一种细菌性痢疾多价疫苗.pdf

一种细菌性痢疾多价疫苗，包括志贺氏菌不同血清型抗原O-特异性多糖偶联载体蛋白质的单价偶联物，其特征是所述的多价疫苗是由志贺氏菌中至少两种或两种以上O-特异性多糖单价偶联物组成的二价疫苗或二价以上直至四十七价疫苗。志贺氏菌不同血清型偶联物相互混合后偶联物之间不发生物理的或化学的变化，并不影响各自的免疫原性，为开发覆盖更多的志贺氏血清型多价偶联疫苗、保护更多人群免受细菌之害奠定了基础。

1、  一种细菌性痢疾多价疫苗，包括志贺氏菌不同血清型抗原O-特异性多糖偶联载体蛋白质的单价偶联物，其特征在于：所述的多价疫苗是由志贺氏菌中至少两种或两种以上O-特异性多糖单价偶联物组成的二价疫苗或二价以上直至四十七价疫苗。

2、  根据权利要求1所述的多价疫苗，其特征在于：所述的多价疫苗是由痢疾志贺菌和福氏志贺菌及宋内氏志贺菌中至少两种或两种以上O-特异性多糖单价偶联物组成的二价疫苗或二价以上直至二十九价疫苗。

3、  根据权利要求1或2所述的多价疫苗，其特征在于：所述的多价疫苗由痢疾志贺氏I型、福氏2a和宋内氏三种O-特异性多糖偶联物组成的三价疫苗。

4、  根据权利要求3所述的多价疫苗，其特征在于：所述的多价疫苗由痢疾志贺氏I型和宋内氏两种O-特异性多糖偶联物组成的二价疫苗。

5、  根据权利要求1或2或4所述的多价疫苗，其特征在于：疫苗中含有佐剂和/或缓冲液，所述的佐剂选自铝佐剂或皂角类佐剂或细菌脂多糖或合成类脂A佐剂或毒素亚单位类佐剂；所述的缓冲液选自磷酸缓冲液或Tris缓冲液。

6、  根据权利要求5所述的多价疫苗，其特征在于：疫苗中含有稳定剂或/和分散剂，所述的稳定剂选自氨基酸，所述的分散剂选自多聚山梨醇酯。

7、  由权利要求1所述的细菌性痢疾多价疫苗，可用公知技术加工成各种制剂，其特征在于：所述的制剂选自液体剂或冻干剂或胶囊剂或片剂或丸剂。

一种细菌性痢疾多价疫苗
一、技术领域
本发明涉及疾病预防用的疫苗，确切地说一种细菌性痢疾多价疫苗。
二、背景技术
早在1898年，在东京北里研究所工作的Shiga就发现了志贺氏菌，100多年过去了，志贺氏菌引起的菌痢依然是全球范围内最高发、最常见的传染病。据世界卫生组织统计，全球每年菌痢患者达到1.647亿，其中1.632亿在发展中国家，造成110万的死亡。细菌性痢疾是经粪口传播的肠道传染病，和地方的卫生条件息息相关，因而是发展中国家最常见疾病。我国细菌性痢疾也是一种多发病和常见病，每年的报告病例近100万，是我国夏秋季发病率最高的传染病。
志贺氏菌属共分四群47个血清型，具体为痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae，13个血清型)、福氏志贺菌(Shigella flexneri，15个血清型)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii，18个血清型)和宋内氏志贺菌(Shigella sonnei，1个血清型)。菌型的分布在不同地区有所不同，在发达国家常以宋内氏志贺菌为主，在发展中国家以福氏志贺菌为主。痢疾志贺氏菌以I型为主，常引起中毒性痢疾，死亡率极高。我国地域辽阔，地区间的经济发展不平衡，志贺氏菌的分布也有所不同，在经济发达地区，宋内氏志贺菌比例在逐渐上升，但整体而言，我国志贺氏菌以福氏为主导，最常见的血清型为2a，其次可见1b、X变种、2b和4型等。痢疾志贺氏I型菌引起的病例不多，但由于发病急、病死率高，也应该引起足够重视。
志贺氏菌属发现虽逾百年，但目前还没有特别有效的疫苗。我国批准有口服痢疾双价疫苗，为全菌体活疫苗，含福氏志贺氏2a和宋内氏志贺氏菌两个血清型的脂多糖抗原，但由于各方面的原因，到目前仍未大规模使用。从全球来看，针对细菌性痢疾的疫苗研发上世纪四、五十年代就已开展，但所有疫苗候选株或是安全性问题，或是效果不确定，都只开展到临床研究阶段。受b型流感嗜血杆菌多糖蛋白质偶联疫苗的启发，许多细菌性疫苗的研制都参照这种思路。志贺氏菌的O-特异性多糖是保护性抗原，以此多糖成分偶联蛋白质载体制备细菌性痢疾疫苗从理论上将是可行的。国外用类似方法制备的福氏2a痢疾偶联疫苗和宋内氏痢疾偶联疫苗经人体试验后，证明都能诱导产生高效价的特异性抗体应答。在以色列的临床试验证明，宋内氏痢疾偶联疫苗能产生74％的对型保护。国内也有类似的研究报道，分别制备有痢疾志贺氏I型偶联疫苗、福氏2a型偶联疫苗、宋内氏偶联疫苗，经动物试验证明，都能诱导产生特异性的免疫应答。然而目前的化学偶联疫苗均属单价疫苗，没有一种
覆盖面广的多价疫苗。
细菌的O-特异性多糖是来源于革兰氏阴性细菌脂多糖的抗原成分。革兰氏阴性细菌的脂多糖是一种毒性成分，也是细菌的保护性抗原，它的抗原决定簇位于脂多糖的O-特异性多糖侧链部分。通过化学方法可将志贺氏菌的O-特异性多糖从菌体中分离出来，但O-特异性多糖分子量一般在1万道尔顿左右，是半抗原，而且它的结构也是单元重复类型，属于典型的T细胞非依赖型抗原，可以采用氨还原、氰化物活化或其他适宜的方法，将O-特异性多糖成分与载体蛋白质共价偶联，使其转化为T细胞依赖性抗原，制备出不同型的细菌性痢疾单价偶联物。再者，由于志贺氏菌属有多个血清型，常见的流行型也有数种，而O-特异性多糖成分是血清特异性的，血清群之间没有交叉保护，血清型内部的交叉保护还有待于验证，因而，开发尽量多的含盖各种血清型细菌性痢疾的多价疫苗是可行的，尤其是优势菌型。
三、发明内容
本发明针对现有细菌性痢疾疫苗多为减毒活疫苗、而少数化学偶联疫苗均为单价偶联疫苗的现状，旨在提供一种安全性高、免疫原性好、覆盖面广的细菌性痢疾多价疫苗，所要解决的技术问题是首先提取血清型抗原O-特异性多糖，然后与载体蛋白质制备不同的单价偶联物，最后要配成多价疫苗。
本发明采用液体培养基发酵罐培养志贺氏菌，经甲醛杀菌后，连续流离心收集菌体，-20℃以下保存备用。采用常规方法提取、纯化脂多糖，如三氯醋酸法、酚水法和酚氯仿法等。纯化好的脂多糖经弱酸水解，凝胶层析纯化O-特异性多糖成分。
本发明还提供了一种全新的方法，用于制备O-特异性多糖成分。发酵罐培养的志贺氏菌，经甲醛杀菌后，中空纤维浓缩菌体，弱酸和/或表面活性剂处理菌体，离心收集上清，层析纯化O-特异性多糖成分。
本发明制备的O-特异性多糖成分残余核酸和残余蛋白质含量都低于5％，最佳低于2％，更佳低于1％。内毒素含量低于100EU/μg多糖，最佳低于50EU/μg多糖，更佳低于10EU/μg多糖。制备的O-特异性多糖成分能与特异性血清形成免疫沉淀线。
本发明制备不同型单价偶联物是根据志贺氏菌各O-特异性多糖结构的特征，采用不同的方法制备单价偶联物。优选O-特异性多糖经溴化氰活化后，与己二酰二肼(ADH)反应，形成交联臂，再通过碳二亚胺(EDAC)介导的缩合作用与载体蛋白质共价结合，制备出各单价偶联物，凝胶层析纯化，除菌过滤后备用。也可以用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)活化O-特异性多糖，与ADH反应，再偶联形成结合物，凝胶层析纯化。还可以采用经典的氨还原法制备偶联物，用高碘酸钠氧化O-特异性多糖，与载体蛋白质直接偶联，再用硼氰化钠还原，凝胶层析纯化。还可以利用O-特异性多糖上固有的羧基或氨基，在EDAC介导的缩合作用下，直接与载体蛋白质反应。所述的载体蛋白质选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、突变白喉毒素中的交叉反应物质(CRM9，CRM197)、百日咳类毒素(PT)、B群流脑外膜蛋白质复合物(OMP)、流脑64K外膜蛋白、流感嗜血杆菌P1、P2、P4、P5、P6外膜蛋白、黏附素、重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)、白蛋白、匙兰蛋白中的任何一种。
本发明的偶联物纯化方法优选凝胶层析，所用填料可以用葡聚糖凝胶(Sephadex)，优选琼脂糖凝胶(Sepharose)，最优选丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)。偶联物纯化也可以采用切向流超滤膜过滤，选择超滤膜孔径(截留分子量)10-50万道尔顿，优选20-40万道尔顿，最优选30万道尔顿。偶联物纯化还可以采用离心交换层析或/和疏水层析。
本发明所称的细菌性痢疾多价疫苗，包括志贺氏菌不同血清型抗原O-特异性多糖偶联载体蛋白质的单价偶联物，与现有技术的区别是本多价疫苗由志贺氏菌中至少两种或两种以上O-特异性多糖单价偶联物组成的二价疫苗或二价以上直至四十七价疫苗。所述的四十七价疫苗包括痢疾志贺菌13个血清型、福氏志贺菌15个血清型、鲍氏志贺菌18个血清型和宋内氏志贺菌1个血清型间的相互组合。优选二价或二价以上直至二十九价疫苗，即痢疾志贺菌13个血清型、福氏志贺菌15个血清型和宋内氏志贺菌1个血清型间的相互组合。下边举例只选择部分最佳组合，其他志贺氏菌属血清型间的组合也应包括在本发明范围之内。具体包括但不仅限于：
1、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、福氏4a、福氏6型、X变种、Y变种、宋内氏I相九价痢疾疫苗；
2、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、福氏6型、X变种、Y变种、宋内氏I相八价痢疾疫苗；
3、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、福氏4a、X变种、Y变种、宋内氏I相八价痢疾疫苗；
4、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、福氏4a、福氏6型、X变种、宋内氏I相八价痢疾疫苗；
5、痢疾志贺氏I型、福氏1b、福氏2a、福氏4a、福氏6型、X变种、Y变种、宋内氏I相八价痢疾疫苗；
6、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、X变种、Y变种、宋内氏I相七价痢疾疫苗；
7、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、福氏6型、X变种、宋内氏I相七价痢疾疫苗；
8、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、福氏4a、X变种、宋内氏I相七价痢疾疫苗；
9、痢疾志贺氏I型、福氏1b、福氏2a、福氏4a、福氏6型、X变种、宋内氏I相七价痢疾疫苗；
10、痢疾志贺氏I型、福氏1a、福氏1b、福氏2a、X变种、宋内氏I相六价痢疾疫苗；
11、痢疾志贺氏I型、福氏1b、福氏2a、福氏6型、X变种、宋内氏I相六价痢疾疫苗；
12、痢疾志贺氏I型、福氏1b、福氏2a、福氏4a、X变种、宋内氏I相六价痢疾疫苗；
13、痢疾志贺氏I型、福氏1b、福氏2a、X变种、宋内氏I相五价痢疾疫苗；
14、痢疾志贺氏I型、福氏2a、X变种、宋内氏I相四价痢疾疫苗；
15、痢疾志贺氏I型、福氏1b、福氏2a、宋内氏I相四价痢疾疫苗；
16、痢疾志贺氏I型、福氏2a、宋内氏I相三价痢疾疫苗；
17、福氏2a、宋内氏I相二价痢疾疫苗。
以上多价组合中，最优选痢疾志贺氏I型、福氏2a、宋内氏三价痢疾疫苗和福氏2a、宋内氏二价痢疾疫苗。
本发明的多价疫苗中，每一人用剂量含每种血清型的O-特异性多糖为1-50μg，优选2-40μg，更优选5-30μg，最优选10-25μg。小鼠免疫原性实验使用剂量为1-1/10人用剂量，优选1/10人用剂量。家兔免疫原性实验使用剂量为1-1/10人用剂量，优选1/5人用剂量。
本发明多价疫苗可包含佐剂和/或缓冲液，所述的佐剂选自铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等。水包油或细菌细胞壁成份，如MF59、SAE、RAS等。或者皂角类佐剂，如Quil A、QS-21。或者细菌脂多糖或合成类脂A佐剂。细胞因子，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、共刺激分子B7-1、B7-2等。或者毒素亚单位类佐剂，如霍乱毒素及亚单位、百日咳毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)等。所述的缓冲液选自磷酸缓冲液或Tris缓冲液浓度可以是0.01-0.05M，优选0.01-0.02M，最优选0.01M。
本发明多价疫苗还可包含稳定剂和/或分散剂，稳定剂选自氨基酸，氨基酸可以是组氨酸，优选L-组氨酸，使用浓度1-100mM，优选2-50mM，更优选3-10mM，最优选5mM。组氨酸可以组氨酸缓冲液的形式出现。分散剂选自多聚山梨醇酯，优选Tween 80，使用浓度0.01-1％，优选0.01-0.1％，更优选0.02-0.05％。
本发明多价疫苗，可用公知技术加工成供临床用的各种制剂，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型，更优选液体剂型和冻干剂型，最优选液体剂型。
本发明多价疫苗接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服，还包括口腔、鼻腔、肛门、阴道黏膜途径。
总之，本发明的痢疾多价偶联疫苗可以覆盖更多的志贺氏血清型，保护更多人群免受菌痢之害。而且，本发明的痢疾多价偶联疫苗是一种全新的组合，至今还未见类似疫苗。本发明的独到之处还在于发现不同血清型的志贺氏菌偶联物成分以适当比例混合到一起，并不影响各自的免疫原性，偶联物之间也没有其他物理和化学的变化，为多价疫苗的开发奠定了基础。
四、附图说明
图1.福氏2a志贺氏菌的脂多糖、O-特异性多糖、单价偶联物与福氏2a志贺氏菌免疫血清的琼脂免疫双扩散图。表明提取的脂多糖和O-特异性多糖，到用化学方法制备出的单价偶联物都保存有良好的抗原性。
图2.福氏2a志贺氏菌的O-特异性多糖在190-300nm光波范围内的扫描图。表明纯化的福氏2a志贺氏菌的O-特异性多糖残余核酸和残余蛋白质含量低。
图3.福氏2a志贺氏单价菌偶联物的Sepharose 4B层析纯化图。图中2个峰，左边峰是第一峰，是福氏2a志贺氏菌单价偶联物，右边峰是第二峰，是未结合上的物质及其他残余化学物。
五、具体实施方式
本发明可通过如下实施例进一步了解，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅为了更好展示本发明，而非对发明内容进行限制。
实施例1
福氏2a志贺氏菌的发酵培养
开启福氏2a志贺氏菌菌种，接种于2支大豆胨斜面，35-37℃培养12-24小时，扩种于2个500ml液体培养基中，35-37℃培养摇床培养8-16小时，扩种于10-20L液体培养基中，35-37℃培养摇床培养4-8小时，接种含300-500L液体培养基的发酵罐中，35-37℃培养到生长至对数生长末期，其间维持pH在中性，革兰氏染色镜检和纯菌实验。无污染的培养物加终浓度0.5-2％的甲醛灭菌，连续流离心机分离菌体。
其他血清型志贺氏菌的发酵培养与福氏2a志贺氏菌类似，仅宋内氏志贺氏菌采用类志贺氏邻单胞菌，发酵培养类似。
实施例2
脂多糖提取
以10％的浓度将菌体悬浮于95％酚溶液中，68℃充分搅拌1小时，离心，分离水相，酚相再补充水至原体积，68℃抽提30分钟，离心，分离水相。两次水相合并，加乙醇至浓度25％，补充部分盐离子，离心，去沉淀。上清加乙醇至浓度75％，离心收集沉淀。无水乙醇、丙酮洗涤后抽干。
实施例3
O-特异性多糖提取
脂多糖以1％的浓度溶解于1％冰醋酸溶液中，沸水浴60-90分钟，60000-80000g离心2-4小时，收集上清，凝胶层析收集多糖部分，75％乙醇沉淀或冻干。
实施例4
菌体直接提取O-特异性多糖
培养灭活的培养物用0.22-0.45μ的超滤膜(或中空纤维)浓缩至1/10-1/20体积，5倍生理盐水洗涤后，加脱氧胆酸钠至0.5％，35-40℃搅拌1小时，加冰醋酸至1％浓度，沸水浴60-90分钟，伴随搅拌悬浮，离心收集上清。加乙醇至25％，离心去除沉淀，加乙醇至75％，离心收集沉淀，无水乙醇、丙酮洗涤，抽干，获得粗提物。粗提物溶解于无热源水至10mg/ml，离心去除沉淀，上清用羟基磷灰石纯化，收取O-特异性多糖部分，75％乙醇沉淀或冻干。
实施例5
溴化氰活化法制备偶联物
O-特异性多糖溶解为10mg/ml，调pH至10-11，等重量加入溴化氰，反应5-10分钟，维持pH在10-11。等体积加入0.5M ADH溶液，维持pH在8.5，反应至pH相对稳定，置2-8℃过夜。
超滤洗涤去除未反应的ADH，调整O-特异性多糖浓度至20mg/ml，调pH至5-6，等体积加入20mg/ml浓度的载体蛋白质，加入EDAC至0.01-0.05M，维持pH 5-6反应3-6小时，透析。
实施例6
氨还原法制备偶联物
O-特异性多糖溶解为10mg/ml，加入高碘酸钠至20-30mM，4℃暗中反应过夜，超滤洗涤去除未反应的化学物质。调整O-特异性多糖浓度至20-50mg/ml，加入适量载体蛋白质，在硼氰化钠(1M)存在的条件下反应24-72小时，pH为6.1，加入ADH终止反应。
实施例7
偶联物纯化
凝胶过滤纯化结合物，缓冲液为0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)，pH为中性。收集V0附近的偶联物，除菌过滤。
也可以超滤纯化，超滤膜的截留分子量300K。用含硫酸铵的生理盐水超滤洗涤偶联物反应液，再用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，逐级除菌过滤。
实施例8
痢疾多价疫苗配制
在配制罐中加入适量0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)，依次加入L-组氨酸、Tween 80、各志贺氏血清型偶联物单价原液，使终浓度分别为：L-组氨酸5mM，Tween 800.025％，各型志贺氏偶联物O-特异性多糖含量20μg/ml。若需铝佐剂，可加入至铝含量终浓度为0.44mg/ml。
实施例9
痢疾多价疫苗小鼠免疫力实验
选用BABL/c小鼠，皮下免疫痢疾多价疫苗两针，间隔2周，剂量0.1ml，以PBS为对照。痢疾多价疫苗免疫分两组，分别免疫痢疾志贺氏I型、福氏2a、宋内氏三价痢疾偶联疫苗和福氏2a、宋内氏二价痢疾偶联疫苗。每组20只小鼠，分别于第一针和第二针免疫后2周，经摘眼球采血，离心收集血清测定。
血清测定采用间接ELISA，以相应的血清型脂多糖包被酶标板，包被浓度0.1-1μg/孔。测定结果见表1。
表1.痢疾多价偶联疫苗免疫原性研究