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一种抗氧化防衰老的保健品
技术领域
本发明属功能保健食品技术领域。
背景技术
在生物体内存在各种自由基，如超氧阴离子自由基(O₂^·-)、羟自由基(OH·)、二氧化氮(NO₂·)和一氧化氮(NO·)自由基等。自由基是疾病和衰老的罪魁祸首，在生物体内，一旦体内清除自由基的能力减弱，疾病就随之而来。
研究发现，一些疾病如心脑血管疾病、中枢神经系统疾病和癌症等的产生不单单是由自由基的氧化造成的，而是自由基相互之间快速结合后，产生一种比其母分子更具有氧化性和细胞毒性的物质。过氧亚硝酸根——一氧化氮和超氧阴离子自由基快速结合的产物，能够介导生物大分子(DNA、蛋白质和脂质)的修饰与损伤。有人专门研究了过氧亚硝酸根与低密度脂蛋白(LDL)的作用，结果表明过氧亚硝酸根将LDL氧化生成ox-LDL(氧化低密度脂蛋白)。ox-LDL具有损伤动脉血管内皮细胞，刺激血管平滑肌细胞增殖，导致血管细胞凋亡等作用，与动脉粥样硬化的致病过程紧密相联。
由于人体内不存在清除过氧亚硝酸根专一的酶类，体内的酶系统-SOD、CAT等“人体卫士”对人体产生的自由基清除能力是有限的。当人体受环境影响时，如机体损伤或衰老，都会产生大量的氧、羟基等自由基，此时“人体卫士”就无法完全清除过多的自由基，这就需要人们从外界补充，以便最大限度地清除自由基的毒性效应。
目前人们主要通过自然的食物、营养食品或是个别药物来摄取各种抗氧化剂，其抗氧化效果往往不能够最大效益的发挥，比如当硒(Se)和生育酚(Ve)搭配食用时，生育酚才能够发挥最好的抗氧化效果。
发明内容
本发明的目的在于既考虑了对体内自由基及其自由基生成物的清除能力，又考虑了免疫调节、新陈代谢、肝脏排毒等生命现象，从而研制了一种成分丰富、配比恰当的无毒副作用的新型抗氧化保健复合配方。
本发明选用具有巨大药用价值的紫锥菊(Echinacea)和迷迭香(Rosemary)提取物作为配方的主要成分。紫锥菊提取物购自陕西弓博科技发展有限公司，迷迭香水溶性提取物购自海南迷迭香生物工程有限公司。(迷迭香中提取的抗氧化成分除黄酮外，主要是鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酸和迷迭香酚，它们都具有二酚双萜的活性部位。此外，迷迭香中还含有迷迭香二酚、迷迭香醌等多种不同的酚类，这些酚类物质之间以加合作用来表现整体的抗氧化性，并且这些成分都不容易挥发，具有良好的热稳定性。紫锥菊提取物的主要有效成分为咖啡酸衍生物，包括菊苣酸、绿原酸、咖啡酸、紫锥菊甙、菜蓟菊和异绿原酸等。
本发明提供了一种抗氧化防衰老成分的保健品，其特征在于：包括迷迭香提取物、紫锥菊提取物、抗坏血酸、生育酚和亚硒酸钠。
所述的保健品，其特征在于：还包括β-胡萝卜素。所述的保健品，其特征在于，各种原料的重量份为：迷迭香提取物800-1200份，紫锥菊提取物800-1200份，β-胡萝卜素50-100份，抗坏血酸50-150份，生育酚20-40份，亚硒酸钠1-5份。
紫锥菊具有抗菌作用，能抗细菌、抗病毒与抗炎症。在美国，紫锥菊被草药产品协会给予一级安全等级，而且紫锥菊几乎很少引起过敏反应，它的主要成分有多糖、黄酮、咖啡酸的衍生物、精油、多炔、烷基胺(Alkylamides)和生物碱。迷迭香系唇形科迷迭香属，是目前公认的具有较高抗氧化作用的一种植物，主要成分为迷迭香酚、表迷迭香酚，异迷迭香酚、迷迭香酸及黄酮、黄酮苷等。
本发明同时含有亚硒酸钠和生育酚。研究发现，血硒水平的高低与癌的发生息息相关，硒被科学家称之为人体微量元素中的“抗癌之王”。硒是谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)的组成成分，GSH-Px是体内重要的自由基清除剂，但与生育酚在体内的抗氧化机制不同，所以生育酚和硒两者相互补充，具有协同作用。
本发明含有抗坏血酸。对人体来说，抗坏血酸是一种必需的营养物质，抗坏血酸在体内参与多种反应，如参与氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。抗坏血酸主要与细胞间质的合成有关，缺乏抗坏血酸，胶原蛋白合成受阻，导致细胞连接障碍，不但会使正常的细胞间信号转导受阻，而且加快癌细胞对正常体细胞的侵染。抗坏血酸同时可促进胆固醇的排泄，防止胆固醇在动脉内壁沉积，所以对动脉粥样硬化有一定的防治效果。
本发明含有β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。近十年来胡萝卜素受到医学界空前的关注，原因是很多流行病学的调查说明：在膳食中经常摄取丰富胡萝卜素的人群，患动脉硬化、某些癌肿以及退行性眼疾等疾病的机会都明显低于摄取较少胡萝卜素的人群。研究发现，β-胡萝卜素只有在饮食中同时含有维他命C和E等其他的重要抗氧化剂时才能发挥它的抗癌作用。β-胡萝卜素也是一种常用的食品着色剂。
附图说明
图1：不同组合对过氧亚硝酸根诱导DNA链断裂的抑制效果图
图2原料不同剂量配比对生成TBARS的抑制效果图
图33-硝基酪氨酸标准曲线
图4不同组合对ABTS⁺的清除效果图
具体实施方式
【实施例1】对过氧亚硝酸根诱导DNA链破坏的抑制试验
分组：组1阳性对照组。
组2阴性对照组
组3迷迭香提取物1000mg，紫锥菊提取物1000mg，抗坏血酸20mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组4生育酚2000mg，亚硒酸钠20mg。
组5抗坏血酸2000mg，亚硒酸钠20mg。
组6抗坏血酸1000mg，生育酚1000mg，亚硒酸钠20mg。
试验方法：以上各组用去离子水定容至100mL，使用前稀释500倍。
图1为本配方抑制DNA链断裂的DNA电泳效果图。Line1为阳性对照——只有DNA；Line2为阴性对照——DNA和过氧亚硝酸根的混合物；Line3-Line6分别为加入组3-组6该配方后的DNA电泳。从图1可知，未加过氧亚硝酸根的DNA结构未发生变化(SupercoiledDNA)，加入了过氧亚硝酸根而未加入抑制剂的DNA链发生断裂(Open circular DNA)，加入不同成分组合物之后，部分DNA被保护，而组3所对应的DNA被保护效果最明显。同时不难看出，紫锥菊提取物和迷迭香提取物在保护DNA链断裂起的作用非常明显。
实验结果如下：
表1不同各组合物抗DNA链断裂结果

  组别  Open circular DNA(％)  Supercoiled DNA(％)  组1  0  100  组2  100  0  组3  28  72  组4  65  35
  组5  69  31  组6  60  40
试验证明：本发明的不同成分之间的配比都有抗过氧亚硝酸根诱导DNA链断裂的作用，但是我们发现只有将紫锥菊提取物、迷迭香提取物、抗坏血酸、亚硒酸钠和生育酚结合到一起，才能发挥最大的抗DNA链断裂效果(72％)。同时，我们也注意到，亚硒酸钠与生育酚一起的抗氧化效果要比亚硒酸钠与抗坏血酸的效果好(分别为35％和31％)。
【实施例2】相同成分不同剂量配比的抗DNA链断裂实验
分组：组1阳性对照
组2阴性对照
组3紫锥菊提取物800mg，迷迭香提取物800mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组4紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组5紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸150mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组6紫锥菊提取物1200mg，迷迭香提取物1200mg，抗坏血酸150mg，生育酚40mg，亚硒酸钠2mg。
实验方法同实施例1，实验结果如下：
表2各组抗DNA链断裂结果
  组别  Open circular DNA(％)  Supercoiled DNA(％)  组1  0  100  组2  100  0  组3  38  62  组4  31  69  组5  27  73  组6  15  85
以上实验说明在组分成分确定后，其对过氧亚硝酸根诱导DNA链断裂的抑制效果随组分浓度的增大而显著。
【实施例3】过氧亚硝酸根诱导LDL氧化和酪氨酸硝化的抑制试验
分组：组1去离子水对照组
组2紫锥菊提取物800mg，迷达香提取物800mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组3紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组4紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸150mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组5紫锥菊提取物1200mg，迷迭香提取物1200mg，抗坏血酸150mg，生育酚40mg，亚硒酸钠2mg。
以上各组用去离子水定容至100mL，使用前稀释500倍。
实验方法：1、以硫代巴比妥酸(TBARS)的生成量为指标研究了本配方对过氧亚硝酸根诱导的低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用。根据Lambert-Beer定律计算出TBARS的生成量。
2、利用高效液相色谱以3-硝基酪氨酸的生成量为指标研究不同组分对过氧亚硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用。具体步骤为：将100μl 1mmol/L的酪氨酸溶液(0.05mM PBSpH＝7.4)和稀释后的对应组分于37℃水浴中反应15分钟，然后各加入20mmol/L的过氧亚硝酸根溶液100μl，用PBS定容至1mL。样品经0.22μm针孔滤膜过滤。色谱柱选用反相色谱柱(Agilent C18，4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇∶磷酸盐缓冲溶液(0.05mMpH3.5)＝10∶90(V/V)；检测波长设定为365nm，流速为1mL/min，柱温为37℃。取20μL进样。所得数据根据3-硝基酪氨酸的标准曲线计算出不同浓度的新型保健配方与3-硝基酪氨酸生成量的关系。
试验结果
表3抗LDL氧化和酪氨酸硝化的实验结果
  组分  硫代巴比妥酸(μmol/L)  3-硝基酪氨酸(μmol/L)  组1  1.27  97.06  组2  1.07  58.20  组3  1.0  37.81  组4  0.97  31.69
  组5  0.92  22.65  组6  0.88  20.28
从表3可明显地看出，随着配方含量加大，硫代巴比妥酸的生成量在逐步减少，说明该配方对过氧亚硝酸根诱导LDL的氧化具有抑制作用，对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化也有抑制效果，因此在动脉粥样硬化等心脑血管疾病中，该新型保健配方具有一定的防治效果。
通过以上三个过氧亚硝酸根诱导DNA链的断裂、保护低密度脂蛋白(LDL)以及抑制过氧亚硝酸根对酪氨酸硝化的实验，本发明都具有很好的保护作用，因而对某些疾病如血栓、动脉粥样硬化等疾病有很好的预防效果。
【实施例5】对超氧阴离子自由基(O₂^·-)、羟基(OH·)自由基以及ABTS⁺的清除试验
分组：组1去离子水对照组
组2抗坏血酸2000mg，亚硒酸钠20mg。
组3生育酚2000mg，亚硒酸钠20mg。
组4抗坏血酸1000mg，生育酚1000mg，亚硒酸钠20mg。
组5紫锥菊提取物800mg，迷迭香提取物800mg，抗坏血酸20mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组6紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸20mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
试验方法：以上各组用去离子水定容至100mL，使用前稀释1000倍。
1、采用邻苯三酚法在碱性条件下邻苯三酚可以自氧化产生O₂^·-自由基，同时生成有色中间产物，在320nm处有最大吸收峰。在25℃恒温水浴中，向相同反应体系(邻苯三酚溶液60mmol/L，HCl 10mmol/L，Tris-HCl缓冲溶液pH＝8.2)中加入不同浓度的新型保健配方，以去离子水做参比，在320nm处测吸光值，并按公式：
O₂^·-自由基清除率％＝(1-A_样品/A_对照)×100
A_样品：样品管的吸光度，A_对照：对照管的吸光度
计算出清除率。
2、采用Fenton反应体系模型利用H₂O₂与Fe²⁺混合产生OH·自由基，而水杨酸和OH·自由基反应产生有色物质并于510nm处有吸收峰。若加入具有清除OH·功能的被测物，可与水杨酸竞争OH·，从而使有色产物的生成量减少。在反应体系(水杨酸溶液520/mL，EDTA-Na₂-Fe₂+1mmol/L，H₂O₂8.8mmol/L，磷酸缓冲溶液pH＝7.4)中加入不同浓度的保健配方溶液，以去离子水做参比，在510nm处测量吸光值，按方法1计算出对OH·自由基的清除率。
3、将5ml的7mmol/L ABTS和88μl的140mmol/L高硫酸钾混合，在室温避光的条件下静置过夜，形成ABTS⁺自由基储备液，该储备液在室温避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液。在每只试管中加入不同浓度的新型保健配方，再加入ABTS⁺工作液，以无水乙醇为空白，混合10s后于30℃静置6min，在734nm波长下测吸光度。以不同浓度的新型保健配方为横坐标，以ABTS⁺自由基的吸光度为纵坐标作图，如图4。
试验结果
表4对O₂^·-和OH·的清除率
  组分  O₂^·-清除率(％)  OH·清除率(％)  ABTS⁺清除率  (％)  组1  0  0  0  组2  39.3  20.6  30.45  组3  46.39  23.8  43.81  组4  49.35  35.6  48.52  组5  88.62  70.8  82.64  组6  98.36  72.6  99.73
从实施例5三个体外抗氧化能力的实验结果中，可以看到该保健品配方对不同类的自由基都有清除作用。在同时没有紫锥菊提取物和迷迭香提取物情况下，各自由基的清除率不足50％，当有紫锥菊提取物和迷迭香提取物时，对各自由基的清除率接近100％。
【实施例6】对大鼠血清MDA和SOD的影响试验
分组：组1去离子水对照组
组2紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg。
组3紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg，β-胡萝卜素50mg。
组4紫锥菊提取物1000mg，迷迭香提取物1000mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg，β-胡萝卜素100mg。
组5紫锥菊提取物1200mg，迷迭香提取物1200mg，抗坏血酸50mg，生育酚20mg，亚硒酸钠2mg，β-胡萝卜素50mg。
实验方法：以上各组用去离子水定容至100mL。
选用成年小白鼠50只，雌雄各半。随机分为5组，对应各组份每天灌胃1次(μl/g)，各小鼠连续灌胃30天后，断头取血、离心并取血清。测定血清中丙二醛(MDA)含量(化学比色法)和超氧化物歧化酶(SOD)活力(比色法)。试验结果如表5。
表5本配方对小鼠血清SOD和MDA的影响(x±S)
  组分  小鼠数  (只)  MDA  (nmol/ml)  SOD  (u/ml)  组1  10  5.24±0.44  246±15.6  组2  10  4.43±0.55  259±11.3  组3  10  4.37±0.32^*  261±19.3^*  组4  10  4.21±0.92  270±14.6^*  组5  10  4.02±0.54^*  279±17.1^*
[注]^*：方差分析，与对照组比较，p＜0.01。
与对照组相比，各组分对SOD活力都有一定的提高，血清中MDA的含量也随着组分的不同而不同量的减少。可以看出，在有无β-胡萝卜素时，MDA的浓度变化比SOD活力要明显，但是增加β-胡萝卜素的量比其增加紫锥菊提取物和迷迭香提取物来说，前者的效果就相对逊色一些。