截短型人睫状神经营养因子活性片段及其融合蛋白.pdf

本发明涉及一种蛋白转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段的蛋白以及含有编码所述截短型活性片段的核苷酸序列的核酸分子。本发明涉及含有上述核酸分子的表达载体。本发明还涉及所述蛋白或核酸分子用于制备治疗神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森综合症、黑质退行性病变、多发性硬化症、亨延顿舞蹈症、脊髓性肌萎缩和肌萎缩性侧索硬化症等运动神经元疾病等)的药物的用途、用于制备视网膜退行性疾病、青光眼、肥胖症或与肥胖症相关的疾病及神经损伤相关疾病的药物的用途。本发明特别涉及含有所述蛋白或核酸分子的药物组合物，及其经注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔粘膜及肛栓或皮肤吸收、滴眼液吸收等多种方式施用。

1.  蛋白转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段，其特征在于该蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.  截短型人睫状神经营养因子活性片段，其特征在于该片段包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.  编码权利要求1所示蛋白的SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

4.  编码权利要求2所示蛋白的SEQ ID NO.4所示的核酸序列。

5.  权利要求1的蛋白序列，其中所述蛋白转导肽序列由以下几种的任何一种氨基酸序列组成或其功能性片段组成。
(A)含选自HIV-1反式激活蛋白(trans-activatortranscription，TAT)中的蛋白转导区，其氨基酸序列包含SEQ ID NO.5所示的序列。
(B)果蝇触角蛋白同源结构域(ANTP)，其氨基酸序列包含SBQ IDNO.6所示的序列。
(C)单纯疱疹病毒(HSV)VP22的蛋白转导序列，其氨基酸序列包含SEQ ID NO.7所示的序列。

6.  一种含有编码权利要求1所述蛋白的核酸序列的核酸分子及表达载体。

7.  含有权利要求2所述截短型活性片段的核酸序列的核酸分子及重组表达载体。

8.  制备权利要求包括：对截短型人睫状神经营养因子活性片段的设计；获得蛋白转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段基因的cDNA；构建重组质粒，转化大肠杆菌，进行诱导表达；以稀释复性方法进行复性。

9.  权利要求1-4任一项所述的蛋白或核酸分子在制备用于治疗神经退行性疾病的药物的用途，所述疾病包括并不限于阿尔茨海默病、帕金森综合症、黑质退行性病变、多发性硬化症、亨延顿舞蹈症、脊髓性肌萎缩和肌萎缩性侧索硬化症等运动神经元疾病，以及神经损伤相关疾病等。

10.  权利要求1-4任一项所述的蛋白或核酸分子在制备用于治疗肥胖症或与肥胖症相关疾病的药物中的用途。

11.  权利要求1-4任一项所述的蛋白或核酸分子在制备用于治疗视网膜退行性疾病及青光眼的药物中的用途。

12.  一种药物组合物，其含有权利要求1-4任一项所述的蛋白或核酸分子作为活性成分、和药学上可接受的载体或赋性剂。

13.  根据权利要求12的药物组合物，所述药物组合物的给药方式选自静脉给药、皮下给药、肌肉给药、鞘内给药或粘膜给药。

14.  根据权利要求13的药物组合物，所述的粘膜给药选自鼻腔粘膜给药、口腔粘膜给药或直肠粘膜给药。

15.  根据权利要求12的药物组合物，所述药物组合物的制剂形式选自口服制剂或胃肠外制剂或其相应的缓控释制剂。

16.  根据权利要求15的药物组合物，所述药物组合物的胃肠外制剂形式选自注射剂、冻干制剂、吸入雾剂、皮肤涂抹剂、滴眼液剂或其缓控释制剂。

截短型人睫状神经营养因子活性片段及其融合蛋白
技术领域：
本发明涉及重组融合蛋白与其制备方法，具体涉及蛋白转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段编码核酸，以及蛋白的原核表达制备方法。本发明还涉及所述转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段的蛋白或核酸分子各自及其药物组合物，可以用于治疗神经退行性疾病、视网膜退行性疾病、肥胖症或与肥胖症相关的疾病，及神经损伤相关疾病中的用途。
技术背景：
睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)最初由Helfand等在1976年发现，1984年Barbin等从鸡睫状神经元提取获得，因可维持鸡副交感神经节的存活而得名。CNTF能促使多种神经细胞的存活，是第一个被发现的能维持在体和离体脊髓运动神经元的存活及突起生长的神经营养因子。
人CNTF基因位于人第11号染色体长臂近端11q12，为单拷贝基因。没有信号肽，没有糖基化的通用序列，只在第17位有一个非活性必需的半胱氨酸残基。与白血病抑制因子(LIF)、IL-6、OSM及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等的分子结构有一定的相似性，属于神经性细胞因子家族。CNTF的经典信号传导途径是CNTF与其受体α亚基结合后再与细胞膜上亚基gp130和LIFRβ聚合，形成受体复合物，激活膜内侧的JAK激酶，使STAT磷酸化，进入核内，与特定的DNA序列结合，调控细胞核内基因转录和蛋白合成。CNTF在体内具有多种生物学功能，主要作用对象是神经系统，对睫状神经节细胞、交感神经元、脊神经节的感觉神经元、脊髓运动神经元、胆碱能神经元、多巴胺神经元等多种神经细胞都有作用，可促进这些神经细胞的分化、生长，支持其生存，促进神经损伤后的再生和修复。
1.CNTF与疾病
1.1CNTF与神经退行性病变
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性致命性的中枢神经系统退行性疾病。主要破坏脑细胞，引起渐进性记忆力和认知力减退、语言障碍，思考和行为能力下降，精神行为异常，影响工作、生活及社交活动，病情呈进行性加重，逐渐丧失独立生活能力，发病后多因并发症而死亡。目前全世界患阿尔茨海默病的人数已超1800万，患病人数仍在不断地增加。我国阿尔茨海默病患病人数已超过500万，而且随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大。随着年龄的增长，痴呆的发病率和患病率均呈逐渐增高的趋势。在60岁以上的老年人群中，年龄每增加5岁，阿尔茨海默病的患病危险就可增加1.85倍，阿尔茨海默病已经成为21世纪威胁人类的最严重疾病之一。尽管病人数目在增加，目前尚没有治愈措施，全世界都加快脚步寻找更好的治疗方法，延缓发病或者阻止疾病进展。阿尔茨海默病人大脑中特定区域的某些类型神经细胞呈进行性变性死亡，易感区包括杏仁核、海马及海马周围区，受染细胞群体包括儿茶酚胺能、5羟色胺能及胆碱能神经细胞。CNTF可阻止体内这些神经元的退行性丧失，能促进遭受神经病学损伤或神经变性疾病损伤的中枢神经元存活。CNTF还对亨延顿(Huntington)舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森综合症、黑质退行性病变、多系统委缩症和脊髓性肌萎缩(SMA)等有治疗作用。
1.2CNTF与视网膜退行性疾病
CNTF对视网膜神经节细胞具有保护作用。在众多的神经营养因子中，CNTF是唯一能有效促进视网膜神经节细胞再生的营养因子，CNTF可诱导视网膜神经细胞分化，减少神经细胞凋亡，促进细胞再生。体内外实验研究均已证明，CNTF是感光细胞(视锥细胞和视杆细胞)发育过程中所必需的营养因子。玻璃体内注射CNTF可以对感光细胞产生明显的保护作用。CNTF也可治疗青光眼。
1.3CNTF与肥胖症或与肥胖症相关的疾病
肥胖是一种严重危害人体健康的慢性疾病，肥胖可以大大提高患糖尿病、心脏病、高血压、中风和癌症等疾病的风险。实验发现CNTF降低小鼠的体脂，从而使小鼠体重下降。CNTF与位于丘脑部位的受体结合，通过STAT3信号传导途径，能使缺乏leptin的肥胖小鼠(ob/obmice)脂肪减少，体重降低；对于饮食诱导的肥胖模型小鼠(DIO mice)，CNTF也能使之体重下降，这种小鼠模型更能代表人类肥胖症的实际情况。CNTF可能使丘脑的体重调节点下调，从而抑制食物摄入，与通过严格控制饮食减肥及其他的治疗方法相比，CNTF不会发生停药后过量摄入食物而引起体重反弹，因此，CNTF有望开发成为一种新型、高效的减肥药品，具有广阔的临床应用开发前景。
1.4CNTF与神经损伤相关疾病
外周神经雪旺细胞中存在大量的CNTF，当外周神经受损时，CNTF得以释放进入细胞间隙，这些CNTF可通过轴突逆向转运到胞体独自发挥作用，也可和肌肉中存在的可溶性CNTFRA形成复合物而发挥促进神经损伤修复的作用。外周神经切断可引起相应脊髓皮质运动神经元死亡，应用CNTF能支持部分脊髓皮质运动神经元存活。CNTF促进运动神经元轴突在正常肌肉中分支发芽。CNTF能防止初生大鼠因轴突切断导致的运动神经元的死亡，切断面神经的实验显示，CNTF能有效的防止面神经核大部分神经细胞的退变。
2.重组人CNTF的研究现状
CNTF目前主要应用于治疗运动神经元疾病如肌萎缩侧索硬化(ALS)。但临床应用的效果却并不令人满意。将装有能分泌CNTF的活细胞的半透膜微囊植入病变局部，可提高局部CNTF浓度，降低血药浓度、减轻副作用。包被细胞输送CNTF疗法的一期实验显示出CNTF对治疗色素性视网膜炎有效。CNTF治疗其他CNS疾病的研究较少。CNTF在CNS大部分区域的水平均较低，人体内自然产量极低，基因工程是获得大量高纯度CNTF的可靠手段。
3.CNTF与血脑屏障
血脑屏障是存在于血液和脑组织之间的屏障系统，毛细血管内皮细胞与神经细胞间的紧密连接是血脑屏障的基本构成成分。在正常生理情况下只允许气体分子及相对质量小于0.6kD的脂溶性小分子通过。从神经生长因子发现以来，神经营养因子(NTFs)已有20余种。但半个世纪以来，由于血脑屏障的作用，NTFs的临床应用仍很有限。目前临床上仍缺乏一条合理有效的中枢给药途径。已报道的给药途径主要包括外周系统给药、大脑实质直接注射、侧脑室给药、鞘内注射及经鼻给药几种。外周给药，创伤性小，但受到血脑屏障的严重影响，进入大脑实质的量非常有限。大脑实质直接注射、侧脑室给药、鞘内注射给药量容易控制，作用部位直接，但创伤性给药风险大，应用困难。CNTF是蛋白质大分子，很难透过血脑屏障，从而限制了其在中枢的治疗应用，目前开展的一些细胞移植和基因治疗方面的研究虽然在动物实验中取得了一些进展，由于这些治疗方案都采取手术和脑室注射等创伤性手段，离临床应用尚有很大的距离。
本发明选择蛋白转导肽为CNTF运载体，采用基因工程技术将CNTF基因进行改构，使克隆表达的CNTF蛋白N端缺失14个氨基酸，以增高其活性，并去掉C端15个氨基酸，以增加稳定性和可溶性。通过活性检测，证明截短的CNTF蛋白活性片段比市售rhCNTF显示出更高的生物活性。
发明内容：
本发明的一个方面提供了一种具有跨膜转导功能并且具有更高生物活性的截短型人睫状神经营养因子活性片段，所述蛋白特征为人睫状神经营养因子N端缺失14个氨基酸同时融合了蛋白转导肽，并去掉了C端15个氨基酸。所述蛋白转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段(下文缩写成CNTFt)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中截短型活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个方面提供了编码所述蛋白的核酸序列，其中蛋白转导肽融合截短型人睫状神经营养因子活性片段的核酸序列如SEQ IDNO.3所示，而截短型活性片段的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明进一步提供制备CNTFt蛋白的方法，所述方法包括：通过对CNTF分子及其与受体结合的关键部位的分析，同时综合比较分析CNTF蛋白的溶解性、稳定性及免疫原性，设计并获得CNTF截短型活性片段的cDNA；结合蛋白转导肽的强大透膜优势，将TAT蛋白转导肽与CNTF截短型活性片段融合，获得本发明的CNTFt的基因序列，构建了原核表达载体，转化大肠杆菌，进行诱导表达，包涵体经洗涤稀释复性后，获得高纯度的CNTFt活性蛋白。因而提供了含有CNTFt的核酸分子的重组表达载体，包含被任何所述载体转化的宿主细胞，以及由其衍生的新的株系或细胞系。
本发明还展示了CNTFt的透膜能力和生物活性。CNTFt能透过细胞膜进入SH-SY5Y细胞，并能通过血脑屏障进入脑实质，可用于穿越皮肤、粘膜、角膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的治疗用途；能促进TF-1细胞的生长与存活，促进各种神经元的生长及存活，包括海马神经元，皮层神经元等，并促进神经修复和再生，减少神经元的正常死亡以及学习记忆能力的下降。
本发明提供CNTFt多种疾病的治疗用途。CNTFt能用于阿尔茨海默病、帕金森综合症、黑质退行性病变、多发性硬化症、亨延顿舞蹈症、脊髓性肌萎缩和肌萎缩性侧索硬化症等运动神经元疾病，及神经损伤相关疾病等；CNTFt能降低体重，可用于肥胖症或与肥胖症相关的疾病；CNTFt能用于治疗视网膜退行性疾病和青光眼。
本发明进一步提供含有CNTFt及其核酸分子作为活性成分的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，对患者没有危险，不使有效成分失活或者不干扰有效成分的作用。
含CNTFt蛋白的药物组合物可以配制成通过包括静脉内、皮下、肌肉、鞘内、鼻腔粘膜、口腔粘膜、舌下含服或者直肠粘膜等方式给药，优选本发明药物组合物借助胃肠外制剂施用，其施用的有效方法包括吸入雾剂、皮肤涂抹剂、滴眼液剂、注射剂或其缓控释制剂。
附图说明：
图1.SOE-PCR扩增出目的CNTF基因的1.2％琼脂糖凝胶电泳图。
泳道1：DNA marker；泳道2：CNTFt。
图2.双酶切鉴定pBV220-CNTFt质粒。
泳道1、2和3：pBV220-CNTFt酶切后；泳道4：DNA Marker。
图3.CNTFt的表达。
1：蛋白Marker；2：全菌；3：上清；4：沉淀；5：包涵体洗涤液I洗后沉淀；6：包涵体洗涤液I洗后上清；7：包涵体洗涤液II洗后上清；8：包涵体洗涤液II洗后沉淀。
图4.包涵体经稀释透析复性后的SDS-PAGE电泳图。
泳道1：蛋白Marker；泳道2-4：CNTFt。
图5.Western blot分析CNTFt的结果。
图6.CNTFt对TF-1细胞的活性测定。
图7荧光免疫组化显示CNTFt透过SH-SY5Y细胞膜。
A：CNTFt；B：rhCNTF对照品。
图8.荧光免疫组化显示CNTFt透过小鼠血脑屏障。
A：CNTFt给药组的海马齿状回；B：rhCNTF对照品组的海马部位。
图9.Morris水迷宫检测CNTFt对Aβ诱导的阿尔茨海默病模型小鼠的治疗作用。
*，p＜0.01。
具体实施方式：
本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明，这些实施例只是说明性的，不应当理解成限制本发明的范围。
实施例一：CNTFt的构建
以健康成人白细胞基因组DNA为模板，重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增目的基因。以引物P1和P4扩增出全长CNTF基因，反应条件为95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，进行30个循环；最后于72℃延伸10分钟结束反应。1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，得到CNTF带内含子的全片段；回收；以所得CNTF为模板，P1与P2组成一对引物扩增外显子1，P3与P4扩增外显子2。其中各引物序列为：P1(CG GGT ACC ATG GAC CTC TGTAGC CGC TCT ATC TG)；P2(GCC CTG ATG CTT CAC ATA GGA TTC CGTAAG AGC AG)；P3(CTC TTA CGG AAT CCT ATG TGA AGC ATC AGG GCCTG)；P4(CGC GTC GAC TTA CCC AGT CTG ATG AGA AG)
EXON 1的PCR条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸15秒，进行30个循环；最后于72℃延伸10分钟结束反应。2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，切胶回收；
EXON 2的PCR条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸30秒，进行30个循环；最后于72℃延伸10分钟结束反应。1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，切胶回收。
分别回收纯化上述外显子1和外显子2的扩增产物，各取1μL作为模板，P1和P4作为引物各取1μL，采用2×Pfu-MasterMix 10μL，加水6μL使反应体系为20μL，行PCR扩增出所需目的基因。PCR条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，48℃退火1分钟，72℃延伸80秒，进行5个循环；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸80秒，进行25个循环；最后于72℃延伸10分钟结束反应。1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在600bp处可见一条明显的扩增带(图1)，与所需目的片段大小符合。回收试剂盒回收。
回收片段后，与pBV220载体同时双酶切，回收后连接，构建pBV220-CNTFt，转化入大肠杆菌中。酶切鉴定获得pBV220-CNTFt质粒(图2)。核苷酸序列测定证明与理论值一致。
实施例二：CNTFt的表达与复性
1.重组基因在大肠杆菌中的诱导表达
经鉴定构建正确的pBV220-CNTFt重组质粒转化大肠杆菌BL21/pLysS(DE3)感受态的细胞，挑取转化的阳性菌落置3mL含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，30℃摇床培养过夜，取活化菌液10％接种于10mL LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，培养至OD₅₅₀为0.6时，将温度调至37-47℃诱导表达。
收集诱导表达4-8小时的菌体，10000g离心10分钟收集表达菌体，超声破碎，离心分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE分析(图3)。
2.包涵体处理液
包涵体洗涤液I：2mol/L尿素，50mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl，5mmol/L EDTA，pH 7.0-9.0；
包涵体洗涤液II：4mol/L尿素，50mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl，5mmol/L EDTA，pH 7.0-9.0；
包涵体溶解液：10mol/L尿素，10mmol/L柠檬酸缓冲液pH3.0-5.0；
包涵体复性液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L L-精氨酸，0.1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.01mmol/L氧化型谷胱甘肽pH8.0-9.0；
3.包涵体的稀释透析复性
超声破碎后的沉淀包涵体分别用包涵体洗涤液I和II洗涤，4℃过夜。将洗涤后的包涵体溶于包涵体溶解液中，10000g离心10分钟，将上清以1∶20的体积比缓慢加入复性液中，于4℃孵育一周。10 000g离心15分钟，取上清液缓慢透析，并经滤膜除菌后储存。
稀释复性沉淀的大部分是杂蛋白，离心后的上清能回收绝大部分的目的蛋白(图4)，所以稀释复性在复性的同时去除了杂蛋白，是一种方便、简单而且易行的适合放大生产的好方法。稀释复性的方法大大增加了样品处理量，因此更省时，更利于放大且回收率高，适合进行产业化研究的需要。
4.CNTFt分子量的测定
按照2000年版《中国生物制品规程》附录方法进行SDS-PAGE电泳。CNTFt电泳的表观分子量为22kD，理论分子量为21.4kD，符合要求。
5.CNTFt免疫印迹检测
表达的蛋白进行蛋白免疫印迹检测，结果显示抗CNTF单克隆抗体能与所表达蛋白特异性结合(图5)，说明构建、表达和纯化是成功的。
实施例三：CNTFt的生物学活性检测
人红白血病细胞TF-1细胞培养于含10％新生牛血清和10ng/mlGM-CSF的1640培养基中，使用前，先用无血清培养基DMEM洗细胞4次，用DMEM培养基稀释至浓度为4×10⁵/ml，以每孔100μl细胞加入上述96孔板，CNTFt样品用无血清培养基DMEM倍比稀释，每孔加样100μl，使终浓度为0.10，0.50，1，5，10，50，100，500，1000，2000ng/ml，于37℃、5％CO₂条件下培养48小时左右，每孔加20μlMTT，再培养5小时后，加入20％SDS 80μl，充分溶解结晶颗粒后在酶联仪上测D570。同样条件测定参照品rhCNTF的活性作对照。
实施例四：CNTFt越过细胞膜，穿越血脑屏障入脑
为确证CNTFt是否通透细胞膜，在对数生长期的SH-SY5Y细胞中分别加入CNTFt和市售rhCNTF作用1小时后，进行荧光免疫组化鉴定，同时设PBS对照。结果显示，CNTFt处理细胞中出现明亮的绿色荧光，而rhCNTF处理的细胞绿色荧光较弱(图7)，说明CNTFt能跨越细胞膜进入胞质。
为确证CNTFt是否通过血脑屏障，将CNTFt腹腔注入小鼠后1小时处死取脑组织行冰冻切片，以抗CNTF为一抗做荧光免疫组织化学检测。CNTFt组的大脑皮层及海马切片显示有绿色荧光发布，而rhCNTF组在大脑实质中未见到荧光(图8)，结果表明CNTFt可透过血脑屏障进入脑内。
实施例五：CNTFt对阿尔茨海默疾病模型小鼠的疗效
阿尔茨海默疾病动物模型的制作：将Aβ(25-35)溶于1ml灭菌生理盐水中，浓度为1.0mg/ml。密封后于37℃培养箱中96小时，使其成为有毒性的凝聚态后。进行小鼠侧脑室内Aβ注射，注射剂量为每只小鼠3μl，假手术组注射相同体积的生理盐水。注射第11天对小鼠进行Morris水迷宫检测，连续5天，水迷宫实验潜伏期大于120秒的小鼠，为造模成功小鼠。将造模成功的小鼠用于实验。
Morris水迷宫：水迷宫自动控制仪装置为由中国医学科学院药物研究所研制，水池直径100cm，水深35cm，水温控制在(23±2)℃。将安全平台置于Morris水迷宫的第三象限，作为小鼠入水后搜索的目标，以第一、二象限为小鼠入水点，水面高出安全平台约1cm。水池上空通过摄像机与计算机相连，计算机自动采集数据。实验每天训练2次，每次训练3分钟。每次入水前将小鼠置于安全平台上15秒，训练结束，再次停留15秒，以加强记忆效果。如果小鼠在入水120秒以内未能找到水池中的安全平台，可将其放置于安全平台上休息30秒后，再进行下一次训练，共训练5天。水迷宫实验环境要求安静，避免一切外界干扰。将小鼠从入水至找到安全平台的时间(即潜伏期)为定量标准来衡量其空间记忆能力。
模型小鼠被随机分为AD模型生理盐水对照组、rhCNTF腹腔治疗组及直肠治疗组和CNTFt腹腔治疗组及直肠治疗组。每组1只小鼠。给药量100μg/kg/day，连续给药10天。Morris水迷宫行为学实验实验结果表明AD模型小鼠无论是腹腔注射还是直肠给予CNTFt均能显著缩短其潜伏期，与AD模型生理盐水组比较差异极为显著(p＜0.01)；而rhCNTF组未能改善AD模型小鼠的潜伏期，与AD模型生理盐水组比较无显著性差异(p＞0.05)(图9)。
实施例六：CNTFt的抗肥胖作用
取若干只小鼠(断乳KM小鼠，雌雄各半，10-15克)，随机选择15只作为正常对照组，给予普通饲料，其余喂以高能饲料(胆固醇1％、蛋黄粉10％、猪油10％、基础饲料79％)，造成DIO模型(饮食诱导型肥胖模型)，第1周每天每只给予8克营养饲料，以后每周增加2克，自由饮水，共造模8周。造模期间，每周用电子天平测体重1次以观察小鼠的造模情况。第8周末，以模型组小鼠体重超过正常组小鼠体重的20％为DIO模型成功，从造模成功的小鼠中选出50只，随机分成5组，分别为模型对照组、腹腔给药高低剂量组和直肠给药高低剂量组，从正常小鼠中选出10只作为正常对照。低剂量CNTFt给药为100μg/kg/day，高剂量给药1000μg/kg/day，共10天。对照组给予同等量的生理盐水。
实验期间随时注意动物行为变化，观察小鼠每天的饮食情况，精神活动及粪便干稀程度。末次给药并禁食24小时后，称取动物体重，并按(终末体重-初始体重)/初始体重×100％，计算体重增加率，将小鼠用乙醚麻醉后，准确测量小鼠从鼻尖到肛门处的距离即体长，并根据下式计算Lee’s指数：Lee’s指数公式＝(体重g)^1/3×1000/体长cm。
实验中发现实验期间，动物各项行为包括饮水，精神活动正常，粪便无异常，实验结束处死动物，检查各脏器，动物的心、肝、脾、肺、肾等均正常，肝脏色泽鲜红，光滑。小鼠体重变化见表1。
表1.不同剂量CNTFt在不同给药途径下对小鼠体重的影响

**，p＜0.01，*，p＜0.05vs DIO-对照。
实施例七：制备以CNTFt为活性组分的注射剂
配方：