林刺激的经典白色诱导方案相比。6(A)UCP1mRNA表达增加了数百倍。6(B)PGC-1α35倍(C)DIO26倍(与图1相比)(n＝3；误差棒是±标准差；*P<0.05**P<0.01)。
图7描绘了白色和棕色脂肪形成地诱导的间充质干细胞的福司柯林处理的结果，其导致脂质沉着物的排空。使用生物成像站定量的MSC的尼罗红含量显示了表达为μm2的尼罗红阳性区域，并关于细胞数目标准化。条件：C＝未诱导的对照；Iw＝白色诱导方案；Ib＝棕色诱导方案(n＝3；误差棒是±标准差；**P<0.01)。
图8指示，白色和棕色脂肪形成地诱导的间充质干细胞的异丙肾上腺素处理会导致脂滴的排空。异丙肾上腺素对在BAT诱导方案下已经分化的脂肪细胞产生更强的脂肪分解作用(n＝3；误差棒是±标准差；*P<0.05)。
图9证实，大分子拥挤会促进MSC衍生的脂肪细胞的白色-至-棕色转化。使用标准白色诱导方案(Iw)诱导MSC分化3周成为白色脂肪细胞，然后用棕色诱导方案±MMC(Ib或Ib mmc)诱导接下来的3周。将成熟的白色脂肪细胞(在3周时)暴露于具有拥挤的棕色诱导方案另外3周(周0-3:Iw；周4-6:Ib mmc)，会表现出与仅仅单独棕色诱导方案(周0-3:Iw；周4-6:Ib)相比35.7倍的UCP1向上调节，所述单独棕色诱导方案仅具有6.5倍的UCP1向上调节(n＝2；误差棒是±标准差；**P<0.01)。
图10描绘了脂肪形成分化的代表性时间线。
具体实施方式
本发明涉及使用包含一种或多种脂肪形成剂和一种或多种棕化剂(例如，一种或多种大分子拥挤剂)的分化混合液从人干细胞或祖细胞(诸如从间充质祖细胞/干细胞/基质细胞)制备功能性人棕色脂肪细胞的方法，以及涉及如本文中所述的分化混合液。本发明也涉及使用包含一种或多种棕化剂(例如，一种或多种大分子拥挤剂)和任选的一种或多种脂肪形成剂的分化混合液使白色脂肪细胞转分化成棕色脂肪细胞的方法，以及涉及这样的分化混合液。
所有细胞的微环境的特征是大分子的高总浓度。这样的介质被称作“拥挤的”而不是“浓缩的”，因为一般而言，没有单一大分子物质在高浓度存在，但是一起会发生给定的特定体积的20-30％的体积占据。如Ellis(Ellis,RJ,Trends Biochem Sci,26(10):597-604(2001))和Minton(Minton,AP,Curr Biol,10(3):R97-9(2000))指出的，大分子拥挤对通常不被赏识的其它大分子的性能具有热力学和动力学作用。生物大分子(诸如酶)已经进化成在这样的拥挤环境内部起作用。例如，在细菌(如大肠杆菌)内的蛋白和RNA的总浓度是在300-400g/l的范围内。大分子拥挤会造成体斥效应(EVE)，因为拥挤试剂的最基本特征是所有溶质分子的相互不可入性。该非特异性的空间排斥总是存在，不论在溶质分子之间是否可能发生任意其它吸引性或排斥性相互作用。因而， 拥挤是地球上所有基于碳的生命形式的细胞内环境的必然标志(综述在Ellis,RJ,Trends Biochem Sci,26(10):597-604(2001))。由大分子拥挤引起的效应是如此大，以致于本领域的权威声称，酶催化的反应速率的许多估测和试管中的非拥挤溶液产生的平衡与在细胞内在拥挤条件下运行的相同反应的相应值相差几个数量级(Ellis,RJ,Trends Biochem Sci,26(10):597-6042001)。
尽管具有该知识，生物化学家仍然通常在溶液中研究酶反应，所述溶液具有1-10g/l或更低的总大分子浓度，其中拥挤是可忽略的。一个具体例子是在经稀释的水性环境中进行的聚合酶链式反应。如果将拥挤度引入这样的模拟细胞内环境的系统中，动力学会急剧转移，反应会加速，产生更多的扩增子，并且酶被热保护，且会增强引物-模板相互作用(Lareu,RR,等人,Biophy Biochem Res Comm,363(1):171-177(2007c),Harve,KS,等人,Nucleic Acids Res,epub(Oct.23,2009),Raghunath,M等人.WO 2008/018839A1，它们都通过引用并入本文)。
大分子拥挤的原理还在细胞外环境中占优势。细胞被可溶性的和固定化的大分子包围，所述大分子形成它们的天然微环境。此外，同代细胞培养由以下操作组成：在不会反映粘附细胞最初衍生自的拥挤环境的条件下，将所述粘附细胞放在支持物(组织培养塑料或其它材料)上或将它们保持悬浮在水性介质中。因而，它们不可发挥它们的生理功能至最充分潜力。实际上，已经证实，当使用带负电荷的拥挤剂在拥挤条件下培养纤维发生细胞时，会加速控制胶原的沉积速率的酶促步骤(Lareu,RR.,等人,Tissue Engineering,13(2):385-391(2007a)；Lareu,RR.,等人,FEBS Lett,581(14):2709-2714(2007b))。
在本发明的方法中，使用人干细胞、祖细胞或人白色脂肪细胞。所述祖细胞或干细胞可以包括例如这样的细胞：其衍生自间充质或中胚层谱系(是间充质或中胚层谱系的后代)，以及衍生自能够分化成间充质或中胚层谱系细胞的细胞。代表性的干细胞或祖细胞包括脂肪衍生的干细胞、人胚胎干细胞(HES)、诱导的多能干细胞(iPS)、人骨髓间充质干细胞(hbmMSC)、前脂肪细胞和存在于脂肪组织或骨骼肌中的祖细胞。
使干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞接触包含棕化剂(诸如大分子拥挤剂)的分化混合液。本文中使用的“棕化剂”表示这样的试剂：其通过向棕色谱系驱 动脂肪生成而促进干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞转化成棕色脂肪细胞。在特定实施方案中，所述棕化剂包含如下所述的大分子拥挤剂。在某些实施方案中，所述分化混合液任选地另外包括下述棕化剂中的一种或多种：甲状腺激素(例如三碘甲腺原氨酸)、PPARγ受体激动剂、骨形态发生蛋白(例如BMP7)、类视色素(例如视黄酸)、心利钠肽、肌因子(例如鸢尾素)、成纤维细胞生长因子(例如FGF 21、FGF 2)、微RNA(例如mir193b-165)、催乳激素(例如催乳素)、胰岛素样生长因子(例如IGF-2)、食欲素、胆汁酸、一氧化氮、超乙酰化剂、低甲基化剂、前列腺素、PPARα配体、TLQP-21、源自脑的神经营养因子、瘦素、β-肾上腺素能激动剂、AMPK活化剂、capaisin和它的类似物、墨角藻黄素、2-羟基油酸、白藜芦醇、缀合的亚油酸、海洋起源的n-3脂肪酸、扇贝壳粉末(有机相)和/或防风通圣散。在一个特定实施方案中，所述棕化剂包含PPARγ受体激动剂，其为选自罗格列酮、环格列酮、吡格列酮、达格列酮和曲格列酮的噻唑烷二酮。在另一个特定实施方案中，所述棕化剂是罗格列酮和/或三碘甲腺原氨酸(T3)。
本文中使用的“大分子拥挤”表示，在有大分子拥挤剂存在下培养。在本发明的方法中，所述分化混合液包含一种或多种棕化剂诸如一种或多种有机基亲水大分子，在本文中也被称作拥挤剂大分子或大分子拥挤剂。在另一个实施方案中，使用2种或更多种(至少2种)基于碳水化合物的大分子。在特定方面，使用多种(例如，2、3或4种等)有机基亲水大分子。
本文中使用的“大分子拥挤剂”是惰性或无毒的大分子，且可以具有任意形状(例如，球形形状)，且通常具有中性或负表面电荷，具有高于约50kDa的分子量(参见WO 2011/108993，其通过引用并入本文)。在特定方面，所述大分子是基于碳水化合物的。根据本发明的代表性大分子可以具有约50kDa至约1000kDa的分子量。在具体方面，大分子的分子量是约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000kDa。在特定方面，根据本发明的有机基大分子是基于碳水化合物的亲水大分子。例如，本发明的基于碳水化合物的大分子可以是葡萄糖和/或蔗糖的聚合物。根据本发明的大分子的具体例子包括：蔗聚糖TM70、蔗聚糖TM400、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、糖胺聚糖、葡糖胺聚糖的糖链、纤维素、普鲁兰多糖或它们的混合物。具体地，所述基于碳水 化合物的大分子可以是蔗聚糖TM70、蔗聚糖TM400、葡聚糖、中性葡聚糖(中性葡聚糖410；中性葡聚糖670、PVP 360kDa、普鲁兰多糖、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯磺酸盐、硫酸软骨素、硫酸肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素或它们的混合物。在特定方面，所述基于碳水化合物的亲水大分子是蔗聚糖。在另一个方面，在所述方法中使用的大分子拥挤剂是蔗聚糖TM70和蔗聚糖TM400的混合物。蔗聚糖可以得自商业来源，诸如作为蔗聚糖TM70(Fc70；70kDa)在目录号17-0310下和作为蔗聚糖TM400(Fc400；400kDa)在目录号17-0300下得自GEHealthcare。
在本文提供的方法的其它方面，包含大分子作为棕化剂的分化混合液可以具有小于约2mPa·s的粘度，例如，约1.75mPa·s、1.5mPa·s、1.25mPa·s、1mPa·s 0.75mPa·s、0.5mPa·s或0.25mPa·s的粘度。
在其它方面，所述大分子可以具有约2nm至约50nm、约5nm至约20nm、或约10nm至约15nm的流体动力学半径范围。
在某些方面，总大分子浓度是约2.5-100mg/ml，且在其它方面，约5-90mg/ml、约10-80mg/ml、约20-70mg/ml、约30-60mg/ml、约40-50mg/ml，且在其它方面，约10-40mg/ml、约10-62.5mg/ml或约10-37.5mg/ml。在特定方面，所述大分子可以是以2.5-100mg/ml的浓度存在的蔗聚糖TM70和/或以2.5-100mg/ml的浓度存在的蔗聚糖TM400，或它们的混合物。在其它特定方面，所述大分子可以是以2.5-37.5mg/ml的浓度存在的蔗聚糖TM70和/或以2.5-25mg/ml的浓度存在的蔗聚糖TM400，或它们的混合物。在特定方面，使干细胞与基于碳水化合物的大分子接触，所述基于碳水化合物的大分子包含浓度为约37.5mg/ml的蔗聚糖TM70和浓度为约25mg/ml的蔗聚糖TM400。
还可以基于体积分数占据而计算用在本发明中的大分子的浓度。本领域技术人员已知，最方便地通过“体积分数(Ψ)”或“体积分数占据”来表达含有非常大分子(大分子)(诸如聚合物)的溶液的组合物，所述“体积分数(Ψ)”或“体积分数占据”是用于制备溶液的聚合物的体积除以该大分子体积和溶剂体积的总和。在本文所述的方法中，以生物学上有关的体积分数占据，使细胞与一种或多种大分子接触。在某些方面，所述生物学上有关的体积分数占据是约3％至约30％。在其它方面，所述生物学上有关的体积分数占据是约5％至约25％、 约10％至约20％和约12％至约15％。因而，在本发明的方法中，所述体积分数占据是约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在特定方面，所述生物学上有关的体积分数占据是约15％。
可以使用一种或多种类型的大分子拥挤剂，且可以采用不同尺寸和类型的表面电荷(例如，中性或负)的组合。在某些实施方案中，一种或多种大分子具有2-50nm的半径范围；在某些其它实施方案中，一种或多种大分子具有50kDa至1000kDa(例如，50kDa至500kDa)的分子量。另外，如果需要的话，一种(或多种，如果使用的话)类型的有机基亲水大分子是基于碳水化合物的亲水大分子。代表性的大分子包括，例如，葡萄糖和/或蔗糖的聚合物。如果需要的话，至少一种类型的有机基亲水大分子可以是中性的或衍生的(硫酸化的、乙酰化的、甲基化的)葡聚糖；果聚糖；左聚糖；或糖胺聚糖。
例如，在某些实施方案中，所述分子拥挤剂可以包含：(a)有机基亲水大分子，其具有50kDa至1000kDa(例如，50kDa至500kDa的分子量)的分子量和中性表面电荷；(b)有机基亲水大分子，其具有2-50nm的半径范围和中性或负表面电荷；或(c)这样的大分子的组合。在其它方面，所述方法可以包括：使用2种或多种这样的有机基亲水大分子，每种具有中性表面电荷。
在其它代表性的实施方案中，所述方法包括使用棕化剂：大分子拥挤剂，其包含：(a)2种或更多种有机基亲水大分子，每种大分子具有50kDa至1000kDa(例如，50kDa至500kDa的分子量)的分子量和中性表面电荷，或(b)2种或更多种有机基亲水大分子，每种大分子具有2-50nm的半径范围和中性或负表面电荷，或(c)2种或更多种有机基亲水大分子，每种大分子具有50kDa至1000kDa的分子量(例如，50kDa至500kDa的分子量)和中性表面电荷，其与第三种具有50kDa至1000kDa(例如，50kDa至500kDa的分子量)的分子量和中性表面电荷的有机基亲水大分子组合，或(d)2种或更多种有机基亲水大分子，每种大分子具有50kDa至1000kDa(例如，50kDa至500kDa的分子量)的分子量和中性表面电荷，其与第三种具有50kDa至1000kDa的分子量(例如，50kDa至500kDa的分子量)且具有负或中性表面电荷的有机基亲水大分子组合； (e)2种或更多种有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至500kDa的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和中性表面电荷的有机基亲水大分子；或(f)2种或更多种类型的有机基亲水大分子的混合物，每类具有50kDa至1000kDa(例如，50kDa至500kDa的分子量)的分子量和中性表面电荷，以及第三类具有2-50nm的半径范围和负表面电荷的有机基亲水大分子。
代表性的大分子包括，例如，蔗聚糖TM70、蔗聚糖TM400、葡聚糖、中性葡聚糖(例如中性葡聚糖410kDa、中性葡聚糖670kDa)、普鲁兰多糖、硫酸葡聚糖、纤维素、直链淀粉、糖原、硫酸软骨素、硫酸类肝素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸和淀粉。如果需要的话，同样可以使用其混合物。在一个特定实施方案中，将蔗聚糖TM70和蔗聚糖TM400的混合物用作大分子的混合物。大分子的浓度可以变化；在一个实施方案中，所述浓度是约2.5-100mg/ml。如果使用蔗聚糖TM70和蔗聚糖TM400，例如，蔗聚糖TM70可以以约7.5-100mg/ml(例如，25-50mg/ml，诸如37.5mg/ml)的浓度存在，且蔗聚糖TM40可以以2.5-100mg/ml(例如，10-50mg/ml，诸如25mg/ml)的浓度存在。大分子的粘度可以变化；在某些实施方案中，所述大分子具有小于2mPa·s的粘度。
本领域技术人员会明白，如果需要的话，可以加入其它的大分子拥挤剂。在一个方面，所述其它的拥挤剂是带中性电荷的拥挤剂(例如，PVP)或带负电荷的拥挤剂(例如，硫酸葡聚糖500kDa)(例如，参见WO 2011/108993，其通过引用并入本文)。
在本发明的方法中，如果使用如上所述的人干细胞或祖细胞，用包含一种或多种如下所述的脂肪形成剂和一种或多种棕化剂(例如，大分子拥挤剂)的分化混合液培养所述细胞；如果使用白色脂肪细胞，用包含一种或多种棕化剂(例如，大分子拥挤剂)和任选的(如果需要的话)一种或多种如下所述的脂肪形成剂的分化混合液培养所述细胞。当将大分子拥挤剂用作棕化剂时，可以以多种方式将大分子加入混合液中。例如，将大分子作为粉末或液体加入培养基中。优选地，大分子的加入不会显著增加细胞培养基的粘度。如果需要的话，然后可以将培养基灭菌，例如通过过滤。在一个方面，所述拥挤剂包括蔗聚糖70和蔗聚糖400的组合。
本文中使用的“脂肪形成剂”表示一种或多种被选择用于促进脂肪生成的试剂。在代表性的实施方案中，一种或多种脂肪形成剂选自：胰岛素、糖皮质激素或合成的等效物(例如，地塞米松)、cAMP增强子诸如吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和维生素C。
在有分化混合液存在下培养细胞会产生功能性人棕色脂肪细胞群。本文中使用的“功能性的”人棕色脂肪细胞表示表现出棕色脂肪细胞的特征的脂肪细胞。特征包括，例如，分子标志物的产生或棕色脂肪细胞特有的活性，诸如UCP1基因/蛋白和/或其它代表性棕色脂肪有关的基因/蛋白的表达；线粒体生物发生；氧耗量；解偶联的呼吸；葡萄糖摄取；脂解；燃料代谢或指示代谢活性增加的任意其它参数和/或热产生。例如，人棕色脂肪细胞通常表达代表性的棕色脂肪基因/蛋白，诸如UCP1。其它代表性的棕色脂肪基因/蛋白包括CIDEA、CPT1B、PRDM16、DIO2、PGC1α等。可以评估这样的基因在暴露于分化混合液的细胞中的表达，并与在棕色脂肪细胞中的表达进行对比，或者，可替换地或另外，与白色脂肪细胞中的表达进行对比，以便评估所述细胞是否表现出功能性的人棕色脂肪细胞特征。在一个特定实施方案中，UCP1表达是处于这样的水平：其显著不同于人白色脂肪细胞群的水平。
在本发明的一个方面，通过检查一种或多种因素对这些细胞中的产热程序的活化，可以评估人棕色脂肪细胞的功能性。本文中使用的产热程序的活化指示，导致线粒体中UCP1表达和活性的向上调节的转录途径被活化，且所以发生增加的解偶联的呼吸、增加的线粒体呼吸和随后的热产生。用于测量该现象的当前参数包括，例如，UCP1基因/蛋白的表达；线粒体生物发生；氧耗量；解偶联的呼吸；葡萄糖摄取；脂解；燃料代谢或指示代谢活性增加的任意其它参数和/或热产生。
活化产热程序的因素是例如，用特异性的β-肾上腺素能受体激动剂(例如，异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴酚丁胺、特布他林、化合物CL316243或异丙肾上腺素)和/或升高cAMP的细胞内水平的化合物(例如，二丁酰基-cAMP、8-CPT-cAMP、8-溴-cAMP、二辛酰基-cAMP、吲哚美辛、IBMX或福司柯林)刺激细胞。当产热程序在刺激后被活化时，证实人棕色脂肪细胞的功能性，即：与在没有特异性的β-肾上腺素能受体激动剂和/或升高cAMP 的细胞内水平的化合物模拟存在下得到的可比较测量结果相比，UCP1基因/蛋白的表达增加，和/或线粒体生物发生的表达增加，和/或氧耗量的表达增加，和/或解偶联的呼吸的表达增加，和/或葡萄糖摄取的表达增加，和/或脂解的表达增加，和/或燃料代谢的表达增加，和/或指示代谢活性增加的任意其它参数的表达增加，和/或热产生的表达增加。
本发明还涉及通过本文所述的方法制备的功能性棕色脂肪细胞群。这样的群可以用在例如筛选平台中以鉴别能够如下改变个体的代谢活性的试剂：活化棕色脂肪细胞的产热程序；促进白色脂肪细胞至棕色脂肪细胞转分化；或促进人干细胞或祖细胞向棕色脂肪细胞的分化。
例如，可以将功能性棕色脂肪细胞群暴露于目标试剂，然后监测以评估所述试剂对棕色脂肪细胞的影响。在某些实施方案中，可以使用方法诸如上述的用于评估人棕色脂肪细胞的功能性的方法(例如，定量棕色脂肪细胞特有的一种或多种分子标志物和活性，诸如：人棕色脂肪细胞的UCP1基因/蛋白的表达；线粒体生物发生；氧耗量；解偶联的呼吸；葡萄糖摄取；脂解；燃料代谢或指示代谢活性增加的任意其它参数；和/或热产生)。增加棕色脂肪细胞特有的标志物或活性的表达、存在或活性(例如，诸如通过活化棕色脂肪细胞的产热程序)的试剂被鉴别为可以能够改变个体中的代谢活性的目标试剂。
类似地，可以在实验中将功能性棕色脂肪细胞群用作阳性对照，以评估试剂的促进干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞的分化的能力。未暴露于目标试剂的干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞将充当基线；然后将可比较的干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞暴露于目标试剂，并如本文中关于棕色脂肪细胞功能性所述进行评估。如果所述细胞表现出与如本文中所述的功能性棕色脂肪细胞群类似的功能性，那么所述目标试剂将是能够促进有关的干细胞、祖细胞或白色脂肪细胞分化成棕色脂肪细胞的试剂。
本发明还涉及本文描述的分化混合液作为细胞培养物的添加剂的用途。例如，可以在有分化混合液存在下培养MSC或用于制备棕色脂肪细胞的其它细胞(例如，在生物反应器场合中或在浸没式单层培养中)。这样的培养可以产生可用在代谢研究、遗传研究、表现遗传研究、细胞生物学研究和/或测热研究中的棕色脂肪细胞(例如，在BAT单层中)。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文中所述的分化混合液。可以用生理上可接受的载体或赋形剂配制本文描述的分化混合液，以制备药物组合物。所述载体和组合物可以是无菌的。所述制剂应当适合施用模式。
合适的药学上可接受的载体包括、但不限于：水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、右旋糖、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘稠的石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等以及它们的组合。如果需要的话，可以将药物制剂与助剂混合，所述助剂是例如不会有害地与活性化合物反应的润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、矫味剂和/或芳族物质等。
如果需要的话，所述组合物还可以含有微量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或散剂。可以将所述组合物配制为栓剂，其含有传统的粘合剂和载体诸如甘油三酯。口服制剂可以包括标准载体，诸如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
可以全身性地和/或局部地施用其药物组合物。引入这些组合物的方法包括、但不限于：真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、眼内的、静脉内的、皮下的、局部的、口服的和鼻内的。其它合适的引入方法还可以包括基因疗法、可再充电的或可生物降解的装置、粒子加速设计(“基因枪”)和缓释高分子装置。例如，可以在有分化混合液存在下采用在3D体外生物反应器中的水凝胶培养物，诸如以产生包含棕色脂肪细胞组织或棕色脂肪细胞层(例如，可植入的细胞片)的可植入组合物。在其它实施例中，可以将分化混合液掺入生物材料中、可注射的水凝胶中、微粒中，或以其它方式包装以施用给人个体(例如，施用进脂肪沉着物中诸如皮下地或以其它方式施用进脂肪组织或肌肉)。
还可以施用本发明的药物组合物作为与其它化合物的联合治疗的一部分。
可以根据常规规程将所述组合物配制为适合施用给人类的药物组合物。例如，用于静脉内施用的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在必要的情况下，所述组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂，以减轻在注射部位处 的疼痛。通常，所述成分单独供给或一起混合在单位剂型中，例如，作为在气密密封的容器(诸如安瓿或药囊，其指示活性化合物的量)中的干燥的低压冻干粉末或无水浓缩物。在要通过输注来施用所述组合物的情况下，可以免除含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶。在通过注射来施用所述组合物的情况下，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，使得所述成分可以在施用之前进行混合。
对于局部施用，可以采用不可喷射形式、粘稠至半固体或固体形式，其包含与局部施用相容的载体且具有动态粘度，优选地大于水。合适的制剂包括、但不限于溶液、混悬液、乳剂、乳膏剂、软膏剂、粉剂、灌肠剂、洗剂、溶胶、搽剂、油膏剂、气雾剂等，如果需要的话，将其灭菌或与助剂混合，所述助剂是例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或用于影响渗透压的盐等。可以将所述化合物掺入美容制剂中。对于局部施用，也合适的是可喷射的气溶胶制剂，其中将活性成分(优选地与固体或液体惰性载体材料组合)包装在挤压瓶中或与增压的挥发性的、通常气态的推进剂(例如，增压的空气)混合。
可以将本文描述的化合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基(诸如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生出的那些)形成的那些和与游离羧基(诸如从钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生出的那些)形成的那些。
例如，可以将如本文中所述的分化混合液掺入用于施用给个体的药物组合物中。代表性的药物组合物包含用分化混合液渗透或浸渍的生物材料；例如，可以施用(例如，植入)可生物降解的生物材料或具有可降解包衣的生物材料，作为膜、管、网(例如，电旋转网/垫子/纤维)、泡沫、颗粒或其它形式，呈单一结构或颗粒形式。在一个特定实施方案中，可以使用水凝胶(例如，含有胶原、透明质酸等)、纳米或微米颗粒(例如，用分化混合液包被或具有掺入其中的分化混合液)。其它药物组合物可以包含注射用药物溶液，其为单独的或与另一种生物材料(例如，水凝胶、纳米或微米颗粒)组合，或通过树枝状聚合物技术来递送。在特定实施方案中，通过直接注射、弹道或生物弹道施用(颗粒或基因枪或粉末喷射)或植入(例如，植入脂肪组织或另一个区域)以及递送给人个体的其它适当方式，可以施用这样的药物组合物。
本发明另外涉及使用如本文中所述的方法、分化混合液、药物组合物和/或功能性棕色脂肪细胞群的基于自体细胞的离体治疗以及药理学体内治疗。例如，对于自体治疗，可以从人个体得到干细胞或祖细胞的样品，然后可以采用本文所述的方法来制备功能性棕色脂肪细胞。然后可以将这样的脂肪细胞返回至相同的人个体，由此将棕色脂肪细胞或棕色脂肪组织引入个体。在另一个实施方案中，可以将分化混合液掺入静电纺丝纤维中，且可以将这样的纤维与体内MSC一起植入用于自体治疗。在另一个实施方案中，可以将分化混合液掺入不同的生物材料(例如，如上所述的材料)和植入人个体的白色脂肪沉着物(例如，皮下地)，或以其它方式施用进脂肪组织或其它组织(例如，肌肉)。这样的应用可以促进个体中的白色脂肪细胞至棕色脂肪细胞转分化。对于药理学治疗，可以将分化混合液或包含分化混合液的药物组合物施用给人个体，由此在所述个体中产生其它的棕色脂肪细胞。
这样的离体和体内方法都可以用于体重减轻疗法，用于治疗肥胖和它的相关的疾病诸如代谢综合征、糖尿病、动脉粥样硬化、心血管心脏病、高血压、中风、骨关节炎和一些癌症(乳腺癌、结肠癌)(关于相关的疾病，参见，例如，WHO Factsheet:Obesity and Overweight.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/index.html#(2011))。
讨论
本发明的棕色脂肪细胞和一般方法：目前认为棕色脂肪组织在个体的能量消耗和重量控制中起关键作用。棕色脂肪细胞具有巨大的甘油三酯清除和葡萄糖处理能力。一个独特特征是它们的执行解偶联的线粒体呼吸的能力(由于解偶联蛋白UCP1的存在)。因而，棕色脂肪细胞是产热者，并且单独地负责无颤抖产热。最初认为棕色脂肪细胞仅存在于新生儿中，最近已经在成年人的周边位置中发现了棕色脂肪细胞。这已经启发临床研究人员研究棕色脂肪细胞作为用于治疗肥胖、糖尿病和代谢综合征的治疗靶标；但是，以前不存在人棕色脂肪细胞的体外培养的来源。已经在小鼠和鼠前体细胞系中进行了对棕色脂肪组织的发育起源和功能的研究。
我们最近已经开发了专有的大分子拥挤技术来增强人骨髓间充质干细胞的白色脂肪形成分化[参见PCT/SG2011/000081；WO2011/108993A1]。我们现 在已经令人惊奇地发现，该培养系统会在白色诱导方案过程中使UCP1基因表达的基础水平增加10倍。这意味着，与聚蔗糖一起的混合大分子拥挤可以诱导‘棕化’效应。在棕色脂肪诱导的条件下使用该系统(利用例如蔗聚糖TM70和蔗聚糖TM400的混合物)，在福司柯林刺激后存在数百倍向上调节。因此，我们可以从其它细胞(包括从白色脂肪细胞)制备人棕色脂肪细胞。本发明是肥胖和代谢综合征的药理学平台和基于细胞的疗法的基础。
肥胖问题以及与棕色和白色脂肪细胞的关联：当能量摄入超过能量消耗时，发生肥胖。在发达国家中，我们现在看到加工食品和肉制品的丰富且廉价供应的组合。与久坐生活方式以及CNS不能适当地抑制食欲相组合，这些会导致能量失衡和过量卡路里在脂肪组织中的被动贮存。但是，脂肪组织不仅是脂肪堆积物，而且是活跃的内分泌器官，从而释放出游离脂肪酸和脂肪因子诸如瘦素、脂联素、TNFα、白介素-6和视黄醇结合蛋白-4，它们都可以作用于其它组织(包括脑、肝和肌肉)以调节食物摄入、能量平衡和胰岛素敏感性(Cypess,A.M.等人.Current Opinion in Endocrinology,Diabetes and Obesity,17,143-149(2010))。
白色脂肪组织(WAT)分布(肠相对于皮下)会极大地影响代谢风险。除了储存能量的WAT以外，包括人类在内的哺乳动物具有棕色脂肪组织(BAT)，其燃烧能量用于产热。在小哺乳动物中，BAT对于产热和能量平衡而言是重要的。小鼠中的BAT诱导会促进能量消耗，降低体脂肪率，并保护免于饮食诱导的肥胖。BAT消融会降低能量消耗和响应于高脂肪饮食而增加肥胖[综述在Cypess&Khan 2010]。棕色脂肪细胞显示众多大线粒体。线粒体内膜承载BAT-特异性的解偶联蛋白1(UCP1)，所述解偶联蛋白1当被活化时会消散膜间质子动力势和产生热而不是ATP。以前估计，在人类中，如果最大刺激的话，低至50g BAT可以利用多达20％的基础卡路里需求(Rothwell,N.J.等人.Clin Sci(Lond).64,19-23(1983))。
图1描绘了棕色脂肪组织的活化和活性。β3-肾上腺素能受体的刺激会借助于2型5'去碘酶(DIO2)导致三碘甲腺原氨酸(T3)的细胞内浓度的急剧增加；T3又会刺激解偶联蛋白1(UCP1)的转录，所述UCP1造成质子从线粒体的内膜渗漏，因此以热的形式消散能量。cAMP＝环腺苷一磷酸，CRE＝cAMP应 答元件，TRE＝甲状腺激素应答元件(得自Celi F.N Engl J Med.2009)。
UCP1是BAT的标记蛋白，且是介导产热所必需的。除了UCP1以外，通过2型碘甲腺原氨酸去碘酶(DIO2in图1)的和转录共调节剂(诸如PGC-1α)的高水平表达，可以在分子水平将棕色脂肪细胞与WAT区分开(Gesta,S.,等人.Cell.131,242-256(2007))。
成年人中棕色脂肪的(再)发现：BAT对于啮齿类动物中的代谢调节而言是关键性的，且已知在人新生儿中存在于某些位置(图2)。但是，由于BAT沉着物在成年人中难以在组织学上检测，BAT在正常成年人中的重要性和功能在生物学上被认为在成年人中是无关的。随着使用18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)来搜寻代谢活性肿瘤的、与计算机体层摄影术联用的正电子-发射断层摄影术(PET/CT)的出现，辐射学家注意到具有该示踪剂的高摄取的脂肪组织的较小但是独特的非肿瘤集合。在2007年，在成年人中做出BAT的第一个意外发现(Nedergaard,J.,等人.AJP:Endocrinology and Metabolism.293,E444-E452(2007))，且在2009年，5个独立小组使用18F-FDG PET/CT证实了BAT在成年人中的存在和关联性(Saito,M.等人.Diabetes.58,1526-1531(2009)；Zingaretti,M.C.等人.FASEB J.23,3113-3120(2009)；van Marken Lichtenbelt,W.等人.N Engl J Med.360,1500-1508(2009)；Cypess,A.等人.N Engl J Med.360,1509-1517(2009)；Virtanen,K.A.等人.N Engl J Med.360,1518-1525(2009)。
在颈-锁骨上区域中发现了代谢活性脂肪的这些贮库，其含有UCP1且表现出BAT组织学(图2)。
图2描述了与成年人中的分布相比，BAT在新生儿、婴儿中的分布。(A)婴儿中的BAT位于肩胛间区域、肾周、纵隔以及锁骨上面和下面的颈区域中。(B)经由高葡萄糖摄取的FDG-PET突出显示区域，在冷攻击的成年人中的BAT的示意图，一种最初用于检测肿瘤的方法。
本发明的优点-人棕色脂肪细胞用于研究和临床应用的可用性：脂肪组织是人类的一个重要内分泌和分泌器官。然而，脂肪形成细胞分化和功能性的当前模型是基于永生化的系诸如3T3L1，即一种鼠前脂肪细胞细胞系。利用人原代和多能细胞和干细胞的本发明具有远远更多的临床相关性。本发明允许构 建BAT筛选平台来鉴别化合物以对抗肥胖、糖尿病和其它代谢疾病，用于营养物和营养制品以及制药工业。并且，本发明提供了将自体MSC转化成BAT的平台，其用于再植入目的以向上驱动代谢速率和作为代谢综合征的辅助治疗。
本发明的优点-白色脂肪细胞/前脂肪细胞向棕色脂肪细胞的药理学转化：使用噻唑烷二酮(一类胰岛素敏化药物)通过选择性地活化PPARγ来治疗II型糖尿病(Yki-H.Thiazolidinediones.N Engl J Med.351,1106-1118(2004))。令人感兴趣的是，该药物种类似乎对白色脂肪细胞产生“棕化”效应，从而推动它们表达UCP1和其它产热标志物。(Bogacka等人.Diabetes.54,1392-1399(2005))证实，吡格列酮会诱导II型糖尿病患者的人体内皮下脂肪组织的线粒体生物发生以及产热基因(诸如PGC-1α和UCP1)的向上调节表达。最近(Vernochet等人,Mol Cell Biol.29,4714-4728(2009))证实，曲格列酮会向上调节成熟的3T3-L1白色脂肪细胞中的ucp1和其它BAT基因。(Petrovic等人,J Biol Chem.285,7153-7164(2010))证实，罗格列酮对得自小鼠附睾区域的前体细胞的慢性治疗会促进产热程序(包括去甲肾上腺素可诱导的Ucp1基因)的表达。因而，利用该平台，我们已经开发了在体外将WAT转化成BAT的工具，这是因为使用罗格列酮时上述的“棕化”效应。
大分子拥挤(MMC)会增强细胞外基质(ECM)的沉积和改造，并增加隔离在基质中的FGF2的量。ECM作为微环境的组分在指导分化和维持细胞表型中起重要作用。因而，我们检验了MMC是否影响在脂肪生成中特异性地参与的ECM蛋白的沉积和改造。我们观察到在从纵向网状模式(纤连蛋白和胶原IV)分化至蜂巢模式的过程中ECM的形态学转变；我们平行地观察到增加的纤连蛋白降解，如已经关于鼠前脂肪细胞3T3细胞中的脂肪形成基质改造所描述的。我们还证实了增强的ECM沉积伴有富含基质结合的硫酸肝素的蛋白聚糖的增加。硫酸化多糖(诸如肝素和类肝素)在隔离多种生长因子中起重要作用，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子、骨形态形成蛋白(BMP)和肝生长因子。实际上，与硫酸类肝素在ECM中较强存在的免疫细胞化学观察结果比较有关的是，我们发现了在有MMC存在下被隔离在脂肪形成地诱导的MSC的细胞层中的FGF2的量的30倍增加。被隔离在脂肪形成地诱导的细胞层±MMC中的IGF1的量没有显著差异(图3)，而BMP4是不可检 测的(数据未显示)。
以前的实验指示，脂肪形成地诱导的MSC在大分子拥挤下沉积更多的细胞外基质和有关的配体，并被强力地改造。参见，例如，WO 2011108993A1。此外，如(Chen等人.Adv Drug Deliv Rev.63,277-290(2011))所描述的，混合的大分子拥挤会对基质沉积产生多效影响。我们研究了在以下情况下的脂肪生成指导潜力：没有脂肪形成地诱导的MSC(adip)沉积的ECM的化学刺激存在，没有(-MMC)和有(+MMC)大分子拥挤存在。为此目的，将未分化的MSC接种在不同基质上，并在基础培养基中维持3周。将在有/没有拥挤和未分化MSC存在下由脂肪形成地诱导的细胞产生的无细胞基质接种，并将这些基质在基础培养基中保持7天。在没有化学诱导下，脂肪细胞衍生的ECM将MSC诱导成自发的脂肪生成(数据未显示)。参见，例如，WO 2011108993A1。
脂肪细胞衍生的ECM诱导MSC以表达脂肪生成的表现遗传标记：我们还分析了在PDRM16(在脂肪生成过程中涉及/向上调节的关键基因)内的2个基因座上的甲基化(Seale,P.等人.Nature.454,961-967(2008)。该分析的目的是，考虑MSC向无细胞的脂肪细胞衍生的ECM的突然暴露是否会模拟由经典的、持续的生化脂肪形成诱导引起的表现遗传效应。令人感兴趣的是，在长时间ECM接触后减少的甲基化的趋势与在拥挤下用化学分化观察到的趋势相同。由于甲基化的减少对应于基因表达的向上调节(Cedar,H.Cell.53,3-4(1988))，我们推断，在拥挤下沉积的基质实际上是分化的强驱动器。如在图4中所示，在没有(-)和有(+)大分子拥挤(MMC)存在下，脂肪形成地分化的MSC(adip)沉积ECM；然后将去细胞化的和新鲜未分化的MSC接种在这些基质上。基因PDRM 16上的2个基因座的CpG甲基化的Sequenome分析揭示了，与化学诱导的那些相比，已经在脂肪细胞基质上培养的细胞中所发生的类似甲基化模式(n＝3；误差棒是±标准差；**P<0.01)。
大分子拥挤会在常规白色诱导方案中诱导UCP1mRNA和蛋白(一种棕色脂肪细胞标志物)的表达：因为最近在小鼠肌成纤维细胞向棕色脂肪细胞的分化中描述了PRDM16的表达(Seale,P.等人.Nature.454,961-967(2008)，我们分析了UCP1(棕色脂肪细胞的标记基因)的表达。意外的是，在拥挤条件下，在白色分化方案中发生了UCP1mRNA的10倍向上调节。转变为在拥挤下的 棕色诱导方案(参见下面的方法)，我们观察到与当前白色诱导方案相比23倍向上调节(图5)。
在白色和棕色诱导方案中，单独的大分子拥挤可以刺激脂肪形成地诱导的MSC中的UCP1mRNA表达，如在图5中所示。应当指出，BMP7(Ib组)与Ib(-BMP7)组相比仅不大地增加UCP1表达，从而指示BMP7在分化过程中可能不是关键性的。另外，在有混合的大分子拥挤(+MMC)和4小时福司柯林刺激存在下，在经历不同的WAT(lw)或BAT(Ib)诱导方案的MSC的细胞提取物中通过免疫印迹法检测到UCP1蛋白(数据未显示)。
在福司柯林刺激和其它产热基因以后，在大分子拥挤下MSC的棕色脂肪形成诱导会将UCP1表达向上调节数百倍。功能性棕色脂肪细胞的一个重要试验是，它们对去甲肾上腺素能刺激的应答或福司柯林刺激对cAMP的更一般下游诱导(参见图2)。当用福司柯林刺激这些细胞(肾上腺素能刺激以后的下游信号传递步骤)时，UCP1mRNA被向上调节了额外10倍。大分子拥挤培养的效应是惊人的，从而导致在4小时以后UCP1的强福司柯林应答被向上调节2个数量级。如在图6中所示，在4小时福司柯林刺激以后，在棕色诱导方案下大分子拥挤会诱导产热基因的大量向上调节。与没有MMC和福司柯林刺激下的经典白色诱导方案相比，(A)UCP1mRNA表达增加了数百倍，(B)PGC-1α增加了40倍(C)DIO2增加了7倍(与图1相比)。
在棕色诱导方案下产生的脂肪细胞在福司柯林刺激后执行脂解：我们接下来试验了福司柯林刺激对cAMP的一般下游诱导(参见图1)是否会诱导脂解。我们通过评估脂质存储物的排空评估了该生化过程。我们通过使用生物成像站测量尼罗红面积/孔(24个孔)来对此定量。与当前常规白色诱导方案相比，在大分子拥挤下的棕色诱导方案会产生最高脂滴含量。在福司柯林刺激以后16小时，在棕色诱导方案中的尼罗红阳性区域减少了2.14倍。但是，这些值代表表面(2D)。如果我们将此模型化为圆的表面并导出单个含有甘油三酯的球体的假定体积，我们将在拥挤下棕色诱导的MSC中看到福司柯林处理后体积减少了3倍。图7描绘了白色和棕色脂肪形成地诱导的间充质干细胞的福司柯林处理会导致脂质沉着物的排空。
在棕色诱导方案下产生的脂肪细胞在β-肾上腺素能刺激以后执行脂解：我 们接下来试验了更多的BAT-特异性的刺激，即儿茶酚胺作为脂解的诱导物。在5μM异丙肾上腺素16小时以后进行评估(对比图7)。显示在图8中的结果表明，白色和棕色脂肪形成地诱导的间充质干细胞的异丙肾上腺素处理会导致脂滴的排空。异丙肾上腺素对在BAT诱导方案下已经分化的脂肪细胞发挥更强的脂肪分解效应。
大分子拥挤诱导白色脂肪细胞至棕色脂肪细胞的转化：最后，为了研究大分子拥挤是否能够促进脂肪细胞的白色-至-棕色转化，使用标准的白色诱导方案(Iw)，诱导MSC分化3周成为白色脂肪细胞，然后在用棕色诱导方案±MMC(Ib或Ib mmc)诱导接下来的3周。图9表明，与仅具有UCP1的6.5倍向上调节的仅仅单独棕色诱导方案(周0-3:Iw；周4-6:Ib)相比，将成熟的白色脂肪细胞(3周)暴露于棕色诱导方案并拥挤另外3周(周0-3:Iw；周4-6:Ib mmc)会表现出UCP1的35.7倍向上调节。
方法
a)间充质干细胞培养.商购(Cambrex)得到处于第2代(p2)的人骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)，并在基础培养基中培养，所述基础培养基由补充了Glutamax、10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μl/ml链霉素的低葡萄糖Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(LG DMEM,Gibco)组成。在37℃在5％CO2的控湿气氛下维持细胞，每周更换培养基2次。为了防止自发分化，使用TrypLETMExpress(Gibco)将脱离之前的细胞维持在亚汇合水平，以1:3传代，并培养以产生后代。用第6代(p6)至第8代(p8)之间的细胞进行定向分化。
b)间充质干细胞(MSC)的脂肪形成诱导.以约10.5x 104个细胞/cm2的最初密度将MSC接种在孔板中，并培养至汇合。经由3个诱导4天然后维持3天的循环，诱导脂肪形成分化。在分化过程中使用的基础培养基由补充了Glutamax、10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μl/ml链霉素的高葡萄糖Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(HG DMEM,Gibco)组成。标准的白色脂肪形成诱导培养基补充了3-异丁基-1甲基黄嘌呤(0.5mM)、吲哚美辛(0.2mM)、地塞米松(1μM)和胰岛素(10μg/ml)。对于棕色脂肪细胞分化，在诱导前3天，用BMP7(R&D Systems 354-BP,125ng/ml)预处理细胞。棕色脂肪形成诱导培 养基补充了3-异丁基-1甲基黄嘌呤(0.5mM)、吲哚美辛(0.2mM)、地塞米松(1μM)、胰岛素(10μg/ml)、三碘甲腺原氨酸(1nM)和罗格列酮(1μM)。在维持阶段中使用单独基础培养基。对于用大分子拥挤(+MMC)处理过的条件，贯穿分化过程(在诱导阶段和维持阶段中)，将由蔗聚糖70(37.5mg/ml)和蔗聚糖400(25mg/ml)组成的大分子混合液(+MMC)加入基础培养基(高葡萄糖DMEM,Gibco)中。该策略的代表性时间线显示在图10中。
c)用福司柯林或异丙肾上腺素刺激.3-周脂肪形成分化以后，在分析之前将细胞与10μM福司柯林(Sigma)或5μM异丙肾上腺素(Sigma)一起温育4h或16h，以模仿培养物中的去甲肾上腺素能刺激。
d)用于评估细胞质脂质积累区域的尼罗红附着细胞计量术.21天(对应于3个完整诱导循环)以后，将细胞培养物用PBS冲洗，在4％甲醛中固定(10min；室温)，然后如前所述用尼罗红(Sigma-Aldrich；5μg/ml)(针对细胞质脂滴)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；0.5μg/ml)(针对细胞核DNA)共染色30min。附着荧光细胞计量术是基于每个孔的9个位点，所述位点用连接至2倍放大率的Nikon TE2000显微镜的coolSNAP HQ照相机拍摄图像，从而覆盖总孔面积的83％。在罗丹明滤光片[Ex572nm/Em630nm]下观察尼罗红，而用DAPI滤光片[Ex350nm/Em465nm]评估DAPI荧光。设定测量的尼罗红事件的阈值，并通过图像分析软件(MetaMorph 6.3v3)进行测量。基于检测到的DAPI荧光，通过标准化为细胞核计数的阈值事件的尼罗红荧光面积，定量脂肪形成分化的程度。最终数据对应于每个孔存在的脂滴总面积除以细胞数目。
e)用于评估总脂肪细胞和棕色脂肪细胞基因的表达的定量PCR.使用Trizol(15596,Invitrogen)-氯仿方法，然后按照生产商的方案用微试剂盒(Qiagen)，以12-孔板形式从单层提取总RNA。使用MaximaTM第一链cDNA合成试剂盒(K1642,Fermentas)，从分离的mRNA合成cDNA。进行实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)，并使用MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(K0222,Fermentas)在实时PCR仪器(Stratagene)上监测。用MxPro软件(Strategene)进行数据分析。使用ΔΔ-Ct方法确定相对基因表达水平，用人TATA框结合蛋白(TBP)和核糖体磷蛋白P0(RPLP0)水平的几何平均值作为内源对照。使用的引物序列显示在表1中。
表1:引物序列(5′→3′书写，正向和反向)

RPLP0(人核糖体磷蛋白P0)；TBP(TATA框结合蛋白)；UCP1(解偶联蛋白1)；PGC-1α(PPAR-γ辅激活因子1α)；DIO2(去碘酶，碘甲腺原氨酸，II型)
f)蛋白提取和蛋白质印迹法。使用Laemmli缓冲液从细胞单层提取蛋白为全细胞裂解物。对每个样品的17.6μl蛋白提取物进行还原SDS-PAGE。然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上在20V保持16h。用5％的脱脂奶在TBST中的溶液在室温封闭膜1h。然后将膜与第一抗体一起在1％的脱脂奶在TBST中的溶液中在室温温育1.5h。使用的第一抗体是抗-兔UCP1(1:100,ab10983Abcam)、抗-小鼠COXIV(1:1000,ab33985Abcam)和抗-小鼠β-肌动蛋白(1:1000A228Sigma)(作为负载对照)。在1％的脱脂奶在TBST中的溶液中，以1:1000用Dako HRP山羊-抗小鼠抗体(P0447)和Dako HRP山羊-抗兔抗体(P0448)检测结合的第一抗体，在室温进行1h。用Versadoc(Biorad 5000MP)捕获化学发光。
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