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1、(10)申请公布号 CN 104328056 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328056 A (21)申请号 201410597983.1 (22)申请日 2014.10.29 CCTCC NO: M 2014506 2014.10.22 C12N 1/14(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (71)申请人 青岛蔚蓝生物集团有限公司 地址 266061 山东省青岛市崂山区苗岭路 29 号山东高速大厦 12A07 申请人 潍坊康地恩生物科技有限公司 (72)发明人 黄亦钧 吴佳鹏 许丽红 李瑞 王玉明 (7。
2、4)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 (54) 发明名称 一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用 (57) 摘要 本发明提供了一株里氏木霉 (Trichoderma reesei) 突变菌株 VLKDN-1， 其保藏号为 CCTCC NO ： M 2014506。本发明利用紫外诱变技术， 并结 合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突 变菌株。与出发菌相比， 突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的发酵上清液酶活提高了 235， 蛋白含量提高 了 157 ； 该突变菌的菌落形态明显小于出发菌， 且菌丝比出发菌的菌丝短、 分枝多。在生产过程 中， 该突变菌株 “。
3、小型化” 的菌落形态以及菌丝短、 分枝多的特点能使发酵菌液的粘度显著降低， 达 到降低搅拌速度又提高溶氧的目的， 从而有利于 降低生产成本， 应用前景广泛。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104328056 A CN 104328056 A 1/1 页 2 1. 一株里氏木霉菌株， 其特征在于， 所述的菌株的保藏编号为 CCTCC NO ： M 2014506。 2. 权利要求 1 所述的里氏木霉菌株的制备。
4、方法， 其特征在于， 所述的制备方法是通过 紫外诱变获得的。 3. 权利要求 1 所述的里氏木霉菌株在纤维素酶生产中的应用。 4. 一种制备纤维素酶的方法， 其特征在于， 所述的方法是用权利要求 1 所述的里氏木 霉菌株接种到发酵培养基中， 培养后添加乳糖诱导菌体进行发酵生产纤维素酶。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述的发酵培养基的组成如下 ： 葡萄糖 30-50g/L， 乳糖 2.0-10g/L， 玉米浆 20-50g/L， 硫酸铵 10-30g/L， 硫酸镁 5-10g/L， 磷酸二氢 钾 15-30g/L。 权 利 要 求 书 CN 104328056 A 2 1/。
5、4 页 3 一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物筛选技术领域， 具体涉及一种高产纤维素酶的里氏木霉及其在 纤维素酶生产中的应用。 背景技术 0002 里氏木霉 (Trichoderma reesei) 是一种丝状真菌， 属于多细胞的真核微生物， 是 红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型， 分类上隶属于真菌门、 半知菌亚门、 丝孢纲、 丛 梗孢目、 木霉属。 里氏木霉广泛分布于自然界， 在腐木、 种籽、 植物残体、 有机肥、 土壤和甚至 是空气中 (Montenecourt&Eveleigh,1979,Adv Chem Ser.)。 000。
6、3 里氏木霉能表达多种胞外纤维素酶和半纤维素酶， 包括外切纤维素酶 (CBH1 和 CBH2)、 内切纤维素酶 (EG1、 EG2、 EG3、 EG4 和 EG5 等 )、 beta- 葡萄糖苷酶、 木聚糖酶和甘 露聚糖酶等。通过这些纤维素酶和半纤维素酶的协同作用， 将纤维素彻底分解为单糖 (Biely&Tenkanen.1998,In Trichoderma and Gliocladium)， 因此， 木霉产纤维素酶已经是 二代纤维素生物乙醇的主要酶制剂来源。 0004 但是， 木霉纤维素酶和半纤维素酶往往是协同表达的， 而影响木霉纤维素酶表达 的因素很多。首先， 培养碳源的影响 ： 纤维素。
7、， 乳糖和槐糖用来诱导木霉产纤维素酶 ； 葡 萄糖和甘油等阻遏纤维素酶的表达。碳源的诱导作用是调控因子来影响表达的， 如与诱 导表达相关的正调控因子是 ACEII 和 XYR1， 而负调控因子是 CRE1 和 ACEI(Ilme n et al.,1997,Mol.Gen.Genet. ； Foreman et al.,2003,J.Biol.Chem.)。其次， 菌体 ( 菌丝 ) 形 态也是影响分泌表达的关键因素之一。一般认为， 丝状真菌是通过顶端分泌来输出胞外蛋 白的。因此， 高效分泌菌株形态上往往是多分枝的。 0005 然而从自然界中直接筛选到的木霉菌株产酶水平往往很低， 不适合商业生。
8、产。因 此， 如何通过现有技术改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量， 以降低生产成本就成为本领域 的研究热点之一。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一株高产纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用， 通过紫外诱变 的方法获得了一株菌落形态小且高产纤维素酶的里氏木霉突变株， 可广泛应用于纤维素酶 的生产， 降低生产成本。 0007 本发明一方面提供了一株里氏木霉 (Trichoderma reesei) 突变菌株 VLKDN-1， 已于 2014 年 10 月 22 日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCC NO ： M 2014506。 0008 本发明还提供了上述里氏木。
9、霉突变菌株 VLKDN-1 在纤维素酶生产中的应用。 0009 本发明利用紫外诱变技术， 并结合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突 变菌株。与出发菌相比， 突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的发酵上清液酶活提高了 235， 蛋白含 量提高了 157； 该突变菌的菌落形态明显小于出发菌， 且菌丝比出发菌的菌丝短、 分枝多。 说 明 书 CN 104328056 A 3 2/4 页 4 在生产过程中， 该突变菌株 “小型化” 的菌落形态以及菌丝短、 分枝多的特点能使发酵菌液 的粘度显著降低， 达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的， 从而有利于降低生产成本， 应用前 景广泛。 附图说明 0010 图。
10、 1 ： 出发菌和突变菌的菌落形态比较， 其中 ： A 为出发菌， B 为突变菌里氏木霉 VLKDN-1 ； 0011 图 2 ： 出发菌和突变菌的菌丝形态比较， 其中 ： A 为出发菌， B 为突变菌里氏木霉 VLKDN-1。 具体实施方式 0012 下面结合具体的实施方案对本发明进行更详细的描述。 但本发明并不受所述实施 例的限制。提供实施方案的目的是为了使说明书全面而透彻， 并向本领域的技术人员全面 传达发明的范围。除另定义外， 本发明所使用的所有技术和科学术语均具有作为本发明所 属技术领域中普通技术人员通常理解的同样的含义。 0013 实施例 1 菌落 “小型化” 突变菌株的筛选 00。
11、14 1、 菌种处理 ： 0015 将出发菌种里氏木霉 ( 该菌株是本专利发明人黄亦钧于 2013 年 6 月从青岛市崂 山区林场的枯树皮中筛选到的 ) 接种于 PDA 琼脂平板 ( 马铃薯 200-300 克， 葡萄糖 20 克， 琼脂 15-20 克， 自来水 1000 毫升， 自然 pH) 上， 28-30恒温培养 1 周至稳定期。待孢子成 熟后， 往平板上加入 5-10ml 无菌水洗刷孢子， 吸取孢子悬液并计数， 依据孢子含量用调整 其浓度至 105-6个 /ml， 然后进行后续诱变处理。 0016 2、 诱变筛选 ： 0017 将上述孢子悬液， 加入到空平板中， 并进行磁力搅拌 (2。
12、0-550rpm)， 然后利用紫 外对准平板进行诱变处理， 诱变条件为 ： 10-20W 紫外灯， 照射距离为 10-20cm， 照射时间为 3-5min ； 然后将诱变后的孢子悬液在暗光或红光条件下涂布于 PDA 琼脂平板 ； 最后将平板 至于 30恒温培养， 直至长出菌落， 时间约为 7-10 天。 0018 挑取菌落形态明显小于出发菌的突变体菌分别接种到 PDA 琼脂平板。 0019 实施例 2 高产纤维素酶突变菌株的筛选 0020 1、 利用 96 深孔板筛选 ： 0021 在 96 深孔板的孔中加入 2-3ml 诱导培养基， 诱导培养基 (GLC 培养基 ) 的组成为 CaCl21.。
13、125g/L， 葡萄糖 10g/L， 乳糖 20g/L， 玉米浆 15mlg/L， 微量元素 10ml/L， KH2PO420g/L， pH5.0 ； 其中微量元素 (ME) 的组成为 FeSO4.7H2O 0.75g/L,ZnSO4.7H2O 0.06g/L,CuSO4.5H2O 0.012g/L,MnSO4.H2O0.053g/L,H3BO30.003g/L。 然后将实施例1中筛选到的突变株分别接种 于各个孔中， 置于摇床上， 30， 200rpm， 培养 3 天。培养结束后， 分别离心取上清进行酶活 检测和 SDS-PAGE 电泳检测。根据检测结果， 筛选出酶活和胞外蛋白含量显著高于出发。
14、菌的 突变菌共 4 株， 分别命名为 VLKDN-1， VLKDN-2， VLKDN-3， VLKDN-4。 0022 (1) 酶活测定的方法 ： CMC 法 0023 (2) 测定的原理 ： 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末 说 明 书 CN 104328056 A 4 3/4 页 5 端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与 3,5- 二硝基水杨酸 (DNS) 试剂发生显色反应。反 应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比， 而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶 的活力成正比。 因此， 通过分光比色测定反应液颜色的强度， 可以计算反应液中纤维素酶的 活力。 0024 (3)。
15、 测定过程 ： 取三支试管各加入 0.5mlCMC 底物， 与待测酶液一起 50水浴预热 5min。在第一、 二试管中各加入 0.5ml 待测液， 并计时， 50水浴中反应 15min。反应完后在 三支试管中各加入 1.5ml 的 DNS 试剂， 并在第三支试管中补加 0.5ml 的待测酶液。取出并 摇匀三支试管后， 在沸水浴中反应 5min。迅速冷却至室温， 用水定容至 5.0ml。以第三支试 管液为对照在 540nm 波长条件下测得第一、 二试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线 计算出酶活力值。 0025 (4) 酶活力计算 ： 0026 酶活力 (IU/ml 或 IU/g) ( 葡萄糖。
16、等量值 /180/15/0.5)n 0027 式中 ： 180葡萄糖从微克换算成微摩尔 0028 15待测液与底物的反应时间 0029 0.5加入反应的待测酶液量 0030 n酶样的稀释倍数 0031 2、 摇瓶筛选 ： 0032 将上述四株突变菌 (VLKDN-1， VLKDN-2， VLKDN-3， VLKDN-4) 分别接种于 500ml 三 角瓶中 ( 含 50mlGLC 诱导培养基 )， 置于摇床上， 30， 200rpm， 培养 5-7 天。培养结束后， 分 别离心取上清， 进行酶活检测(CMC酶活检测法)和蛋白含量测定(考马斯亮蓝检测法)， 结 果如表 1 所示。 0033 菌株。
17、酶活 (U/ml)蛋白含量 (g/L) 出发菌910.41 突变菌 VLKDN-11690.70 突变菌 VLKDN-21430.60 突变菌 VLKDN-31490.62 突变菌 VLKDN-41570.65 0034 从表 1 的结果可以看出， 本发明筛选到的 4 株突变菌中 VLKDN-1 的发酵酶活和胞 外蛋白含量最高， 比出发菌提高了 70 -85， 取得了显著的技术效果。 0035 申请人将该突变株命名为里氏木霉 VLKDN-1(Trichoderma reesei VLKDN-1)， 并 于 2014 年 10 月 22 日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏编。
18、号为 CCTCC NO ： M 2014506。 0036 实施例 3 突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的纯化 0037 将里氏木霉 VLKDN-1 接种于 PDA 琼脂平板上， 28-30恒温培养 1 周至稳定期。待 说 明 书 CN 104328056 A 5 4/4 页 6 孢子成熟后， 往平板上加入 5-10ml 无菌水洗刷孢子 ； 然后再次吸取适量孢子悬液涂布于 PDA 平板， 最后将平板至于 30恒温培养， 直至长出单菌落 ； 挑取单菌落， 即纯化的突变菌 里氏木霉VLKDN-1， 接种于PDA平板。 同时， 以出发菌作为对照组， 采用上述同样操作进行培 养、 纯化， 挑取单菌落接。
19、种于 PDA 平板。 0038 在 PDA 平板上培养 1 周后， 出发菌和突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的菌落形态和菌丝 形态均差异显著。如图 1 所示， 突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的菌落形态明显小于出发菌 ； 如图 2 所示， 突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的菌丝比出发菌的菌丝短、 分枝多。 0039 实施例 4 突变菌里氏木霉 VLKDN-1 的发酵放大培养 0040 将出发菌和突变菌里氏木霉 VLKDN-1 分别接种于摇瓶种子培养基 ( 葡萄糖 10-30g/L， 土豆 100-200g/L)， 30， 200rpm 摇床培养 48h 之后， 然后将发酵液转入 7.5L 发 。
20、酵罐(培养基为 ： 葡萄糖30-50g/L， 乳糖2.0-10g/L， 玉米浆20-50g/L， 硫酸铵10-30g/L， 硫 酸镁 5-10g/L， 磷酸二氢钾 15-30g/L)， 温度控制在 251， pH 值控制在 5.00.2， 在发酵 罐培养10h到15h之后， 开始补加乳糖诱导菌体产酶， 发酵时间约为160h到170h， 制成发酵 菌液。 0041 将上述发酵菌液离心， 取上清， 进行酶活检测 (CMC 酶活检测法 ) 和蛋白含量测定 (考马斯亮蓝检测法)。 结果显示， 出发菌的发酵上清液酶活为457U/mL， 蛋白含量为2.47g/ L， 突变菌里氏木霉VLKDN-1的发酵上清液酶活为1533U/mL， 比出发菌提高了235， 蛋白含 量为 6.35g/L， 比出发菌提高了 157。 0042 综上， 本发明通过紫外诱变技术结合摇瓶筛选， 获得的突变菌里氏木霉 VLKDN-1 不仅能大幅提高纤维素酶的产量， 而且其 “小型化” 的菌落形态以及菌丝短、 分枝多的特点 能使其发酵菌液的粘度显著降低， 达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的， 从而有利于降低 生产成本， 应用前景广泛。 说 明 书 CN 104328056 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104328056 A 7 。